專利名稱：：一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬植物藥獼猴桃的制備領(lǐng)域，特別是涉及一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法。
背景技術(shù)：
：作為藥用的獼猴桃根系獼猴桃科獼猴桃屬植物《中華獼猴桃Actinidiachi體sisPlanch.》或獼猴梨《軟麥獼猴桃Actinidiaargute(Sieb.etZucc)Planch.》的根，收載于中國(guó)藥典1977年版P551。具有解毒活血、清熱利濕之功效，民間臨床上常用于抗腫瘤。在CN01128730、CN1093594A、CN1478495ACN02114318、CN02129513、CN03156252、CN200410022919等中國(guó)專利中都涉及了制備具有抗癌作用的復(fù)方中成藥中使用了藤梨根或獼猴桃根，這些專利大多涉及復(fù)方中成藥的配方組成、制備和應(yīng)用，而不是強(qiáng)調(diào)單方藤梨根提取有效部位和膠囊制劑的新藥制備。申請(qǐng)?zhí)?005100326685公開了藤梨根抗腫瘤提取物及其制備方法和用途，該藤梨根抗腫瘤提取物可通過水或有機(jī)溶劑在70w10(TC溫度下浸提、然后減壓濃縮、調(diào)酸、乙酸乙酯萃取、聚酰胺層析、溶劑洗脫、濃縮干燥制得。但上述專利中未使用大孔樹脂分離，而用乙酸乙酯萃取，此方法在大工業(yè)生產(chǎn)時(shí)帶來設(shè)備、勞防、環(huán)保等問題，此方法未解決提取物制備新藥的制劑。專利CN100457116C中，闡述了獼猴桃素的制備方法和通用制劑的制備，缺少制劑的實(shí)際操作和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，除了生產(chǎn)工藝方面的成熟，還解決了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性保障，獼猴桃膠囊可以用于防治肺癌及消化道腫瘤。本發(fā)明的一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法，包括(1)取中華獼猴桃根(市售)粗粉，加6-12倍量去離子水，浸泡10-60分鐘，加熱煮沸，保持沸騰l-3小時(shí)，濾取藥液；第二次煎煮加6-10倍量去離子水，煎煮1-2小時(shí)；第三次煎煮加4-8倍量去離子水，煎煮0.5-1.5小時(shí)；合并三次煎液，靜置過夜，濾取上清液，真空濃縮至相對(duì)密度1.06-1.12;(2)將澄清劑加入到上述水提濃縮液中，邊加入邊攪拌，至無沉淀后靜置12小時(shí)，濾取上清液，加乙醇至藥液含醇量達(dá)15-30%(V/V)，過濾，棄沉淀，濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)75-85%(V/V)，過濾；(3)沉淀物將上述過濾后的沉淀物抽干，加乙醇洗滌，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉(多糖)；(4)濾液回收乙醇，至無醇，加水溶解，通過D型大孔吸附樹脂的柱子，先用去離子水洗脫至無色，再用15%(V/V)乙醇洗脫至無色，繼用55%(V/V)乙醇洗脫至無色，收取55%(V/V)乙醇洗脫液，回收乙醇，流份濃縮至浸膏(比重1.30-1.35)，再用70-80%(V/V)乙醇溶解，過濾，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉(提取物)；(5)制劑將步驟(3)和(4)所制得的細(xì)粉按質(zhì)量比13:l，充分混勻，制成細(xì)顆粒，填充膠囊即得。所述步驟(2)中的為每100ml醋酸溶液含有O.1-0.8g殼聚糖，該醋酸溶液的濃度為0.5-1.5%(V/V)。所述步驟(4)中的D型大孔吸附樹脂的用量為步驟(1)中獼猴桃根粗粉重量的0.5-1.5倍。本發(fā)明提供了從獼猴桃根提取獼猴桃中的有效成分的方法，用純凈水煎煮使用本煎煮方法，雜質(zhì)少，有效成分轉(zhuǎn)移率高；醇提加大孔樹脂分離，富集了脂溶性有效成分。制成膠囊后，避免了通常煎服的使用原藥材量大、煎煮不方便、攜帶麻煩、劑量不準(zhǔn)、雜質(zhì)太多等弊病。有益效果本發(fā)明的制備方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，將獼猴桃根中的有效成分精制，保留水溶性的多糖和脂溶性的甾萜及苷類；除了生產(chǎn)工藝方面的成熟，還解決了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性保障，獼猴桃膠囊可以用于防治肺癌及消化道腫瘤。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1取藤梨根(中華獼猴桃根別名)10kg，加100L去離子水，浸泡30分鐘，加熱煮沸，保持沸騰2小時(shí)，濾取藥液；第二次煎煮加80L去離子水，煎煮1.5小時(shí)；第三次煎煮加80L去離子水，煎煮1小時(shí)；合并三次煎液，靜置過夜，濾取上清液，真空濃縮至相對(duì)密度1.08;用澄清劑含0.5%(g/ml)殼聚糖的1%(v/v)醋酸溶液，加入水提濃縮液中，邊加入邊攪拌，至無沉淀后靜置12小時(shí)，濾取上清液，加乙醇至藥液含醇量達(dá)28%(v/v)，過濾，棄沉淀，濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)78%(v/v)，過濾；沉淀物將上述過濾后的沉淀物抽干，加約500ml乙醇洗滌，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉約200g;濾液回收乙醇，至無醇，加水溶解，通過已活化的D101-II型大孔吸附樹脂10kg的柱子，用去離子水洗脫至無色，再用15%(v/v)乙醇洗脫至無色，繼用55%(v/v)乙醇洗脫至無色，收取55%(v/v)乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮至浸膏(比重1.30)，再用75%(v/v)乙醇溶解，過濾，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉約100g;將沉淀物與萃取物混合，制成細(xì)顆粒，填充膠囊1000粒，即得。實(shí)施例2取藤梨根10kg，加120L去離子水，浸泡20分鐘，加熱煮沸，保持沸騰2小時(shí)，濾取藥液；第二次煎煮加100L去離子水，煎煮1小時(shí)；第三次煎煮加80L去離子水，煎煮1小時(shí)；合并三次煎液，靜置過夜，濾取上清液，真空濃縮至相對(duì)密度1.08;用澄清劑含0.1%(g/ml)殼聚糖的O.5%(V/V)醋酸溶液，加入水提濃縮液中，邊加入邊攪拌，至無沉淀后靜置12小時(shí)，濾取上清液，加乙醇至藥液含醇量達(dá)15%(V/V)，過濾，棄沉淀，濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)75%(V/V)，過濾;沉淀物將上述過濾后的沉淀物抽干，加600ml乙醇洗滌，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉約210g;濾液回收乙醇，至無醇，加水溶解，通過已活化的D101-II型大孔吸附樹脂12kg的柱子，用去離子水洗脫至無色，再用10%(V/V)乙醇洗脫至無色，繼用50%(V/V)乙醇洗脫至無色，收取50%(v/v)乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮至浸膏(比重1.33)，再用70%(V/V)乙醇溶解，過濾，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉約105g;將沉淀物與萃取物混合，制成細(xì)顆粒，填充膠囊1000粒，即得。實(shí)施例3取藤梨根10kg，加60L去離子水，浸泡60分鐘，加熱煮沸，保持沸騰1小時(shí)，濾取藥液；第二次煎煮加60L去離子水，煎煮1小時(shí)；第三次煎煮加60L去離子水，煎煮1小時(shí)；合并三次煎液，靜置過夜，濾取上清液，真空濃縮至相對(duì)密度1.08;用澄清劑含0.8%(g/ml)殼聚糖的1.5%(V/V)醋酸溶液，加入水提濃縮液中，邊加入邊攪拌，至無沉淀后靜置12小時(shí)，濾取上清液，加乙醇至藥液含醇量達(dá)30%(V/V)，過濾，棄沉淀，濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)85%(V/V)，過濾;沉淀物將上述過濾后的沉淀物抽干，加450ml洗滌，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉約185g;濾液回收乙醇，至無醇，加水溶解，通過已活化的D101-11型大孔吸附樹脂8kg的柱子，用去離子水洗脫至無色，再用20%(V/V)乙醇洗脫至無色，繼用60%(V/V)乙醇洗脫至無色，收取60%(V/V)乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮至浸膏(比重1.35)，再用80%乙醇溶解，過濾，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉約96g;將沉淀物與萃取物混合，制成細(xì)顆粒，填充膠囊1000粒，即得。實(shí)施例性狀本品為膠囊劑，內(nèi)容物為棕黃色至淡褐色的粉末。鑒別1、取本品0.lg，加水10ml溶解，取2-3ml，加入等量的菲林試劑(堿性酒石酸銅試劑)置沸水浴中加熱數(shù)分鐘，即產(chǎn)生紅色沉淀。2、另取本品溶液2-3ml，加入a-萘酚試劑3滴，沿壁加入濃硫酸，分層處呈顯紫色環(huán)反應(yīng)。3、取本品1.0g，加甲醇30ml，超聲提取30min，過濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?5ml溶解，用醋酸乙酯20ml提取2次，取醋酸乙酯層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取獼猴桃根5g對(duì)照品，同上方法處理，加甲醇制成每lml，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述溶液各10iU，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:IO)I(TC以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。檢查水分不得過9.0%。崩解時(shí)限不得過30分鐘。微生物限度檢查細(xì)菌數(shù)應(yīng)不得過1000個(gè)/g。霉菌數(shù)應(yīng)不得過100個(gè)/g。大腸桿菌應(yīng)不得檢出。含量測(cè)定對(duì)照品溶液的制備精密稱取105t:干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品適量，加水制成每lml含O.lmg的溶液，即得。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取對(duì)照品溶液0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.Oml，1.2mlml，置10ml具塞試管中，加水至2.Oml，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮0.lg，加80%的硫酸溶液100ml使溶解，搖勻)6ml，搖勻，置水浴中加溫?zé)?5分鐘，取出，放人冰浴中冷卻15分鐘，以相應(yīng)的試劑作空白，照紫外_可見分光光度法(附錄VA)，在625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。供試品溶液的制備取本品粉末約2g，精密稱定，置索氏提取器中，加水90ml，電加熱器加熱回流提取至提取液無色，提取液轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，加入乙醇150ml，搖勻，4t:放置12個(gè)小時(shí)，取出，離心，傾去上清液，，沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法精密量取供試品溶液2ml，置10ml具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自"精密加入硫酸蒽酮溶液6ml"起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中的含葡萄糖的重量(mg)，計(jì)算，即得。本品每粒膠囊內(nèi)容物含獼猴桃多糖以葡萄糖計(jì)，不得少于10mg。功能主治扶正祛邪，清肺抑瘤，活血益氣。用法與用量口服，一次2粒，一日2-3次?；蜃襻t(yī)囑。規(guī)格每粒裝0.3g。40粒/瓶貯藏陰涼處密封保存實(shí)施例51、實(shí)驗(yàn)?zāi)康墨J猴桃膠囊體外抗腫瘤作用研究。2、儀器設(shè)備(1)C02細(xì)胞培養(yǎng)箱，PHA薩SCIENTIFIC(2)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Labsystems，wellscan，MK.2(3)垂直單面雙人超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠(4)倒置生物顯微鏡，37XB/37XBTV，上海光學(xué)儀器六廠3、實(shí)驗(yàn)材料及配制(1)細(xì)胞株NCI-H460(人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞)、K562(人慢性髓原白血病細(xì)胞株)、A549(人肺癌細(xì)胞)、上述細(xì)胞株按實(shí)驗(yàn)規(guī)范凍存和傳代。(2)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO):含10%滅活新生小牛血清(上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司)；L-谷氨酰氨(進(jìn)口分裝，SANG0N);丙酮酸鈉；1X105U.L—1青霉素，lOOmg.L—1鏈霉素；無菌過濾，4t:保存。(3)0.25%胰蛋白酶溶液(Trypsin):購自Invitrogen公司，-2(TC保存。(4)磷酸緩沖液(PBS):NaC18g，KC10.2g，Na2HP04l.15g，KH2P040.2g，溶于1L雙蒸水，121°C高壓消毒20min，4°C保存。(5)MTT(AMRESCO)溶液用PBS配成5mg/ml溶液。(6)溶解液每100ml去離子雙蒸水含SDS10g，異丁醇5ml，濃硫酸0.12ml。(7)樣品獼猴桃膠囊(8)對(duì)照品順鉬4、實(shí)驗(yàn)方法對(duì)上述腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性通過MTT法測(cè)得。具體步驟如下(1)細(xì)胞培養(yǎng)①將細(xì)胞從液氮中取出，在37t:水浴中迅速解凍，細(xì)胞在無菌操作臺(tái)中移入10ml無菌離心管中加6mlRPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。棄去上清液，沉淀中加入5-6mlRPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，滴管吹打使其懸浮后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。②次日，自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞瓶中RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基〔除K562(人慢性髓原白血病細(xì)胞株)懸浮細(xì)胞〕，加入5-6mlRPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，置37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。③隔日，自培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄去細(xì)胞瓶中RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基〔除K562(人慢性髓原白血病細(xì)胞株)，加入PBS(ra7.4)2_3ml晃動(dòng)清洗，倒掉PBS溶液后再重復(fù)一次清洗。在培養(yǎng)瓶中加入3-5滴0.25%胰蛋白酶溶液晃動(dòng)均勻，加蓋置于371:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)3分鐘左右，于顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自培養(yǎng)瓶壁上脫離，加RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基2ml，滴管吹打使細(xì)胞完全脫離瓶壁后，分別移入2個(gè)干凈培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基5-6ml吹打均勻，置于37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。K562(人慢性髓原白血病細(xì)胞株)懸浮細(xì)胞取出l-2ml懸浮液，分別移入2個(gè)干凈培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基5_6ml，置于37t:細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。④隔日，重復(fù)③步驟。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，貼壁細(xì)胞不允許生長(zhǎng)過密，懸浮細(xì)胞始終保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。(2)樣品制備用DMS0溶解后，加入PBS配成1000yg/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用PBS稀釋。對(duì)照品制備用DMS0溶解后，加入PBS配成1000yg/ml的溶液或均勻的混懸液，然后用PBS稀釋為100、10、1、0.liig/ml。(3)將稀釋好的樣品加入平底96孔板中，每孔10iU，每點(diǎn)作兩個(gè)平行測(cè)試。將匿S0相應(yīng)作梯度稀釋后加入板中，作為對(duì)照。(4)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，經(jīng)苔盼藍(lán)染色排除法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液密度至2X105細(xì)胞/ml。(5)在平底96孔板中，每孔加入90微升細(xì)胞，于371:、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(6)將加入細(xì)胞的平底96孔板在37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。(7)每孔中加入20ii15mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫34小時(shí)。(8)每孔加入100ii1溶解液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫過夜，使生成的甲臢晶體充分溶解。測(cè)定492nm光吸收值。(9)根據(jù)光吸收值計(jì)算SM仁；005；處理后細(xì)胞相對(duì)存活率。計(jì)算公式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(10)通過軟件計(jì)算對(duì)各腫瘤細(xì)胞的工C5n05、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1．對(duì)各細(xì)胞株的體外增殖抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例6l獼猴桃膠囊對(duì)小鼠溶血素的影響1．1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察獼猴桃膠囊對(duì)小鼠溶血素的影響。1．2受試藥物藥物名稱獼猴桃膠囊提供單位趙正福1．3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，急性，18—20g，由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)SCXK(滬)2003一o0031．4實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)劑量為o．5g／kg；1．5g／kg1．5陽性藥名稱云芝糖肽膠囊規(guī)格o．34g／粒用法用量一次3粒，一日3次。實(shí)驗(yàn)劑量lg／kg1．6給藥途徑及容量灌胃給藥，o．5ml／20g。1．7實(shí)驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分組，每組lo只。獼猴桃膠囊2個(gè)劑量組，陽性藥組，空白對(duì)照組。分組后第二天開始給藥，連續(xù)一個(gè)月，每星期稱重一次，根據(jù)體重調(diào)正給藥量，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4天將濃度為20％的綿羊紅細(xì)胞懸液，按o．2ml／鼠從腹腔注入。4天后眼球取血，分離離心血清。所得血清按500倍稀釋，取lml稀釋血清加入lo％o．5ml綿羊紅細(xì)胞、再加入lml經(jīng)預(yù)處理的llo豚鼠血清，37℃水浴lo分鐘后置入冰水終止反應(yīng)。2000r／min離心lo分鐘取上清液lml加3ml都氏試劑，放置lo分鐘后在722S分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)處測(cè)定。D值。HQ測(cè)定取10%綿羊紅細(xì)胞0.25ml加3ml都氏試劑，放置10分鐘后測(cè)定0D值。按下列公式計(jì)算每個(gè)樣品的半鼠溶血值(HC5。)。HC5。=(樣品0D值/羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血時(shí)0D值)X稀釋倍數(shù)1.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)表2可知獼猴桃膠囊具有增加小鼠溶血素作用，提高體液免疫。陽性藥也顯示一定的作用。表2獼猴桃膠囊對(duì)小鼠HC5。的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>各組與模型組比較fp<0.05;**P<0.01。2獼猴桃膠囊對(duì)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬功能的影響2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察獼猴桃膠囊對(duì)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬功能的影響。2.2受試藥物藥物名稱獼猴桃膠囊提供單位趙正福2.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，$性，18-20g，由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)SCXK(滬)2003-00032.4實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)劑量為0.5g/kg;1.5g/kg2.5陽性藥名稱云芝糖肽膠囊規(guī)格0.34g/粒用法用量一次3粒，一日3次。實(shí)驗(yàn)劑量lg/kg2.6給藥途徑及容量灌胃給藥，O.5ml/20g。2.7實(shí)驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分組，每組10只。獼猴桃膠囊2個(gè)劑量組，陽性藥、空白對(duì)照各一組。分組后第二天開始給藥，連續(xù)一個(gè)月，每星期稱重一次，根據(jù)體重調(diào)正用藥量。連續(xù)給藥一個(gè)月，在最后一次給藥后一小時(shí)小鼠腹腔內(nèi)注射2%雞紅細(xì)胞(經(jīng)去除纖維蛋白，生理鹽水多次洗滌)0.2ml/只，4小時(shí)后處死小鼠，用生理鹽水沖洗腹腔，收集沖洗液、離心，傾去上清液，收集細(xì)胞涂片，涼干后用瑞氏染色液染色，油鏡下觀察。計(jì)數(shù)100個(gè)巨嗜細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)，按下公式計(jì)算。(1)吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨嗜細(xì)胞數(shù)/100個(gè)巨嗜細(xì)胞數(shù)，(2)吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/100巨嗜細(xì)胞數(shù)。2.8實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可知獼猴桃膠囊具有促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用，表明該藥對(duì)非特異性免疫也有促進(jìn)作用。表3獼猴桃膠囊對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>各組與模型組比較fp<0.05;**P<0.01。3.獼猴桃膠囊對(duì)C57小鼠NK細(xì)胞活性及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響3.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察獼猴桃膠囊對(duì)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞吞噬功能的影響。3.2受試藥物藥物名稱獼猴桃膠囊提供單位趙正福3.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠C57BL/6，$性，18-20g，由上海斯萊克動(dòng)物責(zé)任有限公司提供。合格證號(hào)SCXK(滬)2003-00033.4實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)劑量為0.5g/kg;1.5g/kg3.5陽性藥名稱云芝糖肽膠囊規(guī)格0.34g/粒用法用量一次3粒，一日3次。實(shí)驗(yàn)劑量lg/kg3.6給藥途徑及容量灌胃給藥，O.5ml/20g。3.73H_TdR上海原子核研究所，放射濃度20muci/ml3.8實(shí)驗(yàn)方法小鼠隨機(jī)分組，每組6只。獼猴桃膠囊2個(gè)劑量組，陽性藥、空白對(duì)照各一組。分組后第二天開始給藥，連續(xù)一個(gè)月，每星期稱重一次，根據(jù)體重調(diào)正用藥量。最后一次給藥后1小時(shí)斷頸處死小鼠，無菌取脾，用手術(shù)剪刀將脾臟剪碎、制成懸液，離心去上清液，用1640培養(yǎng)劑調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107ml細(xì)胞，進(jìn)行NK活性測(cè)定及淋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。(1)NK活性測(cè)定在96孔培養(yǎng)板中加入1X107ml濃度脾細(xì)胞100ul作為效應(yīng)細(xì)胞，另取已培養(yǎng)24小時(shí)處于旺盛生長(zhǎng)期的YAC-1、濃度IX10Vml細(xì)胞100ul作為靶細(xì)胞加入培養(yǎng)板中，同時(shí)加3H_TdR0.4uci/孔在37t:、C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞在液閃儀上測(cè)定CPM值，各組設(shè)6復(fù)管，自然摻入組不加脾細(xì)胞。(2)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化測(cè)定在96孔培養(yǎng)板中加入1X107ml濃度脾細(xì)胞100ul，ConA(50ug/ml)50ul，在5XC02、37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，加入20ul3H_TdR培養(yǎng)24小時(shí)，各組設(shè)6復(fù)管，對(duì)照管用培養(yǎng)劑代替，培養(yǎng)結(jié)束后在多孔細(xì)胞收集器上收集細(xì)胞，5%TCA固定，無水乙醇脫水，液閃儀上測(cè)定CPM值。NK活性=(對(duì)照組CPM值-實(shí)驗(yàn)組CPM值)/(對(duì)照組CPM值-自然摻入組CPM值)X100%淋轉(zhuǎn)指數(shù)=實(shí)驗(yàn)組CPM值/對(duì)照組CPM值3.9實(shí)驗(yàn)結(jié)果獼猴桃膠囊對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性具有促進(jìn)作用，表明該藥對(duì)細(xì)胞免疫也有作用。表4獼猴桃膠囊對(duì)小鼠NK活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例7表5獼猴桃膠囊對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表6獼猴桃膠囊對(duì)小鼠S180抑瘤試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法，包括(1)取獼猴桃根粗粉，加6-12倍量去離子水，浸泡10-60分鐘，加熱煮沸，保持沸騰1-3小時(shí)，濾取藥液；第二次煎煮加6-10倍量去離子水，煎煮1-2小時(shí)；第三次煎煮加4-8倍量去離子水，煎煮0.5-1.5小時(shí)；合并三次煎液，靜置過夜，濾取上清液，真空濃縮至相對(duì)密度1.06-1.12；(2)將澄清劑加入到上述水提濃縮液中，邊加入邊攪拌，至無沉淀后靜置12小時(shí)，濾取上清液，加乙醇至藥液含醇量達(dá)15-30％(V/V)，過濾，棄沉淀，濾液再加乙醇至藥液含醇量達(dá)75-85％(V/V)，過濾；(3)沉淀物將上述過濾后的沉淀物抽干，加乙醇洗滌，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉；(4)濾液回收乙醇，至無醇，加水溶解，通過D型大孔吸附樹脂的柱子，先用去離子水洗脫至無色，再用濃度為15％(V/V)乙醇液洗脫至無色，繼用55％(V/V)乙醇液洗脫至無色，收取55％(V/V)乙醇液洗脫液，回收乙醇，流份濃縮至浸膏，比重為1.30-1.35，再用70-80％(V/V)乙醇溶解，過濾，抽干，真空干燥，粉碎成細(xì)粉；(5)制劑將步驟(3)和(4)所制得的細(xì)粉按質(zhì)量比1～3∶1混勻，制成細(xì)顆粒，填充膠囊即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的澄清劑為每100ml醋酸溶液含有O.l-0.8g殼聚糖，該醋酸溶液的濃度為0.5-1.5%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的D型大孔吸附樹脂的用量為步驟(1)中獼猴桃根粗粉重量的O.5-1.5倍。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有防治抗肺癌作用的獼猴桃膠囊的制備方法，包括取獼猴桃根粗粉，進(jìn)行三次煎煮，合并煎液，靜置過夜，濾取上清液，真空濃縮至相對(duì)密度1.06-1.12；加入澄清劑至無沉淀后，濾取上清液，加乙醇攪拌、靜置沉淀，過濾；將上述過濾后的沉淀物經(jīng)抽干、用乙醇洗滌、干燥，粉碎成細(xì)粉；將含醇濾液回收乙醇后，經(jīng)大孔吸附樹脂層析，收集，干燥，粉碎成細(xì)粉；最后將二個(gè)細(xì)粉充分混勻，制成細(xì)顆粒，填充膠囊即得。本發(fā)明的制備方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，將獼猴桃根中的有效成分精制，保留水溶性的多糖和脂溶性的甾萜及苷類；除了生產(chǎn)工藝方面的成熟，還解決了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性保障，獼猴桃膠囊可以用于防治肺癌及消化道腫瘤。文檔編號(hào)A61K125/00GK101791325SQ20101015804公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者張際忠,趙正福,黃曉東申請(qǐng)人:香港曉源藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司