專利名稱：顯微染色鑒別冬春夏草粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥材鑒別領(lǐng)域，具體涉及一種顯微染色鑒別冬春夏草粉的方法
背景技術(shù)：
在我國(guó)傳統(tǒng)的醫(yī)藥中，冬蟲(chóng)夏草一直就是高級(jí)滋補(bǔ)品，藥用地位十分顯著，與人 參、鹿茸并稱為“三大補(bǔ)品”。隨著各相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域的深入研究，近年來(lái)不斷有蟲(chóng)草新的種 類(lèi)、新的分布的報(bào)道，化學(xué)成分不斷被分離、鑒定，而有關(guān)免疫、抗腫瘤等多方面的藥理、藥 效學(xué)研究充分證實(shí)了冬蟲(chóng)夏草的藥效。由于冬蟲(chóng)夏草的特殊生長(zhǎng)環(huán)境、特殊的地理環(huán)境及 重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，使得人們的研究興趣倍加強(qiáng)烈，尤其是對(duì)冬蟲(chóng)夏草及其代用品的研究更 是十分活躍。目前市場(chǎng)流通與銷(xiāo)售的純冬春夏草粉，由于被制成了一定的劑型，很難區(qū)分真?zhèn)危?雖然可以用檢驗(yàn)儀器的手段，證明冬春夏草的若干標(biāo)記物的存在，如蟲(chóng)草素與腺苷的含量， 但這些標(biāo)記物容易買(mǎi)到，而且并不貴，理論上可以用來(lái)作添加劑，所以理化檢驗(yàn)既不能檢出 雜質(zhì)，也不能辨別贗品。由于蟲(chóng)草粉價(jià)格高昂，為了保護(hù)消費(fèi)者的利益，本領(lǐng)域需要建立準(zhǔn) 確鑒定純冬春夏草粉真?zhèn)蔚姆椒ā?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的是市場(chǎng)流通與銷(xiāo)售的純冬春夏草粉難于分真?zhèn)蔚募夹g(shù)問(wèn)題。本 發(fā)明解決該問(wèn)題的技術(shù)方案是提供一種準(zhǔn)確鑒別冬春夏草粉的方法。該方法包括以下步 驟取待檢冬蟲(chóng)夏草粉，染色制成涂片；所述染色為分別進(jìn)行蘇木精-伊紅-碘液染色、番 紅-固綠染色、斯氏染液-碘液染色中的至少一種染色；將制成的涂片于顯微鏡下進(jìn)行顯微觀測(cè)，如每片均能清晰觀察到冬蟲(chóng)夏草的特有 結(jié)構(gòu)，且沒(méi)有碘液染色下的明顯藍(lán)色斑點(diǎn)，并且沒(méi)有觀測(cè)到明顯的植物組織，即可判斷為純 冬蟲(chóng)夏草粉，否則為不純的冬蟲(chóng)夏草粉。其中，本發(fā)明鑒別純冬春夏草粉的方法中所述的冬蟲(chóng)夏草的特有結(jié)構(gòu)為冬蟲(chóng)夏草 的蟲(chóng)體菌絲體、冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體表皮層、冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體肌肉組織、冬蟲(chóng)夏草的子座菌絲體 或冬蟲(chóng)夏草的子座表皮層中的至少4種。其中，本發(fā)明鑒別純冬春夏草粉的方法中所述的冬蟲(chóng)夏草的染色方法為滴加蘇木 染液lOmin染色后水洗5min，然后依次分別用50 %、75%、95 %乙醇梯度洗，然后滴加伊紅 染液染色5min，然后滴加碘液染色5min，然后依次分別用50 %、75 %、95 %、100 %的乙醇梯 度洗滌，后置于二甲苯液中5 lOmin以完成染色。其中，本發(fā)明鑒別純冬春夏草粉的方法中所述的冬蟲(chóng)夏草的染色方法為將涂片用 50%乙醇浸泡后滴加番紅染液25min染色，然后依次分別用50 %、75 %、95 %乙醇梯度洗 滌，然后滴加固綠染色lmin，然后依次分別用95%、95%、100%、100%的乙醇梯度洗滌，后 置于二甲苯與100%乙醇混合液中5 lOmin，再置于純二甲苯液中5 lOmin以完成染色。其中，本發(fā)明鑒別純冬春夏草粉的方法中鑒別冬蟲(chóng)夏草的特有結(jié)構(gòu)時(shí)，可以用同種方式染色的具有冬蟲(chóng)夏草特有結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)切片為標(biāo)準(zhǔn)。還可以用冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體橫切片 和冬蟲(chóng)夏草子座橫切片作為參考標(biāo)準(zhǔn)。以防止檢驗(yàn)人員由于經(jīng)驗(yàn)不足產(chǎn)生誤判。其中，本發(fā)明鑒別純冬春夏草粉的方法中對(duì)每批待檢的純冬春夏草粉物料取樣 4 10份。一股取6份進(jìn)行檢測(cè)，以提高準(zhǔn)確度。對(duì)每批待檢的純冬蟲(chóng)的每張涂片中的每 1張上都要有至少4種特有結(jié)構(gòu)才為真品。具體而言，本發(fā)明方法可采用以下的詳細(xì)實(shí)施過(guò)程取待檢冬蟲(chóng)夏草粉4 10份，一股取6份。將取的樣染色制成涂片；所述染色為 分別進(jìn)行蘇木精_伊紅染色、番紅_固綠染色、斯氏染液染色中的至少一種染色，并進(jìn)行碘 液染色；其中蘇木精-伊紅染色的方法為滴加蘇木染液lOmin染色后水洗5min，然后依 次分別用50%、75%、95%乙醇梯度洗滌，然后滴加伊紅染液染色5!^11，然后滴加碘液染 色5min，然后依次分別用50 %、75 %、95 %、100 %的乙醇梯度洗滌，后置于二甲苯液中5 lOmin以完成染色。其中番紅-固綠染色的方法為將涂片用50%乙醇浸泡后滴加番紅染液25min染 色，然后依次分別用50%、75%、95%乙醇梯度洗滌，然后滴加固綠染色lmin，然后依次分 別用95 %、95%、100%、100%的乙醇梯度洗滌，后置于二甲苯與100%乙醇混合液中5 lOmin，再置于純二甲苯液中5 lOmin以完成染色。然后將制成的涂片于顯微鏡下進(jìn)行顯微觀測(cè)，如每片均能清晰觀察到冬蟲(chóng)夏草的 特有結(jié)構(gòu)，且沒(méi)有碘液染色下的明顯藍(lán)色斑點(diǎn)，并且沒(méi)有觀測(cè)到明顯的植物組織，即可判斷 為純冬蟲(chóng)夏草粉，否則為不純的冬蟲(chóng)夏草粉。所述的冬蟲(chóng)夏草的特有結(jié)構(gòu)為冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng) 體菌絲體、冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體表皮層、冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體肌肉組織、冬蟲(chóng)夏草的子座菌絲體或冬 蟲(chóng)夏草的子座表皮層中的至少4種特有結(jié)構(gòu)都能在顯微鏡下觀測(cè)到。本發(fā)明方法的有益效果在于本發(fā)明主要采用顯微染色鑒別的思路，針對(duì)冬蟲(chóng)夏 草的特殊情況，開(kāi)發(fā)出本發(fā)明方法。本發(fā)明方法通過(guò)對(duì)冬蟲(chóng)夏草微細(xì)結(jié)構(gòu)的染色，經(jīng)過(guò)生物 顯微鏡，在不同的放大倍數(shù)下，能清晰辨認(rèn)細(xì)小的飲片粉末和分辨出不屬于冬春夏草的物 質(zhì)。而且該方法成本低、效率高，不易受各種添加成分的干擾，準(zhǔn)確度非常高，適用于1500 目以內(nèi)的超微粉的鑒別觀察?？梢詥为?dú)使用以鑒別純冬蟲(chóng)夏草超微粉，對(duì)判斷目前市場(chǎng)銷(xiāo) 售的冬蟲(chóng)夏草超微粉及冬蟲(chóng)夏草制劑的可信度及純正度有著十分重要的意義。本發(fā)明方法 可以單獨(dú)使用確判斷珍貴冬蟲(chóng)夏草的真?zhèn)?，也可以結(jié)合其他的冬蟲(chóng)夏草及冬蟲(chóng)夏草超微粉 在通過(guò)鑒別方法，如蟲(chóng)草性狀中形狀、色澤、氣味與滋味、環(huán)紋、蟲(chóng)足的檢測(cè)；感官品質(zhì)要求 的外觀、色澤、氣味與滋味；理化指標(biāo)中對(duì)水分、腺苷、雜質(zhì)、重金屬、微生物的檢測(cè)在判斷珍 貴冬蟲(chóng)夏草的真?zhèn)蔚幕A(chǔ)上確定其質(zhì)量水平，這對(duì)保護(hù)消費(fèi)者的利益有著深遠(yuǎn)的意義，在 本領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。


圖1為冬蟲(chóng)夏草縱切片(40X)圖2為冬蟲(chóng)夏草橫切片。左為冬蟲(chóng)夏草蟲(chóng)體橫切片(40X)，右為冬蟲(chóng)夏草子座橫切 片(40X)。圖3為蟲(chóng)體菌絲體(100X)
圖4為冬蟲(chóng)夏草超微粉_蟲(chóng)體菌絲體(100X)，伊紅染液。圖5為蟲(chóng)體表皮層(100X)，蘇木染液。圖6為冬蟲(chóng)夏草超微粉_蟲(chóng)體表皮層(100X)，伊紅染液。圖7為蟲(chóng)體肌肉組織(100X)，左為蘇木染液；右是伊紅染液。圖8為冬蟲(chóng)夏草超微粉_蟲(chóng)體肌肉組織(100X)，伊紅染液下。圖9為子座菌絲體(100X)，左為蘇木染液下，右是固綠染液下。圖10為冬蟲(chóng)夏草超微粉_子座菌絲體(100X)，伊紅染液下。圖11為子座表皮層(100X)，左為蘇木染液下，右邊是伊紅染液下。圖12為冬蟲(chóng)夏草超微粉_子座表皮層(100X)，伊紅染液下。圖13為碘液染色的淀粉顆粒(100X)圖14為蘇木染液下植物組織_葉(100X)其中圖3、5、7、9、11是指在冬蟲(chóng)夏草整體切片上找到的相應(yīng)典型結(jié)構(gòu)的部分圖 片(即圖1，圖2的局部放大圖)。圖4、6、8、10、12為待測(cè)的冬蟲(chóng)夏草超微粉涂片的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式五、實(shí)驗(yàn)方法及參數(shù)1.實(shí)驗(yàn)樣品冬蟲(chóng)夏草切片、市售極草牌純冬蟲(chóng)夏草超微粉，淀粉超微粉、淀粉超微粉和純冬蟲(chóng) 夏草超微粉的混合物。2.染色劑固綠染液國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；番紅染液國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 伊紅染液沈陽(yáng)新光化工廠；蘇木精染液沈陽(yáng)新光化工廠；斯氏液北京化工廠；碘南京 新化原化學(xué)有限公司，按常規(guī)方法配成染液。3.儀器或其他用具雙筒生物顯微鏡，照相轉(zhuǎn)接設(shè)備，佳能單反相機(jī)。酒精燈，載玻片，蓋玻片，染色架， 香柏油，無(wú)水乙醇，二甲苯，加拿大樹(shù)膠，擦鏡紙，蒸餾水等常規(guī)器材。4.流程固定一透明一涂片(裝片)—染色一封藏一干燥一鏡檢。5.步驟5. 1 固定取攪拌均勻的樣品適量，用蒸餾水浸泡4h，再用FAA(甲醛10%，乙醇50% -75%, 余量為蒸餾水的混合液)固定4-24h。5. 2.透明將固定好的冬蟲(chóng)夏草超微粉經(jīng)過(guò)30 %、50 %、75 %、95 %、100 %的乙醇梯度洗滌 (每個(gè)步驟洗滌3-5分鐘)，置于二甲苯液中10分鐘。5. 3.涂片(裝片)取潔凈的載玻片，取透明后的冬蟲(chóng)夏草超微粉適量，混勻并裝片，不宜過(guò)厚。同法 制成六組。取潔凈的載玻片，取淀粉超微粉適量，用斯氏液混勻并裝片，不宜過(guò)厚。同法制成六組。
5. 4.染色(1)蘇木精-伊紅染色。
將每種樣品六組玻片平放于培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加染液(蘇木染液IOmin —水洗 5min — 50 %、75 %、95 % 乙醇洗一伊紅染液 5min —碘液 5min — 50 % ,75 % ,95 % UOO %, 100%的乙醇洗滌，置于二甲苯液中l(wèi)Omin。)1 2滴于相應(yīng)涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄 膜為宜)。染色約25-30min。染色結(jié)果細(xì)胞核被蘇木精染為蘭色，細(xì)胞漿(細(xì)胞質(zhì))、核仁、肌纖維、膠元纖維、 紅細(xì)胞等被伊紅染成程度不同的鮮紅色。漿細(xì)胞的分泌顆粒由于它能同時(shí)被蘇木精和伊紅 染色故顯深紫色。如有淀粉顆粒則染成藍(lán)色顆粒。所用伊紅將能將上皮細(xì)胞、肌肉纖維和細(xì)胞漿染 為紅色。(2)、番紅-固綠染液染色將每種樣品六組玻片平放于培養(yǎng)皿內(nèi)，用(50%乙醇浸泡一番紅染液25min—用 50%、75%、95%乙醇洗一固綠Imin — 95%、95%、100%、100%的乙醇洗滌，置于二甲苯與 100%乙醇混合液中5-lOmin，置于純二甲苯液中5-lOmin。)1 2滴于相應(yīng)涂片上(染液 剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。染色約25-30min。固綠是酸性染料，能溶于水(溶解度為4% )和酒精(溶解度為9% )。固綠是一 種染含有漿質(zhì)的纖維素細(xì)胞組織的染色劑，在染細(xì)胞和植物組織上應(yīng)用極廣，和蘇木精、番 紅并列為植物組織學(xué)上三中最常用的染料。番紅可溶解于水和乙醇，通常配成水溶液染 植物的木質(zhì)部，也可以按照以下配方配成苯胺番紅液對(duì)組織進(jìn)行塊染番紅5g，95%乙醇 50mL,苯胺油20mL，蒸餾水450mL。番紅能夠?qū)χ参锏哪举|(zhì)化、栓質(zhì)化和膠質(zhì)化部分進(jìn)行染 色，染色后的部分為紅色。染色時(shí)間一股為2 24hrs，常與固綠等進(jìn)行合作染色。(3)斯氏染液_碘液染色將斯氏液混勻的樣品六組玻片平放于培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加碘液5min — 50%、75%、 95%、100%、100%的乙醇洗滌，置于二甲苯與100%乙醇混合液中5 lOmin，置于二甲苯 液中5 lOmin。5. 5 封藏從二甲苯溶液中取出載玻片，在有粉末的位置處滴加1-2滴加拿大樹(shù)膠溶液，力口 蓋玻片封藏。5. 6 干燥將封藏好的載玻片，自然干燥、電吹風(fēng)吹干或用恒溫烤箱40°C _50°C烘干(溫度不 能太高)。5. 7 鏡檢玻片干后鏡檢。用雙目生物顯微鏡或數(shù)碼生物顯微鏡在不同倍數(shù)下觀察每種樣品 的結(jié)構(gòu)(鑒定真假冬蟲(chóng)夏草)。如用油鏡觀察，則玻片必須完全干燥。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)論使用本發(fā)明方法的上述染色步驟，可以看到真的純冬蟲(chóng)夏草粉中有無(wú)混加一些其 他物質(zhì)比如淀粉、植物組織；未被真菌感染的蟲(chóng)體；市售的人工培育的菌絲體等。
在進(jìn)行是否純冬蟲(chóng)夏草超微粉的判斷時(shí)，如檢測(cè)人員經(jīng)驗(yàn)不足，無(wú)法直接判斷，則 可以用冬蟲(chóng)夏草組織的切片或純冬蟲(chóng)夏草超微粉制作的涂片為參照判斷的標(biāo)準(zhǔn)。冬蟲(chóng)夏草組織的切片，通過(guò)4X、10X、40X倍物鏡下觀察，可見(jiàn)相應(yīng)染色劑顏色的斑 點(diǎn)。通過(guò)100X油鏡下觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)，除碘液染色片外，對(duì)于其余染色液，尤其經(jīng)過(guò)伊紅染 液、蘇木精染液及固綠染液，在冬春夏草標(biāo)準(zhǔn)切片中，清晰可見(jiàn)蟲(chóng)體菌絲體(見(jiàn)圖3)，蟲(chóng)體 表皮層(見(jiàn)圖5)，蟲(chóng)體肌肉組織(見(jiàn)圖7)，子座菌絲體(見(jiàn)圖9)，子座表皮層(見(jiàn)圖11)等 結(jié)構(gòu)的片段，未發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的物質(zhì)。本實(shí)施例中，待測(cè)的純冬蟲(chóng)夏草超微粉能檢出以下五個(gè)結(jié)構(gòu)中的任意四個(gè)就可以 判斷為真冬蟲(chóng)夏草粉蟲(chóng)體菌絲體(見(jiàn)圖3)；蟲(chóng)體表皮層(見(jiàn)圖5)；蟲(chóng)體肌肉組織(見(jiàn)圖7)；子座菌絲 體(見(jiàn)圖9)；子座表皮層(見(jiàn)圖11)。由于檢測(cè)物質(zhì)為1500目以下冬蟲(chóng)夏草超微粉末，所 以在100X物鏡下觀察。檢測(cè)結(jié)果表明市售的極草牌純冬春夏草超微粉涂片中，均清晰可見(jiàn)蟲(chóng)體菌絲體 (見(jiàn)圖4)，蟲(chóng)體表皮層(見(jiàn)圖6)，蟲(chóng)體肌肉組織(見(jiàn)圖8)，子座菌絲體(見(jiàn)圖10)，子座表皮 層(見(jiàn)圖12)等結(jié)構(gòu)的片段，與自制的冬蟲(chóng)夏草切片和純冬春夏草超微粉涂片對(duì)照，各結(jié)構(gòu) 均為冬蟲(chóng)夏草的特有結(jié)構(gòu)。對(duì)比冬春夏草縱切片圖1、橫切片圖2，未發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的物質(zhì)。 且沒(méi)有觀測(cè)到?jīng)]有明顯的植物組織和明顯的淀粉顆粒，因此可判定為該批次極草牌冬蟲(chóng)夏 草超微粉為純冬蟲(chóng)夏草超微粉。而添加有淀粉的冬蟲(chóng)夏草粉，由于能檢測(cè)出代表淀粉的藍(lán) 色顆粒，直接就可判定為不純的冬蟲(chóng)夏草粉。
權(quán)利要求
鑒別純冬春夏草粉的方法，其特征在于包括以下步驟取待檢冬蟲(chóng)夏草粉，分別染色制成涂片；所述染色為分別進(jìn)行蘇木精-伊紅-碘液染色、番紅-固綠染色、斯氏染液-碘液染色中的至少一種染色；將制成的涂片于顯微鏡下進(jìn)行顯微觀測(cè)，如每片均能清晰觀察到冬蟲(chóng)夏草的特有結(jié)構(gòu)，且沒(méi)有觀測(cè)到明顯的植物組織或沒(méi)有碘液染色下的明顯藍(lán)色斑點(diǎn)，即可判斷為純冬蟲(chóng)夏草粉，否則為不純的冬蟲(chóng)夏草粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別純冬春夏草粉的方法，其特征在于所述的冬蟲(chóng)夏草的 特有結(jié)構(gòu)為冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體菌絲體、冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體表皮層、冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體肌肉組織、冬 蟲(chóng)夏草的子座菌絲體或冬蟲(chóng)夏草的子座表皮層中的至少4種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別純冬春夏草粉的方法，其特征在于所述的冬蟲(chóng)夏草的 染色方法為滴加蘇木染液lOmin染色后水洗5min，然后依次分別用50%、75%、95%乙醇梯 度洗，然后滴加伊紅染液染色5min，然后滴加碘液染色5min然后依次分別用50 %、75 %、 95%、100%的乙醇梯度洗滌，后置于二甲苯液中5 lOmin以完成染色。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別純冬春夏草粉的方法，其特征在于所述的冬蟲(chóng)夏草的 染色方法為將涂片用50%乙醇浸泡后滴加番紅染液25min染色，然后依次分別用50%、 75%、95%乙醇梯度洗滌，然后滴加固綠染色lmin，然后依次分別用95 %、95 %、100 %、 100%的乙醇梯度洗滌，后置于二甲苯與100%乙醇混合液中5 lOmin，再置于純二甲苯液 中5 lOmin以完成染色。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別純冬蟲(chóng)夏草粉的方法，其特征在于鑒別冬蟲(chóng)夏草的特 有結(jié)構(gòu)時(shí)，以用同種方式染色的具有冬蟲(chóng)夏草特有結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)切片為參考標(biāo)準(zhǔn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒別純冬蟲(chóng)夏草粉的方法，其特征在于對(duì)每批待檢的純冬 蟲(chóng)夏草粉物料取樣6份以上分別制成涂片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鑒別純冬蟲(chóng)夏草粉的方法，其特征在于對(duì)每批待檢的純冬 蟲(chóng)6張涂片中的每1張上都要有至少4種特有結(jié)構(gòu)才為真品。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥材鑒別領(lǐng)域，具體涉及一種顯微染色鑒別冬春夏草粉的方法。本發(fā)明要解決的是市場(chǎng)流通與銷(xiāo)售的純冬春夏草粉難于分真?zhèn)蔚募夹g(shù)問(wèn)題。本發(fā)明解決該問(wèn)題的技術(shù)方案是提供一種準(zhǔn)確鑒別冬春夏草粉的方法。該方法包括以下步驟取待檢冬蟲(chóng)夏草粉，染色制成涂片；將制成的涂片于顯微鏡下進(jìn)行顯微觀測(cè)，如每片均能清晰觀察到冬蟲(chóng)夏草的特有結(jié)構(gòu)，且沒(méi)有碘液染色下的明顯藍(lán)色斑點(diǎn)，并且沒(méi)有觀測(cè)到明顯的植物組織，即可判斷為純冬蟲(chóng)夏草粉，否則為不純的冬蟲(chóng)夏草粉。本發(fā)明方法能清晰辨認(rèn)細(xì)小的飲片粉末和分辨出不屬于冬春夏草的物質(zhì)，成本低、效率高，不易受各種添加成分的干擾，準(zhǔn)確度非常高，在本領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P37/02GK101804082SQ20101015188
公開(kāi)日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2010年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者張雪峰, 徐麗 申請(qǐng)人:張雪峰