亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

小檗堿在制備防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應用的制作方法

文檔序號:1182259閱讀:339來源:國知局
專利名稱:小檗堿在制備防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領域
本發(fā)明涉及中藥,具體涉及小檗堿在制備防治類風濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的 應用。
背景技術(shù)
類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一種病因尚未明了的慢性全身 性炎癥性疾病,以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn),屬于自身免 疫炎性疾病。該病好發(fā)于手、腕、足等小關(guān)節(jié),反復發(fā)作,呈對稱分布。早期有關(guān)節(jié)紅腫熱痛 和功能障礙,晚期關(guān)節(jié)可出現(xiàn)不同程度的僵硬畸形,并伴有骨和骨骼肌的萎縮,極易致殘。 從病理改變的角度來看,類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種主要累及關(guān)節(jié)滑膜(以后可波及到關(guān)節(jié)軟 骨、骨組織、關(guān)節(jié)韌帶和肌鍵),其次為漿膜、心、肺及眼等結(jié)締組織的廣泛性炎癥性疾病。 類風濕性關(guān)節(jié)炎的全身性表現(xiàn)除關(guān)節(jié)病變外,還有發(fā)熱、疲乏無力、心包炎、皮下結(jié)節(jié)、胸膜 炎、動脈炎、周圍神經(jīng)病變等。但是,類風濕性關(guān)節(jié)炎至今尚無特效療法,仍處于對炎癥及后 遺癥的治療。黃連解毒湯首載于葛洪《肘后備急方》,已有一千七百年的應用歷史。本方由黃連、 黃芩、黃柏、桅子4味中藥組成,是清熱解毒的經(jīng)典方劑,具有清熱、瀉火、解毒之功效。主治 實熱火毒、三焦熱盛之證?,F(xiàn)代藥理研究表明黃連解毒湯具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗 內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)、解熱、降壓等多方面作用。為尋求中醫(yī)藥治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的有 效方劑,本發(fā)明人經(jīng)大量試驗證實,黃連解毒湯有明顯的抗炎及免疫作用,能較好的預防和 治療類風濕性關(guān)節(jié)炎(專利申請?zhí)?200910195341. 8中藥黃連解毒湯在制備防治類風濕性 關(guān)節(jié)炎的藥物中的應用)。同時對黃連解毒湯進行了治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥效物質(zhì)基礎 研究,揭示了一種新的藥物組合物,其組成成分為小檗堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿、黃柏 堿、黃連堿、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、桅子苷、藏紅花素、綠原酸(專利申請?zhí)?200910195343. 7 一種防治類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物)。但是黃連解毒湯13個成分的 有效物質(zhì)組雖然清楚,但組成太多,產(chǎn)業(yè)化成本太高,且其中的綠原酸被報道為許多注射劑 不良反應的致敏源。本發(fā)明人在對黃連解毒湯進一步深入的研究中發(fā)現(xiàn),中藥小檗堿對類風濕性關(guān)節(jié) 炎有很好的治療效果,這一發(fā)現(xiàn)相比所述200910195341. 8和200910195343. 7專利而言有 積極的意義。小檗堿Berberine,又稱黃連素,是一種異喹啉類生物堿,具有抗菌、抗結(jié)核、抗 鉤端螺旋體、抗原蟲、鎮(zhèn)靜、解熱、降血壓、利膽等作用,未見其具有治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的 報道。本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的作用是對小檗堿這一資源的進一步拓展, 對類風濕性關(guān)節(jié)炎的防治有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究設計小檗堿在制藥中的應用。本發(fā)明提供了小檗堿在制備防治類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應用。本發(fā)明采用小檗堿進行動物藥效試驗,結(jié)果顯示小檗堿可抑制CIA(Collagen-Induced Arthritis,膠原誘導的關(guān)節(jié)炎)的臨床發(fā)病,明顯抑制了CIA的發(fā) 病嚴重程度和發(fā)病率。并能下調(diào)脾細胞上清液中TNF-α (腫瘤壞死因子a)、IL_17(白介 素17)、IFN- γ (干擾素γ ),抑制促炎細胞因子TNF- α、IFN- γ和IL-17的分泌,從而對 CIA疾病具有保護作用。TNF-α和IFN-γ在RA發(fā)病機制中起著重要作用。TNF-α可直接 誘導蛋白水解酶的合成,造成基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。實驗結(jié)果也表明,小檗堿可較大程度降低脾 臟細胞分泌TNF-α。用抗TNF-α療法在治療RA上取得了良好的效果,不但阻止了骨組織 破壞而且也抑制了 IL-17的產(chǎn)生。小檗堿對炎癥的控制及對關(guān)節(jié)組織的保護可能與其降低 TNF-α含量有關(guān)。IFN- γ主要由浸潤在病灶局部的⑶4+Τ細胞分泌,它可以激活巨噬細胞,活化的巨 噬細胞隨后表達多種炎癥因子,參與并加重炎癥反應;IFN- γ還可誘導MIP-I α、MIP-I β 和ΙΡ-10的表達,這些趨化因子參與淋巴細胞向病灶遷移的過程。本發(fā)明的實驗中,小檗堿 在體內(nèi)明顯降低了 IFN-Y的水平,有可能與阻斷了淋巴細胞的后繼遷移有關(guān)。有研究報 道,TNF-α與IFN-Y在體外共同刺激纖維原細胞和人微血管內(nèi)皮細胞可協(xié)同誘導趨化因 子CXCLlO的產(chǎn)生,RA病人滑液中大量CXCLlO的表達導致活化Thl細胞及自然殺傷細胞的 浸潤,對組織造成損傷。在類風濕關(guān)節(jié)炎的模型中升高的IL-15可通過誘導IL-17而發(fā)揮其促炎癥細胞因 子的特性,IL-15可能通過環(huán)孢菌素A和類固醇敏感的途徑,導致關(guān)節(jié)中的IL-17過度分泌。 IL-17除了可刺激滑膜細胞釋放各種炎癥介質(zhì)外,還可通過刺激RANKL與RANK結(jié)合,刺激骨 吸收,是目前認識到的在類風濕性關(guān)節(jié)炎骨破壞病理中最重要的細胞因子之一。因此,小檗堿對CIA有明顯的療效,可明顯抑制CIA臨床發(fā)病,可顯著抑制IL-17 的生成,降低炎性細胞因子TNF-α及IFN-Y的分泌,這是小檗堿治療類風濕關(guān)節(jié)炎的機 制。本發(fā)明所述小檗堿在制備防治類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物為以小檗堿作為活性成分與 常規(guī)藥用輔料制成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是片劑、分散片、含片、口崩片、緩釋 片、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑等。


圖1小檗堿臨床評分中+模型組+對照組+小檗堿lmg/kg —小檗堿5mg/kg 小檗堿 10mg/kg圖2脾細胞上清細胞因子TNF-α檢測結(jié)果圖;柱1:空白組柱2:模型組柱3:甲 氨喋呤組柱4 小檗堿0. 2mg/kg柱5 小檗堿lmg/kg柱6 小檗堿2mg/kg *P < 0. 05**P < 0. 01圖3脾細胞上清細胞因子IL-17檢測結(jié)果圖;柱1:空白組柱2 模型組柱3:甲 氨喋呤組柱4 小檗堿0. 2mg/kg柱5 小檗堿lmg/kg柱6 小檗堿2mg/kg *P < 0. 05**P < 0. 01圖4脾細胞上清細胞因子IFN-γ檢測結(jié)果圖;柱1 空白組柱2:模型組柱3:甲 氨喋呤組柱4 小檗堿0. 2mg/kg柱5 小檗堿lmg/kg柱6 小檗堿2mg/kg *P < 0. 05**P < 0. 0具體實施例方式實施例1小檗堿動物藥效試驗一、實驗材料藥物與試劑小檗堿購自中國藥品生物制品鑒定所,以3%。的CMC-Na溶液溶解成lmg/ml的溶 液。給藥時按照動物體重腹腔注射不同的體積。雞II型膠原(CII) =Chondrex, Redmond, WA 98052,USA ;不完全弗氏完全佐劑(IFA)Difco Laboratories, Detroit, MI ;磷酸緩沖鹽 溶液(PBS)由本實驗室自行配制,在800ml蒸餾水中溶解8gNaCl,0. 2g KCl,1.44g Na2HPO4 和0.24g ΚΗ2Ρ04。用鹽酸調(diào)PH至7. 4,加水定容至1L,過濾除菌后使用;DMSO 二甲基亞砜 (Dimethylsulfoxide, DMS0)為sigma公司產(chǎn)品;1640培養(yǎng)基吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公 司;小牛血清民海生物有限公司;96孔平底板,CORNING公司;70 μ m細胞研磨濾網(wǎng),BD Falcon 公司;15ml、50ml 離心管,BD Falcon 公司;0. 22 μ m 濾器,Millipore 公司;Iml 旋口 注射器,BD公司;貝朗三通,德國貝朗公司;甲氨喋呤片上海醫(yī)藥(集團)有限公司信誼制 藥總廠(080605)動物DBI/I型小鼠,雄性,6-8周,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,許可證 號SCXK (滬)2007-0005,飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學實驗動物中心清潔級環(huán)境中。儀器與設備高速臺式離心機,Eppendorf ;高速臺式低溫離心機,HITACHI公司;倒置顯微鏡, Nikon公司;超凈臺,蘇凈集團安泰公司制造;電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設備有 限公司;濕度CO2培養(yǎng)箱,Heraus公司;恒溫水浴鍋,上海國華電器有限公司。二、實驗方法模型的建立實驗準備完全弗氏佐劑(CFA)的制備在不完全弗氏佐劑中加入熱滅活的結(jié)核分支桿菌至 終濃度4mg/ml,使用之前充分混勻。0. OlM冰乙酸制備11. 43 μ 1冰乙酸溶于20ml去離子水中,過濾,4°C備用。CII制備將CII溶解于0. OlM冰乙酸至終濃度4mg/ml,4°C保存??乖娜榛萌ü苓B接兩支玻璃針管,將PBS、完全弗氏佐劑和抗原CII分別 加入一支針管中(每100 μ 1乳化液含200 μ g CII和50 μ 1完全弗氏佐劑),排除針管內(nèi)氣 泡后,來回推動針管約500次,將針管內(nèi)各成分充分混勻成乳化狀態(tài)。CIA模型的誘導第0天,小鼠尾根部2-3厘米處給予100 μ 1/只乳化好的CII抗原皮下注射免疫; 第21天,加強免疫50μ 1 CII和150 μ 1 PBS充分混勻,150ul/只腹腔注射;正常組用生理 鹽水同法注射。三、實驗分組和給藥方案小鼠隨機分為6組,每組12只,分別為正常組、CIA模型組、陽性對照組(甲氨喋呤 2mg/kg)、小檗堿組分為高、中、低三個劑量組,其給藥量分別為10mg/kg、5mg/kg、lmg/kg。于二次免疫前一天(第20天)至第34天小檗堿組分別按10mg/kg、5mg/kg、lmg/kg連續(xù)灌胃給藥,甲氨喋呤組每兩天按2mg/kg給藥,正常組和模型組按10ml/kg給予飲用水。1、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,Al)評分二次免疫后,定期記錄小鼠全身關(guān)節(jié)病變情況,按3級評分法評價,計算發(fā)病率及 平均發(fā)病指數(shù)。具體評分標準為0分_關(guān)節(jié)正常;1分-關(guān)節(jié)輕微紅腫;2分-關(guān)節(jié)紅腫嚴 重,累及整個關(guān)節(jié),活動受限;3分-爪子或關(guān)節(jié)功能障礙,關(guān)節(jié)僵硬。四肢的總和為小鼠的 評分,最高為12分。2、淋巴及脾臟單個核細胞(MNC)懸液的制備小鼠處死,固定,剪開腹部皮膚,取兩側(cè)腹股溝淋巴結(jié);后打開腹腔,取出脾臟,立 即放入裝有1640的15ml離心管中,置于冰上;將脾臟倒入70 μ m的細胞研磨濾網(wǎng)中,用Iml 注射器針芯充分研磨,使之成細胞懸液;收集細胞懸液,4°C,IOOOrpm,離心8min,離心后棄 去上清;打散細胞,加入0. 83%氯化銨水(約1. Oml/脾臟),裂解5min ;加入3倍體積的 PBS終止裂解反應,并用玻璃吸管去除細胞懸液中的絮狀物;4°C,IOOOrpm,離心8min,離心 后棄去上清;打散細胞,加入Iml 1640 (含小牛血清),混勻后計數(shù),以1640完全培養(yǎng)基(含 小牛血清)在96孔板中培養(yǎng),5 X 106/ml每孔lOOul,貼壁2小時。3、脾細胞NO測定在96孔平圓底板中每孔加入5X 106/ml脾臟MNClOOul,每組4復孔;貼壁2小時 后,換液DMEM培養(yǎng)基,每孔加LPS (終濃度lug/ml),將細胞置于37°C,5 % CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)18小時后取出上清液檢測N0。4、脾、淋巴細胞增值測定在96孔平圓底板中分別加入5X 106/ml脾臟及淋巴MNClOOul,每組4復孔;貼壁 2小時后,加CII (100ug/ml),將細胞置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后取出加MTS
測增值。5、脾細胞細胞因子測定在96孔平圓底板中加入5 X 106/ml脾臟MNClOOul,每組4復孔;貼壁2小時后,力口 CII (100ug/ml),將細胞置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后取上清液檢測細胞因子。四、結(jié)果1、小檗堿可抑制CIA的臨床發(fā)病在此CIA的實驗中,用CII誘導CIA模型,初次免疫為第0天,第21天加強免疫后 小鼠隨機分為6組對照組和三組小檗堿組。于第20天開始給,陽性對照組每兩天給予甲 氨喋呤藥2mg/kg,小檗堿高劑量組給予10mg/kg,中劑量組為5mg/kg,低劑量組為lmg/kg, 連續(xù)給藥14天,直到實驗結(jié)束。每天觀察小鼠并依據(jù)評分標準給每只小鼠評分。CII誘導CIA,加強免疫后小鼠陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)病,對照組與用藥組在發(fā)病時間上沒有 明顯差異。發(fā)病后,模型組組小鼠疾病嚴重程度加重較快,在免疫后第37天達到高峰,而給 藥組小鼠發(fā)病后疾病發(fā)展較對照組小鼠緩和(圖1)。從發(fā)病率來看,模型組為90%,對照 組為73%,小檗堿高、中、低三個劑量組分別為70%,72%和73%。由此可見,小檗堿對CIA 發(fā)病時間沒有明顯影響,但明顯抑制了 CIA的發(fā)病嚴重程度和發(fā)病率,說明小檗堿對CIA具 有明顯的保護作用。2、小檗堿能下調(diào)脾細胞上清液中TNF- α、IL-17、IFN- γ
在體內(nèi)給予藥物治療CIA的實驗中,疾病達到平臺期后處死小鼠,取出脾臟細胞,制成單細胞懸液,每孔1. 5 X IO6個細胞鋪板,在體外用20 μ g/ml的抗原CII刺激,培養(yǎng)48 小時后收集上清,用ELISA方法測量細胞因子TNF-α、IFN-γ的濃度。如圖2、3、4所示,CII刺激后,模型組細胞上清中TNF-α ,IFN-γ及IL-17均高于 各個藥物處理組,與陽性對照組及小檗堿組相比,存在統(tǒng)計學差異(ρ <0.05)。說明體內(nèi) 給予藥物治療后,能夠抑制促炎細胞因子TNF- α、IFN- γ和IL-17的分泌,并能從而對CIA 疾病具有保護作用。實施例2片劑小檗堿20g乳糖177g玉米淀粉50g硬脂酸鎂3g制備方法將小檗堿、乳糖和淀粉混合,用水均勻濕潤,把濕潤后的混合物過篩并 干燥,再過篩,加入硬脂酸鎂,然后將混合物壓片,每片重250mg,小檗堿含量為20mg。實施例3 安瓿劑小檗堿IOg氯化鈉9g制備方法將小檗堿和氯化鈉溶解于適量的注射用水中,過濾所得溶液,在無菌條 件下裝入安瓿瓶中,每支含小檗堿10mg。實施例4 注射用凍干粉針劑小檗堿 IOg甘露醇 20g制備方法將小檗堿和甘露醇溶解于適量的注射用水中,過濾所得溶液,在無菌條 件下裝入西林瓶中,凍干,每支含小檗堿10mg。
權(quán)利要求
小檗堿在制備預防治療類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用,其特征在于所述藥物為小檗堿作為活性成分與常規(guī)藥 用輔料制成的藥物組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用,其特征在于所述藥物組合物為片劑、分散片、含片、口 崩片、緩釋片、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了小檗堿在制備防治類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應用。本發(fā)明采用小檗堿進行動物藥效試驗,結(jié)果顯示小檗堿可抑制膠原誘導的關(guān)節(jié)炎的臨床發(fā)病,明顯抑制了發(fā)病嚴重程度和發(fā)病率。并能下調(diào)脾細胞上清液中腫瘤壞死因子α、白介素17、干擾素γ,抑制促炎細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17的分泌,從而制備防治類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物,有較大的臨床應用價值。所述藥物為小檗堿作為活性成分與常規(guī)藥用輔料制成的藥物組合物,包括片劑、分散片、含片、口崩片、緩釋片、膠囊劑、軟膠囊劑、滴丸、顆粒劑、注射劑、粉針劑或氣霧劑。
文檔編號A61P19/02GK101822670SQ20101012657
公開日2010年9月8日 申請日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者張衛(wèi)東, 徐希科, 李慧梁, 柳潤輝, 沈云亨, 焦晴晴, 胡振林, 蘇娟 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1