專利名稱：：一種預(yù)防肥胖癥和降低高血脂的柳茶有效部位提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，人類營養(yǎng)狀況得到大幅度改善，肥胖和高膽固醇血癥已成為影響人類健康的關(guān)鍵問題，尋找有效的預(yù)防和/或治療肥胖和高膽固醇血癥的中藥有效成分已成為本領(lǐng)域關(guān)注的熱點。肥胖(obesity)是指長期能量攝入超過消耗，導(dǎo)致體內(nèi)過多的能量以脂肪的形式儲存，脂肪的聚集達到損害健康的程度。肥胖與許多重大疾病如糖尿病、心腦血管疾病、癌癥、睡眠呼吸暫停綜合癥以及骨關(guān)節(jié)炎等相關(guān)。高血脂癥是一種全身性疾病，是指血中總膽固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)過高或高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)過低。脂質(zhì)不溶或微溶于水，必須與蛋白質(zhì)結(jié)合以脂蛋白形式存在，因此，高血脂癥通常為高脂蛋白血癥，即血清脂蛋白濃度升高。目前已經(jīng)公認高血脂癥，包括高膽固醇血癥(Hypercho1estero1emia)、高甘油三脂血癥(Hypertriglyceridemia)及二者都高的復(fù)合性高血脂癥。世界衛(wèi)生組織已宣布肥胖是全球最大的慢性疾病。美國肥胖的流行比例最高，有35%的人口確定為肥胖。至少有9700萬美國人，為超重或肥胖，從1960年以來這個數(shù)字在持續(xù)增長，趨勢不會減慢。在歐洲，英國是肥胖增長率最高的國家之一，為18%。緊接著是法國和德國，在全世界總共有2.5億以上的人口患有肥胖癥。而且，肥胖與死亡率有關(guān)，在美國每年因肥胖而導(dǎo)致死亡的人數(shù)在300，000人。加強對肥胖病因、發(fā)病機制及防治藥物的研究已成為21世紀(jì)面臨的最大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。在整體水平，能量吸收和能量消耗失衡導(dǎo)致肥胖，在細胞水平，肥胖是由脂肪細胞的數(shù)目增多和體積增大所致，脂肪細胞的增多是由于前脂肪細胞的不斷增殖和分化所引起，脂肪細胞的體積反映了在特定細胞中脂質(zhì)分解和合成之間的平衡。而肥胖和高血脂的共同特點是脂肪細胞數(shù)目過量增多，因此尋找一種能夠抑制脂肪細胞增殖和分化的藥物對于肥胖癥的防治和降低高血脂將起到非常重要的作用。預(yù)防肥胖對于有肥胖傾向人群是十分必要的。脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]是一種特殊獨立的血槳脂蛋白。已發(fā)現(xiàn)在血栓性疾病、腎臟疾病、糖尿病患者的脂蛋白(a)血清水平明顯高于一般人群，但目前故尚無確切降低脂蛋白(a)濃度的藥物。因此尋找能夠確切降低脂蛋白(a)濃度的藥物實屬當(dāng)務(wù)之急。柳茶為藏族民間常用藥物，以薔薇科(Rosaceae)鮮卑花屬(Sibiraea)植物窄葉3魚羊卑花(Sibiraeaangustata(Rehd.)Hand_Mazz.)或魚羊卑花(Sibiraealaevigata(L)Maxim.)的葉和嫩枝入藥，具清胃熱、助消化、調(diào)節(jié)脂代謝的功效。目前已有"柳茶水提取物對K562腫瘤細胞生長的影響"、"柳茶提取物免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究"、"柳茶對小鼠抗氧化能力及免疫器官影響的實驗觀察"、"柳茶對CC14肝損傷的保護作用及機理初探"和"柳茶調(diào)節(jié)脂類代謝作用的研究"等報道，但是還未見"預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物"的報道。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物。本發(fā)明的再一目的是提供上述提取物的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物的用途。根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的柳茶有效部位提取物通過包括以下步驟的方法獲得，1)清洗并粉碎柳茶原料；2)以水浸提粉碎后的柳茶、并濃縮，得到柳茶水提總浸膏；3)以甲醇或乙醇溶解所述柳茶水提總浸膏，并加水分散，得到醇溶液；4)以氯仿或二氯甲烷萃取所述醇溶液；5)用乙酸乙酯萃取被氯仿或二氯甲烷脫脂后的水溶液，所得乙酸乙酯萃取液即為所述能預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物。根據(jù)本發(fā)明的柳茶有效部位提取物，其中，在步驟2)中，以水冷浸或熱提方法浸提柳茶原料。根據(jù)本發(fā)明的柳茶有效部位提取物，其中，在步驟2)中，水與柳茶原料的質(zhì)量比為8:i15:i。根據(jù)本發(fā)明的柳茶有效部位提取物，其中，所述方法還包括濃縮所述乙酸乙酯萃取液得到浸膏的步驟。根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物的制備方法包括以下步驟1)清洗并粉碎柳茶原料；2)以水浸提粉碎后的柳茶、并濃縮，得到柳茶水提總浸膏；3)以甲醇或乙醇溶解所述柳茶水提總浸膏，并加水分散，得到醇溶液；4)以氯仿萃取所述醇溶液；5)用乙酸乙酯萃取被氯仿脫脂后的水溶液，所得乙酸乙酯萃取液即為所述能預(yù)防肥胖癥和降低高血脂的柳茶有效部位提取物。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，在步驟2)中，以水冷浸或熱提方法浸提柳茶原料。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，在步驟2)中，水與柳茶原料的質(zhì)量比為8:115:1。本發(fā)明還提供了預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)藥物，所述藥物包括上述的預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的柳茶有效部位提取物。本發(fā)明還提供了上述柳茶有效部位提取物在制備用于預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人通過涉及適當(dāng)?shù)奶崛》桨刚业搅肆杼崛∥镏心軌蝾A(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的有效部位一乙酸乙酯萃取液或浸膏，其可以抑制前體脂肪細胞增殖和分化，起到預(yù)防肥胖和治療高血脂癥的作用，從而拓寬了柳茶提取物的醫(yī)藥用途，同時也提供了一種安全有效的預(yù)防肥胖癥和和治療高膽固醇血癥(降低血液中的甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和脂蛋白(a)濃度，改善血液粘稠度)的藥物。圖1為MTT法檢測柳茶乙酸乙酯提取物不同時間(A)和不同濃度(B)處理對3T3-L1前脂肪細胞的細胞增殖率的影響，匿分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基；SAA:柳茶乙酸乙酯提取物；SAA100:100mg/mlSAA。圖2流式細胞術(shù)檢測柳茶乙酸乙酯提取物處理對3T3-L1前脂肪細胞的細胞周期的影響，GM:生長培養(yǎng)基；DM:分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基；SAA:柳茶乙酸乙酯提取物；SAAIOO:100mg/mlSAA;SAA200:200mg/mlSAA。圖3油紅0染色觀察柳茶乙酸乙酯提取物處理對3T3-L1脂肪細胞分化的影響，DM:分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基；GW9662:PPARy抑制劑；SAA:柳茶乙酸乙酯提取物；SAA50:50mg/mlSAA;SAAIOO:100mg/mlSAA;SAA200:200mg/mlSAA。圖4半定量逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(A)及實時定量逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(從左至右依次為Con、Tro、SAA50、SAAIOO、SAA200)(B)檢測柳茶乙酸乙酯提取物處理對3T3-L1脂肪細胞分化相關(guān)基因表達的影響，Con:空白對照；Tro:曲格列酮，PPARy激動劑；SAA:柳茶乙酸乙酯提取物；SAA50:50mg/mlSAA;SAAIOO:100mg/mlSAA;SAA200:200mg/mlSAA;FAS:脂肪酸合成酶基因；PPARY:過氧化物酶增殖物受體Y。具體實施例方式實施例1、制備柳茶有效部位提取物干燥或新鮮柳茶(薔薇科植物窄葉鮮卑花(Sibiraeaangustata(Rehd.)Hand.-Mazz.)或鮮卑花(Sibiraealaevigata(L.)Maxim.)為原料，清洗、粉碎后，分別用水冷浸和熱提兩種方法提取，水與原料的比例分別為8:ii5:i。1、冷浸室溫下將粉碎的原料用水浸提，時間為1224小時，過濾，濾渣再次在室溫下浸提，時間為612小時，濾去殘渣，合并兩次濾液，濾液濃縮后得浸膏。2、熱提將原料用水加熱回流提取半小時到1小時，然后過濾，濾渣再次用水加熱回流半小時，合并兩次濾液，濾液濃縮后得浸膏。新鮮柳茶水提總浸膏的出膏率(8.08.5%)，干燥柳茶水提總浸膏的出膏率(1011%)。總浸膏用甲醇(或乙醇)溶解，加水分散(水醇=8:l)，然后用氯仿(或二氯甲烷)萃取5次(每次水氯仿=3:lv/v)，目的脫脂，除去無效成分，被氯仿脫脂后的水溶液進一步用乙酸乙酯萃取36次(每次水乙酸乙酯=3:lv/v)，合并乙酸乙酯萃取液，濃縮后得乙酸乙酯有效部位浸膏(占總浸膏的4.85.0%)備用，棄去剩余的無效水溶性成分。實施例2、柳茶乙酸乙酯提取物抑制前脂肪細胞的增殖與分化l)MTT法檢測前脂肪細胞的增殖采用100mg/mL、200mg/mL實施例1制備的柳茶乙酸乙酯提取物分別處理3T3-L1前脂肪細胞，MTT結(jié)果顯示，柳茶乙酸乙酯提取物對前脂肪細胞的增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用，并有明顯的時間和劑量依賴效應(yīng)，如圖1所示。2)流式細胞儀檢測細胞周期采用100mg/mL、200mg/mL實施例1制備的柳茶乙酸乙酯提取物分別處理3T3-L1前脂肪細胞，分別進行細胞周期檢測，結(jié)果表明柳茶乙酸乙酯提取物能阻止細胞進入S期，從而抑制前脂肪細胞的數(shù)目的增多，如圖2所示。3)油紅染色檢測脂肪細胞分化程度誘導(dǎo)分化8天后，空白對照組細胞呈現(xiàn)典型的脂肪細胞表型，90%以上的細胞中富含較大脂滴，而在實施例1制備的柳茶乙酸乙酯提取物處理組，僅10%20%的細胞出現(xiàn)較大脂滴，其油紅著色明顯較空白組淡，油紅能與中性脂肪結(jié)合，這表明柳茶乙酸乙酯提取物處理的細胞的脂肪含量明顯少于空白組。提示柳茶乙酸乙酯提取物能抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累，抑制細胞分化，如圖3所示。4)半定量逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(sRT-PCR)及實時定量逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(RealtimePCR)檢測脂肪細胞分化相關(guān)基因半定量RT-PCR結(jié)果分析表明，3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化過程中加入實施例1制備的柳茶乙酸乙酯提取物，其靶基因(過氧化物酶增殖受體PPARy等)mRNA表達量明顯降低；同樣，實時定量PCR結(jié)果分析表明，柳茶乙酸乙酯提取物可以降低脂肪細胞分化的相關(guān)基因的表達。實施例3、柳茶乙酸乙酯提取物對不同生長時期小鼠的影響A.對生長期小鼠的影響實驗方法4周齡昆明小鼠50只，體重12-15g，隨機分為5組(空白對照，陽性藥物對照組和3個實驗藥物劑量組)每組10只。除基礎(chǔ)飼料外，3個實驗組每天灌胃給予不同劑量的柳茶乙酸乙酯提取物的稀釋液，劑量折合成人(50Kg)每天用藥量(g/w)的80%、100%和120%給藥；陽性藥物對照組每天灌胃給予康爾瘦膠囊粉溶液，劑量計算同上；空白對照組每天灌飼與實驗組相同體積的蒸餾水。飼養(yǎng)8天，每天稱重一次。實驗結(jié)果顯示，柳茶乙酸乙酯提取物對生長期小鼠的增重有明顯的抑制作用，抑制效果呈劑量關(guān)系。B.對肥胖型小鼠的影響肥胖型小鼠40只，體重36-45g，隨機分為4組，每組10只。除基礎(chǔ)飼料外，實驗組每天灌胃給予中等劑量的柳茶乙酸乙酯提取物稀釋液，2個藥品對照組每天分別灌胃給予康爾瘦及苗條霜膠囊粉溶液，空白對照組每天灌飼與實驗組相同體積的蒸餾水。飼養(yǎng)8天，每天稱重一次，結(jié)果如以下表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注1、II、III組是劑量依次增加的實驗組實驗結(jié)果顯示，柳茶乙酸乙酯提取物對肥胖型小鼠有明顯的減重作用。實施例4柳茶乙酸乙酯提取物對血脂異?；颊咦饔贸醪接^察觀察方法將柳茶乙酸乙酯萃提取物與藥用輔料混合，制備成顆粒，裝1號膠囊，每粒相當(dāng)生藥10克。受試人群按每次2粒，每日3次，連續(xù)服用30天；觀察期間保持平日的生活和飲食習(xí)慣。在觀察前后各采靜脈血l次，測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度膽固醇(HDL-C)和低密度膽固醇(LDL-C);血脂異常嚴重、且經(jīng)濟條件允許者做全血分析，增項測定脂蛋白(a)[Lp(a)]、全血粘度(mpas)。試驗對象志愿參加觀察、年齡在3171歲、患有高膽固醇血癥的成年30名，其中女性11名。觀察結(jié)果觀察組30例中，TG降低者18例，TC降低者28例，HDL-C升高者24例，LDL-C降低者30例。3例測定脂蛋白(a)[Lp(a)]、全血粘度(mpas)者用藥后Lp(a)含量顯著下降，mpas值均恢復(fù)到正常值范圍。典型病例1:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用藥前后血檢驗結(jié)果對比表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>柳茶異常毒性檢查按2000年藥典異常毒性檢查法檢查1、昆明小鼠，每個藥品五只；2、供試品實施例1制備柳茶有效部位提取物；3、按照常規(guī)的急毒試驗進行檢測；4、結(jié)果，正常飼養(yǎng)，觀察48小時內(nèi)未見死亡。9權(quán)利要求一種預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的柳茶有效部位提取物，其特征在于，所述提取物通過包括以下步驟的方法獲得，1)清洗并粉碎柳茶原料；2)以水浸提粉碎后的柳茶、并濃縮，得到柳茶水提總浸膏；3)以甲醇或乙醇溶解所述柳茶水提總浸膏，并加水分散，得到含醇水溶液；4)以氯仿或二氯甲烷萃取所述水溶液；5)用乙酸乙酯萃取被氯仿或二氯甲烷脫脂后的水溶液，所得乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮即為所述能預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的柳茶有效部位提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柳茶有效部位提取物，其特征在于，在步驟2)中，以水冷浸或熱提方法浸提柳茶原料。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柳茶有效部位提取物，其特征在于，在步驟2)中，水與柳茶原料的質(zhì)量比為8:115:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柳茶有效部位提取物，其特征在于，所述方法還包括濃縮所述乙酸乙酯萃取液得到浸膏的步驟。5.—種預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的柳茶有效部位提取物的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)清洗并粉碎柳茶原料；2)以水浸提粉碎后的柳茶、并濃縮，得到柳茶水提總浸膏；3)以甲醇或乙醇溶解所述柳茶水提總浸膏，并加水分散，得到醇溶液；4)以氯仿萃取所述醇溶液；5)用乙酸乙酯萃取被氯仿脫脂后的水溶液，所得乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮即為所述能預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的柳茶有效部位提取物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，以水冷浸或熱提方法浸提柳茶原料。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟2)中，水與柳茶原料的質(zhì)量比為8:i15:i。8.—種預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的藥物，其特征在于，所述藥物包括權(quán)利要求i所述的預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的柳茶有效部位提取物。9.權(quán)利要求1所述的預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的柳茶有效部位提取物在制備用于預(yù)防肥胖癥，以及治療高膽固醇血癥的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的柳茶有效部位提取物及其制備方法和用途。根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防肥胖癥，所述柳茶有效部位提取物通過包括以下步驟和方法獲得(1)清洗并粉碎；(2)以水浸提得到水提總浸膏；(3)以甲醇或乙醇溶解總浸膏；(4)以氯仿或二氯甲烷萃取；(5)然后用乙酸乙酯萃取被氯仿或二氯甲烷脫脂后的水溶液，減壓濃縮得有效部位。本發(fā)明提供了柳茶提取物中能夠預(yù)防肥胖癥和治療高膽固醇血癥的有效部位-乙酸乙酯浸膏，其可以抑制前體脂肪細胞增殖和分化，起到預(yù)防肥胖作用。文檔編號A61P3/00GK101732441SQ20101010029公開日2010年6月16日申請日期2010年1月22日優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日發(fā)明者何蘭,唐志剛,潘宣,翟永功申請人:北京師范大學(xué)