專利名稱：抗生素協(xié)同作用的制作方法
抗生素協(xié)同作用對序列表的引用本申請包含計算機(jī)可讀形式的序列表。該計算機(jī)可讀形式通過提述并入本文。發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及防衛(wèi)素類抗生素和β -內(nèi)酰胺類抗生素之間的協(xié)同作用。背景抗微生物化合物的可用類型稀少限制了對細(xì)菌感染包括涉及抗生素抗性細(xì)菌的感染的單一和組合藥物處理的范圍。因此，抗細(xì)菌化療研究著眼于發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)以供開發(fā)新的抗細(xì)菌劑。發(fā)現(xiàn)新的抗細(xì)菌化合物的另一方法是發(fā)現(xiàn)抗生素增效劑?？刮⑸锆煼ǖ膮f(xié)同作用是周知的，并用于描述組合使用抗生素的超加成(supra-additive)活性。舉例而言，在處理細(xì)菌感染時，已顯示組合如青霉素或氨芐西林和鏈霉素或慶大霉素針對腸球菌感染具有超加成作用。類似地，羧芐西林或替卡西林與氨基糖苷類如慶大霉素或妥布拉霉素在處理銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染時呈現(xiàn)協(xié)同作用。一同使用鏈霉素與四環(huán)素的組合療法比單獨(dú)使用任一藥物更加有效地治療布氏菌病，而氯霉素加上磺胺的混合物針對由流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)引起的腦膜炎更為有效。本領(lǐng)域已知幾種抗細(xì)菌防衛(wèi)素多肽。實例包括菌絲霉素(Plectasin)(參見WO 03/044049)和菌絲霉素的變體(參見WO 2006/131504)。β -內(nèi)酰胺類抗生素也是一組周知的抗細(xì)菌化合物。β “內(nèi)酰胺是具有雜環(huán)結(jié)構(gòu)的內(nèi)酰胺，由三個碳原子和一個氮原子組成。內(nèi)酰胺環(huán)是幾種抗生素(如青霉素)的一部分，因此這些抗生素也稱為內(nèi)酰胺類抗生素。之前并未公開防衛(wèi)素類和β -內(nèi)酰胺類抗生素的組合，及其治療用途。本發(fā)明的目的是提供使用防衛(wèi)素類和β “內(nèi)酰胺類抗生素的協(xié)同組合治療。

發(fā)明內(nèi)容
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)防衛(wèi)素多肽和β -內(nèi)酰胺類抗生素呈現(xiàn)協(xié)同的抗細(xì)菌活性。相應(yīng)地，本發(fā)明提供包含第一抗細(xì)菌化合物和第二抗細(xì)菌化合物的(協(xié)同性)藥物組合物，所述第一抗細(xì)菌化合物為防衛(wèi)素，且所述第二抗細(xì)菌化合物為內(nèi)酰胺類抗
生素或氨基糖苷。在第二個方面，本發(fā)明提供了在人或動物中處理細(xì)菌感染的方法，包括以處理所述細(xì)菌感染的有效量向需要這種處理的人或動物施用第一抗細(xì)菌化合物和第二抗細(xì)菌化合物，所述第一抗細(xì)菌化合物為防衛(wèi)素且所述第二抗細(xì)菌化合物為內(nèi)酰胺類抗生素或
(a beta-lactam antibiotic or anaminoglyeoside)。發(fā)明詳述定義抗細(xì)菌活性術(shù)語“抗細(xì)菌活性”于本文定義為一種能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞或抑制細(xì)菌細(xì)胞生長的活性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抗細(xì)菌”旨在意指有殺細(xì)菌和/或抑制細(xì)菌的效果，其中所述術(shù)語“殺細(xì)菌”應(yīng)理解為能夠殺死細(xì)菌細(xì)胞；而其中所述術(shù)語“抑制細(xì)菌的”應(yīng)理解為能夠抑制細(xì)菌生長。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞的生長受抑制時，細(xì)胞處于非生長狀態(tài)，即其
無法繁殖。在優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語“抗細(xì)菌活性”定義為針對鏈球菌(Streptococci)(優(yōu)選月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae))或葡萄球菌(Staphylococci)(優(yōu)選金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的殺細(xì)菌和/或抑制細(xì)菌活性。就本發(fā)明而言，抗細(xì)菌活性可根據(jù)由Lehrer等，Journal of ImmunologicalMethods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991)所述的方法測定。或者， 抗細(xì)菌活性可根據(jù)來自CLSI (臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)；之前稱為國家臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(National Committee ofClinical and Laboratory Standards))的 NCCL S 指南測定。將具有抗細(xì)菌活性的化合物以濃度為500 μ g/mL ；優(yōu)選濃度為250 μ g/mL ；更優(yōu)選濃度為100 μ g/mL ；甚至更優(yōu)選濃度為50 μ g/mL ；最優(yōu)選濃度為25 μ g/mL ；且特別是濃度為10 μ g/mL的所述具有抗微生物活性的多肽在相關(guān)微生物生長底物中于37°C溫育24小時后(優(yōu)選16小時后，更優(yōu)選8小時后，最優(yōu)選4小時后，且特別是2小時后)可具有將肺炎鏈球菌(ATCC 49619)的活細(xì)胞數(shù)減少至1/100的能力。具有抗細(xì)菌活性的化合物當(dāng)以500μ g/mL的濃度加入；優(yōu)選當(dāng)以250 μ g/mL的濃度加入；更優(yōu)選當(dāng)以100 μ g/mL的濃度加入；甚至更優(yōu)選當(dāng)以50 μ g/mL的濃度加入；最優(yōu)選當(dāng)以10 μ g/mL的濃度加入；以及特別是當(dāng)以5 μ g/mL的濃度加入時，在相關(guān)微生物生長底物中于37°C也可具有將肺炎鏈球菌(ATCC 49619)的長出(outgrowth)抑制8小時的能力。本發(fā)明的化合物具有至少20 %，優(yōu)選至少40 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少 60 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少80 %，甚至更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %，且甚至最優(yōu)選至少100%的由SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成的多肽的抗細(xì)菌活性。防衛(wèi)素(Defensin)術(shù)語“防衛(wèi)素”用于本文意指本領(lǐng)域的技術(shù)人員識別為屬于防衛(wèi)素類抗微生物肽的多肽。為確定某多肽是否為本發(fā)明的防衛(wèi)素，優(yōu)選將其氨基酸序列通過使用可免費(fèi)獲得的HMMER軟件包與PFAM數(shù)據(jù)庫的隱蔽馬爾科夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型(HMMprofile))比較(參見實施例 5)。PFAM防衛(wèi)素家族包括防衛(wèi)素_1或“哺乳動物防衛(wèi)素”(登錄號PF00323)、防衛(wèi)素 _2或“節(jié)肢動物防衛(wèi)素”(登錄號PF01097)、防衛(wèi)素或“β防衛(wèi)素”(登錄號PF00711)、 防衛(wèi)素_prop印或“防衛(wèi)素前肽”(登錄號PF00879)與γ-硫素(gamma-thionin)或“ γ-硫素家族”(登錄號PF00304)。防衛(wèi)素可屬于α -防衛(wèi)素類、β -防衛(wèi)素類、θ -防衛(wèi)素類、昆蟲或節(jié)肢動物防衛(wèi)素類、或植物防衛(wèi)素類。來自這些類中每一類的防衛(wèi)素享有共同的結(jié)構(gòu)特征，如半胱氨酸樣式。但重要的是注意類的歸屬并不表明防衛(wèi)素的來源。舉例而言，來自真菌的防衛(wèi)素可屬于昆蟲防衛(wèi)素類。如SEQ ID NO 1所示的防衛(wèi)素是來源于菌絲霉素的合成防衛(wèi)素(參見WO 03/044049)，其屬于昆蟲防衛(wèi)素類。
在一個實施方案中，本發(fā)明的防衛(wèi)素的氨基酸序列包含4、5、6、7或8個半胱氨酸殘基，優(yōu)選4、5或6個半胱氨酸殘基，更優(yōu)選4或6個半胱氨酸殘基，且最優(yōu)選6個半胱氨
酸殘基。防衛(wèi)素也可為享有任何防衛(wèi)素類的特性特征的合成防衛(wèi)素。這樣的防衛(wèi)素的實例包括但不限于α -防衛(wèi)素HNP-I (人嗜中性粒細(xì)胞肽)、ΗΝΡ_2 和 ΗΝΡ-3 ； β -防衛(wèi)素-12、Drosomycin, Heliomicin, γ 1-嘌呤硫素(y 1-purothionin)、 昆蟲防衛(wèi)素 A，和 PCT 申請 WO 99/53053、WO 02/06324、WO 02/085934、WO 03/044049、WO 2006/131504、WO 2006/050737 和 W02006/053565 中所公開的防衛(wèi)素。分離的多肽術(shù)語“分離的變體”或“分離的多肽”用于本文指自來源分離的變體或多肽。在一方面，該變體或多肽為至少純的，優(yōu)選至少5%純的，更優(yōu)選至少10%純的， 更優(yōu)選至少20%純的，更優(yōu)選至少40%純的，更優(yōu)選至少60%純的，甚至更優(yōu)選至少80% 純的，且最優(yōu)選至少90 %純的，如通過SDS-PAGE所測定的。基本上純的多肽術(shù)語“基本上純的多肽”于本文代表一種多肽制備物，其含有以重量計至多10 %，優(yōu)選至多8 %，更優(yōu)選至多6 %，更優(yōu)選至多5 %，更優(yōu)選至多4 %，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，且甚至最優(yōu)選至多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多肽物質(zhì)。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽按該制備物中存在的總多肽物質(zhì)的重量計為至少92%純的，優(yōu)選至少94%純的，更優(yōu)選至少95%純的，更優(yōu)選至少96% 純的，更優(yōu)選至少96 %純的，更優(yōu)選至少97 %純的，更優(yōu)選至少98 %純的，甚至更優(yōu)選至少 99%純的，最優(yōu)選至少99. 5%純的，且甚至最優(yōu)選100%純的。本發(fā)明的多肽優(yōu)選處于基本上純的形式。這可以通過以公知的重組方法或以經(jīng)典的純化方法制備該多肽來完成。同一性兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性通過參數(shù)“同一性” 描述。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用如于EMBOSS包(EMBOSS 歐洲分子生物開放軟件組(The European Molecular BiologyOpen Software Suite), Rice 等，2000，Trends in Genetics 16 276-277 ；http://emboss, org)的 Needle 程序，優(yōu)選3. 0. 0或更新的版本中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48 =443-453)來確定。所使用的任選參數(shù)為缺口產(chǎn)生罰分(gap open p^ialty) 為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長同一性”的Needle的輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性并如下計算(相同的殘基X100)/(比對的長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如于EMBOSS 包(EMB0SS 歐洲分子生物開放軟件組，Rice等，2000，如上；http //emboss, org)的 Needle程序，優(yōu)選3. 0. 0或更晚版本中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和 Wimsch，1970，如上)測定。所使用的任選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0. 5，和 EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用標(biāo)記為“最長同一性”的Needle的輸出(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性并如下計算(相同的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對的長度-比對中缺口的總數(shù))。等位變體術(shù)語“等位變體(allelic variant) ”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對由SEQ ID NO 1的氨基酸序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一處或多處一個或多個(數(shù)個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一處或多處一個或多個(數(shù)個)氨基酸側(cè)鏈的置換；或在氨基酸序列中使用具有相似特征的非天然氨基酸。特別地，所述修飾可為酰胺化，例如C-端的酰胺化。具有抗細(xì)菌活性的防衛(wèi)素多肽在第一方面，本發(fā)明涉及具有與SEQ ID NO :1 ( S卩，成熟多肽)有至少80%，優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，且特別地至少97%同一性程度的氨基酸序列的分離的多肽，其具有抗細(xì)菌活性(以下稱“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有與SEQ ID NO=I的氨基酸序列相差至多六個氨基酸，優(yōu)選至多五個氨基酸，更優(yōu)選至多四個氨基酸，甚至更優(yōu)選至多三個氨基酸，最優(yōu)選至多兩個氨基酸，且特別地是一個氨基酸的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有與SEQ ID NO 2的氨基酸序列相差至多六個氨基酸，優(yōu)選至多五個氨基酸，更優(yōu)選至多四個氨基酸，甚至更優(yōu)選至多三個氨基酸， 最優(yōu)選至多兩個氨基酸，且特別地是一個氨基酸的氨基酸序列。SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有三處氨基酸差異，其在位置9、13 和14處。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO=I的氨基酸序列或其等位變體。在一個優(yōu)選的方面，多肽包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID N0:1的氨基酸序列或其等位變體組成。在另一個優(yōu)選的方面，多肽由SEQ ID NO :1的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(of a minor nature)，即不顯著影響多肽的折疊和/或活性的保守的氨基酸取代或插入；單缺失；小的氨基_或羧基_末端延伸；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸標(biāo)簽(poly-histidine tag)、抗原表位(antigenic epitope)或結(jié)合域 (binding domain)。保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、 酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specific activity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H. Neuratt^PR. L. Hill, 1979，于The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍發(fā)生的交換是 Ala/Ser、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。除了 20個基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸 (pipecolic acid)、噻唑燒羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3- 二甲基脯氨酸。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和 Wells, 1989, Science 244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中， 將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，抗微生物活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996， J. Biol. Chem. 271 :4699_4708。生物相互作用也能夠通過對結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如de Vos等，1992，Science 255 :306_312 ;Smith等，1992， J. Mol. Biol. 224 899-904 ；Wlodaver 等，1992，F(xiàn)EBSLett. 309 :59_64。必需氨基酸的身份 (identity)也能夠根據(jù)分析與多肽的同一性來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 禾Π Sauer, 1988，Science 241 :53_57 ；Bowie 禾Π Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 2152-2156 ；WO 95/17413;或 WO 95/22625 公開的那些方法來進(jìn)行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman 等，1991，Biochem. 30 10832-10837 ；美國專利 No. 5，223，409 ；WO 92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46 145 ；Ner 等，1988，DNA 7 127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。N-端延伸本發(fā)明的多肽的N-端延伸可適當(dāng)?shù)赜?至50個氨基酸，優(yōu)選2-20個氨基酸，尤其是3-15個氨基酸組成。在一個實施方案中，N-端肽延伸不包含Arg(R)。在另一個實施方案中，N-端延伸包含kex2或kex2_樣切割位點，如在下文進(jìn)一步定義的。在一個優(yōu)選的實施方案中，N-端延伸為肽，其包含至少兩個Glu (E)和/或Asp (D)氨基酸殘基，如包含以下序列之一的N-端延伸EAE、EE、DE和DD。Kex2 位點Kex2位點(參見，例如，Methods in Enzymology Vol 185，D. Goeddel編，Academic Press Inc. (1990), San Diego, CA, "Gene Expression Technology，，)禾口 kex2_ 樣位點為在一些蛋白質(zhì)的前肽編碼區(qū)和成熟區(qū)之間存在的二元的(dibasic)識別位點(即，切割位
點)ο插入kex2位點或kex2_樣位點已在某些情況中顯示改進(jìn)了于前肽切割位點處的正確內(nèi)肽酶加工，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌水平增加。在本發(fā)明的上下文中，插入kex2或kex2_樣位點導(dǎo)致在N-端延伸中某個位置處獲得切割的可能性，造成抗微生物多肽與SEQ ID NO :1中所示的成熟多肽相比得到延長。融合的多肽本發(fā)明的多肽也包括融合的多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于本發(fā)明的多肽或其片段的N-端或C-端。通過將編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合的多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制下。如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的防衛(wèi)素的作用機(jī)理已使用多種技術(shù)徹底地研究了如SEQ ID N0:1(后文稱為“防衛(wèi)素2114”)和SEQ ID NO :2(后文稱作“菌絲霉素”)殺滅細(xì)菌細(xì)胞的機(jī)理。與多數(shù)其他抗微生物肽相反，防衛(wèi)素2114和菌絲霉素并不最初或作為主要機(jī)理破壞細(xì)菌的膜。對于暴露于防衛(wèi)素2114或菌絲霉素的細(xì)菌，未檢測到K+的流出且其跨膜電勢保持不變。傳統(tǒng)的摻入法研究顯示對防衛(wèi)素2114或菌絲霉素的暴露嚴(yán)重地影響了細(xì)胞壁前體但非蛋白質(zhì)或核酸(RNA/DNA)的摻入。在補(bǔ)充實驗如DNA微陣列、生長動力學(xué)和細(xì)胞形態(tài)的變化中顯示了防衛(wèi)素2114暴露或菌絲霉素暴露的結(jié)果與暴露于其他細(xì)胞壁抑制劑特別是萬古霉素的反應(yīng)相仿。更具體而言，在體外顯示了防衛(wèi)素2114和菌絲霉素以10_6至Ι ΤΜ—1范圍的結(jié)合常數(shù)結(jié)合于LipidI 和Lipidll，其為用于合成細(xì)菌細(xì)胞壁的前體。在細(xì)菌細(xì)胞中掩蔽LipidII (和LipidI)抑制這些前體聚合為肽聚糖。LipidII聚合為肽聚糖是糖模塊的初始轉(zhuǎn)糖基作用繼以其中通過LipidII的肽部分介導(dǎo)不同糖鏈交聯(lián)的轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)的結(jié)果。兩個反應(yīng)原則上均可由防衛(wèi)素2114或菌絲霉素所阻斷。也顯示了其他抗生素或抗微生物劑結(jié)合并掩蔽Lipidll，例如，作為糖肽的萬古霉素和作為羊毛硫抗生素的尼生素(lantibiotic Nisin)。未在例如萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌(VRSA)和防衛(wèi)素2114或菌絲霉素之間觀察到交叉抗性，表明LipidII上不同的表位涉及對這兩種抗生素的結(jié)合，或在此結(jié)合中起重要作用。β -內(nèi)酰胺類抗生素的作用機(jī)理內(nèi)酰胺環(huán)是幾種抗生素家族結(jié)構(gòu)的一部分，主要為青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單環(huán)內(nèi)酰胺類，因此它們也稱為內(nèi)酰胺類抗生素。這些抗生素通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成起作用。β -內(nèi)酰胺類抗生素(如青霉素G)通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖交聯(lián)而起作用。青霉素的內(nèi)酰胺模塊(官能團(tuán))結(jié)合于在細(xì)菌中連接肽聚糖分子的酶(DD-轉(zhuǎn)肽酶)，其削弱細(xì)菌的細(xì)胞壁(換言之，該抗生素導(dǎo)致由于滲透壓引起的細(xì)胞溶解或死亡)。此外，肽聚糖前體的蓄積引發(fā)細(xì)菌細(xì)胞壁水解酶和自溶素的激活，其進(jìn)一步消化細(xì)菌現(xiàn)有的肽聚糖。青霉素顯示與氨基糖苷類(如慶大霉素)的協(xié)同作用，因為對肽聚糖合成的抑制允許氨基糖苷類更容易穿透細(xì)菌細(xì)胞壁，允許其在細(xì)胞內(nèi)破壞細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成。這導(dǎo)致易感生物的MBC降低。頭孢菌素類化合物由意大利科學(xué)家Gius印pe Brotzu在1948年首先從來自陰溝的頂頭孢霉(C印halosporium acremonium)的培養(yǎng)物中分離。頭孢菌素母核，7-氨基頭孢菌烷酸(7-aminoc印halosporanic acid) (7-ACA)衍生自頭孢菌素C，并證實類似于青霉素母核6-氨基青霉烷酸。因此，頭孢菌素類化合物屬于內(nèi)酰胺類抗生素。頭孢菌素類(如頭孢曲松(Ceftriaxone)或頭孢噻肟(Cefotaxime))為殺細(xì)菌劑，并與其他內(nèi)酰胺類抗生素(如青霉素)具有相同的作用模式。頭孢菌素類破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層的合成。肽聚糖層對于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性是重要的。在肽聚糖合成中最終的轉(zhuǎn)肽步驟由稱作青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的轉(zhuǎn)肽酶促進(jìn)。PBP在胞壁肽(肽聚糖前體) 的末端結(jié)合于D-Ala-D-Ala以交聯(lián)肽聚糖。β _內(nèi)酰胺類抗生素模擬該位點，并競爭性抑制肽聚糖的PBP交聯(lián)。氨基糖苷類的作用機(jī)理氨基糖苷類(如慶大霉素)通過結(jié)合于細(xì)菌30S核糖體亞單位(部分通過結(jié)合于 50S亞單位起作用)，抑制肽酰-tRNA從A位點轉(zhuǎn)位至P位點，還導(dǎo)致mRNA的錯讀，使得細(xì)菌無法合成對其生長極其重要的蛋白質(zhì)而起作用。其通過結(jié)合于16S rRNA而抑制蛋白質(zhì)合成和通過破壞細(xì)菌細(xì)胞膜完整性而殺滅細(xì)菌。呈現(xiàn)協(xié)同抗細(xì)菌活性的組合物本發(fā)明提供呈現(xiàn)協(xié)同抗細(xì)菌活性的藥物組合物，包含-第一抗細(xì)菌化合物，其是防衛(wèi)素，和-第二抗細(xì)菌化合物，其是內(nèi)酰胺類抗生素或氨基糖苷。協(xié)同作用是通過二維或棋盤狀(checkerboard)測試中分級抑制濃度(FIC)指數(shù) (0. 5來鑒定的。在殺滅曲線中，協(xié)同性是根據(jù)在24小時之后，該組合與最具活性的組分之間在CFU/mL方面彡2Log1(1的減少而鑒定的；而在該組合存在情況下存活的生物數(shù)必需低于起始接種物彡2Log1(lCFU/mL。至少一種藥物必需以單獨(dú)使用時不影響測試生物的生長曲線的濃度存在。拮抗是通過>4的FIC指數(shù)鑒定的。亦參見實施例1和2。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物使用選自下組的測試生物呈現(xiàn)FIC指數(shù) ^0. 5 肺炎鏈球菌ATCC49619，金黃色葡萄球菌ATCC29213，金黃色葡萄球菌ATCC34400，金黃色葡萄球菌ATCC25923和表皮葡萄球菌ATCC49134。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物對革蘭氏陽性細(xì)菌如鏈球菌和葡萄球菌呈現(xiàn)協(xié)同性抗細(xì)菌活性。方法和用途本發(fā)明組合物用于處理細(xì)菌感染。相應(yīng)地，本發(fā)明的組合物可用作抗細(xì)菌的獸用或人用治療劑或預(yù)防劑。本發(fā)明的組合物可用于制備用于處理細(xì)菌感染的獸用或人用治療劑或預(yù)防劑。本發(fā)明的組合物以足以處理細(xì)菌感染，S卩，足以殺滅或抑制導(dǎo)致細(xì)菌感染的細(xì)菌， 例如殺滅或抑制鏈球菌屬菌種如肺炎鏈球菌或葡萄球菌屬菌種如金黃色葡萄球菌的生長的量使用。將本發(fā)明組合物的配制物施用于患有細(xì)菌感染的宿主。施用可為局部的或全身的 (systematic)。一般而言，本發(fā)明的組合物的劑量會足以使細(xì)菌群體減少至少llog，且可為 2個或更多個log。本發(fā)明的組合物是以減少細(xì)菌群體同時最小化任何副作用的劑量施用。 考慮的是獲得組合物并在醫(yī)師的指導(dǎo)下使用以用于體內(nèi)用途。 本發(fā)明的組合物中使用的抗細(xì)菌化合物可同時施用，或以任何順序先后施用。還可將所述抗細(xì)菌化合物彼此獨(dú)立地通過不同途徑施用。下述施用和配制的實例適用于本發(fā)明的組合物，以及用于組合物中的各個抗細(xì)菌化合物。可采用多種施用方法?？辜?xì)菌化合物的配制物可口服給予，或可血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、 皮下、腹膜注射、通過氣溶膠、眼部(opthalmically)、膀胱內(nèi)、局部等方式。治療性配制物的劑量變化會很大，取決于待施用的具體抗細(xì)菌化合物、施用的頻率、施用的方式、藥劑自宿主的清除等。初始劑量可以較大，然后為較小的維持劑量。在許多情況中，口服施用會需要比靜脈內(nèi)施用更高的劑量。防衛(wèi)素的酰胺鍵，以及氨基與羧基端，可進(jìn)行修飾以在口服施用時具有較大的穩(wěn)定性。例如，羧端可經(jīng)酰胺化。配制物在本發(fā)明的組合物中使用的抗細(xì)菌化合物可摻入多種配制物中用于治療性施用。 更具體地，所述抗細(xì)菌化合物可通過與適合的、藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合而配制成藥物組合物，且可配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制備物，如片劑、膠囊、粉末、 顆粒、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、泡沫、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球、洗劑 (lotion)和氣霧劑。如此，抗細(xì)菌化合物的施用可以多種方式實現(xiàn)，其包括經(jīng)口施用、含服施用、直腸施用、腸胃外施用、腹膜內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、透皮施用、氣管內(nèi)施用等。本發(fā)明組合物的抗細(xì)菌化合物在施用后可為全身性或可為局部化的。本發(fā)明的組合物可單獨(dú)施用或可與其他已知化合物(例如，穿孔素(perforin)、 抗炎劑、抗生素等)組合使用。在藥物劑型中，組合物的抗細(xì)菌化合物可以其藥學(xué)上可接受的鹽的形式施用。以下方法與賦形劑僅為實例而非以任何方式限制。對于口服制備物，抗細(xì)菌化合物可單獨(dú)使用或與適合的添加劑組合以制造片劑、 粉末、顆?；蚰z囊，例如，與常規(guī)的添加劑，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉組合；與粘合劑(binder)，如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠(acacia)、玉米淀粉或明膠組合；與崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉組合；與潤滑劑，如滑石或硬脂酸鎂組合；以及如果需要，與稀釋劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑和調(diào)味劑結(jié)合?？辜?xì)菌化合物可通過將其溶解、懸浮或乳化于水性或非水性溶劑(例如植物油或其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸的酯或丙二醇)中，以及如果需要，與常規(guī)的添加劑(例如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑)一起，而配制成用于注射的制備物?？辜?xì)菌化合物可用于氣霧劑配制物中以經(jīng)由吸入施用。在本發(fā)明的組合物中使用的抗細(xì)菌化合物可配制于加壓的可接受推進(jìn)劑如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等中。此外，抗細(xì)菌化合物可通過與多種基底(base)(例如乳化基底或水溶性基底)混合而制成栓劑。所述抗細(xì)菌化合物可經(jīng)由栓劑而直腸施用。栓劑可包括媒介物，例如可可脂、碳蠟(carbowax)和聚乙二醇，其在體溫融化，但在室溫固化?？商峁┯糜诳诜蛑蹦c施用的單位劑型，如糖漿、酏劑和懸浮劑，其中每個劑量單位(例如茶匙量、湯匙量、片劑或栓劑)包含預(yù)定量的在本發(fā)明的組合物中使用的抗細(xì)菌化合物。類似的，用于注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑型可包含抗細(xì)菌化合物，而所述劑型為無菌水、生理鹽水或另一種藥學(xué)上可接受的載體中的溶液。用于持續(xù)釋放配制物的移植物是本領(lǐng)域中公知的。移植物以生物可降解的或非生物可降解的聚合物配制成微球、厚片(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成可侵蝕性聚合物，其可良好地被宿主所容忍。將包含本發(fā)明組合物的移植物置于接近感染的位點，使得抗細(xì)菌化合物的局部濃度相對于身體的其余部分增加。用于本文，術(shù)語“單位劑型”意指物理上離散的單位，其適合作為用于人和動物受試者的單位劑量，每個單位包含預(yù)定量的本發(fā)明的抗細(xì)菌化合物，該量經(jīng)計算為足夠產(chǎn)生期望效果的量，所述多肽與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或媒介物組合。本發(fā)明的單位劑型的規(guī)格取決于所采用的具體抗細(xì)菌化合物和待實現(xiàn)的效果、以及在宿主中與抗細(xì)菌化合物相關(guān)的藥效云力力學(xué)(pharmacodynamics)。藥學(xué)上可接受的賦形劑，如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑，是公眾容易獲得的。此外，藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如PH調(diào)整和緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑(tonicity adjusting agent)、穩(wěn)定劑、潤濕劑等，是公眾容易獲得的。用于全身性施用的典型劑量的范圍為0. Ipg至100毫克每公斤受試者重量每次施用。典型劑量可為每天服用二到六次每次一片，或每天服用一次每次一顆延時-釋放的 (time-release)膠囊或片劑，且包含成比例更高含量的活性成分。延時-釋放效果可通過在不同PH值溶解的膠囊材料、通過由于滲透壓緩慢釋放的膠囊、或通過任何其它已知的控制釋放方法而獲得。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解的是劑量水平可作為具體抗細(xì)菌化合物、癥狀的嚴(yán)重性和受試者對副作用的敏感性的函數(shù)而變化。一些特定抗細(xì)菌化合物比其他更為有效。用于給定抗細(xì)菌化合物的優(yōu)選劑量可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過多種手段容易地確定。一個優(yōu)選的手段為測量給定抗細(xì)菌化合物的生理潛力(physiological potency)。使用脂質(zhì)體作為遞送媒介物是一種所關(guān)注的方法。脂質(zhì)體與目標(biāo)位置的細(xì)胞融合并將內(nèi)腔的內(nèi)容物在細(xì)胞內(nèi)遞送。維持脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸一段足夠融合的時間，其使用多種方法以維持接觸，如分離、結(jié)合劑等。在本發(fā)明的一個方面，脂質(zhì)體經(jīng)設(shè)計以氣溶膠化用于肺部施用。脂質(zhì)體可用介導(dǎo)膜融合的純化蛋白質(zhì)或肽(如，仙臺病毒或流感病毒等)制備。脂質(zhì)可為已知的脂質(zhì)體形成性脂質(zhì)的任何有用組合，包括陽離子脂質(zhì)或兩性離子脂質(zhì)， 如磷脂酰膽堿。剩下的脂質(zhì)通常會為中性或酸性脂質(zhì)，如膽固醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油等。為了制備脂質(zhì)體，可使用Kato等(1991)J. Biol. Chem. 266 :3361所描述的方法。簡言之，將脂質(zhì)和包含抗細(xì)菌化合物的內(nèi)腔組合物在適合的水性介質(zhì)(方便地為鹽水介質(zhì)) 中組合，其中總固體在大約1-10重量百分比的范圍內(nèi)。在短時間(大約5-60秒)激烈地攪動后，將管子置于溫水浴(大約25-40°C )并重復(fù)此循環(huán)大約5-10次。然后對所述組合物進(jìn)行聲處理一段方便的時間(一般大約1-10秒)并可進(jìn)一步通過漩渦震蕩而攪動。然后通過加入水性介質(zhì)擴(kuò)增體積，一般使體積增加大約1-2倍，然后搖動并冷卻。此方法允許將高分子量分子并入內(nèi)腔中。具有其它活性劑的配制物為了用于提述方法，在本發(fā)明的組合物中使用的抗細(xì)菌化合物可與其它藥學(xué)活性劑(特別是其它抗微生物劑)一起配制。所關(guān)注的其它藥劑包括廣大范圍的抗生素，如于技術(shù)領(lǐng)域中已知的?？股氐念愋桶ㄇ嗝顾仡悾缜嗝顾谿、青霉素V、甲氧西林(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、羧節(jié)西林(carbenicillin)、萘夫西林 (nafcillin)、氨芐西林等；青霉素類與β -內(nèi)酰胺酶抑制劑，頭胞菌素類的組合，例如頭孢克洛(cefaclor)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢呋辛(cefuroxime)、拉氧頭孢(moxalactam) 等；碳青霉烯類(carbapenems)；單環(huán)內(nèi)酰胺類(monobactams)；氨基糖苷類；四環(huán)素類；大環(huán)內(nèi)酯類；林可霉素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類(quinolones)；氯霉素 (cloramphenical)；甲石肖唑(metronidazole)；大觀霉素；甲氧節(jié)陡(trimethoprim)；萬古
毒素等?？姑咕鷦?包括多烯類，例如兩性霉素B (amphotericin B)、制霉菌素； 5-flucosyn ；以及唑類，例如咪康唑(miconazol)、酮康唑(ketoconazol)、伊曲康唑(itraconazol)與氟康唑(fluconazol))也是有用的。抗結(jié)核藥物包括異煙胼 (isoniazid)、乙胺丁醇(ethambutol)、鏈霉素和利福平(rifampin)。細(xì)胞因子(例如干擾素Y、腫瘤壞死因子α、白介素12等)也可包括于抗細(xì)菌化合物的配制物中。體外合成在本發(fā)明的組合物中使用的防衛(wèi)素多肽可通過體外合成使用如本技術(shù)領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法制備。多種商業(yè)合成設(shè)備(例如Applied BiosystemsInc.，Beckman的自動化合成儀等)是可獲得的。通過使用合成儀，可以用非天然氨基酸(特別是D-異構(gòu)體(或 D-型)，例如D-丙氨酸和D-異亮氨酸、非對映異構(gòu)體、具有不同長度或官能團(tuán)的側(cè)鏈等) 取代天然存在的氨基酸。制備的特定順序和方式可通過方便性、經(jīng)濟(jì)性、所需純度等確定?？蓪⒒瘜W(xué)連接提供給多種肽或蛋白質(zhì)，其包括方便的用于鍵合的官能團(tuán)，如用于酰胺或取代的胺形成(例如還原性胺化)的氨基、用于硫醚或二硫鍵形成的硫醇基、用于酰胺形成的羧基等。如果需要，可在合成過程中或在表達(dá)過程中將多個基團(tuán)(其允許連接至其它分子或表面)導(dǎo)入至肽中。因此，可使用半胱氨酸以制造硫醚、使用組氨酸以連接至金屬離子復(fù)合物、使用羧基以形成酰胺或酯、使用氨基以形成酰胺等。所述多肽也可根據(jù)常規(guī)的重組合成方法分離和純化?？芍苽浔磉_(dá)宿主的裂解物， 而該裂解物使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析、或其它純化技術(shù)純化。一般來說，所使用的組合物會包含按重量計至少20%的期望產(chǎn)物，更通常按重量計至少大約75%，優(yōu)選按重量計至少大約95%，以及為了治療目的，通常按重量計至少大約99. 5%，其系相對于與產(chǎn)物的制備及其純化方法有關(guān)的污染物而言。通常，百分比會基于總蛋白質(zhì)。通過以下實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，且所述實施例不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。
實施例如SEQ ID NO 1所示的防衛(wèi)素多肽在下文中稱作“防衛(wèi)素2114”。如SEQID NO 2 所示的防衛(wèi)素多肽在下文中稱作“菌絲霉素”。實施例1抗生素協(xié)同作用I使用時間-殺滅(Time-Kill)方法針對肺炎鏈球菌ATCC49619、金黃色葡萄球菌ATCC29213、金黃色葡萄球菌ATCC34400、金黃色葡萄球菌ATCC25923和表皮葡萄球菌 ATCC49134調(diào)查防衛(wèi)素2114與多種臨床使用的抗生素之間的協(xié)同作用、相加作用和拮抗作用。
在此方法中，將1/2XMIC的各抗生素單獨(dú)或以特定組合添加至107CFU/mL葡萄球菌或鏈球菌細(xì)胞，并在暴露2、3和5小時之后確定CFU。協(xié)同作用定義為組合與最具活件的單一藥物相比在CFU/ml方面彡21og10的減少。iiMM定義為組合與單獨(dú)的最具活性的單一抗微生物劑相比彡Ilog10的減少。 ^ Μ定義為在菌落計數(shù)方面彡21og10的增加。與防衛(wèi)素2114組合測試的抗生素為慶大霉素、青霉素G、頭孢曲松、萬古霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin)、四環(huán)素、多粘菌素B、立思丁(fucidin)、利奈唑胺(linezolid)、莫匹羅星(mupirocin)和氯霉
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包含-第一抗細(xì)菌化合物，其是防衛(wèi)素，和-第二抗細(xì)菌化合物，其是β -內(nèi)酰胺類抗生素或氨基糖苷。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第一和第二抗細(xì)菌化合物呈現(xiàn)協(xié)同性抗細(xì)菌活性。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述第一和第二抗細(xì)菌化合物使用選自下組的測試生物呈現(xiàn)FIC指數(shù);^ 0. 5 肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae) ATCC49619，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC29213，金黃色葡萄球菌ATCC34400，金黃色葡萄球菌 ATCC25923，和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epiderm idis)ATCC49134。
4.權(quán)利要求1-3任一項的組合物，其中所述第一抗細(xì)菌化合物結(jié)合于細(xì)菌細(xì)胞壁前體 Lipid I 禾口/^Lipid II。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述結(jié)合導(dǎo)致LipidI和/或Lipid II的掩蔽。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中所述結(jié)合的特征為約IO-6M-1或更小的結(jié)合常數(shù)，優(yōu)選約 IO-7M-1的結(jié)合常數(shù)。
7.權(quán)利要求1-6任一項的組合物，其中所述第一抗細(xì)菌化合物屬于節(jié)肢動物防衛(wèi)素類，或昆蟲防衛(wèi)素類。
8.權(quán)利要求1-7任一項的組合物，其中所述防衛(wèi)素包含與SEQID NO :1的氨基酸序列具有至少80 %同一性，優(yōu)選至少85%同一性，更優(yōu)選至少90 %同一性，甚至更優(yōu)選至少 95%同一性，且最優(yōu)選97%同一性的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1-8任一項的組合物，其中所述第二抗細(xì)菌化合物選自下組青霉素類、頭孢菌素類和氨基糖苷類。
10.權(quán)利要求1-9任一項的組合物，其中所述第二抗細(xì)菌化合物選自下組青霉素G、頭孢曲松和慶大霉素。
11.權(quán)利要求1-10任一項的藥物組合物在制備用于治療性處理細(xì)菌感染的藥物中的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，其中所述細(xì)菌感染由革蘭氏陽性細(xì)菌引起。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述細(xì)菌感染由鏈球菌或葡萄球菌引起。
14.權(quán)利要求1-10任一項的藥物組合物，其用于處理細(xì)菌感染。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述細(xì)菌感染由革蘭氏陽性細(xì)菌，如鏈球菌或葡萄球菌引起。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含防衛(wèi)素和β-內(nèi)酰胺類抗生素的藥物組合物的抗生素協(xié)同作用。
文檔編號A61K38/17GK102264382SQ200980152030
公開日2011年11月30日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者多西.桑德范格, 托馬斯.克魯斯, 漢斯-亨里克.K.霍根豪格, 珀.H.邁金德, 萊恩.A.尼爾森 申請人:諾維信阿德寧生物技術(shù)公司