專利名稱：7,2"-脫水葛根素及其鹽類衍生物以及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及葛根素衍生物及其制備方法與應用，尤其涉及7，2"-脫水葛根素及 其鹽類衍生物及其制備方法與應用，屬于醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
葛根素是從豆科植物野葛、甘葛藤根中提取的一種異黃酮苷，研究發(fā)現其具 有清除自由基(J. Agric. Food Chem. 2002，50，7504-7509.)、降低血清膽固醇(J. Nat. Prod. 2003，66，788-792.)、抗凝血以及抗變態(tài)反應(Biol. Pharm. Bull. 2002,25, 1328-1332.)等活性，臨床上用于治療冠心病(中國中西醫(yī)結合雜志2003，23，895-897.)、 心絞痛(中國中西醫(yī)結合雜志1998，18,282-284.)、心肌梗死(Chinese Med. J. 1992，105， 11-17.)、突發(fā)性耳聾(第一軍醫(yī)大學學報2002，22，1044-1045)以及酒精中毒(Pharmacol. Biochem. Behav. 2003，75，593-606 ；Alcohol Clin. Exp. Res. 2003，27，177—185.)等。正因為葛根素具有上述多種藥理活性，引起人們對葛根素及其衍生物的廣泛關 注。但是葛根素口服吸收生物利用度較差，使口服劑型的應用受到限制，臨床主要是用葛 根素的注射液劑型，為方便應用，需要改善葛根素溶解性和生物利用度。目前相關文獻報 道主要在于進行結構修飾或采用特殊劑型。楊若林等曾對葛根素進行了一系列甲基、甲 氧基、異丙基、苯甲?；⑷郊谆妊苌?，進行兔眼血流量試驗表明所得結構修飾后的 化合物中乙?；腿郊谆苌锟娠@著增加血流量(中國藥科大學學報1999，30， 81-85.)。Dan Li等利用酶法對葛根素進行了多種糖基化反應，其衍生物水溶性得到明顯改 善(Carbohydr. Res. 2004，339，2789-2797.)。婁紅祥等對葛根素進行了一系列乙酰水楊酰 基衍生化，抑制血小板凝集活性實驗表明，7-乙酰水楊?；鸶貙θ梭w外血小板聚集反 應具有非常顯著的劑量依賴性的抑制作用(IC5tl = 0. 91mmol. Γ1)，且抑制作用顯著地強于 單用相當量的阿司匹林和葛根素(CN200410036070. 9)。據文獻報道，許多黃酮碳苷類化合物的酚羥基可與其糖基部分的羥基發(fā)生分子內 脫水反應生成具有較強的生物學活性的脫水衍生物(Tetrahedron 2004，60，9357-9379 ； Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004，14，3201-3203 ；Org. Lett. 2009，11，2233-2236.)。但是，經檢 索，目前尚未發(fā)現有7，2" _脫水葛根素衍生物的報道。葛根素為異黃酮碳苷，4'位顯弱酸的羥基為其活性基團，且由于異黃酮母核為 平面結構，因此我們選擇了可改變葛根素空間結構的8位吡喃葡萄糖基團進行結構改 造，將2〃位羥基與7位羥基發(fā)生分子內阻^111101311反應，合成7，2"-脫水葛根素(7， 2 “ -dehydrate puerariri)。

發(fā)明內容
針對上述現有技術，本發(fā)明要解決的技術問題之一是針對葛根素口服吸收生物利 用度較差、臨床只有注射劑應用的現狀，提供一種葛根素結構修飾衍生物——7,2"-脫水 葛根素及其鹽類衍生物及其制備方法；本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供7，2"-脫水
3葛根素及其鹽類衍生物在制備治療或/和預防心腦血管疾病的藥物中的應用，包括心律失 常、冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的本發(fā)明的7，2"-脫水葛根素結構式如下式(I)
其中，R為H。
本發(fā)明的7，2"-脫水葛根素鹽類衍生物，是指7，2" _脫水葛根素的4
位羥基與各種有機、無機堿反應生成的鹽類衍生物，比如，反應后，R可以為Na+、K+、
等離子中的任一種。 本發(fā)明的7，2"-脫水葛根素的制備方法為將葛根素與PY3以及偶氮類化合物按 摩爾比1 (1 4) (1 4)混合，在有機溶劑中，發(fā)生分子內Mitsimobu反應，制得式 I化合物，常規(guī)過濾、濃縮、硅膠柱層析，將得到的7，2" _脫水葛根素分離純化；其合成反應 示意如下 所述PY3中Y基團為芳基、烷基、雜芳基或烷氧基中的任一種。所述偶氮類化合物為偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD)、偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)、N， N, N' ,N'-四甲基偶氮二甲酰胺(TMAD)或偶氮二甲酰二哌啶(ADDP)中的任一種。所述有機溶劑為四氫呋喃、二噁烷、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、甲苯、苯或六 甲基磷酰三胺中的任一種。本發(fā)明的的7，2" _脫水葛根素中4'位顯弱酸的羥基可與各種有機、無機強堿反 應，生成7，2"-脫水葛根素的鹽類衍生物，以增加水溶性和穩(wěn)定性，改善其藥代動力學參數。
本發(fā)明的的7，2"-脫水葛根素及其鹽類衍生物在制備治療或/和預防心腦血管 疾病的藥物中的應用，包括心律失常、冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病。用本發(fā)明的7，2"-脫水葛根素及其鹽類衍生物可制成任何一種藥劑學上所述的 劑型的藥物，在所述的劑型中優(yōu)選口服制劑或注射劑。根據文獻報道，許多黃酮碳苷類化合物的酚羥基可與其糖基部分的羥基發(fā)生分子 內脫水反應生成具有較強的生物學活性的脫水衍生物(Tetrahedron 2004，60，9357-9379 ； Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004，14，3201-3203 ；Org. Lett. 2009，11，2233-2236.)。葛根素為 異黃酮碳苷，4'位顯弱酸的羥基為其活性基團，且由于異黃酮母核為平面結構，因此發(fā)明 人選擇了可改變葛根素空間結構的8位吡喃葡萄糖基團進行結構改造，將2"位羥基與7位 羥基發(fā)生分子內Mitsimobu反應，合成7，2"-脫水葛根素。本發(fā)明的7，2" _脫水葛根素衍生物與葛根素一樣，對心律失常、冠心病、心絞痛、 心肌梗死、腦梗死等多種心腦血管疾病具有良好的預防與治療作用，且經實驗證明，其部分 活性明顯強于葛根素。本發(fā)明的7，2" _脫水葛根素衍生物改變了葛根素本身的極性和空 間結構，以影響化合物的水溶性，改善藥物的細胞膜通透功能，增強在胃腸道中的吸收，提 高葛根素的口服生物利用度，克服了目前臨床上葛根素口服吸收生物利用度較差的缺陷， 在制備心腦血管疾病治療與預防藥物方面應具有良好的應用前景。


圖1為生理鹽水組ECG;圖2丙二醇溶媒灌胃組ECG ；圖3丙二醇溶媒iv組ECG ；圖4葛根素注射液組ECG ；圖57，2〃 -脫水葛根素灌胃組ECG;圖67，2〃 -脫水葛根素iv組ECG ；圖77，2 〃 -脫水葛根素1H NMR ；圖87，2 “-脫水葛根素 13C NMR ；注圖1 6中上方標記分別為開始給予0. BaCl2時的心電圖、給予0. 8冗12后開始出現心律失常的心電圖、以及從開始給予0. I^BaCl2記錄30min時的心電圖。
具體實施例方式實施例1 :7，2〃 -脫水葛根素的制備將2. 9g(約7mmol)葛根素在N2保護下溶于200ml無水四氫呋喃中，冰浴條件下， 加入3. 5ml (約17. 5mmol)偶氮二甲酸二異丙酯和4. 6g (約17. 5mmol)三苯基磷，緩慢升至 室溫，磁力攪拌16h。濃縮、常規(guī)硅膠柱層析(CH2Cl2 CH3OH =13 1,8 1)得2. 4g 7， 2" _脫水葛根素，收率為87. 1%。1,2"-脫水葛根素為白色粉末，分子式為C21H18O8,結構式見式I，分子量398，mp 258. 4 260. I0C ；1H NMR(600MHz, CD3OD) δ 8. 23 (d, 1H, J = 8. 4Ηζ)，8· 21 (s, 1H)，7· 39 (d, 2H, J = 8. 4Hz)，7. 13 (d, 1H, J = 8. 4Hz)，6. 87 (d, 2H, J = 8. 4Hz)，5. 45 (d, 1H, J = 3. 6Hz)， 4. 81(t，lH，J = 3. 6Hz) ,4. 07 (dd, 1H, J = 4. 8，9. 6Hz)，3. 87 (dd，1H，J = 2. 4，12. 0Hz)，
53. 65(m,2H) ,3. 43 (m, 1H) ； 13C NMR(150MHz, CD3OD) δ 61. 8,68. 1,72. 1,73. 6,79. 1,87. 6, 110. 1, 115. 2, 116. 2, 118. 9，122. 9，125. 3，129. 9，130. 4，153. 3，154. 1, 157. 8，166. 2， 176. 8 ；HRMS(ESI)m/z calcd for C21H18O8[M+Na]+421. 0894，found 421. 0893.(如圖 7、圖 8 實施例2:7，2〃 _脫水葛根素的制備將2. 9g(約7mmol)葛根素在N2保護下溶于200ml無水四氫呋喃中，冰浴條件下， 加入2. 4g(約14. Ommol)N，N，N' ,N'-四甲基偶氮二甲酰胺和3. 4ml (約14. Ommol)三正 丁基磷，緩慢升至室溫，磁力攪拌16h。濃縮、常規(guī)硅膠柱層析(CH2Cl2 CH3OH =13 1， 8 1)得2.2g 1,2"-脫水葛根素，收率為81.4%。實施例3:7，2〃 _脫水葛根素的制備將2. 9g(約7mmol)葛根素在N2保護下溶于200ml無水四氫呋喃中，冰浴條件下， 加入1. 6ml (約10. 5mmol)偶氮二甲酸二乙酯和2. 8g (約10. 5mmol)三苯基磷，緩慢升至 室溫，磁力攪拌16h。濃縮、常規(guī)硅膠柱層析(CH2Cl2 CH3OH =13 1,8 1)得2. Ig7， 2" _脫水葛根素，收率為77.5%。試驗1 :7，2"-脫水葛根素的抗心律失常試驗(1)方法取健康成年Wistar大鼠60只，雄性，180_220g，按體重隨機分為生理 鹽水組，丙二醇溶媒灌胃組，丙二醇溶媒iv組，葛根素注射液組，7,2"-脫水葛根素灌胃 組，7，2〃 -脫水葛根素iv組，10只/組。靜脈注射組每天給藥一次，連續(xù)三天；灌胃組每 天給藥兩次，給藥三天。生理鹽水組給予相應體積的0. 9%氯化鈉注射液；丙二醇溶媒灌 胃組給藥劑量為14. 3%丙二醇lml/100g ；丙二醇溶媒靜脈注射組給藥劑量為40%丙二醇 0. 5ml/100g ；葛根素注射液組給藥劑量為50mg/kg ；7，2"-脫水葛根素灌胃組給藥劑量為 60mg/kg，7，2"-脫水葛根素靜脈注射液組給藥劑量為30mg/kg。大鼠腹腔注射10%水合 氯醛麻醉(0. 35ml/100g)，背位固定。連接BL-410生物機能實驗系統(tǒng)，監(jiān)測心電變化。暴露 股靜脈，插入頭皮針，連接恒速注射泵，以恒速注入0. 1 % BaCl2,0. lml/100g,速度為0. 6ml/ min。注射時開始計算時間，監(jiān)測并記錄30min內心電圖(ECG)，記錄心律失常潛伏時間，心 律失常的持續(xù)時間(30min內未恢復記錄為30min)。比較各組大鼠間差異，并用SPSS軟件 進行統(tǒng)計學分析，P < 0. 05認為有統(tǒng)計學差異。(2)結果心電圖如圖1 圖6所示，數據如表1所示，與生理鹽水組比較，7， 2" _脫水葛根素灌胃組與7，2"-脫水葛根素iv組對0.1 ^BaCl2誘導的心律失常潛 伏時間有所延長，但無統(tǒng)計學意義。與生理鹽水組比較，7，2" _脫水葛根素灌胃組與7，
62"-脫水葛根素iv組對心律失常持續(xù)時間有明顯作用，可顯著縮短心律失常持續(xù)時間Γ *Ρ<0.01)ο與陽性對照葛根素注射液比較，也顯著縮短心律失常持續(xù)時間，有顯著統(tǒng)計學 意義(##Ρ< 0.01，sP <0.05)。此外，與7，2"-脫水葛根素iv組比較，7，2〃 -脫水葛根 素灌胃組更明顯的縮短心律失常持續(xù)時間，較7，2"-脫水葛根素iv組效果更顯著。表17，2"-脫水葛根素預防給藥對大鼠心律失常的影響(r±SD) 與生理鹽水組比較*P < 0.05，**P < 0.01.與葛根素注射液組比較:#P < 0. 05，##P < 0. 01.(3)結論本發(fā)明的7，2"-脫水葛根素衍生物可顯著縮短心律失常持續(xù)時間，水 溶性良好，生物利用度高。試驗2:7，2〃 _脫水葛根素的抗凝血試驗(1)方法取家兔一只，稱重，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉lml/kg。麻醉后，分離 頸動脈，結扎遠心端，近心端插管，取血25ml。分別放入預先加入50mg/ml草酸鉀0. 5ml的 試管中，混勻。另取預先加入相應藥物0.25ml的小試管24只，向每只小試管中加入上述兔 血0. 9ml，再各加2mg/ml CaCl2 0. lml，搖勻后立即放入37士0. 5°C的恒溫水浴鍋中。每隔 30s，將試管輕輕傾斜一次，觀察記錄凝血終點時間(以將試管慢慢傾斜，血液不致流出為 終點)。比較各組之間的凝血時間。用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，P <0.05認為有統(tǒng)計學 差異。(2)結果數據如表2所示，與生理鹽水組比較，溶媒組及藥物組明顯延長凝血時 間，有統(tǒng)計學差異。與陽性對照葛根素組比較，7，2"-脫水葛根素藥物中，高劑量組顯著延 長凝血時間，有顯著統(tǒng)計學差異(##P<0.01)。與丙二醇溶媒組比較，葛根素組及7，2"-脫 水葛根素中，高劑量組顯著延長凝血時間，有統(tǒng)計學差異(AP < 0. 05，aaP < 0. 01，aaP < 0. 01)表27，2〃 -脫水葛根素體外抗凝血作用研究±SD) 與生理鹽水組比較ZP < 0.05，〃P < 0.01。與葛根素組比較=flP< 0. 05，##P < 0. 01。與丙二醇溶媒組比較AP < 0. 05，“P < 0. 01。
8
權利要求
7，2″ 脫水葛根素及其鹽類衍生物，其特征在于，是指結構式如下式(I)的化合物，及其鹽類衍生物其中，R為H；所述7，2″ 脫水葛根素鹽類衍生物，是指7，2″ 脫水葛根素的4′位羥基與各種有機、無機堿反應生成的鹽類衍生物。FSA00000099682700011.tif
2.權利要求1所述的7，2"_脫水葛根素及其鹽類衍生物的制備方法，其特征在于， 所述7，2" _脫水葛根素的制備方法如下將葛根素與PY3以及偶氮類化合物按摩爾比 1 (1 4) (1 4)混合，在有機溶劑中，發(fā)生分子內Mitsunobu反應，制得化合物7， 2"-脫水葛根素，常規(guī)過濾、濃縮、硅膠柱層析，將得到的7，2"-脫水葛根素分離純化；其 中，PY3中Y基團為芳基、烷基、雜芳基或烷氧基中的任-種。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述偶氮類化合物為偶氮二甲酸二 異丙酯、偶氮二甲酸二乙酯、N，N，N' ,N'-四甲基偶氮二甲酰胺或偶氮二甲酰二哌啶中的 任一種。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述有機溶劑為四氫呋喃、二噁烷、 二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、甲苯、苯或六甲基磷酰三胺中的任一種。
5.權利要求1所述的7，2"_脫水葛根素及其鹽類衍生物在制備治療或/和預防心腦 血管疾病的藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于應用時，制成口服制劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及結構式(I)的化合物7，2″-脫水葛根素(7，2″-dehydrate puerarin)及其鹽類衍生物本發(fā)明的7，2″-脫水葛根素是由葛根素通過分子內Mitsunobu反應制備得到的，可顯著縮短心律失常持續(xù)時間，顯著延長凝血時間，該單體化合物及其可藥用鹽做成口服或注射劑，用于治療心律失常、冠心病、心絞痛、心肌梗死以及腦梗死等心腦血管疾病。
文檔編號A61P9/10GK101921282SQ201010159299
公開日2010年12月22日 申請日期2010年4月29日 優(yōu)先權日2010年4月29日
發(fā)明者婁紅祥, 薛霞, 高健 申請人:山東大學