專利名稱：：一種花蕊石提取物的用途及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥花蕊石(蛇紋石)提取物制備方法及其抗癌的應(yīng)用，屬于化學(xué)及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：中藥礦物藥花蕊石為2005版《中國藥典》收載的中藥礦物藥品種，本品為變質(zhì)巖類蛇紋大理巖，從祖國醫(yī)學(xué)上看，花蕊石又名蛇紋石，異名花乳石《嘉祐本草》、白云石《全國中草藥匯編》。始載于宋代《嘉佑本草》，《本草衍義》曰"黃石中間有淡白點(diǎn)，以此得花之名。"《綱目》弓l《玉冊》云"花乳石，陰石也。生代州山谷中(在山西省)，有五色，可代丹砂匱藥。蜀中汶山、彭縣亦有之(四川省)。"從古代各家本草對其形狀、產(chǎn)地、用途等方面進(jìn)行考證與目前習(xí)用的花蕊石，即主要為含蛇紋石多少不等的大理巖相符。其中晶瑩的白點(diǎn)是由方解石組成的大理巖，黃色的花斑或花紋既是為變質(zhì)巖類巖石蛇紋石大理巖塊具有化瘀止血的功效。始載于宋"〈嘉佑本草》，《本草綱目，石部》謂其功專止血，酸以收之。臨床上花蕊石多見于抗癌復(fù)方尤其見于抗肝癌復(fù)方中，臨床治療肝癌效果顯著，而有關(guān)其水煎液、提取物及其化學(xué)組分、化學(xué)結(jié)構(gòu)抗癌活性研究迄今為止尚未見報(bào)道?；ㄈ锸饕煞稚呒y石，是一種天然生成的鎂的硅酸鹽(Mg6[Si0401Q](0H)8)，蛇紋石為層狀構(gòu)造的Fe、Mg硅酸鹽，含Ni、Co、Ca、An等元素，是礦物主要脈石礦物，有葉蛇紋石、膠蛇紋石、水蛇紋石和纖維蛇紋石共4個(gè)亞科(曹樹明等蛇紋石理化性質(zhì)及生物活性研究進(jìn)展，中國民族民間醫(yī)藥)。其中以纖蛇紋石含量較大，纖蛇紋石纖維在垂直于纖維軸的二維方向上的尺寸小于100nm，一般在20-50nm之間，因此，它是一種天然產(chǎn)出的納米級(jí)礦物，具有一維納米纖維特性，即小尺寸效應(yīng)、高比表面積和晶格彎曲(彭同江等，纖蛇紋石石棉的納米效應(yīng)與生物活性巖石礦物學(xué)雜志2000，19(3))，具有高生物活性?；ㄈ锸趥鹘y(tǒng)用藥過程中，經(jīng)加工處理粉碎煎煮后，水溶液中纖蛇紋石纖維外柱表面的氫氧鎂石八面體層溶解出Off和Mg"形成堿性環(huán)境，使得纖蛇紋石極易與酸性體液發(fā)生反應(yīng)。纖蛇紋石納米顆粒具有大量活性基團(tuán)，李學(xué)軍等通過對蛇紋石化學(xué)成分、晶體結(jié)構(gòu)及鍵性的分析，將蛇紋石的活性基團(tuán)劃分為5類，即不飽和Si-0-Si、0-Si-0、含鎂鍵類、羥基和氫鍵活性基團(tuán)的大量存在使蛇紋石具有很高的化學(xué)活性(李學(xué)軍天然蛇紋石活性機(jī)理初探巖石礦物學(xué)雜志2003，22(4))。水煎液中富含大量無機(jī)離子與納米顆粒，小尺寸效應(yīng)使纖蛇紋石纖維有非常好的柔韌性和抗拉強(qiáng)度，使得纖蛇紋石很容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，讓各種活性基團(tuán)在細(xì)胞中發(fā)揮作用。水溶液中，纖蛇紋石纖維外柱表面的氫氧鎂石八面體層溶解出Off和Mg"形成堿性環(huán)境，細(xì)胞蛋白質(zhì)的在復(fù)性時(shí)可能造成二硫鍵的錯(cuò)配，得不到天然構(gòu)象，喪失功能活性，PH值的改變會(huì)影響酶分子的構(gòu)象，使大量的酶(適合于pH在1.57之間)變形而失去活性，同時(shí)會(huì)影響底物、ES活性復(fù)合物的離解狀態(tài)；溶液的pH和Mg2+離子強(qiáng)度的改變會(huì)使DNA變性，從而影響DNA的復(fù)制。Mg2+含量的增加抑制了酶的活性，活性下降(孫志賢，1995.現(xiàn)代生物化學(xué)理論與研究技術(shù)[M].北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社.1995);Mg"含量的陡然增加也會(huì)影響氨基酸鏈的折疊由于Ca2+比Mg2+更易在氧化硅上吸附和沉淀，當(dāng)硅氧四面體層裸露(即形成非晶質(zhì)硅氧物外殼)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)C^+濃度會(huì)發(fā)生變化，從而影響C^+對細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)功能；在堿性氧化環(huán)境下，F(xiàn)e、Mg2+和Ca2+在非晶質(zhì)硅氧物外殼上能形成絡(luò)合物M02Si(0H)2+3或螯合物M02Si(0H)°2、M(0Si(0H)3)°2并被吸附，使細(xì)胞功能必需的元素濃度發(fā)生變化(王華東，郝春曦，王建.1992.環(huán)境中的砷[M].北京中國環(huán)境科學(xué)出版社)，造成細(xì)胞的損傷。而有關(guān)花蕊石(蛇紋石)生制品水煎液對癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究目前尚未見報(bào)道。作為傳統(tǒng)中藥的礦物藥花蕊石生/制品水煎提取液已在體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中證明其具有明顯的抑制腫瘤作用，花蕊石已見于中藥抗癌復(fù)方，用于臨床腫瘤治療中。本發(fā)明一方面證明花蕊石提取物的抗腫瘤用途，一方面將傳統(tǒng)醫(yī)藥理論與現(xiàn)代科學(xué)理論結(jié)合，進(jìn)一步詮釋了中醫(yī)理論。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供中藥花蕊石提取物的制備方法及作為其抗癌物質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明給出了一個(gè)具有抗癌作用的提取物制備技術(shù)及應(yīng)用新方案，主要是利用花蕊石，本發(fā)明中所指花蕊石包括蛇紋石單礦、含蛇紋石的大理巖及含有蛇紋石礦族特征的所有巖石。本發(fā)明給出了一個(gè)具有抗癌作用的藥物制備技術(shù)及應(yīng)用新方案是含有花蕊石藥材(生/鍛制品)、藥材超微粉及其礦質(zhì)懸浮顆粒、蛇紋石天然納米纖維的提取液、完全提取物為主要活性成分的。本發(fā)明所用提取溶劑為水。花蕊石提取液及其完全提取物作為一種有效的抗癌藥物，在應(yīng)用于臨床中的有效劑量可以根據(jù)日常常用處方劑量及患者病情酌量增減。本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)臨床的需要將花蕊石抗癌提取物制備為各個(gè)劑型而可添加藥學(xué)上可接受的輔劑及載體供臨床選擇應(yīng)用。具體實(shí)施方案本發(fā)明提供一下技術(shù)措施，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，并不是限制發(fā)明的權(quán)利范圍?！⑺幬镏苽鋵?shí)施例實(shí)施例1:具有抗癌活性花蕊石水提取液及提取物的制備步驟取樣按《巖石礦物分析》中要求，采用交互法、四分法對花蕊石進(jìn)行縮分，以保證試樣均勻。以四分法取出花蕊石，將花蕊石洗凈，風(fēng)干。粉碎凈制的花蕊石經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)粉碎后，粉末過100-200目篩轉(zhuǎn)移于烘箱中，于105t:恒溫干燥2h，置干燥箱中放冷，備用。提取精密稱定恒溫干燥的花蕊石粉末100g，置于2000mL圓底燒瓶中，1:10加入去離子水1000ml，回流提取2-4次，每次l-2h，趁熱過濾，將過濾液濃縮，定容于100ml容量瓶中，加水至刻度，得到花蕊石水提取液。取花蕊石水提濃縮液，凍干濃縮，得到花蕊石完全提取物凍干結(jié)晶粉；取花蕊石水提濃縮液，水浴蒸干，得到花蕊石完全提取物蒸干結(jié)晶粉。二、花蕊石抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究實(shí)施例2花蕊石(產(chǎn)地河南)、蛇紋石纖維(產(chǎn)地四川)生制品水煎提取液對人肝癌細(xì)胞H印G2，人肝癌細(xì)胞S匪C-7721、宮頸癌細(xì)胞Hela、結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480的體外細(xì)胞抑制作用研究。體外抑制癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)A:制備癌細(xì)胞懸液，取對數(shù)生長期的各腫瘤細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基配制成5X104個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100yL。B:37。C，5%C02及飽和濕度下培養(yǎng)細(xì)胞24h。C:將待測藥液，經(jīng)0.45iim濾膜過濾，分別按含不同生藥量的濃度加藥，每孔100i!L，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，將正常癌細(xì)胞組作為陰性對照組，對照組加等量新鮮培養(yǎng)液。37°C，5%C02及飽和濕度下培養(yǎng)細(xì)胞。D:培養(yǎng)72h后，加入新配制的MTT，每孔20yL，置37°CC02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)作用4h，小心吸去上清液，加入二甲亞砜(匿S0)150iiL，在振蕩器上輕輕振蕩5min后，用酶標(biāo)儀于492nm處測吸光度值(A值).取5孔平均值，計(jì)算抑制率.根據(jù)公式細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)X100%實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，表2，表3。表l花蕊石生制品水煎液對不同人腫瘤細(xì)胞的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2蛇紋石生品水煎液對不同人腫瘤細(xì)胞的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表3蛇紋石制品水煎液對不同人腫瘤細(xì)胞抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>結(jié)果表明，花蕊石、蛇紋石纖維生制品水煎提取液對人腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用。實(shí)施例3花蕊石纖維納米粒子對小鼠肝腫瘤H22的體內(nèi)抗癌活性研究。A:H22腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代H22細(xì)胞接種前與DMEM+10X小牛血清培養(yǎng)液中37°C、5%C02傳代培養(yǎng)至狀態(tài)良好，制成2X107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于健康昆明種小鼠腹腔，腹水傳代。B:建立H22肝癌小鼠實(shí)體瘤模型無菌條件下用注射器抽取接種7-9天的H22小鼠腹水，以滅菌生理鹽水稀釋調(diào)整細(xì)胞量為1X107個(gè)/ml，接種到50只小鼠腋下，每只0.2ml，觀察小鼠生長情況，制作實(shí)體瘤模型。C:動(dòng)物分組與給藥接種24h后隨機(jī)分成5組，每組10只，每天上午定時(shí)灌胃給藥①陰性對照組，生理鹽水0.2ml灌胃。②花蕊石制品組，花蕊石制品水煎液(10gkg—1d—0灌胃0.2mL;③蛇紋石生品組，蛇紋石生品水煎液(10gkg—1d—0灌胃0.2mL;④蛇紋石制品組，蛇紋石制品水煎液(10gkg—1d—0灌胃0.2mL;⑤陽性對照組，環(huán)磷酰胺(20mgkg—1d—0灌胃0.2mL。各組連續(xù)灌胃lOd，每天觀察實(shí)體瘤的生長情況。D:抑瘤率檢測小鼠經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，于第lld脫頸椎處死，鑷子鑷住小鼠右腋腫瘤生長部位皮膚后，用手術(shù)剪子剪開皮膚，暴露腫瘤，手術(shù)剪鈍性剝離腫瘤，用天平稱瘤重，計(jì)算抑制率。以抑瘤率來判斷抑瘤作用。腫瘤抑制率(％)=平均實(shí)驗(yàn)組瘤重/平均對照組瘤重)]X100%。6E:統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用X±S表示。P<0.05或P<0.01為差異有顯著或高度顯著性水平。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間比較用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。表5花蕊石、對H22肝癌小鼠實(shí)體瘤抑瘤率(x±sn=10)miiL_瘤重(g)抑制率油里g(%)陰性組審u品花說'石組蛇紋石組制品蛇紋石組/g'kg-、d-101010一實(shí)驗(yàn)前18.88±2,6318.22±1.5619.99±1.0320.56±1.61T^^7試驗(yàn)后19.33±3.1719.87士2.3220.67±0.6922.54±0.891.3492±0.170.6121±0.10*0.6卯9±0.13*0.6086±0.23*54.6348.7954.3260.92注:*與陰性組比較，P<0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各受試給藥組與H22陰性對照組瘤重差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)，各給藥組對H22肝癌小鼠腫瘤抑制率均高于30X(中藥的瘤重抑制率>30%，評定藥物具有抑瘤作用)，表明花蕊石制品水煎液，蛇紋石生品水煎液，蛇紋石制品水煎液對H22肝癌實(shí)體瘤具有明顯的抑制作用。權(quán)利要求一種花蕊石提取物的用途，其特征在于用花蕊石提取物制備成抗癌藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花蕊石提取物的用途，其特征在于所述花蕊石包括蛇紋石單礦、含蛇紋石的大理巖及含有蛇紋石礦族特征的所有巖石的生品或者制品。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花蕊石提取物的用途，其特征在于所述用花蕊石制備成的抗癌藥物中含有花蕊石藥材、生/鍛制品、藥材超微粉、生/鍛制品及其礦質(zhì)懸浮顆粒、蛇紋石天然納米纖維的提取液、完全提取物為主要活性成分的。4.根據(jù)權(quán)利要求3中提取液、提取物制備方法，其特征是提取方法為熱提法，提取溶劑為水。5.根據(jù)權(quán)利要求4中提取物的制備方法，其特征為可采用冷凍干燥，真空干燥、水浴干燥等方法制得。6.根據(jù)權(quán)利要求3中提取液、提取物，其特征在于可制備為各個(gè)劑型而可添加藥學(xué)上可接受的輔劑及載體供臨床治療癌癥選擇應(yīng)用。7.根據(jù)權(quán)利要求3中抗癌提取液、提取物及相應(yīng)劑型，其特征在于在體內(nèi)外均抑制癌細(xì)胞增長，可應(yīng)用于多種肝癌、乳腺癌、腸癌宮頸癌等多種癌癥的治療。8.根據(jù)權(quán)利要求3，其特征是所述劑型給藥方式為口服給藥，局部注射給藥或靜脈注射給藥。全文摘要一種花蕊石提取物的用途及制備方法，本發(fā)明公開了花蕊石(主成分為蛇紋石)提取液的制備方法及其抗癌用途。該提取物可從花蕊石包括蛇紋石單礦、含蛇紋石的大理巖及含有蛇紋石礦族特征的巖石中提取。該提取物來源于花蕊石藥材、藥材超微粉及其礦質(zhì)懸浮顆粒、蛇紋石天然納米纖維(以上來源包括生/鍛制品)。通過體內(nèi)外藥理活性研究表明花蕊石提取物具有較強(qiáng)的抗癌活性，可望開發(fā)為以花蕊石提取物為原料的具有廣泛臨床使用價(jià)值和商業(yè)開發(fā)價(jià)值的抗癌新藥。文檔編號(hào)A61K33/06GK101732340SQ20101001002公開日2010年6月16日申請日期2010年1月6日優(yōu)先權(quán)日2010年1月6日發(fā)明者包永睿,盧秉久,孟憲生,康廷國,王海波,趙晶申請人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)