專利名稱：：異硫氰酸酯在制備防治耐藥腫瘤藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域，涉及異硫氰酸酯在制備防治耐藥腫瘤藥物的用途。
背景技術(shù)：
：我國癌癥的發(fā)病率與死亡率呈快速上升的趨勢。癌癥給患者本人及家庭造成極大痛苦，也占用了大量的社會資源和財富，癌癥已經(jīng)成為人類面臨的日益嚴重的公共衛(wèi)生問題。各國政府都投入了大量的人力物力，以期在癌癥研究領(lǐng)域有所突破。目前癌癥的主要治療方法是外科手術(shù)治療、放療、化療和生物治療等。外科手術(shù)治療是最有效的治療手段。然而絕大多數(shù)患者就診時就已經(jīng)是中晚期，或者是晚期，錯過了手術(shù)治療的機會。放射治療為一種局部治療，其療效是有限的，同時亦有劑量限制性、毒性問題。化療可應(yīng)用于幾乎全部癌癥患者，因此抗腫瘤藥物治療成為中晚期癌癥患者的主要治療手段。然而絕大多數(shù)化療病人最終都死于腫瘤耐藥和腫瘤轉(zhuǎn)移。影響化療效果的一個重要問題是腫瘤細胞產(chǎn)生了對細胞毒藥物的耐藥性。腫瘤耐藥性的產(chǎn)生成為治愈癌癥的重大障礙[1’2]。因此克服腫瘤耐藥成為腫瘤治療中急待攻克的難題。對于腫瘤的耐藥性，國內(nèi)外已開展了大量研究。根據(jù)腫瘤細胞的耐藥特點，耐藥可分為原發(fā)性耐藥(primarydrugresistance)禾口獲得性耐藥(acquireddrugresistance)兩大類。原發(fā)性耐藥在化療前就存在于腫瘤細胞中，與藥物的使用無關(guān)；獲得性耐藥是由于化療藥物作用于腫瘤細胞后，對使用過的相同藥物或/和其它化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的藥物產(chǎn)生的耐藥。原發(fā)性耐藥的腫瘤，一開始對抗腫瘤藥物就具有抗藥性，包括消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占61%；獲得性耐藥的腫瘤，包括皮膚癌、乳腺癌、生殖器癌、內(nèi)分泌腫瘤、白血病和淋巴瘤，約占33%。許多天然來源的抗腫瘤藥物，如生物堿類抗癌藥物(秋水仙堿、長春堿、三尖杉酯堿和紫杉醇等)，蒽環(huán)類抗癌抗生素(阿霉素和柔紅霉素)，表鬼白毒素類(Vp-16和VM-26)，及合成藥(米托蒽醌和胺苯丫啶)都極易引發(fā)耐藥性。鑒于目前抗腫瘤藥物對耐藥腫瘤療效不理想，且具毒副作用的特點，開發(fā)新型抗耐藥腫瘤藥物成為攻克癌癥的難點。其中研究和開發(fā)天然抗耐藥腫瘤藥物是目前抗腫瘤藥物研發(fā)中的前沿和熱點課題。異硫氰酸酯(isothiocyanate)是一種有機小分子化合物，普遍存在于蔬菜中[3]。它是天然存在于十字花科蔬菜(如辣根、花椰菜、卷心菜等)中的硫代葡萄糖苷的降解產(chǎn)物。最早引起人們關(guān)注的是它具有防癌作用，能抑制多種腫瘤的生成，如肺、胃、結(jié)腸、肝、食管、膀胱、乳腺等部位[4_7]。其作用機制是抑制致癌物的活化，如降低細胞色素P450的活性[8]；同時促進致癌物的排出，如增高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性[9]。異硫氰酸酯防治耐藥腫瘤的作用目前還未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供異硫氰酸酯在制備防治耐藥腫瘤藥物的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下異硫氰酸酯在制備防治耐藥腫瘤藥物的用途。所述異硫氰酸酯為異硫氰酸芐酯或異硫氰酸苯乙酯，所述異硫氰酸芐酯的分子式為c6h5ch2ncs；結(jié)構(gòu)式為所述耐藥腫瘤為耐藥肺癌，耐藥肝癌，耐藥食道癌，耐藥胃癌，耐藥結(jié)腸癌，耐藥胰腺癌，耐藥乳腺癌，耐藥宮頸癌，耐藥卵巢癌，耐藥前列腺癌，耐藥陰莖癌，耐藥黑色素瘤，耐藥腦瘤，耐藥口腔腫瘤，耐藥耳癌，耐藥鼻咽癌和/或耐藥舌癌。本發(fā)明運用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，證明異硫氰酸酯能有效抑制人腫瘤耐藥細胞生長。異硫氰酸酯有效抑制耐藥腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)凋亡，調(diào)控腫瘤耐藥相關(guān)基因，引起腫瘤細胞周期停滯，造成腫瘤細胞氧化損傷。因此，可以將異硫氰酸酯作為有效成分制備防治耐藥腫瘤藥物及防治耐藥腫瘤食品、保健品及化妝品。圖1為異硫氰酸芐酯抑制人肺癌順鉬敏感細胞系A(chǔ)549細胞生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸芐酯濃度范圍為1-40yM，處理時間為48小時。圖2為異硫氰酸芐酯抑制人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸芐酯濃度范圍為1-40yM，處理時間為48小時。圖3為異硫氰酸芐酯抑制人肺癌吉非替尼敏感細胞系PC9細胞生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸芐酯濃度范圍為1-40yM，處理時間為48小時。圖4為異硫氰酸芐酯抑制人肺癌吉非替尼耐藥細胞系PC9/AB2細胞生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸芐酯濃度范圍為1-40yM，處理時間為48小時。圖5為異硫氰酸苯乙酯抑制人肺癌順鉬敏感細胞系A(chǔ)549細胞生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸苯乙酯濃度范圍為1-40yM，處理時間為48小時。圖6為異硫氰酸苯乙酯抑制人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸苯乙酯濃度范圍為1-40yM，處理時間為48小時。圖7為異硫氰酸苯乙酯抑制人肺癌吉非替尼敏感細胞系PC9細胞生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸苯乙酯濃度范圍為1-40yM，處理時間為48小時。圖8為異硫氰酸苯乙酯抑制人肺癌吉非替尼耐藥細胞系PC9/AB2細胞生長的劑量一生長曲線。圖中異硫氰酸苯乙酯濃度范圍為1-40yM，處理時間為48小時。圖9為實時定量PCR法檢測異硫氰酸芐酯對人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP中腫瘤耐藥相關(guān)基因MRP1和NQ01的mRNA表達水平的調(diào)控。異硫氰酸芐酯濃度10uM，作用所述異硫氰酸苯乙酯的分子式為C6H5CH2CH2NCS；結(jié)構(gòu)式為時間4小時。圖10為實時定量PCR法檢測異硫氰酸芐酯對人肺癌吉非替尼耐藥細胞系PC9/AB2中腫瘤耐藥相關(guān)基因MRP1和NQ01的mRNA表達水平的調(diào)控。異硫氰酸芐酯濃度為10uM，作用時間為4小時。圖11為流式細胞術(shù)檢測異硫氰酸芐酯誘導(dǎo)人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞凋亡。異硫氰酸芐酯濃度為10iiM，作用時間為24小時。細胞經(jīng)propidiumiodide(PI)和AnnexinV—FITC雙染色。圖11_1對照組；圖11_2:BITC處理。圖12為流式細胞術(shù)檢測異硫氰酸芐酯誘導(dǎo)人肺癌吉非替尼耐藥細胞系PC9/AB2細胞凋亡。異硫氰酸芐酯濃度為10UM，作用時間為24小時。細胞經(jīng)propidiumiodide(PI)和AnnexinV—FITC雙染色。圖12_1對照組；圖12_2:BITC處理。圖13為流式細胞術(shù)檢測異硫氰酸苯乙酯誘導(dǎo)人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞凋亡。異硫氰酸苯乙酯濃度為10iiM，作用時間為24小時。細胞經(jīng)propidiumiodide(PI)和AnnexinV—FITC雙染色。圖13_1對照組；圖13_2:PEITC處理。圖14為流式細胞術(shù)檢測異硫氰酸苯乙酯誘導(dǎo)人肺癌吉非替尼耐藥細胞系PC9/AB2細胞凋亡。異硫氰酸苯乙酯濃度為10iiM，作用時間為24小時。細胞經(jīng)propidiumiodide(PI)和AnnexinV—FITC雙染色。圖14-1對照組；圖14-2:PEITC處理。圖15為異硫氰酸芐酯誘導(dǎo)凋亡細胞的比例。圖16為異硫氰酸苯乙酯誘導(dǎo)凋亡細胞的比例。圖17為流式細胞術(shù)檢測人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞周期。細胞經(jīng)propidiumiodide(PI)染色。異硫氰酸芐酯濃度為10yM，作用時間為24小時。圖17-1對照組；圖17-2:BITC處理。圖18為流式細胞術(shù)檢測人肺癌吉非替尼耐藥細胞系PC9/AB2細胞周期。細胞經(jīng)propidiumiodide(PI)染色。異硫氰酸芐酯濃度為10yM，作用時間為24小時。圖18-1對照組；圖18-2:BITC處理。圖19為流式細胞術(shù)檢測人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞內(nèi)活性氧的水平。細胞經(jīng)BITC或BITC+乙酰半胱氨酸(NAC)處理24小時。圖20為流式細胞術(shù)檢測人肺癌吉非替尼耐藥細胞系PC9/AB2細胞內(nèi)活性氧的水平。細胞經(jīng)BITC或BITC+乙酰半胱氨酸(NAC)處理24小時。圖21為異硫氰酸芐酯對人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞內(nèi)谷胱甘肽水平的影響。異硫氰酸芐酯濃度為5和lOyM，作用時間為3-24小時。圖22為異硫氰酸苯乙酯對人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞內(nèi)谷胱甘肽水平的影響。異硫氰酸苯乙酯濃度為5和10yM，作用時間為3-24小時。圖23為異硫氰酸酯對轉(zhuǎn)錄因子NFkB活性的調(diào)控。人肺癌順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP細胞轉(zhuǎn)染pNFkB-Iuc質(zhì)粒。PEITC和BITC濃度分別為10yM，作用時間20小時。具體實施例方式下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1異硫氰酸芐酯在制備防治耐藥腫瘤藥物的用途，異硫氰酸芐酯(BITC)的分子式為c6h5ch2ncs；結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>所述耐藥腫瘤為耐藥肺癌，耐藥肝癌，耐藥食道癌，耐藥胃癌，耐藥結(jié)腸癌，耐藥胰腺癌，耐藥乳腺癌，耐藥宮頸癌，耐藥卵巢癌，耐藥前列腺癌，耐藥陰莖癌，耐藥黑色素瘤，耐藥腦瘤，耐藥口腔腫瘤，耐藥耳癌，耐藥鼻咽癌和/或耐藥舌癌。實施例2異硫氰酸苯乙酯在制備防治腫瘤耐藥藥物的用途，異硫氰酸苯乙酯(peitc)的分子式為c6h5ch2ch2ncs；結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>所述耐藥腫瘤為耐藥肺癌，耐藥肝癌，耐藥食道癌，耐藥胃癌，耐藥結(jié)腸癌，耐藥胰腺癌，耐藥乳腺癌，耐藥宮頸癌，耐藥卵巢癌，耐藥前列腺癌，耐藥陰莖癌，耐藥黑色素瘤，耐藥腦瘤，耐藥口腔腫瘤，耐藥耳癌，耐藥鼻咽癌和/或耐藥舌癌。異硫氰酸芐酯和異硫氰酸苯乙酯加入藥學(xué)可接收的輔料按常規(guī)方法制成各種劑型，如各種規(guī)格的液體注射劑，粉針注射劑，注射用乳劑，片劑，丸劑，膠囊劑，膏劑，霜劑，貼劑，擦劑，粉劑，噴霧劑，植入劑，滴劑，栓劑，軟膏劑，糖果劑等。異硫氰酸芐酯和異硫氰酸苯乙酯的給藥途徑包括各種給藥途徑口服給藥，注射給藥，植入給藥，腔內(nèi)給藥，舌下給藥，肛門給藥，透皮給藥，內(nèi)外敷等。實施例3異硫氰酸酯抑制多種耐藥腫瘤細胞生長我們選用人肺癌順鉬(cisplatin)敏感細胞系A(chǔ)549和順鉬耐藥細胞系A(chǔ)549/DDP，及人肺癌吉非替尼(Gifitinib)敏感細胞系PC9和吉非替尼耐藥細胞系PC9/AB2，通過MTT法，發(fā)現(xiàn)BITC和PEITC能有效抑制敏感及耐藥細胞的生長，尤其對順鉬耐藥細胞A549/DDP的生長抑制作用(IC5Q分別為8.8PM和13.7UM)比順鉬敏感細胞A549(IC5Q分別為14.lyM和17.6PM)更強，表明對耐藥細胞具有選擇性抑制作用。其中等生長抑制濃度見表1。圖1-圖4為BITC抑制細胞生長的劑量一生長曲線。圖5-圖8為PEITC抑制細胞生長的劑量一生長曲線。表1異硫氰酸酯抑制腫瘤細胞生長的50%生長抑制濃度(IC5Q)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例4異硫氰酸酯對腫瘤耐藥相關(guān)基因的調(diào)控通過定量PCR的方法，檢測了BITC對順鉬耐藥細胞A549/DDP和吉非替尼耐藥細胞PC9/AB2中多藥耐藥蛋白multidrugresistantprotein1(MRP1)和藥物代謝酶NAD(P)Hquinoneoxidoreductase1(NQ01)表達的影響。結(jié)果顯示，BITC濃度為10iiM時，作用4小時即能降低MRP1和NQ01的mRNA的表達水平(圖9-圖10)。實施例5異硫氰酸酯誘導(dǎo)肺癌耐藥細胞凋亡通過Armexin-V標記法，運用流式細胞術(shù)，檢測了異硫氰酸酯誘導(dǎo)肺癌耐藥細胞凋亡的作用。異硫氰酸芐酯和異硫氰酸苯乙酯濃度為10PM，作用時間為24小時。結(jié)果顯示，BITC和PEITC可有效誘導(dǎo)肺癌耐藥細胞凋亡。圖11-1:A549/DDP細胞，對照；圖11_2A549/DDP細胞，BITC處理；圖12-1:PC9/AB2細胞，對照；圖12-2:PC9/AB2細胞，BITC處理。圖13-1:A549/DDP細胞，對照；圖13_2:A549/DDP細胞，PEITC處理；圖14_1:PC9/AB2細胞，對照；圖14-2:PC9/AB2細胞，PEITC處理。圖15顯示BITC誘導(dǎo)凋亡細胞的比例。圖16顯示PEITC誘導(dǎo)凋亡細胞的比例。實施例6異硫氰酸酯誘導(dǎo)肺癌耐藥細胞周期停滯。通過Propidiumiodide染色，運用流式細胞術(shù)，檢測了異硫氰酸酯對細胞周期的影響。研究顯示BITC濃度為lOyM時，作用24小時，可誘導(dǎo)細胞周期停滯，使細胞周期停滯在G2/M期，從而抑制細胞的生長。圖17-1:A549/DDP細胞，對照；圖17_2:A549/DDP細胞，BITC處理；圖18-1:PC9/AB2細胞，對照；圖18-2:PC9/AB2細胞，BITC處理。實施例7異硫氰酸酯提高細胞內(nèi)活性氧的水平。應(yīng)用DCFH-DA熒光探針，運用流式細胞術(shù)，檢測了細胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies,R0S)的水平。異硫氰酸芐酯濃度為10yM，作用時間為24小時。研究發(fā)現(xiàn)，BITC提高細胞內(nèi)活性氧的水平，引發(fā)氧化損傷。抗氧化劑乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可有效保護細胞，降低異硫氰酸酯誘導(dǎo)的細胞內(nèi)活性氧的水平。圖19A549/DDP細胞；圖20:PC9/AB2細胞。實施例8異硫氰酸酯降低耐藥細胞內(nèi)谷胱甘肽glutathione(GSH)的水平應(yīng)用試劑盒檢測了細胞內(nèi)GSH的水平。異硫氰酸芐酯濃度為5和10yM,作用時間為3-24小時。BITC和PEITC明顯降低A549/DDP細胞內(nèi)谷胱甘肽的水平(圖21，圖22)。因谷胱甘肽是細胞內(nèi)重要的還原劑，對維持胞內(nèi)氧化-還原平衡起重要作用，谷胱甘肽水平的降低即造成氧化損傷，從而抑制細胞的生長實施例9異硫氰酸酯抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性。我們檢測了異硫氰酸酯對轉(zhuǎn)錄因子NFkB轉(zhuǎn)錄活性的影響。通過運用熒光素酶報告基因的方法，將質(zhì)粒pNFkB-luc轉(zhuǎn)染到A549/DDP細胞中，檢測了異硫氰酸酯對轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。BITC和PEITC濃度為10iiM，作用時間為20小時。結(jié)果顯示BITC和PEITC抑制轉(zhuǎn)錄因子NFkB(圖23)的活性。上述實驗結(jié)果表明，BITC和PEITC可有效抑制人肺癌耐藥細胞的生長。BITC和PEITC是通過調(diào)控腫瘤耐藥相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，引起細胞周期停滯，引發(fā)氧化損傷，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子等途徑抑制腫瘤耐藥細胞的生長。因BITC和PEITC具有此功能，故可作為有效成分制備具有抑制人腫瘤耐藥細胞生長的藥品、食品、保健品及化妝品。主要參考文獻1.MacDiarmidJA，Amaro-MugridgeNB，Madrid-WeissJetal.Sequentialtreatmentofdrug-resistanttumorswithtargetedminicellscontainingsiRNAoracytotoxicdrug.NatBiotechnol，2009，27:643_512.ZhangJ，YangPL,GrayNS.Targetingcancerwithsmallmoleculekinaseinhibitors.NatRevCancer，2009，9:28_393.HechtSS,UpadhyayaP,WangRLetal.InhibitionoflungtumorigenesisinA/JmicebyN-acetyl-S-(N-2-phenethy1thiocarbamoyl)-L-cysteineandmyo-inositol，individuallyandincombination.Carcinogenesis，2002，23(9)1455-14614.ZhangYandTalalayP.Anticarcinogenicactivitiesoforganicisothiocyanateschemistryandmechanisms.CancerResearch，1994，54:1976s_1981s.5.HechtSS.Chemopreventionbyisothiocyanates.J.Cell.Biochem.,Suppl.，1995,22195-2096.HechtSS.Chemopreventionofcancerbyisothiocyanatesmodifiersofcarcinogenmetabolism.J.Nutr.，1999，129:769s_774s.7.ConawayCC，YangYMandChungFL.Isothiocyanatesascancerchemopreventiveagentstheirbiologicalactivitiesandmetabolisminrodentsandhumans.Curr.DrugMetab.,2002,3233~2558.ConawayCC,JiaoDandChungF_LInhibitionofratlivercytochromeP450isozymesbyisothiocyanatesandtheirconjugate:Astructure-activityrelationshipstudy.Carcinogenesis，1996，16:2423_2427.9.ZhengG，KenneyPMandLamLK，PhenylalkylisothiocyanatecysteineconjugatesasglutathioneS—transferasestimulatingagent.JMedChem1992.35185-188.權(quán)利要求異硫氰酸酯在制備防治耐藥腫瘤藥物的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述異硫氰酸酯為異硫氰酸芐酯或異硫氰酸苯乙酯，所述異硫氰酸芐酯的分子式為C6H5CH2NCS；結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>所述異硫氰酸苯乙酯的分子式為C6H5CH2CH2NCS；結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述耐藥腫瘤為耐藥肺癌，耐藥肝癌，耐藥食道癌，耐藥胃癌，耐藥結(jié)腸癌，耐藥胰腺癌，耐藥乳腺癌，耐藥宮頸癌，耐藥卵巢癌，耐藥前列腺癌，耐藥陰莖癌，耐藥黑色素瘤，耐藥腦瘤，耐藥口腔腫瘤，耐藥耳癌，耐藥鼻咽癌和/或耐藥舌癌。全文摘要本發(fā)明公開了異硫氰酸酯在制備防治耐藥腫瘤藥物的用途。本發(fā)明運用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，證明異硫氰酸酯能有效抑制耐藥腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)凋亡，調(diào)控腫瘤耐藥相關(guān)基因，引起耐藥腫瘤細胞周期停滯，造成腫瘤細胞氧化損傷。因此，可以將異硫氰酸酯作為有效成分制備防治耐藥腫瘤藥物及防治耐藥腫瘤食品、保健品及化妝品。文檔編號A61P35/00GK101822663SQ201010165008公開日2010年9月8日申請日期2010年5月7日優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日發(fā)明者劉博寧,吳驤,周清華,徐克,閆慧琴申請人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院