專利名稱：一種增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種增加⑶4+⑶25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞(Tregs)的血吸蟲來源的抗原分子-日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa (Schistosoma japonicum heatshock protein 60KDa, SjHSP60)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
上個(gè)世紀(jì)九十年代前后，西方發(fā)達(dá)國家提出來“衛(wèi)生假說”，認(rèn)為在衛(wèi)生環(huán)境大大 改善的發(fā)達(dá)國家，一些過敏性疾病和自身免疫病的發(fā)病率大為增加，這是與發(fā)達(dá)國家衛(wèi)生 條件改善，人群發(fā)生病原體感染的機(jī)會(huì)減少有關(guān)(Wills-Karp，et al, Nat Rev Immunol, 2001,1 69-75)。其后的若干年，科學(xué)家們通過一些過敏性疾病和自身免疫病的動(dòng)物模型研 究證明，一些病原體的慢性感染確實(shí)可以預(yù)防這些免疫性疾病的發(fā)生或者減輕免疫病理損 傷(Dunne，Nat Rev Immunol, 2005, 5 420-426)如曼氏血吸蟲感染可以預(yù)防或減輕I型糖 尿病，實(shí)驗(yàn)性腦炎，甲狀腺炎；絳蟲感染會(huì)減少實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的發(fā)病；鏈球菌感染可以抑制 膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，等等。從進(jìn)化史的角度看，慢性感染是病原體和宿主在長期 共同進(jìn)化彼此選擇后，最終所形成的對(duì)雙方都有利的一種平衡狀態(tài)。在這種狀態(tài)下，病原體 不會(huì)被宿主完全清除，可長期存在于宿主；宿主既可維持對(duì)病原體有一定抵抗力，也不會(huì)因 為過強(qiáng)的免疫反應(yīng)而產(chǎn)生免疫病理損傷，而且還預(yù)防了自身免疫病的發(fā)生。隨著免疫學(xué)的發(fā)展，在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了一群天然存在的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞(Tregs) (Sakaguchi，et al.，J Immunol, 1995,155 :1151-64)，這群細(xì)胞主要由胸腺產(chǎn) 生，參與維持外周自身免疫耐受和免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；后來進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，一些病原體的感染 (病毒，細(xì)菌，寄生蟲)也可以在外周從⑶4+T細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生⑶4+⑶25+Tregs (Bluestone and Abbas, Nat Rev Immunol，2003，3 :253_7)。如丙型肝炎病毒(HCV)感染人體后，可以 誘導(dǎo)特異性的 CD4+CD25+Tregs (Bolacchi，et al.，Clin Exp Immunol, 2006,144 188-96)； 小鼠百日咳桿菌感染模型中研究發(fā)現(xiàn)，⑶4+⑶25+Tregs發(fā)生增多(McGuirk，et al.，J Exp Med, 2002,195 :221_31)；寄生蟲類感染中，曼氏血吸蟲感染后4周，發(fā)現(xiàn)腸系膜淋巴結(jié)中 ⑶4+⑶25+Tregs發(fā)生了擴(kuò)增，然后聚集到肝臟和脾臟中發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)(Wilson et al,. unpublished observaton)。進(jìn)一步探究導(dǎo)致慢性感染的病原體是如何誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞，從而抑制免疫攻擊，對(duì)于提高宿主抗感染力和治療免疫病意義都非常重大。寄生蟲中 的蠕蟲類，是一類具有復(fù)雜生物學(xué)功能的多細(xì)胞真核生物，能夠很好的逃避宿主免疫攻擊， 長期存在于宿主機(jī)體中(Maizels，et al.，J ExpMed，2009，206 :2059_66)。蠕蟲類中血 吸蟲感染是一種非常典型的慢性感染，在其感染模型中研究發(fā)現(xiàn)，其蟲卵抗原是刺激誘導(dǎo) CD4+CD25+Tregs 產(chǎn)生的關(guān)鍵因素(Baumgart，et al.，JImmunol，2006，176 :5374_87)；此外， 本課題組也已發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲蟲卵抗原也可以刺激誘導(dǎo)⑶4+CD25+Tregs從而減輕哮喘所 導(dǎo)致的氣道炎癥反應(yīng)(Yang, et al.，Immunology, 2006,120 :8_18)。關(guān)于特異性抗原在外周誘導(dǎo)免疫負(fù)調(diào)控的研究，在自身免疫研究領(lǐng)域已有一些報(bào) 道，有些自身抗原的自身反應(yīng)性在逃避了胸腺中樞的陰性選擇后，它們還可以在外周誘導(dǎo)自身反應(yīng)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而參與免疫調(diào)控。這些自身抗原包括一些組織抗原(谷氨酸 脫羧酶GAD，少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白M0G，肌球蛋白等)；免疫調(diào)控分子(泛素，白介素，肌動(dòng)蛋白 等)；應(yīng)激蛋白(HSP40, HSP60, HSP70) (Merb 1, et al.，J Clin Invest，2007，117 :712_8)。 實(shí)際上，免疫系統(tǒng)天然就存在這些抗原的抗體或反應(yīng)性T細(xì)胞，或其特定的受體(配體)， 它們會(huì)時(shí)刻監(jiān)視著機(jī)體免疫系統(tǒng)，維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(Cohen，Nat Rev Immunol, 2007, 7 569-74)。早些年就有研究發(fā)現(xiàn)，人自身HSP60或其多肽可預(yù)防或減輕I型糖尿病(Elias and Cohen, Diabetes，1996，45 :1168_72)，且于兩年前已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床III期實(shí)驗(yàn) (Eldor, et al.，DiabetesMetab Res Rev, 2009, 25 :316_20)；通過大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型 研究發(fā)現(xiàn)，鼠自身HSP60也可減輕關(guān)節(jié)炎癥病理反應(yīng)(Durai，et al.，J Autoimmun, 2009, 33:208-13)。而且非常特別的是，HSP60屬于進(jìn)化上最為保守的分子家族-熱休克蛋白家 族，在所有真核和原核生物中高度同源。因此，病原體很可能會(huì)利用這個(gè)分子去模擬宿主 HSP60的作用，誘導(dǎo)免疫調(diào)控，抑制宿主免疫攻擊，維持慢性感染。如果能夠鑒定和驗(yàn)證出這 些病原體來源的“模擬分子”，不僅可以找到打破慢性感染的靶標(biāo)，還可應(yīng)用于預(yù)防或治療 免疫性疾病。對(duì)于過敏性疾病和自身免疫病的治療，臨床上很長時(shí)間以來一直在用一些直接抑 制免疫應(yīng)答行為的化學(xué)藥物，如激素類，或者聯(lián)合應(yīng)用硫唑嘌呤(抗胸腺球蛋白類藥物)， 環(huán)孢素 A 等(Bougneres, et al.，Diabetes, 1990,39 1264-72)。但是其中有些藥物不僅 價(jià)格比較貴，會(huì)讓患者產(chǎn)生難以忍受的副作用，而且一旦停止用藥，自身免疫反應(yīng)會(huì)立即反 彈，疾病會(huì)卷土重來。而廉價(jià)的純化蛋白分子，不僅安全沒有毒副作用，更重要的是，它是通 過免疫學(xué)途徑去啟動(dòng)其自身的調(diào)控機(jī)制，從根本上解決了問題；相比較于同類的短肽疫苗， 氨基酸序列較長而不易被降解，且具有多個(gè)表位，可以聯(lián)合發(fā)揮作用，更易被機(jī)體免疫系統(tǒng) 所識(shí)別；此外，蛋白分子的制備，一般都是通過生物表達(dá)系統(tǒng)(原核或真核表達(dá)系統(tǒng))，而不 是生物合成，這有助于形成蛋白質(zhì)的高級(jí)空間結(jié)構(gòu)，能更有效地形成免疫學(xué)表位。已公開的日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa(Schistosoma japonicum heat shock protein60KDa, SjHSP60)基因在 Genebank 中序列號(hào)為 AY813151?？傊?，利用慢性感染中病原體來源的抗原，尋找誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異分子，不 僅有利于鑒定出導(dǎo)致慢性感染主要因素，從而可以針對(duì)性地提高宿主抗感染力，而且在進(jìn) 一步研究應(yīng)用于治療過敏性疾病或自身免疫病方面具有更廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種增加⑶4+⑶25+FoXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的蛋白。本發(fā)明所說的增加⑶4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的蛋白，是日本血吸蟲熱休克蛋 白60KDa(SjHSP60)，其全長氨基酸序列SEQ. ID. NO. 1所示，由572個(gè)氨基酸構(gòu)成。本發(fā)明所說的增加⑶4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的蛋白，還包括缺失了一段多肽 的SJHSP60,即SJHSP60 (D)，SJHSP60 (D)的序列如SEQ. ID. NO. 3所示，由548個(gè)氨基酸組成。本發(fā)明SEQ. ID. NO. 1所示的蛋白與Genebank中SjHSP60基因(序列號(hào)為 AY813151)的蛋白質(zhì)序列并不完全相同(一致性為87%)。但是SEQ. ID. NO. 1分別 與其它種屬同源蛋白中曼氏血吸蟲HSP60 (SmHSP60, Genebank號(hào)AF310263)和人 類 HSP60 (HomoHSP60, Genebank 號(hào):BC003030)的一致性更高，分別為 92 % 和 72 %，而AY813151的蛋白質(zhì)序列與SmHSP60和HomoHSP60的一致性分別為81%和65%。這是單克 隆測序與大規(guī)模測序的差異所在，本發(fā)明是經(jīng)過“Primer walking”測序拼接后翻譯出來的 序列，所以更精確。本發(fā)明所說的蛋白SjHSP60，主要通過以下兩個(gè)途徑增加⑶4+⑶25+FOXp3+TregS， 從而增強(qiáng)機(jī)體免疫抑制力1.上述所說蛋白誘導(dǎo)⑶4+⑶25T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs ；2.上述所說蛋白直接使⑶4+⑶25+Tregs發(fā)生擴(kuò)增；本發(fā)明公開了 SjHSP60和SjHSP60⑶作為增強(qiáng)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑 制效應(yīng)的免疫抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明公開了 SjHSP60和SjHSP60(D)在制備治療免疫反應(yīng)引起的炎癥性疾病藥 物中的應(yīng)用。特別是在制備防治關(guān)節(jié)炎所致的炎性癥狀和免疫病理藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所說的SjHSP60和SjHSP60 (D)蛋白使擴(kuò)增后的CD4+CD25+TregS的免疫抑 制力增強(qiáng)。本發(fā)明所說的蛋白應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性炎癥動(dòng)物模型中有抑制炎性癥狀和免疫病理反 應(yīng)的作用，在治療免疫性疾病方面具有比較廣闊的應(yīng)用前景。


圖ISjHSPeo序列同源性比對(duì)分析，天然表達(dá)分析。A SjHSP60的全長氨基酸序列，與宿主(人，小鼠)的HSP60進(jìn)行序列比對(duì)；B SjHSP60在蟲體中的天然表達(dá)情況；表lSjHSP60與宿主(人，小鼠)自身HSP60的交叉性T細(xì)胞表位分析。圖 2SjHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。A用SjHSP60體內(nèi)免疫小鼠，小鼠脾和淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例顯著增 加；B用SjHSP60體內(nèi)免疫小鼠，檢測小鼠脾和淋巴結(jié)中⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例的 流式細(xì)胞術(shù)檢測圖；C用SjHSP60體外處理小鼠脾和淋巴結(jié)細(xì)胞，⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例均發(fā)生增 加；D用SjHSP60體外處理小鼠脾和淋巴結(jié)細(xì)胞，檢測⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比例的流 式細(xì)胞術(shù)檢測圖；圖3SjHSP60減輕CIA(膠原性關(guān)節(jié)炎)小鼠炎性癥狀和病理損傷。A SJHSP60體內(nèi)免疫可減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)炎性癥狀；B SJHSP60體內(nèi)免疫可減輕CIA小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度；C SjHSP60體內(nèi)免疫可減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹和骨關(guān)節(jié)損害；D SjHSP60體內(nèi)免疫可減輕CIA小鼠關(guān)節(jié)及其周圍軟組織的炎癥病理反應(yīng)；圖4SJHSP60增加CIA小鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例，抑制炎癥抗原 (CollagenII, CII)的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。A SJHSP60體內(nèi)免疫CIA小鼠，小鼠脾和淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例顯著 增加；
B SjHSP60體內(nèi)免疫CIA小鼠，檢測小鼠脾和淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例 的流式細(xì)胞術(shù)檢測圖；C SjHSP60體內(nèi)免疫后，CIA小鼠體內(nèi)針對(duì)炎癥抗原C II的特異性體液免疫應(yīng)答 水平明顯降低；D SjHSP60體內(nèi)免疫后，CIA小鼠體內(nèi)針對(duì)炎癥抗原CII的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答水 平明顯降低圖 5HSP60 增力卩 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通過誘導(dǎo) CD4+CD251 轉(zhuǎn)化為 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。A 用 SjHSP60 處理小鼠 CD4+T，CD4+CD25T 細(xì)胞，SjHSP60 誘導(dǎo) CD4+CD25T 轉(zhuǎn)化為 CD4+CD25+Foxp3+Tregs ；B 用 SjHSP60 處理小鼠 CD4+T，CD4+CD25T 細(xì)胞，SjHSP60 誘導(dǎo) CD4+CD25T 轉(zhuǎn)化為 ⑶4+CD25+Foxp3+Tregs的流式細(xì)胞術(shù)檢測圖； 圖 6S jHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通過直接擴(kuò)增 CD4+CD25+Tregs，且擴(kuò)增 后的⑶4+⑶25+Tregs免疫抑制力更強(qiáng)。A SjHSP60 直接擴(kuò)增 CD4+CD25+Tregs ；B擴(kuò)增后的⑶4+CD25+TregS具有更強(qiáng)的免疫抑制力；圖 7 :SjHSP60(D)仍可顯著增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。A SjHSP60的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和表面功能殘基(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用位點(diǎn))的預(yù) 測和分析；B通過兩次PCR得到了接頭部分重疊且缺失了 SJMHEl的兩個(gè)PCR產(chǎn)物；C通過第三次PCR得到了缺失SJMHEl的SjHSP60 (D)；D用SjHSP60⑶體內(nèi)免疫小鼠，小鼠脾和淋巴結(jié)中⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs比例顯 著增加；E用SjHSP60(D)體內(nèi)免疫小鼠，檢測小鼠脾和淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比 例的流式細(xì)胞術(shù)檢測圖；F用SjHSP60(D)體外處理小鼠脾和淋巴結(jié)細(xì)胞，CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例顯著 增加；G用SjHSP60 (D)體外處理小鼠脾和淋巴結(jié)細(xì)胞，檢測CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例 的流式細(xì)胞術(shù)檢測圖；圖8 去除SjHSP60全長序列中一段多肽(第435到第458個(gè)氨基酸，SJMHE1)的 引物設(shè)計(jì)法和三步PCR示意圖。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解為這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相
6同試劑如無特殊說明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。本發(fā)明實(shí)施例中所提及的表達(dá)載體pGEX-6p_l可從GE Healthcare公司購買(貨 號(hào)28-9546-48)。日本血吸蟲總cDNA的獲取日本血吸蟲感染性釘螺(陽性釘螺)購自江蘇省血吸 蟲病防治研究所。感染性釘螺可以釋放出具有感染性的尾蚴(日本血吸蟲發(fā)育階段之一， 此階段具有感染性)從而用來攻擊感染實(shí)驗(yàn)性小鼠。然后尾蚴在小鼠體內(nèi)可以繼續(xù)發(fā)育為 童蟲，最終發(fā)育為日本血吸蟲成蟲，寄居在小鼠的門靜脈系統(tǒng)。剖殺小鼠后，可以通過灌注 小鼠門靜脈系統(tǒng)取出成蟲，從而可以用來抽提日本血吸蟲總RNA，最后再逆轉(zhuǎn)錄成日本血吸 蟲總cDNA。實(shí)施例一 SjHSP60同源性的序列比對(duì)分析，交叉性表位分析，及其天然表達(dá)的檢 測。1、根據(jù)Genebank中SjHSP60基因(序列號(hào)為:AY813151)全長cDNA序列，先行 設(shè)計(jì)引物上游引物為5，-cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgag-3，(含BamHI酶切位點(diǎn)及 起始密碼字 ATG),下游引物為 5，-ccgctcgagattaagagcaggcagtgtttac-3，(含 XholI 酶 切位點(diǎn)及終止密碼子TAA)，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司(Invitrogen)合成；通過PCR 方法從日本血吸蟲總cDNA中擴(kuò)增SjHSP600RF全長序列，送生物技術(shù)公司(上海英濰捷基 貿(mào)易有限公司，Invitrogen)測序，并回收PCR產(chǎn)物；測序結(jié)果如SEQ. ID. NO. 2所示，再通 過在線生物學(xué)工具Biology WorkBenchftittp://workbench, sdsc. edu/)將其翻譯成氨基 酸序列；并與人和小鼠的HSP60 (Genebank中基因序列號(hào)分別為人HSP60-BC003030，小鼠 HSP60-NM010477)進(jìn)行序列比對(duì)。SJHSP60開放閱讀框ORF的全長序列，如SEQ. ID. NO. 2所示，共1719bp。SJHSP60開放閱讀框ORF的全長序列翻譯后的氨基酸序列為如SEQ. ID. NO. 1所示， 共572個(gè)氨基酸。2、綜合應(yīng)用在線表位預(yù)測軟件IEDB(http://tools, immune印itope. org/main/ index, html)，SYFPEITHI(http://www. syfpeithi. de/home. htm)分析 SjHSP60 分別與人 HSP60,小鼠HSP60的交叉性T細(xì)胞表位。3、用 BamHI (NEB, #R3136V)和 XholI (NEB, #R0146V)將質(zhì)粒 pGEX_6P_l 和此上(1) 中回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離鑒定后，再分別割膠 回收質(zhì)粒和PCR片斷的雙酶切產(chǎn)物；通過T4DNA連接酶(NEB，#M0202S)進(jìn)行載體和PCR產(chǎn) 物的連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-SjHSP60 ；轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，37°C培養(yǎng)過 夜后，挑取單克隆菌落，接種于含Amp的LB培養(yǎng)液中，37°C振搖培養(yǎng)過夜后，抽提質(zhì)粒后行 雙酶切鑒定，進(jìn)一步送測序公司鑒定。鑒定成功后，將菌液進(jìn)行1 100擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD 值達(dá)0. 6-0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為0. 05mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)5h ；收集菌液，4°C 高速離心20min，用IXPBS重懸細(xì)菌沉淀；通過超聲破碎儀和反復(fù)凍融法裂菌；再次4°C 高速離心20min，分別取上清和沉淀，以及未裂解的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析蛋白的 表達(dá)量及分布情況；鑒定為可溶性表達(dá)后，通過融合蛋白GST親和層析法，用Glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare, 17-0751-01)進(jìn)行融合蛋白 GST_SjHSP60 的純化；并用蛋白 酶PreScission Protease(GE Healthcare, 270843)對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切，最后得到純化的 SJHSP60 ；經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析純化結(jié)果，純度> 95%。純化的SjHSP60交由上海中科院英沐生物科技有限公司制備抗SjHSP60的單克隆抗體(mti-SjHSP60mAb)。制備可溶性 的成蟲(SWA)和蟲卵抗原(SEA)，通過Weatern Blot實(shí)驗(yàn)檢測mti_SjHSP60mAb的特異性 和抗體效價(jià)；驗(yàn)證成功后，再用mti-SjHSP60mAb，通過免疫組織化學(xué)方法，檢測日本血吸 蟲成蟲(雌蟲和雄蟲)和蟲卵中SjHSP60的天然表達(dá)和分布情況。結(jié)果如圖1和表1所示，SjHSP60與人、小鼠HSP60序列上具有高度的同源性，序 列的一致性分別達(dá)到72%和70% ；通過T細(xì)胞表位預(yù)測后，發(fā)現(xiàn)SjHSP60，與人HSP60，與小 鼠HSP60，均具有一系列相同或高度相似的MHCI和MHCII類交叉性T細(xì)胞表位。表 1 實(shí)施例二 SjHSP60體內(nèi)免疫小鼠或體外剌激小鼠淋巴細(xì)胞，觀察SjHSP60對(duì) CD4+CD25+Foxp3+Tregs 的影響。1.將實(shí)施例一(3)中純化的 SjHSP60，濾菌并通過 Polymyxin B-Agarose (Sigma， P1411)去除其中的類毒素及其相關(guān)分子，然后再通過Limulus amebocyte Iysate(LAL)檢 測試劑盒E-TOXATE Kits (Sigma, ET0200)，驗(yàn)證純化蛋白的內(nèi)毒素去除效果，< 0. 001FU/ ml(0. lpg/ml)，最后用 DC Protein Assay (BIA-RAD，500-0111)進(jìn)行蛋白定量。將 SjHSP60 與不完全弗氏佐劑IFA (Sigma，F(xiàn)5501)等體積混合，使SjHSP60濃度為250ug/ml，反復(fù)渦懸 振蕩混勻。對(duì)BALB/c小鼠(SPF級(jí)，6-8周齡，雌性，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公 司)進(jìn)行腹股溝皮下免疫，劑量為25ug/100ul/只，首次免疫后，隔兩周再同樣免疫一次， 設(shè)PBS免疫組為對(duì)照組。整個(gè)過程小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房(南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心)。末次免疫結(jié)束后一周，剖殺小鼠，分離各組小鼠的脾和淋巴結(jié)，研磨過濾后，制備成單 細(xì)胞懸液；再經(jīng)紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，制備成單淋巴細(xì)胞懸液；進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，對(duì)各 組每只小鼠取 IXlO6 個(gè)細(xì)胞，按 MouseRegulatory T Cell Staining Kit (eBioscience， 88-8111-40)操作說明書進(jìn)行淋巴細(xì)胞的染色標(biāo)記，再經(jīng)流式細(xì)胞儀FACSCalibur檢測 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。2.分離正常BALB/c小鼠的脾和淋巴結(jié)，按此上(1)中方法，制備成單淋巴細(xì)胞懸液；細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分別轉(zhuǎn)移至96孔圓底培養(yǎng)板，5X IO5個(gè)細(xì)胞/孔；再分三組進(jìn)行刺激，分 別是 SJHSP60 組(0. lug/ml) /PBS 組 / 無刺激(Medium)組，每組設(shè) 4 孔；在 37°C，5% CO2 細(xì) 胞孵箱培養(yǎng)3天后，收集各組細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組取IX IO6個(gè)細(xì)胞，同此上(1)中方法檢 測 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。結(jié)果如圖2所示，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明，SJHSP60可以增加⑶4+CD25+Foxp3+Tregs比 例。實(shí)施例三探究SjHSP60能否在炎癥模型中發(fā)揮抑制炎癥及免疫病理反應(yīng)的作用。1.按實(shí)施例二(1)中方法，分兩組SjHSP60組/PBS組，體內(nèi)免疫DBAl小 鼠(南京大學(xué)國家遺傳工程小鼠資源庫，6-8周齡，雌性)。建立膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎 (CIA)小鼠模型混合牛源 II 型膠原(CII)Bovine Collagen Type II (BD, 354257)和 Mycobacteriumtuberculosis H37RA(Difco, 3114),用 IXPBS 稀釋，使兩者濃度分別為 2mg/ml,3mg/ml ；在混合體系中再加入等體積的不完全弗氏佐劑CFA，渦懸振蕩儀上混勻 2min,反復(fù)6-8次，每隔30min —次；于首次免疫SjHSP60/PBS后一周，在兩組小鼠尾部皮 下免疫混合抗原誘導(dǎo)CIA，IOOul/只。誘導(dǎo)后一周，對(duì)兩組小鼠再分別免疫SjHSP60/PBS — 次。誘導(dǎo)后4周，開始動(dòng)態(tài)觀察兩組小鼠關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)，隔天一次；按如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行炎性癥 狀嚴(yán)重程度評(píng)分O分正常，無癥狀；1分紅斑，只有踝關(guān)節(jié)輕微腫脹；2分紅斑，從踝關(guān)節(jié)到跖骨、掌指關(guān)節(jié)輕微腫脹；3分紅斑，從踝關(guān)節(jié)到掌指關(guān)節(jié)中度腫脹；4分紅斑，從踝關(guān)節(jié)到指尖嚴(yán)重腫脹；每側(cè)肢體最高分為4分，最低分為0分；每只小鼠總得分最高為16分，最低為0分。2.與此上(1)中觀察時(shí)間點(diǎn)同步，使用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(購自溫州三和量具儀 器有限公司)測量各組小鼠左后肢踝關(guān)節(jié)直徑。3.誘導(dǎo)后7周剖殺各組小鼠，取各組小鼠前爪固定于含10%福爾馬林的IXPBS 中，送標(biāo)本至上海瑞金醫(yī)院傷骨科研究所進(jìn)行X光檢測。4. X光檢測后，將標(biāo)本繼續(xù)固定于含10%福爾馬林的IXPBS中，交由江蘇省人民 醫(yī)院病理科進(jìn)行標(biāo)本脫鈣、石蠟包埋、切片及病理HE染色；顯微鏡下觀察HE病理結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，SjHSP60免疫組的CIA小鼠，其關(guān)節(jié)的炎性癥狀，關(guān)節(jié)腫脹度，關(guān) 節(jié)損害程度以及病理炎癥反應(yīng)都顯著減輕。實(shí)驗(yàn)例四觀察SjHSP60能否增加CIA小鼠⑶4+⑶25+FOXp3+TregS，從而發(fā)揮免疫 抑制作用。1.分離CIA誘導(dǎo)后3W和7W各組(HSP60組/PBS組)小鼠脾和淋巴結(jié)，按實(shí)施例 二(1)中方法，檢測各組小鼠⑶4+⑶25+Foxp3+Tregs比例。2.在剖殺此上(1)中各組小鼠前，對(duì)各組小鼠采血，并分離出血清；再經(jīng)ELISA 檢測各組血清中CII特異性抗體(IgG，IgG2a, IgGl)，具體操作是用高親和力酶標(biāo)板預(yù) 包被CII，5ug/ml，4°C包被過夜；棄去包被液，PBS-T洗板2_3遍；5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉， 200ul/孔，37 °C孵育2小時(shí)；棄去封閉液，PBS-T洗板2_3遍；1 20稀釋各組血清后，加入酶標(biāo)板，IOOul/孔，4°C孵育過夜；棄去血清，PBS-T洗板3-4遍；加入稀釋后的二抗HRP anti-mouse IgG (Boster，BA1050) 1 10000 稀釋，HRP anti-mouse IgG2a (BD, 553391) 和 HRP anti-mouse IgGl (BD，559626)均 1 1000 稀釋，IOOul/孔，37 °C 孵育 1 小時(shí)；棄 去二抗，PBS-T洗板4-5遍；加入TMB顯色液(eBioscience，00-4201-56)，室溫避光放置 10-15min后，加入2N H2SO4終止反應(yīng)，IOOul/孔；最后在酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀值。3.取此上(1)中分離后得到的各組每只小鼠的淋巴細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)移至96孔圓底 細(xì)胞培養(yǎng)板，4 X IO5個(gè)/孔，每只小鼠設(shè)9個(gè)孔，再各分為三組處理=Medium組(不刺激)/ ConA刺激組(2ug/ml)/CII刺激組(5ug/ml)，3孔/組；按實(shí)施例四(5)中方法，通過3H摻入 法檢測各組淋巴細(xì)胞增殖情況培養(yǎng)至56小時(shí)，加入氚胸腺嘧啶(3H-thymidine,3H-TDR)， 0. 5 μ Ci/孔；繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)(總計(jì)培養(yǎng)3天)后，經(jīng)Beckman液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞 的3H-TDR摻入情況，從而反映出CII特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果如圖4所示，SjHSP60使CIA模型小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例顯著增 加；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也證明，針對(duì)C II特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答都有明顯的抑制。實(shí)施例五SjHSP60體外分別刺激小鼠CD4+T細(xì)胞，⑶4+⑶25—T細(xì)胞，進(jìn)一步觀察 SjHSP60 如何增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs。分離正常BALB/c小鼠脾和淋巴結(jié)，制備成單淋巴細(xì)胞懸液；用試劑盒⑶4+T celllsolation Kit (MACS, 130-090-860)分選出 CD4+T 細(xì)胞；剩余的 CD4-淋巴細(xì)胞經(jīng) 50ug/ ml絲裂霉素，37°C，5% CO2處理30min后，作為抗原遞呈細(xì)胞(APC)使用。再取部分⑶4+T 細(xì)胞，進(jìn)一步再用 CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit (MACS, 130-091-041)去除 ⑶4+CD25+TregS，從而分離出⑶4+⑶25—T細(xì)胞。具體分選步驟均參照產(chǎn)品說明書。通過流 式細(xì)胞術(shù)檢測⑶4+Τ細(xì)胞和⑶4+⑶25—Τ細(xì)胞純度，純度分別> 90%和> 95%。將兩種細(xì)胞 分別轉(zhuǎn)移96孔圓底培養(yǎng)板，2 X IO5個(gè)細(xì)胞/孔，再加入APC, 2 X IO5個(gè)/孔；CD4+T細(xì)胞和 CD4+CD25—T細(xì)胞再各自分兩組處理，刺激組(SjHSP60，0. lug/ml)/不處理組(Medium)；在 37°C,5% CO2細(xì)胞孵箱培養(yǎng)3天后，收集各組細(xì)胞并計(jì)數(shù)；每組取1 X IO6個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞 術(shù)檢測⑶4+⑶25+FOXp3+TregS比例。此實(shí)例中相關(guān)具體方法可參考實(shí)施例二(1)。結(jié)果如圖5 所示，SjHSP60 增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 可通過誘導(dǎo) CD4+CD25T 細(xì) 胞轉(zhuǎn)化而來。 實(shí)施例六觀察SJHSP60增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs是否可通過直接擴(kuò)增 CD4+CD25+Tregs，擴(kuò)增后的CD4+CD25+Tregs免疫抑制力如何。1.按實(shí)施例二(2)中方法分離正常BALB/c小鼠的脾和淋巴結(jié)，制備成單淋 巴細(xì)胞懸液；用CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit按照說明書步驟分選出 ⑶4+CD25+TregS。參照實(shí)施例五中方法，流式細(xì)胞術(shù)檢測⑶4+⑶25+Tregs的細(xì)胞純度，純度 >95%。轉(zhuǎn)移⑶4+CD25+TregS至96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板，2乂105個(gè)細(xì)胞/孔；再分三組處 理anti-CD3(BD，553057)刺激組(lug/ml)/SjHSP60 刺激組(0. 5ug/ml)/SjHSP60 (0. 5ug/ ml)+anti-ra3(lug/ml)刺激組，均為5孔/組。按實(shí)施例四(3)中方法，通過3H摻入法檢 測各組⑶4+⑶25+Tregs的增殖情況。2.按此上(1)中具體方法分選并刺激處理⑶4+CD25+Tregs，培養(yǎng)3天后，收集并計(jì) 數(shù)；轉(zhuǎn)移至96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板，1 X IO5個(gè)/孔，4孔/組。再按實(shí)施例五中方法分選正常 BALB/C小鼠⑶€細(xì)胞(作為APC使用)和⑶4+CD25T細(xì)胞，分別加入每孔⑶4+⑶25+Tregs，IXlO5個(gè)/孔。共培養(yǎng)3天后，同樣按實(shí)施例四(3)中方法，通過3H摻入法檢測各組 ⑶4+CD25-T細(xì)胞的增殖情況，進(jìn)而反映各組⑶4+CD25+TregS的抑制力。結(jié)果如圖6所示，SJHSP60還可通過直接擴(kuò)增CD4+CD25+Tregs，增加 ⑶4+CD25+Foxp3+Tregs ；且擴(kuò)增后的⑶4+⑶25+Tregs具有更強(qiáng)的免疫抑制力。實(shí)施例七去除SjHSP60全長序列中第435到第458氨基酸的多肽(SJMHEl)后， 得到SjHSP60(D)，觀察SjHSP60(D)是否還能增加小鼠CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例。1.應(yīng)用在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測軟件Phyre server (http//www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre/)，預(yù)測SjHSP60蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)以及表面功能殘基(蛋白_蛋白作 用位點(diǎn))O2.按附圖中圖8所示設(shè)計(jì)引物Pl (5，_3，) cgcggatcccaaccggtgacaatgttacgagP2(5， _3， ) :cacacctgttcgctgtatgccttcctcaattgctP3(5， _3， ) :attgaggaaggcatacagcgaacaggtgtgcgP4(5， _3， ) ccgctcgagattaagagcaggcagtgttta以實(shí)施例一(3)中構(gòu)建的重組表達(dá)載體pGEX_SjHSP60為模板以P1/P2為上下游 引物進(jìn)行PCR I ；以P3/P4為上下游引物進(jìn)行PCRII ；兩次PCR后，得到了缺失SJMHEl且有 部分重疊的兩個(gè)PCR產(chǎn)物。3.等摩爾混合此上⑵中PCR I和PCRII產(chǎn)物(質(zhì)量比大約為3. 5 1)，以此為 模板，以P1/P4為上下游引物，進(jìn)行PCRIII，得到了缺失SJMHEl的SjHSP60(D)，共1816bp。 其全長cDNA序列和經(jīng)過翻譯出來的氨基酸序列分別為SEQ. ID. NO. 4和SEQ. ID. NO. 3所示。4.回收此上(3)中PCR III產(chǎn)物；按實(shí)施例一(3)中方法，用回收的PCR III 產(chǎn)物和PGEX-6P-1構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-SjHSP60(D)；誘導(dǎo)表達(dá)和純化SjHSP60 (D)； 再進(jìn)行內(nèi)毒素的去除和定量驗(yàn)證，最后進(jìn)行蛋白定量。按實(shí)施例二(1)中具體方法，用 S JHSP60 (D)以及多肽SJMHE1(由上海生工公司合成，純度> 99%，序列如SEQ. ID. NO. 5 所示)體內(nèi)免疫正常BALB/c小鼠，設(shè)PBS免疫組為對(duì)照組，檢測各組小鼠脾和淋巴結(jié)中 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 比例。5.按實(shí)施例二⑵中方法，用SjHSP60⑶/多肽SJMHE1/PBS體外刺激正常BALB/ c小鼠的脾和淋巴結(jié)細(xì)胞，檢測各組小鼠脾和淋巴結(jié)中⑶4+⑶25+FOXp3+TregS比例。結(jié)果如圖7所示，經(jīng)過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SjHSP60的三維空間結(jié)構(gòu)表面，除了 SJMHE1， 還存在其它一些功能性殘基(蛋白_蛋白作用位點(diǎn))；進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，缺失SJMHEl 的SJHSP60 (D)仍可增加小鼠脾和淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例。結(jié)合圖2分 析，可以發(fā)現(xiàn)與SJMHEl相比較，SJHSP60和SJHSP60 (D)體內(nèi)免疫小鼠(in vivo)增加 CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例的能力更強(qiáng)一些；而體外刺激淋巴細(xì)胞(in vitro), SJMHE1, SJHSP60和SjHSP60(D)三者增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例的能力無明顯差異。本發(fā)明不限于這些公開的實(shí)例方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以 及權(quán)利要求范圍的各種變型和等效變化。
權(quán)利要求
一種增加CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原，是日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa，它的全長氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.權(quán)利要求1所說的增加⑶4+⑶25+FoXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原作為增強(qiáng) ⑶4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)的免疫抑制劑的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所說的增加CD4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原在制備治療免疫反應(yīng) 引起的炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1中所說的增加CD4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原在制備防治關(guān)節(jié)炎 所致的炎性癥狀和免疫病理藥物中的應(yīng)用。
5.一種增加⑶4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原，是缺失了第435至第458個(gè)氨基酸 的日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa，它的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示。
6.權(quán)利要求5所說的增加⑶4+⑶25+FoXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原作為增強(qiáng) ⑶4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)的免疫抑制劑的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求5所說的增加CD4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原在制備治療免疫反應(yīng) 引起的炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求5中所說的增加CD4+CD25+FOXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原在制備防治關(guān)節(jié)炎 所致的炎性癥狀和免疫病理藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種可以增加CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的血吸蟲來源的蛋白抗原分子-日本血吸蟲熱休克蛋白60KDa(SjHSP60)及其應(yīng)用。SjHSP60全長氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，與感染宿主的HSP60具有一系列相同或高度相似的交叉性T細(xì)胞表位。用SjHSP60體內(nèi)免疫小鼠或體外刺激小鼠脾、淋巴結(jié)細(xì)胞，均可顯著增加CD4+CD25+Foxp3+Tregs。在實(shí)際應(yīng)用上，SjHSP60可有效地減輕關(guān)節(jié)炎所致的炎性癥狀和免疫病理反應(yīng)，因此在誘導(dǎo)免疫抑制，應(yīng)用于治療免疫性疾病方面具有廣闊的前景。
文檔編號(hào)A61P37/06GK101921325SQ20101013314
公開日2010年12月22日 申請日期2010年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者劉豐, 周莎, 汪雪峰, 蘇川, 賀蕾 申請人:南京醫(yī)科大學(xué)