專利名稱：：由肝素衍生的多糖混合物、其制備方法以及含有它們的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及由肝素衍生得到的多糖混合物、它們的制備方法以及含有它們的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：肝素是一種動(dòng)物源的硫酸化粘多糖混合物，這種混合物主要因其抗凝血和抗血栓形成性能而得到應(yīng)用。然而，肝素本身的缺陷制約著其應(yīng)用。特別是它的高抗凝血活性(抗IIa活性)可能引起出血。人們?cè)岢鐾ㄟ^(guò)肝素酯的堿解聚作用來(lái)得到低分子量肝素(EP40144)；但是，這些產(chǎn)物還是具有高的抗IIa活性。在US6384021中，也曾描述過(guò)極低分子量的肝素。然而，在其中的實(shí)施例中測(cè)得的抗Xa活性都沒(méi)有超過(guò)120IU，并且測(cè)得的抗Xa/抗IIa比是15_50。在WO0208295中，采用與US6384021不同的方法制備出極低分子量的肝素，這些肝素的活性是100-150IU，并且在一些應(yīng)用實(shí)施例中測(cè)定的抗Xa/抗IIa比也是非常高的。盡管如此，人們?nèi)孕枰岣哌@類藥物的抗Xa活性，尤其是使其活性達(dá)到150IU/mg以上，以及提高抗Xa/抗IIa比，因此，需要研制新的肝素衍生物制備方法。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是通過(guò)改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法、特別是通過(guò)控制這種解聚步驟時(shí)的水百分?jǐn)?shù)，從而來(lái)提高抗Xa活性與抗Xa/抗IIa比。由此得到的肝素具有極好的抗血栓形成活性，其抗Xa活性也與肝素的抗Xa活性相近，同時(shí)還減少了出血危險(xiǎn)性，而且抗IIa活性也非常低。同時(shí)，本發(fā)明產(chǎn)品的半衰期顯著高于肝素的半衰期。因此，本發(fā)明的目的是一些由肝素衍生得到的新多糖混合物，它們對(duì)活化因子x(因子X(jué)a)和活化因子II(因子IIa)的選擇性活性優(yōu)于肝素。應(yīng)該理解到，可以將平均分子量1500-3000道爾頓的多糖混合物稱之低聚糖。因此，本發(fā)明的目的是這些硫酸化低聚糖混合物，它們具有組成肝素的多糖的一般結(jié)構(gòu)，還具有下述特征-它們的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性是120_200IU/mg，抗IIa活性小于10IU/mg，抗Xa活性/抗IIa活性的比大于30，-組成這些混合物的低聚糖含有2-26個(gè)糖單元，在一個(gè)末端有4，5-不飽和糖醛酸2-0-硫酸酯單元，并且含有下式的六糖ΔIla-IIs-Is<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>在本發(fā)明描述的低聚糖混合物中含有的六糖ΔIIa-IIs-Is是一種對(duì)ATIII具有高親合性的序列，其特征在于抗Xa活性高于740U/mg。本發(fā)明中描述的低聚糖混合物呈堿金屬或堿土金屬鹽形式。對(duì)于堿金屬或堿土金屬鹽，優(yōu)選鈉、鉀、鈣和鎂鹽。可以采用高壓液相色譜法，使用串聯(lián)雙柱，例如以商品名TSKG3000XL和TSKG2000XL銷售的高壓液相色譜儀，測(cè)定平均分子量。采用折光計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。使用的洗脫劑是硝酸鋰，流速是0.6ml/min。采用瓊脂糖-聚丙烯酰胺凝膠層析法(IBF)分餾依諾肝素(AVENTIS)制得的標(biāo)準(zhǔn)品校正這種系統(tǒng)。根據(jù)Barrowcliffe等人，((Thromb.Res.》，12，27-36(1977-78)或D.A.Lane等人，《Thromb.Res.》，12，257-271(1977-78)描述的方法進(jìn)行制備。采用GPC6軟件(PerkinElmer)計(jì)算這些結(jié)果。根據(jù)Teien等人，《Thromb.Res.》，10，399-410(1977)描述的發(fā)色底物酰胺解方法，使用低分子量肝素的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定了抗Xa活性。采用AndersonL.0.等人，《Thromb.Res.》，15，531-541(1979)描述的技術(shù)，使用低分子量肝素的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定了抗IIa活性。優(yōu)選六糖餾分占低聚糖混合物的15-25%。優(yōu)選在低聚糖混合物的六糖餾分中，本發(fā)明的混合物含有8-15%六糖ΔIIa-II互-Is。采用高壓液相層析法，使用TSKG3000XL和TSKG2000XL柱，或者通過(guò)制備性分離六糖餾分，可以分析測(cè)定六糖餾分的百分?jǐn)?shù)。在這種情況下，使用聚丙烯酰胺瓊脂糖類凝膠填充柱，例如從市場(chǎng)上購(gòu)買商標(biāo)UltrogelACA202E(Biosepra)的填充柱，對(duì)這種混合物進(jìn)行層析分離。用碳酸氫鈉溶液洗脫這種混合物。優(yōu)選地，這種碳酸氫鈉溶液是0.I-Imol/1溶液。更優(yōu)選地，用濃度lmol/1的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行這種分離。采用UV光譜法(254nm)進(jìn)行檢測(cè)。分餾后，六糖餾分的碳酸氫鈉溶液用冰乙酸進(jìn)行中和。這種溶液然后在減壓下濃縮達(dá)到乙酸鈉濃度高于30重量％。然后加入3-5個(gè)體積的甲醇沉淀該六糖餾分。這種六糖餾分再使用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾回收。得到的六糖混合物可以采用HPLC(高效液相色譜)進(jìn)行分析，測(cè)定六糖Alla-IIs-Is的含量。根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員采用的技術(shù)(Μ·Hook,I.Bjork,J.HopwoodandU.Lindahl，《F.E.B.Sletters)),vol656(1)(1976))，采用制備性HPLC色譜法或采用親合色譜法，使用抗凝血酶III瓊脂糖柱，可以分離六糖ΔIla-IIg-Is。特別優(yōu)選本發(fā)明的混合物的抗Xa活性是150_200IU/mg。優(yōu)選本發(fā)明的混合物的抗IIa活性小于5IU/mg，特別優(yōu)選是0.5-3.5IU/mg。下面描述的這些應(yīng)用實(shí)施例證明當(dāng)采用該方法優(yōu)選特征時(shí)，本發(fā)明的混合物的抗IIa活性是1.1-1.6IU/mg。優(yōu)選這些混合物的抗Xa活性/抗IIa活性比高于50，特別優(yōu)選高于100。優(yōu)選本發(fā)明混合物的平均分子量是2000-3000道爾頓，特別優(yōu)選平均分子量是2400-2650道爾頓。因此，本發(fā)明的目的非常特別地是如前面定義的這些混合物，其抗Xa活性是150-200IU/mg，抗IIa活性是0.5-3.5IU/mg，平均分子量是2400-2650道爾頓。優(yōu)選地使用pKa大于20的強(qiáng)有機(jī)堿(優(yōu)選地具有類似于例如根據(jù)R.Schwesinger等人，((Angew.Chem.Int.Ed.Engl.》26，1167-1169(1987)，R.Schwesinger等人，((Angew.Chem.》105，1420(1993)定義的膦腈類的性質(zhì))，在有機(jī)介質(zhì)中，通過(guò)肝素芐酯季銨鹽的解聚作用，再將解聚的肝素芐酯季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽，這些殘留酯進(jìn)行皂化和任選地純化，這樣可以制備出本發(fā)明的低聚糖混合物。本發(fā)明方法重復(fù)了如在WO0208295中所述方法的主要步驟，同時(shí)增加一個(gè)基本特征，這種特征能夠使所得到的本發(fā)明低聚糖混合物具有前面描述的物理化學(xué)特征和活性。事實(shí)上，為了得到本發(fā)明的特定低聚糖混合物，需要在解聚步驟時(shí)，通過(guò)非常精確控制在這種混合物中的水含量來(lái)控制這種堿的選擇性。事實(shí)上，本發(fā)明方法的特征在于在解聚作用時(shí)控制這種堿的高選擇性。本發(fā)明能夠使這種肝素解聚，同時(shí)最大限度地保持這些對(duì)ATIII親合性的序列，例如本發(fā)明中描述的六糖Alla-IIf-Is。該方法的這個(gè)關(guān)鍵步驟確保能夠得到本發(fā)明的多糖。所述方法的這個(gè)特征使得這種平均分子量的低聚糖混合物有出乎意料的抗Xa活性(平均分子量2000-3000道爾頓時(shí)，活性為150IU/mg<抗Xa<200IU/mg)。這種選擇性是由于膦腈堿具有非常特別的物理化學(xué)特征所致，PKa大于20并且具有非常高的空間位阻和弱的親核性。這種反應(yīng)介質(zhì)是無(wú)水的時(shí)，這種效果充分表現(xiàn)出來(lái)了。相反地，反應(yīng)介質(zhì)中的水含量增加時(shí)，觀察到解聚作用的選擇性急劇降低。保持對(duì)ATIII親合性的序列降低了，其結(jié)果是抗Xa活性大大降低。在少量水的存在下，膦腈堿變成質(zhì)子化了，而這些反應(yīng)物質(zhì)變成季銨氫氧化物。在這種情況下，失去了非常高的空間位阻和弱的親核性，于是嚴(yán)重影響了所得產(chǎn)品的質(zhì)量。采用控制水含量進(jìn)行解聚作用試驗(yàn)時(shí)，可以明顯觀察到這種效果。下表匯集了水含量對(duì)解聚作用選擇性的影響(在這些試驗(yàn)中只是改變這個(gè)參數(shù)根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)，試劑的化學(xué)計(jì)算量、稀釋度與溫度保持不變。使用的堿是膦腈堿2_叔-丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯(phosphorine))ο<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>為了獲得最佳選擇性和最大保持對(duì)ATIII親合性序列，以肝素芐酯，芐乙銨(benzethonium)鹽計(jì)，使用1摩爾當(dāng)量膦腈堿時(shí)，優(yōu)選的是在水含量小于0.6%、非常優(yōu)選在小于0.3%條件下實(shí)施這個(gè)步驟。因此，非常特別地，本發(fā)明的目的是根據(jù)本
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的技術(shù)人員已知的方法得到的肝素芐酯季銨鹽解聚作用步驟，其特征在于使用特別在含有0.6%以下水的二氯甲烷溶液中的膦腈類堿。優(yōu)選水的百分?jǐn)?shù)應(yīng)該低于0.3%，特別優(yōu)選低于0.2%。最好強(qiáng)堿/酯摩爾比是0.2-5，優(yōu)選是0.6-2，特別優(yōu)選0.8-1.2。因此，使用等摩爾比為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員已知的其它非質(zhì)子溶劑，例如THF或DMF。這些肝素芐酯季銨鹽優(yōu)選地是芐乙銨、鯨蠟基吡啶鐺或鯨蠟基三甲基銨鹽。這些膦腈族堿優(yōu)選地具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中R1-R7基相同或不同，代表烷基。特別地，本發(fā)明的目的是如前面定義的方法，其特征在于解聚作用使用的堿(步驟d)是2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，3，2-二氮雜磷雜環(huán)己烯(2-[(1，1_二甲基乙基)亞氨基]-N，N-二乙基-1，2，2，2，3，5，6-八氫-1，3-二甲基-1，3，2-二氮雜磷雜環(huán)己烯-2-胺)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>或叔-丁基亞氨基三(吡咯烷-1-基)膦。在前式中，所述烷基含有1-6個(gè)直鏈或支鏈碳原子。因此，本發(fā)明的目的是一種制備本發(fā)明低聚糖混合物的方法，該方法包括下述步驟a)通過(guò)苯索氯銨的作用，使肝素鈉鹽交換，b)通過(guò)芐基氯的作用，使芐乙銨肝素鹽酯化，c)將得到的芐酯轉(zhuǎn)變成季銨鹽，d)采用前面定義的方法，使肝素芐酯季銨鹽解聚，e)將季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽，f)通過(guò)一種堿，例如氫氧化鈉的作用，任選地皂化這種肝素，g)特別地通過(guò)一種氧化劑，例如過(guò)氧化氫的作用，任選地純化。下面反應(yīng)流程圖說(shuō)明本發(fā)明<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>一般地講，在溫度15-25°c下，使用乙酸鈉醇溶液，優(yōu)選使用10%(重量/體積)乙酸鈉甲醇溶液處理這種反應(yīng)介質(zhì)，將解聚的肝素芐酯季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽(步驟e)。加入乙酸鹽的重量當(dāng)量?jī)?yōu)選地是加入這種解聚反應(yīng)中的肝素芐酯季銨鹽量的三倍。一般而言，在溫度0-20°C，優(yōu)選在0-10°C下，在含水介質(zhì)中，使用堿金屬氫氧化物，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰進(jìn)行皂化反應(yīng)(步驟f)。通常使用1-5摩爾當(dāng)量的堿金屬氫氧化物。優(yōu)選在1-2摩爾當(dāng)量的堿金屬氫氧化物存在下進(jìn)行皂化反應(yīng)?？梢圆捎萌魏我阎募兓饩鄹嗡氐姆椒?例如EP0037319B1)任選地純化這個(gè)最后產(chǎn)物(步驟g)。優(yōu)選地，在一種含水介質(zhì)中，在溫度10-50°C下使用過(guò)氧化氫進(jìn)行這種純化。優(yōu)選地，在20-4(TC下進(jìn)行這種操作。按照下述反應(yīng)流程可以制備這種肝素芐酯季銨鹽a)使用苯索氯銨轉(zhuǎn)化肝素鈉，以得到芐乙銨肝素鹽(鹽交換)，b)使用芐基氯，通過(guò)用乙酸鈉醇溶液處理，使前面得到的芐乙銨鹽酯化，以得到肝素芐酯鈉鹽，c)將肝素芐酯鈉鹽鹽交換成季銨鹽，優(yōu)選地芐乙銨、鯨蠟基吡啶鐺或鯨蠟基三甲基銨鹽。在溫度15-25°C下，通過(guò)過(guò)量苯索氯銨與肝素鈉的作用進(jìn)行步驟a)的反應(yīng)。有利地，鹽/肝素鈉摩爾比是3-4。使用的原料肝素優(yōu)選地是豬肝素。按照專利FR2663639描述的方法，可以預(yù)先對(duì)這種豬肝素進(jìn)行純化，以降低其硫酸皮膚素含量。在溫度25_45°C，優(yōu)選地30_40°C下，優(yōu)選地在含氯有機(jī)溶劑(例如氯仿或二氯甲烷)中進(jìn)行步驟b)的酯化反應(yīng)。然后，在一種醇(例如甲醇)中，使用10重量％乙酸鈉進(jìn)行沉淀，回收呈芐乙銨鹽形式的酯，該鹽是鈉鹽。每個(gè)體積的反應(yīng)介質(zhì)通常使用1-1.2個(gè)體積的醇。調(diào)節(jié)芐基氯的量和反應(yīng)時(shí)間，以達(dá)到酯化度50-100%，優(yōu)選地70-90%。優(yōu)選地，每1重量份肝素芐乙銨鹽使用0.5-1.5重量份芐基氯。同樣地，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選10-35小時(shí)。在含水介質(zhì)中，在溫度10-25°C下，使用氯化季銨，優(yōu)選使用苯索氯銨、氯化鯨蠟吡啶鐺或鯨蠟基三甲基氯化銨進(jìn)行步驟c)的鹽交換。有利地，氯化季銨/肝素芐酯鈉鹽摩爾比是2—3ο呈鈉鹽形式的本發(fā)明混合物可以轉(zhuǎn)化成另外的堿金屬或堿土金屬鹽。采用專利FR7313580描述的方法，可以任選地實(shí)現(xiàn)從一種鹽到另一種鹽的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的混合物無(wú)毒，因此可以用作藥品。本發(fā)明的低聚糖混合物可以用作抗血栓形成劑。特別地，它們用于治療或預(yù)防靜脈和動(dòng)脈血栓形成、深靜脈栓塞、肺血管梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗塞、心肌缺血、外周動(dòng)脈梗阻疾病和心房纖顫。它們還用于預(yù)防和治療平滑肌細(xì)胞增生、動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈硬化癥，通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成和生長(zhǎng)因子用于治療和預(yù)防癌，以及用于治療和預(yù)防糖尿病癥，例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和腎病。本發(fā)明還涉及含有一種式(I)混合物作為活性組分的藥物組合物，任選地還含有一種或多種惰性賦形劑。這些藥物組合物例如是可以采用皮下或靜脈內(nèi)注射方式用藥的溶液。它們還可以通過(guò)肺部(吸入)或通過(guò)口服用藥。其劑量可隨病人的年齡、體重和健康狀況而改變。成人肌內(nèi)或皮下用藥劑量通常是每天20_100mg。具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例A制備肝素芐酯芐乙銨鹽芐乙銨肝素鹽將25g苯索氯銨在125ml水中的溶液添加到IOg肝素鈉鹽在IOOml水中的溶液里，該產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濾后，用水洗滌與干燥。肝素芐酯(鈉鹽)將16ml芐基氯添加到20g肝素芐乙銨鹽在80ml二氯甲烷中的溶液中。該溶液在溫度30°C下加熱12小時(shí)。然后添加108ml10%乙酸鈉甲醇溶液，混合物經(jīng)過(guò)濾后，用甲醇洗滌與干燥。這樣得到7.6g肝素芐酯，呈鈉鹽形式，它的酯化度是77%。肝素芐酯(芐乙銨鹽)將36g(0.0549mol)肝素芐酯(鈉鹽)和540ml蒸餾水加到2升三角燒瓶A中。在溫度約20°C下均化后，得到了淡黃色溶液。在磁攪拌下，在1升三角燒瓶B中制備了64.45g(0.1438mol)苯索氯銨和450ml水的溶液。在攪拌下，在約35分鐘內(nèi)將三角燒瓶B中的溶液倒入在三角燒瓶A中的溶液里。觀察到已生成大量的白色沉淀物。用200ml蒸餾水漂洗三角燒瓶B，再將洗滌水加到三角燒瓶A中。然后停止攪拌，再使這種懸浮液沉淀12小時(shí)。這個(gè)時(shí)間一過(guò)，就除去上清液的透明部分并棄去。再將560ml水添加到沉降的沉淀物(漿體狀)中，該混合物攪拌20分鐘。使這種沉淀物再沉降約30分鐘。除去上清液并棄去(560ml)。使用約560ml蒸餾水洗滌沉降沉淀物，這個(gè)洗滌操作重復(fù)進(jìn)行兩次。在最后的洗滌操作中，這種沉淀物呈懸浮液狀，再用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾。這種濾餅然后洗滌4次，每次200ml蒸餾水。這種白色濕固體經(jīng)脫水后，在減壓下(2.7kPa)與溫度約60°C下干燥。干燥12小時(shí)后，得到87.5g肝素芐基酯，為芐乙銨鹽。其產(chǎn)率是94.9%。實(shí)施例B六糖ATIII(ΔIla-IIs-Is)的描述NaNaNaP0=S'°O=S:-0O=Sf0NaOONaOONaO。b-/_((M。C。o….…O…O…11〇…O"'OHOHNHOHONHΟPO.NH<(O-S^ISO-SxV丨、、π'丨、、ONaOVONaONaAHalisIs在D2O中的質(zhì)子譜，500MHz，T=298K，δ，以ppm表示1.97(3H，s)，3.18(1H，dd,10和3Hz)，3.30(1H,t,8Hz)，3.37(1H,dd,10和3Hz)，3.60(2H,m)，3.65-3.85(6H,m)，3.87(2H,m)，3.95(1H,d,8Hz)，4.03(1H,d,8Hz)，4.05-4.13(4H,m)，4.16-4.45(8H,m)，4.52(1H,d,8Hz)，4.67(1H,m)，5.06(1H,d,6Hz)，5.10(1H,d,3Hz)，5.33(1H,d,4Hz)，5.36(1H,d,3Hz)，5.46(1H,d,3Hz)，5.72(1H,d,4Hz)。4-脫氧-α-L-蘇型-吡喃己烯糖基糖醛酸-(1—4)_2_脫氧_2_乙酰氨基-6-0-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1—4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1—4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3，6-二-0-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基)_(1—4)-2-0-磺基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸_(1—4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-0-磺基-α-D-吡喃葡糖糖十鈉鹽。實(shí)施例1-7和12說(shuō)明了水含量對(duì)該聚合反應(yīng)的選擇性和對(duì)所得產(chǎn)物的抗Xa和抗IIa活性的影響。實(shí)施例8-10說(shuō)明了堿當(dāng)量數(shù)對(duì)所得產(chǎn)物的抗Xa和抗IIa活性的影響(使用水含量0.)實(shí)施例11說(shuō)明了使用除2-叔-丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫_1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯之外的膦腈堿使用叔-丁基亞氨基三(吡咯烷-1-基)膦。實(shí)施例1解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.水)在三角燒瓶A中放入70ml二氯甲烷。在攪拌下緩慢加入IOg(0.006mol)如實(shí)施例A描述得到的肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.1%。該溶液在氮?dú)庀录訜岬?0°C。在完全溶解后，該溶液冷卻到溫度約20°C，然后添加1.75ml(0.006mol)2-叔-丁基亞氨基_2_二乙基氨基_1，3-二甲基全氫_1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。得到的混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備出30g無(wú)水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將5gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌下，在1分30秒內(nèi)將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物倒入溫度約5°C的乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時(shí)30分鐘。分離上清液清澈部分，并棄去(220ml)。然后將220ml甲醇添加到這種沉降的沉淀物中，再攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約1小時(shí)20分鐘。分離并棄去這種上清液(250ml)。然后將250ml甲醇添加到這種沉降的沉淀物中，混合物攪拌5分鐘。懸浮液中的沉淀物然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾。得到的濾餅再用IOOml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到2.51g在硅藻土(5g)中的解聚肝素鈉鹽。其產(chǎn)率是64%。皂化作用將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和17ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5°C下加入0.4ml(0.004mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHCl進(jìn)行中和，再加入3g氯化鈉。溶解后，將21ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入44ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5°C下沉降45分鐘。然后分離并棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約20分鐘。分離并棄去上清液(80ml)。往沉降沉淀物添加80ml甲醇，再攪拌5分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到1.31g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是66%。純化將1.3g前面得到的粗制解聚肝素和13ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.07ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)，然后該混合物添加INHCl進(jìn)行中和，接著加入2g氯化鈉。該溶液然后用0.45μm膜過(guò)濾，再倒入14ml甲醇。該溶液然后冷卻到10°C，攪拌約15分鐘。然后添加36ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液傾析約15分鐘。然后分離并棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液中的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到1.13g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是87%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2600道爾頓抗Xa活性177IU/mg抗IIa活性1.5IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比118實(shí)施例2解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.2%水)將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下與在氮?dú)鈮毫ο?，緩慢加入如?shí)施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.2%。完全溶解后，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備30g無(wú)水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將5gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5°C下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析2小時(shí)。分離并棄去上清液的清澈部分(220ml)。將220ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約2時(shí)。分離并棄去上清液(230ml)。將230ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液中的沉淀物。得到的濾餅然后用150ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到2.63g在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素。其產(chǎn)率是67%。皂化作用將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和18ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5°C下加入0.4ml(0.004mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHCl進(jìn)行中和，再加入2g氯化鈉。將14ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入36ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5°C下沉降45分鐘。然后分離并棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。往沉降沉淀物添加80ml甲醇，再攪拌5分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥48小時(shí)后，得到2.3g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是65%。純化將1.4g前面得到的粗制解聚肝素和15ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45μm膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.07ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約40°C下攪拌約2小時(shí)，然后該混合物冷卻到溫度20°C，再添加INHCl進(jìn)行中和。往該反應(yīng)介質(zhì)加入2g氯化鈉。該溶液然后用0.45μm膜過(guò)濾，再倒入14ml甲醇。該溶液然后冷卻到10°C，攪拌約15分鐘。這時(shí)添加36ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液傾析約15分鐘。然后分離并棄去上清液(40ml)。將40ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約20分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液中的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到1.2g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是86%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2650道爾頓抗Xa活性161IU/mg抗IIa活性1.4IU/mg抗Xa活性/抗IIa活性比115實(shí)施例3解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.3%水)將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下與在氮?dú)鈮毫ο?，加入如?shí)施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.3%。完全溶解后，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備30g無(wú)水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將5gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5°C下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時(shí)10分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(220ml)。將220ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液中的沉淀物。得到的濾餅然后用IOOml甲醇洗滌。濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到2.57g在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。其產(chǎn)率是66%。皂化作用將2.5g(0.0038mol)前面得到的在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和18ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，再用水漂洗兩次，每次5ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5°C下加入0.4ml(0.004mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHCl進(jìn)行中和，再加入3g氯化鈉。將15ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入36ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液傾析1小時(shí)。然后分離并棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度40°C下干燥。干燥48小時(shí)后，得到1.42g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是62%。純化將1.4g前面得到的粗制解聚肝素和14ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.07ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入2g氯化鈉。溶解后，溶液再用0.45ym膜過(guò)濾，再倒入14ml甲醇。該濾液然后冷卻到10°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加36ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液傾析約40分鐘。然后分離并棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉淀物(漿體狀)中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液中的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到1.24g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是89%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2400道爾頓抗Xa活性132IU/mg抗Ila活性1.4IU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比94實(shí)施例4解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.4%水)將70ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.4%。該溶液在氮?dú)庀掠?0°C下加熱。完全溶解后，再降到溫度約20°C，然后添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基_1，3-二甲基全氫_1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備30g無(wú)水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將5gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約5°C下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析2小時(shí)。分離并棄去上清液的清澈部分(80ml)。將80ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。將沉淀物再沉降約1小時(shí)。分離上清液并棄去(80ml)。將80ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液中的沉淀物。得到的濾餅然后用150ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到3.25g在硅藻土(5g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是83%。皂化作用將3.lg(0.0018mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和21ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，再用水漂洗兩次，每次6ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5°C下加入0.7ml(0.007mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入4g氯化鈉。將28ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入72ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液傾析1小時(shí)。然后分離并棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約20分鐘。然后分離并棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥48小時(shí)后，得到1.9g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是67%。純化將1.9g前面得到的粗制解聚肝素和19ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45um膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.lml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入2g氯化鈉。這種溶液用0.45ym膜過(guò)濾，再倒入14ml甲醇，攪拌15分鐘。這時(shí)添加36ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液傾析15分鐘。然后分離并棄去上清液(40ml)。將40ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約20分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。將500ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約20分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥72小時(shí)后，得到1.56g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是82%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2350道爾頓抗Xa活性122IU/mg抗Ila活性1.3IU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比94實(shí)施例5解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.57%水)將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到0.57%。完全溶解后，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備60g無(wú)水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將10gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4°C下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約1小時(shí)。分離并棄去上清液(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到6.66g在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是85%。皂化作用將6.66g(0.0101mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和47ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約5°C下加入1.lml(0.Ollmol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入9.5g氯化鈉。將66ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入171ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約5°C下傾析3/4小時(shí)。然后分離并棄去上清液(160ml)。將160ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約20分鐘。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到4.53g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是74%。純化將4.53g前面得到的粗制解聚肝素和45ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.25ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入5.5g氯化鈉。這種溶液用0.45ym膜過(guò)濾，再在溫度約10°C下倒入38ml甲醇。該溶液然后升到20°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加100ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液傾析20分鐘。然后分離并棄去上清液(90ml)。將90ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。分離并棄去上清液(100ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到3.7g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是82%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2200道爾頓抗Xa活性120IU/mg抗Ila活性1.4IU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比86實(shí)施例6解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(1.8%水)將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到1.8%。完全溶解后，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基_1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備60g無(wú)水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將10gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4°C下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約1小時(shí)。分離并棄去上清液(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約50°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到7.54g在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是96%。皂化作用將7.54g(0.0101mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和53ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4°C下加入1.25ml(0.012mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入10.5g氯化鈉。將70ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入190ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4°C下沉降3/4小時(shí)。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約20分鐘。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度50°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到5.53g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是80%。純化將5.53g前面得到的粗制解聚肝素和55ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.31ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入7g氯化鈉。這種溶液用0.45ym膜過(guò)濾，再在溫度約10°C下倒入49ml甲醇。該溶液然后升到20°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加126ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然后分離并棄去上清液(105ml)。將105ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。分離并棄去上清液(110ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約55°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到4.53g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是82%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2600道爾頓抗Xa活性105IU/mg抗Ila活性3.lIU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比34實(shí)施例7解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(2.5%水)將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。將反應(yīng)介質(zhì)的水含量調(diào)節(jié)到2.5%。完全溶解后，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備60g無(wú)水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。完全溶解后，將10gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4°C下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物在1分30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時(shí)。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(400ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約50°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到7.78g在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是99.6%。皂化作用將7.78g(0.0119mol)前面得到的在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽和79ml水放到50ml三角燒瓶中。這種懸浮液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，再用水漂洗兩次，每次15ml。將得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4°C下加入1.3ml(0.012mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入10g氯化鈉。將60ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入190ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4°C下沉降3/4小時(shí)。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約20分鐘。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度50°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到5.87g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是82%。純化將5.87g前面得到的粗制解聚肝素和59ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.34ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入7g氯化鈉。這種溶液用0.45ym膜過(guò)濾，再在溫度約10°C下倒入49ml甲醇。該溶液然后升到20°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加126ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然后分離并棄去上清液(105ml)。將105ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約25分鐘。分離并棄去上清液(110ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約55°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到5.21g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是89%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量3550道爾頓抗Xa活性99IU/mg抗Ila活性13.4IU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比7.4實(shí)施例8解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.5當(dāng)量堿)將140ml二氯甲烷裝入三角燒瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。在溫度約30°C下完全溶解，再降到溫度約20°C后，添加1.75ml(0.006mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備60g無(wú)水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4°C下，將三角燒瓶A中的反應(yīng)混合物倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌1小時(shí)后，使這種懸浮液傾析2小時(shí)。分離并棄去上清液的清澈部分(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。使這種沉淀物再沉降約18小時(shí)。分離并棄去上清液(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用甲醇洗滌兩次，每次100ml。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約60°C下干燥。干燥后，得到5.7g粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是73%。皂化作用將5.7g(0.0086mol)前面得到的粗制解聚肝素鈉鹽和53ml水放到100ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4°C下加入0.93ml(0.009mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入6g氯化鈉。將42ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入108ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4°C下沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(180ml)。將180ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約30分鐘。然后分離并棄去上清液(170ml)。將170ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓與溫度60°C下干燥。干燥后，得到3.5g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是67.4%。純化將3.5g前面得到的粗制解聚肝素和35ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.6士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.18ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入3.6g氯化鈉。這種溶液用0.45ym膜過(guò)濾，再在溫度約10°C下倒入27ml甲醇。該溶液然后升到20°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加65ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。使沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓與溫度約60°C下干燥。干燥后，得到2.8g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是80%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2900道爾頓抗Xa活性146.lIU/mg抗Ila活性5.lIU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比28.6實(shí)施例9解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.6當(dāng)量堿)將280ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的40g(0.024mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。在溫度約30°C下完全溶解，再降到溫度約20°C后，添加4.2ml(0.014mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備60g無(wú)水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4°C下，將三頸瓶A中的一半反應(yīng)混合物倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌1小時(shí)后，使這種懸浮液傾析。分離并棄去上清液的清澈部分(310ml)。將310ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌1小時(shí)。使這種沉淀物再沉降約18小時(shí)。分離并棄去上清液(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌1小時(shí)。分離并棄去上清液(300ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用甲醇洗滌兩次，每次100ml。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓與溫度約60°C下干燥。干燥后，得到6g粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是77%。皂化作用將6g(0.0091mol)前面得到的粗制解聚肝素鈉鹽和56ml水放到250ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4°C下加入lml(0.010mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入6.4g氯化鈉。將45ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入115ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4°C下沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(170ml)。將170ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。再使這種沉淀物再沉降約30分鐘。然后分離并棄去上清液(140ml)。將140ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓與溫度60°C下干燥。干燥后，得到3.6g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是65.3%。純化將3.5g前面得到的粗制解聚肝素和35ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.6士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.18ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入3.5g氯化鈉。這種溶液用0.45ym膜過(guò)濾，再在溫度約10°C下倒入25ml甲醇。該溶液然后升到20°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加63ml甲醇，接著攪拌30分鐘。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(70ml)。將70ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。使沉淀物再沉降幾分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次30ml。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓與溫度約60°C下干燥。干燥后，得到2.5g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是71.4%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2600道爾頓抗Xa活性150.5IU/mg抗Ila活性3.2IU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比47實(shí)施例10解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.8當(dāng)量堿)將70ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的10g(0.006mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。在溫度約30°C下完全溶解，再降到溫度約20°C后，添加1.38ml(0.004mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備30g無(wú)水乙酸鈉在300ml甲醇中的溶液。在磁攪拌與溫度約4°C下，將三頸瓶A中的反應(yīng)混合物在1分鐘15秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時(shí)。分離并棄去上清液的清澈部分(190ml)。將190ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(190ml)。將190ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。分離并棄去上清液(190ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用150ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到3.05g粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是80%。皂化作用將3.05g(0.0048mol)前面得到的粗制解聚肝素鈉鹽和21ml水放到100ml三角燒瓶中。該溶液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，用水漂洗兩次，每次6ml。得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4°C下加入0.6ml(0.006mol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入4g氯化鈉。將28ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入72ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4°C下沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約30分鐘。然后分離并棄去上清液(80ml)。將80ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌30分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度40°C下干燥。干燥后，得到1.6g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是57%。純化將1.6g前面得到的粗制解聚肝素和16ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.6士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.08ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入2g氯化鈉。這種溶液用0.45ym膜過(guò)濾，再在溫度約10°C下倒入14ml甲醇。該溶液然后升到20°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加36ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液沉降30分鐘。然后分離并棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥后，得到1.25g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是78%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2400道爾頓抗Xa活性154.3IU/mg抗Ila活性1.6IU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比96.4實(shí)施例11解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽將140ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。在溫度約40°C下完全溶解，再降到溫度約20°C后，添加3.5ml(0.Ollmol)叔丁基亞氨基-三(吡咯烷基)膦。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備60g無(wú)水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在完全溶解后，將10gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4°C下，將三頸瓶A中的反應(yīng)混合物在1分鐘30秒內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析30分鐘。分離并棄去上清液的清澈部分(400ml)。將400ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使這種沉淀物再沉降約1小時(shí)20分鐘。分離并棄去上清液(250ml)。將250ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥后，得到5.39g粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是69%。皂化作用將5g(0.0076mol)前面得到的粗制解聚肝素(芐酯，鈉鹽)和35ml水放到50ml三角燒瓶中。該溶液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，用水漂洗兩次，每次10ml。得到的濾液裝入250ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4°C下加入1ml(0.Olmol)30%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌2小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入6g氯化鈉。將42ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入104ml甲醇，接著攪拌15分鐘。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4°C下沉降1小時(shí)。然后分離并棄去上清液(140ml)。將140ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。再使這種沉淀物再沉降約45分鐘。然后分離并棄去上清液(160ml)。將160ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的濾餅再用100ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥后，得到2.7g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是59%。純化將2.6g前面得到的粗制解聚肝素和25ml蒸餾水裝入50ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.15ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入3g氯化鈉。這種溶液用0.45ym膜過(guò)濾，再在溫度約10°C下倒入21ml甲醇。該溶液然后升到20°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加54ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液沉降20分鐘。然后分離并棄去上清液(50ml)。將50ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約20分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用50ml甲醇洗滌。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到2.35g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是90%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2400道爾頓抗Xa活性167.5IU/mg抗Ila活性1.lIU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比152實(shí)施例12解聚作用并轉(zhuǎn)化成鈉鹽(0.05%水)將140ml二氯甲烷裝入三頸瓶A中。在攪拌下，緩慢加入如實(shí)施例A中描述得到的20g(0.019mol)肝素芐酯(酯化度75%，芐乙銨鹽)。往該反應(yīng)介質(zhì)添加20g4A分子篩，將水含量調(diào)節(jié)到0.05%，同時(shí)緩慢攪拌48小時(shí)。在惰性氣氛下將其上清液轉(zhuǎn)移到三頸瓶A中。在完全溶解后，添加3.5ml(0.012mol)2-叔丁基亞氨基_2_二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，2，3-二氮雜磷雜環(huán)己烯。這種混合物在溫度約20°C下攪拌24小時(shí)。在這個(gè)時(shí)間，在三角燒瓶B中制備60g無(wú)水乙酸鈉在600ml甲醇中的溶液。在完全溶解后，將10gHyflosupercel硅藻土添加到該溶液中。在磁攪拌與溫度約4°C下，將三頸瓶A中的反應(yīng)混合物在2分鐘內(nèi)倒入上述乙酸鈉甲醇溶液中。在攪拌5分鐘后，使這種懸浮液傾析1小時(shí)。分離并棄去上清液的清澈部分(420ml)。將420ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌15分鐘。使這種沉淀物再沉降約1小時(shí)。分離并棄去上清液(450ml)。將450ml甲醇添加到沉降沉淀物中，攪拌15分鐘。然后用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液。得到的濾餅然后用200ml甲醇洗滌。淡黃色濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約50°C下干燥。干燥16小時(shí)后，得到5.36g在硅藻土(10g)中的粗制解聚肝素鈉鹽。產(chǎn)率是68.6%。皂化作用將5.36g(0.00817mol)前面得到的粗制解聚肝素鈉鹽和50ml水放到50ml三角燒瓶中。該懸浮液用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，用水漂洗四次，每次15ml。得到的濾液裝入150ml三角燒瓶中。在磁攪拌與溫度約4°C下加入1.01ml(0.0122mol)35%氫氧化鈉溶液。加完后，該混合物攪拌3小時(shí)。這種溶液用INHC1進(jìn)行中和，再加入llg氯化鈉。將77ml甲醇添加到反應(yīng)介質(zhì)中。攪拌15分鐘后，加入200ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液在溫度約4°C下沉降1小時(shí)。然后分離并棄去上清液(240ml)。將240ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌10分鐘。再使這種沉淀物再沉降約30分鐘。然后分離并棄去上清液(225ml)。將225ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌10分鐘。用3號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾懸浮液。得到的濾餅再用甲醇洗滌兩次，每次50ml。這種濕固體經(jīng)脫水后在減壓(6kPa)與溫度約40°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到2.65g粗制解聚肝素(鈉鹽)。產(chǎn)率是53.7%。純化將2.65g前面得到的粗制解聚肝素和26.5ml蒸餾水裝入100ml三角燒瓶中。這種混合物在磁攪拌下升溫到40°C。加入IN氫氧化鈉將其pH調(diào)節(jié)到9.7士0.1。反應(yīng)介質(zhì)使用0.45ym膜進(jìn)行過(guò)濾，再添加0.25ml30%過(guò)氧化氫水溶液。在溫度約20°C下攪拌約2小時(shí)后，往該混合物添加INHC1進(jìn)行中和，然后加入3g氯化鈉。這種溶液用0.45i!m膜過(guò)濾，再在溫度約10°C下倒入21ml甲醇。該溶液然后升到20°C，攪拌15分鐘。這時(shí)添加54ml甲醇，接著攪拌1小時(shí)。這時(shí)停止攪拌，使這種懸浮液沉降45分鐘。然后分離并棄去上清液(46ml)。將46ml甲醇添加到這種沉降沉淀物中，攪拌5分鐘。使沉淀物再沉降約30分鐘。分離并棄去上清液(50ml)。然后用4號(hào)燒結(jié)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾呈懸浮狀的沉淀物。得到的白色濾餅再用兩份甲醇洗滌，每份10ml。這種濕固體經(jīng)脫水后，在減壓(6kPa)與溫度約50°C下干燥。干燥18小時(shí)后，得到2.363g純解聚肝素(鈉鹽)。其產(chǎn)率是89.1%。如此得到的解聚肝素特征如下平均分子量2500道爾頓抗Xa活性192IU/mg抗Ila活性1.3IU/mg抗Xa活性/抗Ila活性比148。權(quán)利要求硫酸化低聚糖混合物，它們具有組成肝素的多糖的一般結(jié)構(gòu)，還具有下述特征-它們的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性是150.5-200IU/mg，抗IIa活性小于10IU/mg，抗Xa活性/抗IIa活性的比大于30，這些混合物的組分低聚糖-含有2-26個(gè)糖單元，-在其中一個(gè)末端有4，5-不飽和糖醛酸2-O-硫酸酯單元，-含有下式的六糖ΔIIa-IIs-Is并且這些低聚糖混合物呈堿金屬或堿土金屬鹽形式。FSA00000028034000011.tif2.根據(jù)權(quán)利要求所述1的低聚糖混合物，其特征在于堿金屬或堿土金屬鹽選自鈉、鉀、鈣和鎂鹽。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗IIa活性小于5IU/mg。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗IIa活性是0.5-3.5IU/mg05.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗Xa活性/抗IIa活性比大于50。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗Xa活性/抗IIa活性比大于100。7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的低聚糖混合物，其特征在于它的平均分子量是2000-3000道爾頓。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的低聚糖混合物，其特征在于它的平均分子量是2400-2650道爾頓。9.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的低聚糖混合物，其特征在于它的抗Xa活性是150-200IU/mg，抗IIa活性是0.5-3.5IU/mg，而平均分子量是2400-2650道爾頓。10.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述低聚糖混合物的方法，在制備過(guò)程中，在一種有機(jī)介質(zhì)中，在一種PKa大于20的強(qiáng)有機(jī)堿存在下，對(duì)肝素芐酯季銨鹽進(jìn)行解聚，其特征在于使用的有機(jī)堿為膦腈族堿。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于使用的膦腈族堿是含有水百分?jǐn)?shù)小于0.3%的膦腈族堿二氯甲烷溶液。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備權(quán)利要求1所述低聚糖混合物的方法，其特征在于水含量小于0.2%。13.根據(jù)權(quán)利要求10或12所述的制備方法，其特征在于肝素芐酯季銨鹽是芐乙銨、鯨蠟基吡啶鐺或鯨蠟基三甲基銨鹽。14.根據(jù)權(quán)利要求10或12所述的制備方法，其特征在于膦腈族堿是下式的堿<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式中R1-R7是相同或不同的，它們代表有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈含烷基。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的制備方法，其特征在于解聚步驟使用的膦腈族堿是2-叔丁基亞氨基-2-二乙基氨基-1，3-二甲基全氫-1，3，2-二氮雜磷雜環(huán)己烯或叔丁基亞氨基-三(吡咯烷-ι-基)_膦。16.根據(jù)權(quán)利要求10或12所述的制備方法，其特征在于這種強(qiáng)堿/肝素芐酯季銨鹽的摩爾比是0.2-5。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的制備方法，其特征在于這種強(qiáng)堿/酯摩爾比是0.6-2。18.使用肝素制備根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述低聚糖的方法，其中進(jìn)行下述操作a)通過(guò)苯索氯銨的作用，使肝素鈉鹽交換，b)通過(guò)芐基氯的作用，使芐乙銨肝素鹽酯化，c)將得到的芐酯鹽交換成肝素芐酯季銨鹽，d)采用權(quán)利要求14或15定義的方法，使肝素芐酯季銨鹽解聚，e)將季銨鹽鹽交換成解聚肝素芐酯鈉鹽，f)通過(guò)一種堿的作用皂化或者不皂化這種解聚肝素芐酯鈉鹽，g)通過(guò)一種氧化劑作用，進(jìn)行或不進(jìn)行純化。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于步驟f)中使用的堿為氫氧化鈉。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于步驟g)中使用的氧化劑為過(guò)氧化氫。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于在溫度約15-25°C與苯索氯銨/肝素鈉摩爾比3-4的條件下，通過(guò)過(guò)量苯索氯銨與肝素鈉的作用進(jìn)行步驟a)的反應(yīng)。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于在含氯有機(jī)溶劑中，在溫度25-45°C下進(jìn)行步驟b)的酯化反應(yīng)，然后使用10重量％乙酸鈉醇溶液沉淀回收呈鈉鹽形式的酯，所述醇的濃度是每個(gè)體積的反應(yīng)介質(zhì)為1-1.2個(gè)體積的醇。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述醇是甲醇。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于所述的含氯有機(jī)溶劑是氯仿或二氯甲焼。25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于在溫度30-40°C下進(jìn)行步驟b)的酯化反應(yīng)。26.根據(jù)權(quán)利要求18或22所述的方法，其特征在于肝素芐酯季銨鹽的酯化度是50-100%。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于肝素芐酯季銨鹽的酯化度是70-90%。28.根據(jù)權(quán)利要求18或22所述的方法，其特征在于每1重量份肝素芐乙銨鹽使用0.5-1.5重量份芐基氯，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)是10-35小時(shí)。29.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于在一種含水介質(zhì)中，在溫度10-25°C下，使用氯化季銨，優(yōu)選使用苯索氯銨、氯化鯨蠟吡啶鐺或鯨蠟基三甲基氯化銨，進(jìn)行步驟C)的鹽交換。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于氯化季銨/肝素芐酯鈉鹽的摩爾比是2-3。31.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于在溫度15-25°C下，使用乙酸鈉醇溶液處理反應(yīng)介質(zhì)，將解聚的肝素芐酯季銨鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于所述乙酸鈉醇溶液為10%重量/體積的乙酸鈉甲醇溶液。33.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于在一種含水介質(zhì)中，在溫度0-20°C下，使用堿金屬氫氧化物進(jìn)行該皂化作用，所述的堿金屬氫氧化物是氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于反應(yīng)溫度為0-10°C。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于使用1-5摩爾當(dāng)量堿金屬氫氧化物。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于使用1-2摩爾當(dāng)量氫氧化鈉。37.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于在一種含水介質(zhì)中，在溫度10-50°C下，使用過(guò)氧化氫進(jìn)行純化步驟g。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于所述溫度為20-40°C。39.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的低聚糖作為藥物。40.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的低聚糖作為具有抗血栓形成活性的藥物。41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的藥物，它們用于治療或預(yù)防靜脈和動(dòng)脈血栓形成、深靜脈栓塞、肺血管梗塞、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗塞、心肌缺血、外周動(dòng)脈梗阻疾病和心房纖顫、平滑肌細(xì)胞增生、動(dòng)脈粥樣硬化病和動(dòng)脈硬化癥，通過(guò)調(diào)節(jié)血管生成和生長(zhǎng)因子用于治療和預(yù)防癌，以及用于治療和預(yù)防糖尿病癥。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的藥物，其中所述糖尿病癥為糖尿病性視網(wǎng)膜病和腎病。43.一種藥物組合物，它含有至少一種如權(quán)利要求38限定的藥物和一種或多種藥用惰性賦形劑或載體或添加劑。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其特征在于它是采用皮下或靜脈內(nèi)注射方法給藥的溶液。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其特征在于它是通過(guò)肺部吸入方法給藥的制劑。46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其特征在于它是通過(guò)口服方法給藥的制劑。47.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)權(quán)利要求所限定的多糖混合物，它們可以采用權(quán)利要求18所限定的方法得到。全文摘要本發(fā)明涉及由肝素衍生的多糖混合物、其制備方法以及含有它們的藥物組合物。這些肝素衍生的多糖混合物的平均分子量是1500-3000道爾頓，抗Xa活性/抗IIa活性的比大于30。本發(fā)明還涉及它們的制備方法和含有它們的藥物組合物。文檔編號(hào)A61P3/10GK101817940SQ201010120370公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2003年10月8日優(yōu)先權(quán)日2002年10月10日發(fā)明者C·維斯科夫,L·格龍達(dá)爾,P·穆里耶,V·比貝爾羅維科申請(qǐng)人:安萬(wàn)特醫(yī)藥股份有限公司