專利名稱：胞內(nèi)細(xì)菌感染的處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用防衛(wèi)素多肽在吞噬性細(xì)胞中處理胞內(nèi)細(xì)菌感染。背景金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是多種在社區(qū)和醫(yī)院遭受的感染的主要病原體，所述感染的范圍從輕微感染如皮炎或傷口感染至嚴(yán)重的涉及敗血病的疾病，包括關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎和腦膜炎。對(duì)葡萄球菌疾病的治療常常是困難的，因?yàn)樯踔猎谟每刮⑸飫╅L(zhǎng)期治療之后， 感染也常常持續(xù)或復(fù)發(fā)。葡萄球菌感染的持續(xù)可涉及細(xì)菌發(fā)病機(jī)制的幾個(gè)方面。由幾位作者報(bào)道的重要特征是細(xì)菌侵入吞噬細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)存活的能力。細(xì)菌的胞內(nèi)累積使得抗微生物劑的使用復(fù)雜化，因?yàn)榘麅?nèi)活性取決于幾個(gè)因素如藥物穿透并在細(xì)胞中累積的能力，以及藥物代謝和胞內(nèi)分布。許多抗生素藥劑無(wú)法進(jìn)入吞噬細(xì)胞，此外，研究顯示對(duì)于能夠穿透細(xì)胞的藥物，抗微生物活性和細(xì)菌對(duì)療法的應(yīng)答性常常受到削弱(impaired)。幾位作者已描述了抗生素針對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的體外活性，但許多報(bào)道得到爭(zhēng)議性結(jié)果。Seral等顯示胞內(nèi)濃度和累積對(duì)于活性僅為部分預(yù)見性的，且仍不清楚哪個(gè)參數(shù)決定抗生素的胞內(nèi)活性。Gresham等顯示感染金黃色葡萄球菌的多形核嗜中性白細(xì)胞(PMN)含有足夠量的生活的胞內(nèi)細(xì)菌使得通過(guò)將這些細(xì)胞腹膜內(nèi)注射于健康小鼠導(dǎo)致感染。而且，他們闡明了將PMN的遷移限制于感染位點(diǎn)導(dǎo)致增強(qiáng)的宿主防御。這些數(shù)據(jù)可表明細(xì)菌的胞內(nèi)存活是金黃色葡萄球菌感染發(fā)病機(jī)制的重要因素之一。許多藥物，包括常用的糖肽類如萬(wàn)古霉素，針對(duì)金黃色葡萄球菌的胞內(nèi)作用不佳。 此外，甲氧西林抗性(MRSA)金黃色葡萄球菌發(fā)生率的增加和多抗藥性株的出現(xiàn)進(jìn)一步使得這些感染的治療復(fù)雜化。因此，對(duì)針對(duì)這些類型的感染的新型化合物的需要正在增加。菌絲霉素(Plectasin)是來(lái)源于腐生子囊菌淡黑假黑盤菌(Pseudoplectania nigrella)的防衛(wèi)素。該抗微生物肽在體外和體內(nèi)均針對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌的菌株顯示有力的抗微生物作用。此外，其與常用的抗葡萄球菌化合物相比具有新型的對(duì)細(xì)菌作用模式。然而，這個(gè)或任何其他新型抗微生物肽據(jù)我們所知從未在胞內(nèi)感染模型中得到過(guò)測(cè)試。假如新藥如菌絲霉素，具有進(jìn)入細(xì)胞并殺滅胞內(nèi)細(xì)菌的能力，這對(duì)于未來(lái)對(duì)葡萄球菌感染的治療而言會(huì)是有利之處。存在多種使用人或動(dòng)物細(xì)胞系的體外模型以供研究胞內(nèi)抗微生物活性。然而，僅有極少的研究在動(dòng)物中進(jìn)行。
本發(fā)明涉及通過(guò)施用防衛(wèi)素針對(duì)存在于人或動(dòng)物吞噬性細(xì)胞(phagocyticcell) (吞噬細(xì)胞(phagocyte))如巨噬細(xì)胞之內(nèi)的葡萄球菌的抗細(xì)菌作用。

發(fā)明內(nèi)容
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)某些防衛(wèi)素多肽可用于處理吞噬性細(xì)胞(吞噬細(xì)胞)如巨噬細(xì)胞中的胞內(nèi)細(xì)菌感染。相應(yīng)地，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有抗細(xì)菌活性的多肽在制備用于在吞噬性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞中治療性處理胞內(nèi)細(xì)菌感染的藥物中的用途，所述多肽包括與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌感染是葡萄球菌感染。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在吞噬性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞中處理胞內(nèi)細(xì)菌感染的方法，包括向需要此種處理的人或動(dòng)物以用于在吞噬性細(xì)胞中處理所述胞內(nèi)細(xì)菌感染的有效量施用抗細(xì)菌多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述處理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一劑量。用于本發(fā)明用途或用于在吞噬性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明處理胞內(nèi)細(xì)菌感染的多肽在下文中命名為“(根據(jù))本發(fā)明的多肽”。發(fā)明詳述定義抗細(xì)菌活性術(shù)語(yǔ)“抗細(xì)菌活性”于本文定義為一種能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞或抑制細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“抗細(xì)菌的”旨在意指有殺細(xì)菌的和/或抑制細(xì)菌的作用，其中術(shù)語(yǔ)“殺細(xì)菌的”應(yīng)被理解為能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞，而其中術(shù)語(yǔ)“抑制細(xì)菌的”應(yīng)被理解為能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制時(shí)，細(xì)胞處于非生長(zhǎng)狀態(tài)，即其無(wú)法繁殖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“抗細(xì)菌活性”定義為針對(duì)鏈球菌(Streptococci)(優(yōu)選月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae))或葡萄球菌(Staphylococci)(優(yōu)選金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的殺細(xì)菌和/或抑制細(xì)菌活性。就本發(fā)明而言，抗細(xì)菌活性可根據(jù)由Lehrer等，Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2)pp. 167-174(1991)所述的方法測(cè)定。或者，抗細(xì)菌活性可根據(jù)來(lái)自 CLSI (臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute)；之前稱為國(guó)家臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的 NCCLS 指南確定。將具有抗細(xì)菌活性的化合物以濃度為500 μ g/mL ；優(yōu)選濃度為250 μ g/mL ；更優(yōu)選濃度為100 μ g/mL ；甚至更優(yōu)選濃度為50 μ g/mL ；最優(yōu)選濃度為25 μ g/mL ；且特別是濃度為10 μ g/mL的所述具有抗微生物活性的多肽在相關(guān)微生物生長(zhǎng)底物中于37°C溫育M小時(shí)后(優(yōu)選16小時(shí)后，更優(yōu)選8小時(shí)后，最優(yōu)選4小時(shí)后，且特別是2小時(shí)后)可具有將肺炎鏈球菌(ATCC 49619)的活細(xì)胞數(shù)減少至1/100的能力。具有抗細(xì)菌活性的化合物當(dāng)以500 μ g/mL的濃度加入；優(yōu)選當(dāng)以250 μ g/mL的濃度加入；更優(yōu)選當(dāng)以100 μ g/mL的濃度加入；甚至更優(yōu)選當(dāng)以50 μ g/mL的濃度加入；最優(yōu)選當(dāng)以10μ g/mL的濃度加入；以及特別是當(dāng)以5μ g/mL的濃度加入時(shí)，在相關(guān)微生物生長(zhǎng)底物中于37°C也可具有將肺炎鏈球菌(ATCC 49619)的長(zhǎng)出(outgrowth)抑制8小時(shí)的能力。本發(fā)明的多肽具有至少20 %，優(yōu)選至少40 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少60 %， 更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少100%的由SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成的多肽的抗微生物活性。防衛(wèi)素(Defensin)術(shù)語(yǔ)“防衛(wèi)素”用于本文意指本領(lǐng)域的技術(shù)人員識(shí)別為屬于防衛(wèi)素類抗微生物肽的多肽。為確定某多肽是否為根據(jù)本發(fā)明的防衛(wèi)素，優(yōu)選將其氨基酸序列通過(guò)使用可免費(fèi)獲得的HMMER軟件包與PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)的隱蔽馬爾科夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型(HMM profile))比較(參見實(shí)施例 5)。PFAM防衛(wèi)素家族包括防衛(wèi)素1或“哺乳動(dòng)物防衛(wèi)素”(登錄號(hào)PF00323)、防衛(wèi)素2 或“節(jié)肢動(dòng)物防衛(wèi)素”(登錄號(hào)PF01097)、防衛(wèi)素β或“β防衛(wèi)素”(登錄號(hào)PF00711)、防衛(wèi)素_prop印或“防衛(wèi)素前肽”(登錄號(hào)PF00879)與γ-硫素(gamma-thionin)或“ γ -硫素家族”(登錄號(hào)PF00304)。防衛(wèi)素可屬于α -防衛(wèi)素類、β -防衛(wèi)素類、θ -防衛(wèi)素類、昆蟲或節(jié)肢動(dòng)物防衛(wèi)素類、或植物防衛(wèi)素類。來(lái)自這些類中每一類的防衛(wèi)素享有共同的結(jié)構(gòu)特征，如半胱氨酸樣式。但重要的是注意類的歸屬并不表明防衛(wèi)素的來(lái)源。舉例而言，來(lái)自真菌的防衛(wèi)素可屬于昆蟲防衛(wèi)素類。如SEQ ID NO 1所示的防衛(wèi)素是來(lái)源于菌絲霉素的合成防衛(wèi)素(參見WO 03/044049)，其屬于昆蟲防衛(wèi)素類。菌絲霉素顯示為SEQ ID NO :2。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的防衛(wèi)素的氨基酸序列包含4、5、6、7或8個(gè)半胱氨酸殘基，優(yōu)選4、5或6個(gè)半胱氨酸殘基，更優(yōu)選4或6個(gè)半胱氨酸殘基，且最優(yōu)選6個(gè)半胱氨酸殘基。防衛(wèi)素也可為享有任何防衛(wèi)素類的特性特征的合成防衛(wèi)素。這樣的防衛(wèi)素的實(shí)例包括(但不限于)α-防衛(wèi)素ΗΝΡ-1(人嗜中性粒細(xì)胞肽)、ΗΝΡ-2 和 ΗΝΡ-3 ； β -防衛(wèi)素-12、Drosomycin, Heliomicin, γ 1-嘌呤硫素 (Y Ι-purothionin)、昆蟲防衛(wèi)素 Α，和 PCT 申請(qǐng) WO 99/53053,WO 02/06324,WO 02/085934、 WO 03/044049, WO 2006/131504、WO 2006/050737 和 W02006/053565 中所公開的防衛(wèi)素。分離的多肽術(shù)語(yǔ)“分離的變體”或“分離的多肽”用于本文指自來(lái)源分離的變體或多肽。在一方面，該變體或多肽為至少純的，優(yōu)選至少5%純的，更優(yōu)選至少10%純的， 更優(yōu)選至少20%純的，更優(yōu)選至少40%純的，更優(yōu)選至少60%純的，甚至更優(yōu)選至少80% 純的，且最優(yōu)選至少90 %純的，如通過(guò)SDS-PAGE所測(cè)定的?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”于本文代表一種多肽制備物，其含有以重量計(jì)至多10 %，優(yōu)選至多8 %，更優(yōu)選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4 %，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，且甚至最優(yōu)選至多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多肽物質(zhì)。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽按該制備物中存在的總多肽物質(zhì)的重量計(jì)為至少92%純的，優(yōu)選至少94%純的，更優(yōu)選至少95%純的，更優(yōu)選至少96% 純的，更優(yōu)選至少96 %純的，更優(yōu)選至少97 %純的，更優(yōu)選至少98 %純的，甚至更優(yōu)選至少 99%純的，最優(yōu)選至少99. 5%純的，且甚至最優(yōu)選100%純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選處于基本上純的形式。這可以通過(guò)以公知的重組方法或以經(jīng)典的純化方法制備該多肽來(lái)完成。同一性兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性通過(guò)參數(shù)“同一性” 描述。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS 歐洲分子生物開放軟件組(The European Molecular Biology Open Software Suite)， Rice 等，2000，Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)的 Needle 程序，優(yōu)選3. 0. 0或更新的版本中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48 =443-453)來(lái)確定。所使用的任選參數(shù)為缺口產(chǎn)生罰分(gap open penalty) 為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并如下計(jì)算(相同的殘基X100)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如于EMBOSS 包(EMBOSS 歐洲分子生物開放軟件組，Rice等，2000，如上；http //emboss, org)的 Needle程序，優(yōu)選3. 0. 0或更晚版本中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和 mmsch，1970，如上)測(cè)定。所使用的任選參數(shù)為缺口產(chǎn)生罰分10，缺口延伸罰分0.5，和 EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle 的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為百分比同一性并如下計(jì)算(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中缺口的總數(shù))。等位變體術(shù)語(yǔ)“等位變體(allelic variant) ”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。修飾術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文的意思是，對(duì)由SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對(duì)編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一處或多處一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一處或多處一個(gè)或多個(gè)(數(shù)個(gè))氨基酸側(cè)鏈的置換；或在氨基酸序列中使用具有相似特征的非天然氨基酸。特別地，所述修飾可為酰胺化，例如C-端的酰胺化。具有抗細(xì)菌活性的多肽在第一方面，本發(fā)明涉及具有與SEQ ID NO :1 ( S卩，成熟多肽)有至少80%，優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，且特別地至少97%同一性程度的氨基酸序列的分離的多肽，其具有抗細(xì)菌活性(以下稱“同源多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有與SEQ ID NO :1的氨基酸序列相差至多六個(gè)氨基酸，優(yōu)選至多五個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至多四個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至多三個(gè)氨基酸，最優(yōu)選至多兩個(gè)氨基酸，且特別是一個(gè)氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列或其等位變體。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID N0:1的氨基酸序列或其等位變體組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO :1的氨基酸序列組成。
優(yōu)選地，氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是較不重要的(of a minor nature)，即不顯著影響多肽的折疊和/或活性的保守的氨基酸取代或插入；單缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸標(biāo)簽(poly histidine tag)、抗原表位(antigenic印itope)或結(jié)合域 (binding domain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、 酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specific activity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H. Neurath和R. L. Hill，1979，于The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍發(fā)生的交換是 Ala/^er、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。除了 20個(gè)基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過(guò)修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，且包括六氫吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫脯氨酸、3-和 4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244 :1081-1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中， 將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的生物活性(即，抗細(xì)菌活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996， J. Biol. Chem. 271 :4699_4708。生物相互作用也能夠通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過(guò)以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)測(cè)定。參見例如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith等，1992， J. Mol. Biol. 224 :899-904 ；Wlodaver 等，1992，F(xiàn)EBSLett. 309 :59_64。必需氨基酸的身份 (identity)也能夠根據(jù)分析與多肽的同一性來(lái)推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413;或 WO 95/22625 公開的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman 等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美國(guó)專利 No. 5，223，409 ；WO 92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速測(cè)定感興趣的多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是防衛(wèi)素多肽，優(yōu)選昆蟲或節(jié)肢動(dòng)物防衛(wèi)素多肽。N-端延伸本發(fā)明的多肽的N-端延伸可適當(dāng)?shù)赜?至50個(gè)氨基酸，優(yōu)選2-20個(gè)氨基酸，尤其是3-15個(gè)氨基酸組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，N-端延伸包含kex2或kex2_樣切割位點(diǎn)，如在下文進(jìn)一步定義的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，N-端延伸為肽，其包含至少兩個(gè)Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸殘基，如包含以下序列之一的N-端延伸EAE、EE、DE和DD。Kex2 位點(diǎn)Kex2位點(diǎn)(參見，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D. Goeddel編，Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology，，)禾口 kex2_ 樣位點(diǎn)為在一些蛋白質(zhì)的前肽編碼區(qū)和成熟區(qū)之間存在的二元的(dibasic)識(shí)別位點(diǎn)(即，切割位
點(diǎn))ο插入kex2位點(diǎn)或kex2_樣位點(diǎn)已在某些情況中顯示改進(jìn)了于前肽切割位點(diǎn)處的正確內(nèi)肽酶加工，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌水平增加。在本發(fā)明的上下文中，插入kex2或kex2_樣位點(diǎn)導(dǎo)致在N-端延伸中某個(gè)位置處獲得切割的可能性，造成抗細(xì)菌多肽與SEQ ID NO :1中所示的成熟多肽相比得到延長(zhǎng)。融合的多肽本發(fā)明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于本發(fā)明的多肽或其片段的N-端或C-端。通過(guò)將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來(lái)產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼所述多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并且使融合的多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。方法和用途本發(fā)明涉及本發(fā)明多肽在吞噬性細(xì)胞優(yōu)選巨噬細(xì)胞中處理胞內(nèi)細(xì)菌感染的用途。 相應(yīng)地，本發(fā)明多肽可用于制備獸用或人用治療劑或預(yù)防劑以供在吞噬性細(xì)胞優(yōu)選巨噬細(xì)胞中處理胞內(nèi)細(xì)菌感染。胞內(nèi)細(xì)菌感染意指造成感染的細(xì)菌存在(reside)于人或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)細(xì)菌感染是胞內(nèi)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌感染；更優(yōu)選地，所述胞內(nèi)細(xì)菌感染是胞內(nèi)葡萄球菌Staphylococcus)感染；更優(yōu)選地，所述胞內(nèi)細(xì)菌感染是胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染。本發(fā)明的多肽可用于治療慢性肉芽腫病(CGD)，其為其中免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(吞噬性細(xì)胞)難以形成用于殺滅攝取的病原體如金黃色葡萄球菌的活性氧化合物(最重要地， 超氧自由基)的疾病。這導(dǎo)致在許多器官中形成肉芽腫。罹患CGD的患者由于其免疫系統(tǒng)對(duì)抗造成疾病的生物(其部分存在于胞內(nèi))的能力下降而屢次遭受感染發(fā)作。因?yàn)楸景l(fā)明多肽能夠在胞內(nèi)呈現(xiàn)針對(duì)由吞噬性細(xì)胞攝取的病原體的抗細(xì)菌活性，其可用于制備用于治療慢性肉芽腫病的藥物。本發(fā)明的多肽可以以足以殺滅存在于人或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的葡萄球菌屬菌種如金黃色葡萄球菌或抑制其生長(zhǎng)的量使用。將本發(fā)明多肽的配制物施用于正遭受吞噬性細(xì)胞優(yōu)選巨噬細(xì)胞中的胞內(nèi)細(xì)菌感染或?qū)ζ湟赘械乃拗?。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)細(xì)菌感染是由葡萄球菌屬菌種如金黃色葡萄球菌的感染造成的。施用可為局部化的或全身性的。一般而言，本發(fā)明的抗細(xì)菌多肽的劑量足以減少微生物種群至少llog，且可殺滅2或更多個(gè)log。將本發(fā)明的多肽以減少微生物種群同時(shí)最小化任何副作用的劑量施用。考慮的是所述組合物可在醫(yī)師的指導(dǎo)下獲得并用于體內(nèi)用途?？刹捎枚喾N施用方法。所述多肽配制物可口服給予，或可血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜注射、通過(guò)氣溶膠、眼部(opthalmically)、膀胱內(nèi)、局部等方式。治療性配制物的劑量變化會(huì)很大，取決于待施用的具體抗細(xì)菌多肽、施用的頻率、施用的方式、藥劑自宿主的清除等。初始劑量可較大，然后為較小的維持劑量。優(yōu)選初始劑量至少為17mg/kg。在許多情況中，口服施用會(huì)需要比靜脈內(nèi)施用更高的劑量?？蓪?duì)酰胺鍵以及氨基與羧基端進(jìn)行修飾以在口服施用時(shí)具有較好的穩(wěn)定性。例如，羧基端可以是酰胺化的。配制物本發(fā)明的多肽可摻入多種配制物中用于治療性施用。更具體地，本發(fā)明的多肽可通過(guò)與適合的、藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合而配制成藥物組合物，且可配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制備物，如片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏(ointment)、乳霜 (cream)、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球、洗劑(lotion)和氣霧劑。如此，所述多肽的施用可以多種方式實(shí)現(xiàn)，其包括經(jīng)口施用、含服施用、直腸施用、腸胃外施用、腹膜內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、透皮施用、氣管內(nèi)施用等。本發(fā)明的抗細(xì)菌多肽可在施用后為全身性的或可為局部化的。本發(fā)明的多肽可單獨(dú)施用、彼此組合施用或其可與其他已知化合物(例如，穿孔素(perforin)、抗炎劑、抗生素等)組合使用。在藥物劑型中，所述多肽可以其藥學(xué)上可接受的鹽的形式施用。以下方法和賦形劑僅為示例性的而非以任何方式進(jìn)行限制。對(duì)于口服制備物，所述多肽可單獨(dú)使用或與適合的添加劑組合以制造片劑、粉末、 顆?；蚰z囊，例如，與常規(guī)的添加劑，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉組合；與粘合劑(binder)，如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠(acacia)、玉米淀粉或明膠組合； 與崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉組合；與潤(rùn)滑劑，如滑石或硬脂酸鎂組合；以及如果需要，與稀釋劑、緩沖劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑和調(diào)味劑結(jié)合。所述多肽可通過(guò)將其溶解、懸浮或乳化于水性或非水性溶劑例如植物油或其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高級(jí)脂肪酸的酯或丙二醇中，以及如果需要，與常規(guī)的添加劑例如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑一起，而配制成用于注射的制備物。所述多肽可用于氣溶膠配制物中以經(jīng)由吸入施用。本發(fā)明的多肽可配制于加壓的可接受推進(jìn)劑如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等中。此外，所述多肽可通過(guò)與多種基底(base)(例如乳化基底或水溶性基底)混合而制成栓劑。本發(fā)明的多肽可經(jīng)由栓劑而直腸施用。栓劑可包括媒介物，例如可可脂、碳蠟 (carbowax)和聚乙二醇，其在體溫融化，但在室溫固化。
可提供用于口服或直腸施用的單位劑型，如糖漿、酏劑和懸浮劑，其中每個(gè)劑量單位(例如茶匙量、湯匙量、片劑或栓劑)包含預(yù)定量的組合物，所述組合物含有一種或多種本發(fā)明的多肽。類似地，用于注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑型可包含在組合物中的本發(fā)明多肽，而所述組合物為無(wú)菌水、生理鹽水或另一藥學(xué)上可接受的載體中的溶液。用于持續(xù)釋放配制物的移植物是本領(lǐng)域中公知的。移植物以生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、厚片(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可侵蝕性聚合物，其被宿主良好地耐受。包含本發(fā)明的抗細(xì)菌多肽的移植物置于接近感染的位點(diǎn)，使得活性劑的局部濃度相對(duì)于身體的其余部分增加。術(shù)語(yǔ)“單位劑型”用于本文意指物理上離散的單位，其適合作為用于人和動(dòng)物受試者的單元?jiǎng)┝?，每個(gè)單元包含預(yù)定量的本發(fā)明多肽，該量經(jīng)計(jì)算為足夠產(chǎn)生期望效果的量，所述多肽與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或媒介物組合。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格取決于所采用的具體多肽和待實(shí)現(xiàn)的效果、以及在宿主中與所述多肽相關(guān)的藥效動(dòng)力學(xué) (pharmacodynamics)0藥學(xué)上可接受的賦形劑，如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑，是公眾容易獲得的。此外，藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如PH調(diào)整和緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑(tonicity adjusting agent)、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑等，是公眾容易獲得的。用于全身性施用的典型劑量的范圍為0. Ipg至100毫克每公斤受試者重量每次施用。典型劑量可為每天服用二到六次每次一片，或每天服用一次每次一顆延時(shí)-釋放的 (time-release)膠囊或片劑，且包含成比例更高含量的活性成分。延時(shí)-釋放效果可通過(guò)在不同PH值溶解的膠囊材料、通過(guò)由于滲透壓緩慢釋放的膠囊、或通過(guò)任何其它已知的控制釋放方法而獲得。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解的是劑量水平可作為具體多肽、癥狀的嚴(yán)重性和受試者對(duì)副作用的敏感性的函數(shù)而變化。一些特定多肽比其他更為有效。給定多肽的優(yōu)選劑量可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)多種手段容易地確定。一個(gè)優(yōu)選的手段為測(cè)量給定多肽的生理潛力(physiological potency)。使用脂質(zhì)體作為遞送媒介物是一種受關(guān)注的方法。脂質(zhì)體與目標(biāo)位點(diǎn)的細(xì)胞融合并將內(nèi)腔的內(nèi)容物在細(xì)胞內(nèi)遞送。維持脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸一段足夠融合的時(shí)間，其使用多種方法以維持接觸，如分離、結(jié)合劑等。在本發(fā)明的一個(gè)方面，脂質(zhì)體經(jīng)設(shè)計(jì)以氣溶膠化用于肺部施用。脂質(zhì)體可用介導(dǎo)膜融合的純化蛋白質(zhì)或肽(如，仙臺(tái)病毒或流感病毒等)制備。脂質(zhì)可為已知的脂質(zhì)體形成性脂質(zhì)的任何有用組合，包括陽(yáng)離子脂質(zhì)或兩性離子脂質(zhì)， 如磷脂酰膽堿。剩下的脂質(zhì)通常會(huì)為中性或酸性脂質(zhì)，如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。為了制備脂質(zhì)體，可使用Kato等(1991) J. Biol. Chem. 266 :3361所描述的方法。 簡(jiǎn)言之，將脂質(zhì)和包含肽的內(nèi)腔組合物在適合的水性介質(zhì)(方便地為鹽水介質(zhì))中組合，其中總固體在大約1-10重量百分比的范圍內(nèi)。在短時(shí)間(大約5-60秒)激烈地?cái)噭?dòng)后，將管子置于溫水浴(大約25-40°C )并重復(fù)此循環(huán)大約5-10次。然后對(duì)所述組合物進(jìn)行聲處理一段方便的時(shí)間(一般大約1-10秒)并可進(jìn)一步通過(guò)漩渦震蕩而攪動(dòng)。然后通過(guò)加入水性介質(zhì)擴(kuò)增體積，一般使體積增加大約1-2倍，然后搖動(dòng)并冷卻。此方法允許將高分子量分子并入內(nèi)腔中。
具有其它活性劑的配制物為了用于提述方法，本發(fā)明的抗細(xì)菌多肽可與其它藥學(xué)活性劑(特別是其它抗微生物劑)一起配制。所關(guān)注的其它藥劑包括廣大范圍的抗生素，如于技術(shù)領(lǐng)域中已知的?？股氐念愋桶ㄇ嗝顾仡悾缜嗝顾谿、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、 苯唑西林(oxacillin)、羧節(jié)西林(carbenicillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨節(jié)西林等；青霉素類與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，頭胞菌素類的組合，例如頭孢克洛(cefaclor)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢呋辛(cefuroxime)、拉氧頭孢(moxalactam)等；碳青霉烯類 (carbapenems)；單環(huán)內(nèi)酰胺類(moncAactams)；氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類(quinolones)；氯霉素(cloramphenical)；甲硝唑 (metronidazole)；大觀霉素；甲氧節(jié)唆(trimethoprim)；萬(wàn)古霉素等?？姑咕鷦?包括多烯類，例如兩性霉素B (amphotericin B)、制霉菌素； 5-flucosyn ；和唑類，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)和氟康唑(fluconazol))也是有用的?？菇Y(jié)核藥物包括異煙胼 (isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、鏈霉素和利福平(rifampin)。細(xì)胞因子(例如干擾素Y、腫瘤壞死因子α、白介素12等)也可包含于本發(fā)明的抗細(xì)菌多肽的配制物中。體外合成本發(fā)明的多肽可通過(guò)體外合成使用如本技術(shù)領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法制備。多種商業(yè)合成設(shè)備是可獲得的，例如Applied Biosystems Inc.，Beckman的自動(dòng)化合成儀等。通過(guò)使用合成儀，可以用非天然氨基酸(特別是D-異構(gòu)體(或D-型)，例如D-丙氨酸與D-異亮氨酸、非對(duì)映異構(gòu)體、具有不同長(zhǎng)度或官能團(tuán)的側(cè)鏈等)取代天然存在的氨基酸。制備的特定順序和方式可通過(guò)方便性、經(jīng)濟(jì)性、所需純度等確定?？蓪⒒瘜W(xué)連接提供給多種肽或蛋白質(zhì)，其包括方便的用于鍵合的官能團(tuán)，如用于酰胺或取代的胺形成(例如還原性胺化)的氨基、用于硫醚或二硫鍵形成的硫醇基、用于酰胺形成的羧基等。如果需要，可在合成過(guò)程中或在表達(dá)過(guò)程中將多個(gè)基團(tuán)(其允許連接至其它分子或表面)導(dǎo)入至肽中。因此，可使用半胱氨酸以制造硫醚、使用組氨酸以連接至金屬離子復(fù)合物、使用羧基以形成酰胺或酯、使用氨基以形成酰胺等。所述多肽也可根據(jù)常規(guī)的重組合成方法分離和純化?？芍苽浔磉_(dá)宿主的裂解物， 而該裂解物使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析、或其它純化技術(shù)純化。一般來(lái)說(shuō)，所使用的組合物會(huì)包含按重量計(jì)至少20%的期望產(chǎn)物，更通常按重量計(jì)至少大約75%，優(yōu)選按重量計(jì)至少大約95 %，以及為了治療目的，通常按重量計(jì)至少大約99. 5 %，其系相對(duì)于與產(chǎn)物的制備及其純化方法有關(guān)的污染物而言。通常，百分比會(huì)基于總蛋白質(zhì)。通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，且所述實(shí)施例不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例在下述實(shí)施例中，SEQ ID NO 1所示的防衛(wèi)素多肽在下文中稱作“防衛(wèi)素2114”， 而SEQ ID NO :2所示的防衛(wèi)素多肽在下文中稱作“菌絲霉素”。實(shí)施例1
對(duì)干菌絲霍素和防下.素2114在THP-I巨卩策細(xì)胞,中胞內(nèi)作用的體夕卜研究本實(shí)施例呈現(xiàn)在受感染的THP-I巨噬細(xì)胞中對(duì)菌絲霉素和防衛(wèi)素2114的胞內(nèi)抗細(xì)菌活性的體外研究。細(xì)菌菌株的制備對(duì)于菌絲霉素研究，使用了兩種金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923(MSSA)和 E33235(MSSA，axil，來(lái)自 Statens Serum Institute，Denmark 的臨床分離株)。對(duì)于防衛(wèi)素2114研究，使用了兩種金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923 (MSSA)、 MRSA(臨床敗血病分離株，Statens Serum Institute,引用號(hào)1-15479)和 VRSA2(Pennsylvania HIP 11983)。將細(xì)菌的過(guò)夜培養(yǎng)物用人血清(AB陽(yáng)性，Lonza, USA)調(diào)理45分鐘。之后將所述細(xì)菌使用分光光度計(jì)(CECIL 2040)滴定，并對(duì)THP-I巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用4個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞進(jìn)行感染。將THP-I細(xì)胞在補(bǔ)充有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)菌與細(xì)胞在37°C，0)25%培養(yǎng)1小時(shí)以允許吞噬作用。洗滌在1小時(shí)溫育之后，將感染的細(xì)胞與慶大霉素(50μ g/mL)溫育45分鐘以消滅剩余的未經(jīng)吞噬的細(xì)菌。為了在溫育之后去除慶大霉素，將細(xì)胞用PBS洗滌3x。在第三次洗滌之后，將細(xì)胞重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基(+10%胎牛血清)中，并將菌絲霉素或防衛(wèi)素2114 以所需濃度添加(O-USxMIC)。將一個(gè)樣品與慶大霉素以IxMIC溫育以控制胞內(nèi)生長(zhǎng)。在防衛(wèi)素2114研究中，將活性與萬(wàn)古霉素和達(dá)托霉素的活性相比較。將細(xì)胞在6孔板中在37°C，0)25%溫育M小時(shí)。在溫育之后，將細(xì)胞在PBS中洗滌，并隨后在無(wú)菌水中重懸以釋放胞內(nèi)細(xì)菌。CFU量的確定將樣品根據(jù)預(yù)計(jì)的CFU量稀釋并涂布于TSA板上，并在35°C溫育過(guò)夜。在M小時(shí)溫育之后，對(duì)CFU進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞蛋白測(cè)定可將樣品在-20°C儲(chǔ)藏長(zhǎng)達(dá)一周。對(duì)樣品進(jìn)行聲處理并如Lowry等所述滴定蛋白質(zhì)，由此獲得作為CFU/mg蛋白的結(jié)果。對(duì)所有樣品進(jìn)行三次重復(fù)測(cè)試。數(shù)據(jù)分析體外胞內(nèi)劑量-應(yīng)答研究對(duì)于劑量-效果關(guān)系的分析，采用Hill等式(斜率=1)計(jì)算最大相對(duì)效力(maximal relative efficacy)，^liax，靜止?jié)舛?static concentration, Cstatic)和擬合優(yōu)度。這些參數(shù)使用非線性回歸確定。Efflax定義為CFU計(jì)數(shù)在吞噬后接種物和M小時(shí)處理之間的log變化，而Cstatic為導(dǎo)致無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)(CFU與起始接種物相同)的濃度(以MIC的倍數(shù)計(jì))。結(jié)果24小時(shí)之后菌絲霉素針對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923和E33235 表1.最大作用，^iax (以及置信區(qū)間，Cl)和靜止劑量(static dose)，Cstati。，來(lái)自
菌絲霉素的體外胞內(nèi)研究
權(quán)利要求
1.具有抗細(xì)菌活性的多肽在制備用于治療性處理吞噬性細(xì)胞中胞內(nèi)細(xì)菌感染的藥物中的用途，所述多肽包含與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述吞噬性細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的用途，其中所述細(xì)菌感染是金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)感染。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的用途，其中所述處理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一劑量。
5.具有抗細(xì)菌活性的多肽用于處理吞噬性細(xì)胞中的胞內(nèi)細(xì)菌感染，所述多肽包含與 SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5使用的多肽，其中所述吞噬性細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)使用的多肽，其中所述細(xì)菌感染是金黃色葡萄球菌感染。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)使用的多肽，其中所述處理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一劑量。
9.具有抗細(xì)菌活性的多肽在制備用于治療性處理慢性肉芽腫病的藥物中的用途，所述多肽包含與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
10.具有抗細(xì)菌活性的多肽用于處理慢性肉芽腫病，所述多肽包含與SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
11.處理吞噬性細(xì)胞中胞內(nèi)細(xì)菌感染的方法，包括向需要此種處理的人或動(dòng)物以用于處理吞噬性細(xì)胞中所述胞內(nèi)細(xì)菌感染的有效量施用抗細(xì)菌多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述吞噬性細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
13.權(quán)利要求11-12任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌感染是金黃色葡萄球菌感染。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其中所述處理包括至少17mg/kg的所述多肽的第一劑量。
15.處理慢性肉芽腫病的方法，包括向需要此種處理的人或動(dòng)物以用于處理慢性肉芽腫病的有效量施用抗細(xì)菌多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少90% 同一性的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用防衛(wèi)素多肽治療胞內(nèi)細(xì)菌感染的方法。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102264383SQ200980152304
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者卡羅林.S.布林科 申請(qǐng)人:諾維信阿德寧生物技術(shù)公司