專利名稱：1千億活芽胞每克多粘芽胞桿菌原粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及污染水體凈化、垃圾除臭等領(lǐng)域，更具體涉及一種多粘芽胞桿菌原粉 (1，000億活芽胞/克)的制備方法，將在飼料工業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面上得到廣泛應(yīng)用。隨著 芽胞桿菌功能還在不斷地被發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用范圍也在不斷擴大，在國內(nèi)國際市場上有很強的競爭力。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)50年代以來，抗生素作為疾病治療劑和動物生長促進(jìn)劑發(fā)揮了重大作 用。然而，由于抗生素負(fù)面效果越來越嚴(yán)重，世界衛(wèi)生組織已禁止在飼料中使用任何抗菌藥 物，一些發(fā)達(dá)國家對獸用抗生素的使用也有明確規(guī)定。飼料和養(yǎng)殖業(yè)以添加抗生素預(yù)防和 促進(jìn)動物生長的飼養(yǎng)方式已經(jīng)受到了很大沖擊，抗生素替代品的使用和推廣成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā) 展的必然方向。芽胞桿菌益生菌具備抗生素預(yù)防疾病和促進(jìn)生長的特點，成為抗生素的替 代品，將取得理想的應(yīng)用效果，在養(yǎng)殖業(yè)中具有很大的開發(fā)潛力。益生菌又稱微生態(tài)制劑，是指有益微生物經(jīng)過特殊馴化和加工制成的活菌制劑， 益生菌可以改善動物腸道中微生物的菌群平衡，防治某些細(xì)菌性疾病的發(fā)生，能提高動物 的飼料利用率、提高機體免疫力，促進(jìn)生長和改善生產(chǎn)性能，得到安全無藥物殘留的動物產(chǎn) 品?，F(xiàn)已開發(fā)成商品制劑的益生菌有芽胞桿菌類、酵母、乳酸菌、雙歧桿菌、鏈球菌、曲霉寸。目前，國內(nèi)芽胞桿菌益生菌制品的生成工藝主要有兩種，即固體發(fā)酵法和液體深 層發(fā)酵法。固體發(fā)酵法是把益生菌接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其優(yōu)點是相對管理 比較粗放，具有生產(chǎn)工藝簡單，投資少的特點，但同時具易受雜菌污染，菌體含量不易控制、 產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的缺點。目前我國大多數(shù)芽胞桿菌益生菌產(chǎn)品都是采用該生產(chǎn)方法。液體 深層發(fā)酵法是采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，將益生菌菌種接種到反應(yīng)器中進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)，對整個發(fā) 酵過程都可以進(jìn)行精細(xì)的過程控制，具有便于無菌操作，容易控制菌體含量，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 的特點，但技術(shù)水平要求較高，相對固體發(fā)酵投資要高，但更適合工業(yè)化生產(chǎn)。其一般工藝 流程為菌種接種培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)一排放培養(yǎng)液一收集菌體一加入適 量載體和保護(hù)劑一干燥一粉碎一過篩一稀釋混和一成品包裝一質(zhì)檢一益生菌產(chǎn)品。國內(nèi)通常采用的固體發(fā)酵方式生產(chǎn)的多粘芽胞桿菌制劑一般不形成芽胞。采用本 工藝生產(chǎn)的多粘芽胞桿菌原粉(原藥)具有生產(chǎn)清潔安全、回收率高、產(chǎn)品芽孢數(shù)穩(wěn)定、產(chǎn) 品活芽胞數(shù)達(dá)1，000億活芽胞每克等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種1千億活芽胞每克多粘芽胞桿菌原粉的制備方 法，本發(fā)明方法易行，操作簡便，安全、高效優(yōu)質(zhì)，由該工藝生產(chǎn)的多粘芽胞桿菌原粉(原 藥)中的活芽胞數(shù)達(dá)1，000億活芽胞每克。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施
多粘芽胞桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化及液體高密度補料發(fā)酵技術(shù)；高效的芽胞提取回收工 藝，產(chǎn)品活芽胞數(shù)高。一種多粘芽胞桿菌原粉的制備方法，其步驟是1.高產(chǎn)CGMCC 1. 224的培養(yǎng)基優(yōu)化采用Box-B ehken設(shè)計的響應(yīng)面實驗，首先從眾多因子中選擇重要的部分因子 篩選設(shè)計，利用合理的試驗設(shè)計，考慮碳源、氮源、無機離子等多個因素之間的協(xié)同作用， 用于尋找臨近最大值的優(yōu)化區(qū)域的最陡坡試驗(Path of Ste印estascent)，和用于優(yōu)化 響應(yīng)面最大值的中心組合設(shè)計(Central Composite Design)來擬合因素與響應(yīng)值之間 的函數(shù)關(guān)系得到回歸方程，通過對回歸方程的分析，設(shè)計優(yōu)化B-53發(fā)酵培養(yǎng)基(大米粉 25. 31g/L，葡萄糖17. 75g/L，酵母粉26. 55g/L，豆粕5. 91g/L，花生粕6. 21g/L，磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 1. 75g/L，氯化錳(MnCl2) 0. 09g/L，硫酸鎂(MgSO4) 0. 05g/L)。2.液體深層高密度補料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基B-53進(jìn)行分批發(fā)酵動力學(xué) 研究，以發(fā)酵前期，對數(shù)期，穩(wěn)定期0D、溶氧、pH、芽胞數(shù)為指標(biāo)，確定各時期遲緩期、對數(shù)生 長期和穩(wěn)定期最佳營養(yǎng)平衡(以C/N表示)，及與芽胞形成關(guān)系。在分批發(fā)酵研究基礎(chǔ)上， 優(yōu)化高密度補料發(fā)酵工藝，在分批發(fā)酵配方上進(jìn)行碳源和氮源濃度加倍，采用糖濃度15g/ ml，通過補加葡萄糖，使發(fā)酵過程還原糖濃度為0. 5-1. 0% (質(zhì)量比)，發(fā)酵過程共用葡萄糖 5% (質(zhì)量比)；，發(fā)酵過程補加氨水，使pH控制在6. 8-7. 2范圍，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達(dá)25億 /ml ；3.特殊、高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收發(fā)酵罐堿化，4N氫氧化鈉，調(diào)pHIO，升溫50_55°C，加3.5%。(質(zhì) 量比)硫酸鋅，攪拌3-8分鐘，再加2. 5%0 (質(zhì)量比)黃血鹽，攪拌1-2分鐘，靜置15-30分 鐘，離心去上清，菌漿加3倍體積的水水洗后二次離心，得到菌漿進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥 進(jìn)口風(fēng)溫200-201°C，出口風(fēng)溫85-87°C，原粉活芽胞數(shù)達(dá)1，000億/克。發(fā)明的目的在于對篩選的生長迅速、生物量高、產(chǎn)芽胞同步率高的多粘芽胞桿 菌菌株，采用培養(yǎng)基的優(yōu)化和高密度發(fā)酵工藝、高效芽胞回收工藝，生產(chǎn)出活芽胞數(shù)達(dá)到 1，000億/克的多粘芽胞桿菌安全原藥(原粉)，而國內(nèi)通常采用的固體發(fā)酵方式生產(chǎn)的多 粘芽胞桿菌制劑一般不形成芽胞。一種多粘芽胞桿菌(Bacillus polymyxa),CGMCC 1.224， (該菌種由武漢科諾公司購自中國普通微生物菌種保藏管理中心)。一種1千億活芽胞每克多粘芽胞桿菌原粉的制備方法，其步驟是1.高產(chǎn)CGMCC 1. 224的培養(yǎng)基優(yōu)化采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗，首先從眾多因子中選擇重要的部分因子篩 選設(shè)計，利用合理的試驗設(shè)計，考慮碳源、氮源、無機離子等多個因素之間的協(xié)同作用，用于 尋找臨近最大值的優(yōu)化區(qū)域的最陡坡試驗(Path of Ste印estascent)，和用于優(yōu)化響應(yīng)面 最大值的中心組合設(shè)計(Central Composite Design)。來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān) 系，通過對回歸方程的分析，設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基B-53 大米粉25. 31g/L，葡萄糖17. 75g/ L,酵母粉26. 55g/L，豆粕5. 91g/L，花生粕6. 21g/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1. 75g/L，氯化錳 (MnCl2) 0. 09g/L，硫酸鎂(MgSO4)O. 05g/L。2.液體深層高密度補料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量
采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵動力學(xué)研 究，以發(fā)酵前期，對數(shù)期，穩(wěn)定期0D、溶氧、pH、芽胞數(shù)為指標(biāo)，確定各時期遲緩期、對數(shù)生長 期和穩(wěn)定期最佳營養(yǎng)平衡(以C/N表示)，及與芽胞形成關(guān)系。在分批發(fā)酵研究基礎(chǔ)上，優(yōu) 化高密度補料發(fā)酵工藝。3.特殊、高效的芽胞提取與回收工藝
芽胞提取與回收發(fā)酵罐堿化，4N氫氧化鈉，調(diào)pHIO，升溫50_55°C，加3. 5%。(質(zhì) 量比)硫酸鋅，攪拌3-8分鐘，再加2. 5%0 (質(zhì)量比)黃血鹽，攪拌1-2分鐘，靜置15-30分 鐘，離心去上清，菌漿加3倍體積的水水洗后二次離心，得到菌漿進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥 進(jìn)口風(fēng)溫200-201°C，出口風(fēng)溫85-87°C，多粘芽胞桿菌原粉活芽胞數(shù)達(dá)1，000億/克。國內(nèi)通常采用的固體發(fā)酵方式生產(chǎn)的多粘芽胞桿菌制劑一般不形成芽胞，采用本 發(fā)明，多粘芽胞桿菌原粉活芽胞數(shù)可以達(dá)1，000億/克。該工藝安全、高效優(yōu)質(zhì)，方法易行， 由該工藝生產(chǎn)的多粘芽胞桿菌原藥中的活芽胞數(shù)達(dá)1，000億活芽胞每克；水份彡7%, PH 6.0-8.0，細(xì)度(150 μ m)彡95%，噬菌體含量彡40個/10，000活芽胞。
具體實施例方式一種1千億活芽胞每克多粘芽胞桿菌原粉的制備方法，其步驟是1.高產(chǎn)CGMCC 1. 224的培養(yǎng)基優(yōu)化采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗，以芽胞數(shù)(cfu)為篩選指標(biāo)，利用單因子實 驗首先從10個碳源(玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊 精、玉米粉，)；13個氮源(水解植物復(fù)合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉 米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨，)；9個微量元素氯化鈷 (CoCl2)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鎂(MgSO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、硫酸亞鐵 (FeSO4)、氯化錳(MnCl2)、硫酸銅(CuSO4)、硫酸鋅(ZnSO4)因子中選擇重要的部分因子篩選 設(shè)計，利用合理的試驗設(shè)計，考慮重要碳源(大米粉和葡萄糖)、氮源(酵母粉、豆粕和花生 粕)及無機離子(磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化錳(MnCl2)和硫酸鎂(MgSO4))等多個因素之間 的協(xié)同作用，用于尋找臨近最大值的優(yōu)化區(qū)域的最陡坡試驗(Path of Steepest ascent) 和用于優(yōu)化響應(yīng)面最大值的中心組合設(shè)計(Central Composite Design)來擬合因素與響 應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系得到回歸方程，通過對回歸方程的分析來設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)基B-53，芽胞 數(shù)為20億cfu/ml。(1)、碳源因子通過單因子實驗，從玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露 醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中篩選出大米粉和葡萄糖為CGMCC 1. 224最佳碳源需 求因子。(2)、氮源因子通過單因子實驗，從水解植物復(fù)合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、 蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨中篩選 出酵母粉、豆粕和花生粕為CGMCC 1. 224最佳氮源需求因子。(3)、微量元素因子通過單因子實驗，從氯化鈷(CoCl2)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鎂 (MgSO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、硫酸亞鐵(FeSO4)、氯化錳(MnCl2)、硫酸銅 (CuSO4)、硫酸鋅(ZnSO4)中篩選出磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化錳(MnCl2)和硫酸鎂(MgSO4) 為CGMCC 1. 224最佳微量元素需求因子。
(4)、利用 PB 實驗設(shè)計(Plackett-Burman Design)篩選影響 CGMCC 1. 224 芽胞形 成的重要因子，試驗表明大米粉、葡萄糖和酵母粉對CGMCC 1.224芽胞形成有極顯著的影 響，因此增加它們的用量對促進(jìn)CGMCC 1.224芽胞形成具有積極的意義。通過最陡坡試驗 (Path of Steepest ascent)最終確定大米粉用量為25. 31g/L，葡萄糖用量為17. 75g/L， 酵母粉用量為26. 55g/L時CGMCC 1. 224芽胞數(shù)達(dá)到17億。利用本公司從SAS公司購買的 SAS統(tǒng)計軟件設(shè)計中心組合實驗(Central Composite Design)，最終得到CGMCC 1. 224發(fā) 酵最佳配方B-53 大米粉25. 31g/L，葡萄糖17. 75g/L，酵母粉26. 55g/L，豆粕5. 91g/L，花 生粕 6. 21g/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1. 75g/L，氯化錳(MnCl2)O. 09g/L，硫酸鎂(MgSO4)O. 05g/ L，采用該配方，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達(dá)20億/ml。2.高密度液體補料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量以響應(yīng)面法優(yōu)化的培養(yǎng)基配方 B-53進(jìn)行分批發(fā)酵動力學(xué)研究，以發(fā)酵前期，對數(shù)期，穩(wěn)定期0D、溶氧、pH、芽胞數(shù)為指標(biāo)， 確定各時期最佳營養(yǎng)平衡(以C/N表示)，及與芽胞數(shù)關(guān)系。在分批發(fā)酵配方上進(jìn)行碳源 和氮源濃度加倍，分析出現(xiàn)反饋抑制因素及濃度，進(jìn)行分批補料發(fā)酵動力學(xué)研究，確定補料 工藝為采用初始糖濃度15g/mL，通過補加葡萄糖，使發(fā)酵過程還原糖濃度保持0. 5-1.0% (質(zhì)量比)水平，發(fā)酵工程共用葡萄糖5% (質(zhì)量比)；發(fā)酵過程補加氨水，使pH控制在 6. 8-7. 2范圍；發(fā)酵過程通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制溶氧水平不低于臨界氧(3ppm)。較分批發(fā)酵相 比，雖然菌數(shù)和總耗量明顯增加，但采用補料工藝，不僅沒有出現(xiàn)底物反饋抑制，也沒有因 對數(shù)期溶解氧不能維持在臨界氧之上而影響芽胞的形成。采用此工藝，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達(dá) 25 億 /ml。
3.高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收發(fā)酵罐堿化，4N氫氧化鈉，調(diào)pHIO，升溫50_55°C，加3. 5%。(質(zhì) 量比)硫酸鋅，攪拌3-8分鐘，再加2. 5%0 (質(zhì)量比)黃血鹽，攪拌1-2分鐘，靜置15-30分 鐘，離心去上清，菌漿加3倍體積的水水洗后二次離心，得到菌漿進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥 進(jìn)口風(fēng)溫200-201°C，出口風(fēng)溫85-87°C，原粉活芽胞數(shù)達(dá)1，000億/克。
權(quán)利要求
1千億活芽胞每克多粘芽胞桿菌原粉的制備方法，其步驟是A.CGMCC 1.224的培養(yǎng)基配方篩選采用Box-Behken發(fā)明的響應(yīng)面方法設(shè)計實驗，以芽胞數(shù)為篩選指標(biāo)，利用單因子實驗首先從碳源、氮源、微量元素因子中選擇因子篩選設(shè)計，采用多元一次和二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系得到回歸方程，通過回歸方程設(shè)計培養(yǎng)基B-53，發(fā)酵液芽胞數(shù)為20億cfu/ml；(1)、碳源因子通過單因子實驗，從玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中篩選出大米粉和葡萄糖為CGMCC 1.224碳源需求因子；(2)、氮源因子通過單因子實驗，從水解植物復(fù)合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨中篩選出酵母粉、豆粕和花生粕為CGMCC 1.224氮源需求因子；(3)、微量元素因子微量元素因子通過單因子實驗，從氯化鈷、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸亞鐵、氯化錳、硫酸銅、硫酸鋅中篩選出磷酸二氫鉀、氯化錳和硫酸鎂為CGMCC 1.224微量元素需求因子；(4)、利用PB實驗設(shè)計篩選影響CGMCC 1.224芽胞形成的因子，試驗表明大米粉、葡萄糖和酵母粉對促進(jìn)CGMCC 1.224芽胞的形成，通過最陡坡試驗確定大米粉用量為25.31g/L，葡萄糖用量為17.75g/L，酵母粉用量為26.55g/L，通過SAS統(tǒng)計軟件設(shè)計中心組合實驗，最終得到CGMCC 1.224發(fā)酵配方B-53，芽胞數(shù)達(dá)到20億大米粉25.31g/L，葡萄糖17.75g/L，酵母粉26.55g/L，豆粕5.91g/L，花生粕6.21g/L，磷酸二氫鉀1.75g/L，氯化錳0.09g/L，硫酸鎂0.05g/L；B.提高發(fā)酵生物量采用CGMCC 1.224發(fā)酵配方B-53進(jìn)行分批發(fā)酵，以發(fā)酵前期，對數(shù)期，穩(wěn)定期OD、溶氧、pH值、芽胞數(shù)為指標(biāo)，確定營養(yǎng)平衡，及與芽胞數(shù)關(guān)系，在分批發(fā)酵配方上進(jìn)行碳源和氮源濃度加倍，采用糖濃度15g/ml，通過補加葡萄糖，使發(fā)酵過程還原糖濃度為0.5-1.0％質(zhì)量比，發(fā)酵過程共用葡萄糖5％質(zhì)量比；，發(fā)酵過程補加氨水，使pH控制在6.8-7.2范圍，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達(dá)25億/mlC.芽胞提取與回收發(fā)酵罐堿化，4N氫氧化鈉，調(diào)pH10，升溫50-55℃，加3.5‰質(zhì)量比硫酸鋅，攪拌3-8分鐘，再加2.5‰質(zhì)量比黃血鹽，攪拌1-2分鐘，靜置15-30分鐘，離心去上清，菌漿加3倍體積的水水洗后二次離心，得到菌漿進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥進(jìn)口風(fēng)溫200-201℃，出口風(fēng)溫85-87℃，多粘芽胞桿菌原藥活芽胞數(shù)達(dá)1,000億/克。
全文摘要
本發(fā)明公開了1千億活芽胞每克多粘芽胞桿菌原粉的制備方法，其步驟A.篩選菌種CGMCC 1.224的發(fā)酵培養(yǎng)基，采用Box-Behken發(fā)明的響應(yīng)面方法設(shè)計實驗，以芽胞數(shù)為篩選指標(biāo)，得到一個有利于提高芽胞數(shù)的培養(yǎng)基配方；B.提高發(fā)酵生物量，通過響應(yīng)面法篩選的培養(yǎng)基配方進(jìn)行分批發(fā)酵，確定有利于產(chǎn)芽胞的最優(yōu)發(fā)酵工藝，并通過分批補料發(fā)酵進(jìn)一步提高芽胞數(shù)；C.芽胞提取與回收。由該工藝生產(chǎn)的多粘芽胞桿菌原藥具有生產(chǎn)清潔安全、回收率高、產(chǎn)品芽孢數(shù)穩(wěn)定、產(chǎn)品活芽胞數(shù)達(dá)1,000億活芽胞每克等優(yōu)點。
文檔編號A61P31/04GK101869181SQ201010147899
公開日2010年10月27日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者余娜, 劉華梅, 劉荷梅, 李坤, 李青, 楊克華, 王巧梅, 程治國, 謝攀, 謝翔, 陳又香, 陳振民, 黃志遠(yuǎn) 申請人:武漢科諾生物科技股份有限公司