專利名稱：制備肽粉末形式的方法
制備肽粉末形式的方法本發(fā)明涉及制備肽粉末形式，特別涉及GLP-I肽藥物的可自由流動的均一的粉末形式。適當?shù)碾乃幬锸侨艘雀哐撬貥与?1 (human glucagon-like peptide-1 (GLP-I))的類似物，特別是具有根據(jù)如下SEQ ID No. 1的氨基酸序列的GLP-I類似物His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-A Ia-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Aib-Arg-NH2,其中這些氨基酸中的沈個處于天然L構型而四個不是手性的。Aib意指α-氨基異丁酸。這種肽也稱為(Aib8’35)GLP-l (7-36)NH2，其藥學用途以及通過固相肽合成(SPPS) 的制備在PCT公開WO 2000/34331中描述。GLP-I類似物的合成也可遵循包括固相肽合成(SPPS)和溶液中片段偶聯(lián)兩者的混合方法進行。例如PCT公開WO 2007/147816描述了通過制備三個片段并在溶液中偶聯(lián)這些片段來制備(Aib8’35) GLP-I (7-36) NH2。單個合成步驟通常是高度選擇性的，然而，在多步驟化學合成的最后，產(chǎn)物一般不夠純以便作為藥物使用。因此粗制品可進行反相高效液相層析(RP-HPLC)以進一步純化肽，獲得范圍在96至99% (面積)的純度。在RP-HPLC階段后，產(chǎn)品通常以肽濃度一般為 1至15% (w/w)的溶液形式獲得。為了獲得適用于藥物制劑的干燥終產(chǎn)物，溶液可進行凍干或沉淀技術。然而，本領域已知的程序苦于供應不可自由流動形式的產(chǎn)物。進一步的沉淀和凍干技術費時并需要分批應用。因此本發(fā)明的目的是開發(fā)能夠以可自由流動的均一的粉末形式供應GLP-I肽藥物并且能夠在技術規(guī)模上應用的方法。發(fā)現(xiàn)可通過如下文概述的本發(fā)明的方法達到這種目的。產(chǎn)生GLP-I肽類似物的可自由流動的均一的粉末形式的方法的特征在于使所述肽類物在水性有機溶劑中的溶液進行噴霧干燥過程并以可自由流動的均一的粉末形式回收。所述肽的溶液直接從RP-HPLC階段或從RP-LPLC(低壓液相層析(low-pressure liquid chromatography)) 5 RP-MPLC(中壓液才目層析(medium-pressure liquid chromatography))—。術語“可自由流動的(freely flowable) ”描述噴霧干燥的GLP-I肽類似物的性質(zhì)以顯示良好的流動性質(zhì)，即所述GLP-I肽處于均一的粉末形式，沒有形成凝聚物或塊的傾向。術語“GLP-1肽類似物”包括天然人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)類似物 GLP-I (7-37)和 GLP-I (7-36) NH2 和 GLP-I 肽的合成類似物(GLP-1 類似物)。優(yōu)選的GLP-I類似物是具有根據(jù)如下SEQ ID No. 1的氨基酸序列的人GLP-I類似物His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-AIa-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Aib-Arg-NH2,即(Aib8’35)GLP-l(7-36)NH2*PCT公開 WO 2000/34331 中描述的另外的類似物。 (Aib8’35)GLP-I (7-36)NH2是最優(yōu)選的。短的形式表示這樣的類似物，即通過缺失第1至6的氨基酸殘基，在C-末端酰胺化和通過α-氨基異丁酸(Aib)置換位置8 (Ala)和35 (Gly) 的天然存在的氨基酸殘基從天然人GLP-I (1-37)正式獲得的類似物。適當?shù)腉LP-I 肽類似物可進一步選自 GLP-I (7-37)，GLP-I (7-36) NH2, (Gly8) GLP-I (7-37)，(Gly8) GLP-I (7-36)，(Ser34) GLP-I (7-37), (Val8) GLP-I (7-37), (Val8, Glu22) GLP-I (7-37)，(N-ε-(y -Glu (N- α -十六烷酰)))-Lys26Arg34-GLP-I (7-37)(利拉糖肽 (Liraglutide))和D-Ala8Lys37-(2_ (2_馬來酰亞胺基丙酰胺基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))GLP-I (7-37) (CJC-1131)。GLP-I肽的另外的類似物可以是毒蜥外泌肽(exendin)類似物，其選自毒蜥外泌肽-3，具有根據(jù)下述SEQ ID No. 2的氨基酸序列的毒蜥外泌肽-4(艾塞那肽 (exenatide))His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2，毒蜥外泌肽-4酸，毒蜥外泌肽_4 (1_30)，毒蜥外泌肽-4(1-30)酰胺，毒蜥外泌肽-4(1-28)，毒蜥外泌肽-4(1-28)酰胺，14Leiu25Phe毒蜥外泌肽_4酰胺和14Leu, 25Phe毒蜥外泌肽-4 (1-28)酰胺以及具有根據(jù)下述SEQ ID No. 3的氨基酸序列的毒蜥外泌肽類似物AVE-OOlO His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A Ia-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pr o-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LyS-NH2 ο附圖具有如下概述的含義

圖1 顯示噴霧干燥過程的流程圖。圖加顯示沉淀的(Aib8’35) GLP-I (7-36) NH2的掃描電子顯微鏡檢查。圖沘顯示噴霧干燥的(Aib8’35) GLP-I (7-36) NH2的掃描電子顯微鏡檢查。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述方法的特征在于所述肽類似物在水性有機溶劑中的溶液直接從制備型HPLC獲得并進料到噴霧干燥過程中。噴霧干燥過程包括步驟a)從供應槽(1)經(jīng)過濾器( 進料所述肽在水性有機溶劑中的溶液；b)在霧化器的幫助下在噴霧室(3)中霧化過濾的溶液；c)將霧化的混合物與經(jīng)過入口( 進料的熱干燥氣體混合，由此導致溶劑蒸發(fā)和肽粉末沉淀；和d)進料氣體粉末混合物到旋風分離器(cyclone) (6)中，其中所述肽能夠作為可自由流動的均一的粉末來收集。步驟a)步驟a)需要從供應槽(1)中經(jīng)過濾器( 進料所述肽在水性有機溶劑中的溶液。如上文所概述的，肽類似物在水性有機溶劑中的溶液優(yōu)選地直接取自制備型 HPLC(在圖1中用符號“A”表示)。在水與乙腈和THF的混合物在純化步驟中用作溶劑的情況下，所述肽溶液必須使用水與脂肪醇的混合物作為溶劑通過HPLC，或備選地通過 LPLC (低壓液相層析)或MPLC (中壓液相層析)進行隨后的濃縮。水性有機溶劑通常是20%至80% w/w的水與20%至80% w/w的脂肪醇的混合物， 優(yōu)選地是40%至70% w/w的水與30%至60% w/w的脂肪醇的混合物。脂肪醇可選自甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、正丁醇、仲丁醇或叔丁醇，優(yōu)選地是甲醇或乙醇。水性有機溶劑中的肽含量一般而言范圍在0. 5%至15% w/w之間，優(yōu)選地在1.0% 至10 % w/w之間，更優(yōu)選地在0. 5 %至8 % w/w之間。所述肽的溶液適宜地含有用于pH穩(wěn)定的普通緩沖劑。適當?shù)木彌_劑優(yōu)選地選自乙酸銨，其使用劑量的范圍可以是0.05%至0. 25% w/w，或乙酸，其使用劑量的范圍可以是 0. 05%至w/w。更優(yōu)選地，緩沖劑是0. 05至w/w的量的乙酸。所述肽溶液從供應槽(1)經(jīng)過濾器( 通常以進料速度lkg/h至20kg/h，優(yōu)選地 ^g/h至15kg/h進料到噴霧室(3)中。取決于所使用的噴霧干燥器設備的大小，進料速度可因而增加5至10的比例因子(scale-factor)。所述肽溶液的溫度可以在5°C至35°C之間選擇。濾器⑵的大小一般而言范圍是0. 2 μ m至4. 0 μ m。步驟b)步驟b)需要在霧化器⑷的幫助下在噴霧室⑶中霧化過濾的溶液。一般而言使用轉輪霧化器(rotary wheel atomizer)。霧化器的速度在10，OOOrpm 至30，OOOrpm的范圍選擇。步驟C)步驟c)需要將霧化的混合物與經(jīng)過入口( 進料的熱干燥氣體混合，由此導致溶劑蒸發(fā)和肽粉末沉淀。作為“熱干燥氣體”可以使用氮氣、二氧化碳或空氣。優(yōu)選的“熱干燥氣體”是氮氣，其可以100°C至200°C，優(yōu)選110°C至140°C的溫度應用。熱干燥氣體以進料速度300kg/h至500kg/h進料到噴霧室( 中。取決于所使用的噴霧干燥器設備的大小，進料速度可因而增加5至10的比例因子。步驟d)步驟d)需要進料所述氣體粉末混合物到旋風分離器(6)中，其中所述肽能夠作為可自由流動的均一的粉末來收集。進料到旋風分離器(6)中的氣體一般而言具有50°C至150°C，優(yōu)選50°C至110°C 和更優(yōu)選60°C至80°C的溫度。所述肽可用本領域熟知的設備諸如在袋濾室(bag housing) (B)中收集。氣體回收在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，氣體可根據(jù)下述氣體回收步驟回收e)用濾器(7)純化離開旋風分離器(6)的氣體；f)在冷凝器(8)中冷凝所述水性有機溶劑；g)在加熱器(9)中加熱離開冷凝器(8)的氣體并將熱干燥氣體再次引入到所述噴霧室(3)中。
濾器(7)適宜地連接用于收集保留在濾器中精細顆粒的適當設備(C)。冷凝器⑶也連接用于回收冷凝的溶劑的適當設備⑶。在加熱器(9)中再次使氣體達到在噴霧干燥過程中用作“熱干燥氣體”的溫度。備選地，可僅使用新鮮氣體。則相對于回收氣體時以“閉合循環(huán)”模式運行，噴霧干燥過程以“開放循環(huán)”模式運行。產(chǎn)物特征從根據(jù)本發(fā)明的噴霧干燥過程獲得的肽一般而言處于可自由流動的均一的粉末形式。因此與沉淀的產(chǎn)物相比，顆粒顯示更低的比表面積和更低的堆積密度。與沉淀的產(chǎn)物相比，噴霧干燥產(chǎn)物的大部分顆粒的直徑要低得多。在優(yōu)選的實施方案中，(Aib8’35)hGLP_l (7_36)NH2的可自由流動的均一的粉末的特征在于根據(jù)BET法(ISO 9277)測量的比表面積是0. 5m2/g至5m2/g，優(yōu)選是0. 5m2/g至 2. 5m2/g，即與沉淀的產(chǎn)物的測量值相比實質(zhì)上更低的值。噴霧干燥的(Aib8'35) hGLP-1 (7_36) NH2的特征還在于低于200 μ m,優(yōu)選地低于 150 μ m和更優(yōu)選低于100 μ m的顆粒大小分布d9(1 (通過激光散射測量)，其意味著90 %的顆粒具有低于200 μ m，優(yōu)選低于100 μ m的顆粒大小。多于60%的沉淀的肽具有超過500 μ m 的顆粒大小。噴霧干燥的(Aib8’35) hGLP-1 (7_36) NH2的平均顆粒大小一般而言在10至60 μ m的范圍內(nèi)，優(yōu)選在20至40 μ m的范圍內(nèi)和更優(yōu)選在20至30 μ m的范圍內(nèi)。噴霧干燥的(Aib8’35)hGLP-1 (7_36)NH2的加工性能參數(shù)堆積密度一般而言低于 0. 25g/cm3,優(yōu)選低于0. 2g/cm3,但可以調(diào)整至低于0. lg/cm3,因此與顯示超過0. 3至0. 4g/ cm3的值的沉淀的產(chǎn)物相比更佳。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)噴霧干燥產(chǎn)品的堆積密度(bulk density)和拍實密度 (tappeddensity)可根據(jù)參數(shù)進行調(diào)整，所述參數(shù)諸如水性有機溶劑(進料溶液)中水與脂肪醇的比例，進料溶液中肽和乙酸鹽的濃度和進料溶液的PH值。進料溶液中有少量乙酸鹽，獲得噴霧干燥的(Aib8’35) hGLP-1 (7_36) NH2的堆積密度低于0. lg/cm3，而進料溶液中更高量的乙酸鹽產(chǎn)生大約0. 2至0. 25g/cm3的堆積密度。因此，通過本文描述的方法獲得了具有低于0. lg/cm3的堆積密度的(Aib8’35) hGLP-1 (7_36)NH2噴霧干燥粉末，所述方法的特征在于肽溶液(進料溶液)含有低于2% w/w 的(Aib8'35) hGLP-1 (JNH2和低于0. 15，優(yōu)選低于0. 10% w/w的乙酸鹽。通過本文描述的方法獲得了具有大約0. 20至0. 25g/cm3的堆積密度的(Aib8’35)hGLP-1 (7_36)NH2噴霧干燥粉末，所述方法的特征在于肽溶液(進料溶液)含有7至8% w/w的(Aib8’35)hGLP-1 (7_36)NH2 和范圍在0. 4至0. 6% w/w的乙酸鹽。下述實施例對本發(fā)明進行示例性說明而不限制本發(fā)明。 實施例實施例A 肽的制備粗制的肽(Aib8’35)GLP-I (7-36)NH2可根據(jù)WO 2007/147816中描述的方法通過產(chǎn)生三個片段并在溶液中偶聯(lián)這些片段制備。
實施例B RP-HPLC 純化粗制的肽的純化在RP(反相)固定相上進行。因此，吸著劑是RP材料諸如硅膠 (例如Kromasil 100-16-C18)或丙烯酸酯大網(wǎng)格的吸附劑(例如Amberchrom CG71M)。純化涉及在大約2的pH的第一次通過層析純化，然后在大約9的pH第二次通過。第一次層析粗制的(Aib8’35) GLP-I (7-36) NH2溶解于水/乙腈/乙酸(例如90/9/lv/v/v)中并裝填到HPLC柱上(裝填達20g/L，床深大約25cm)，開始純化程序(表1中描述了具有45cm 長度的柱的實例)。收集級分，可用水或稀釋的氫氧化銨溶液進行稀釋。^ 1層析1的參數(shù)和純化程序
權利要求
1.產(chǎn)生GLP-I肽類似物的可自由流動的均一的粉末形式的方法，其中使所述肽類似物在水性有機溶劑中的溶液進行噴霧干燥過程并且以可自由流動的均一的粉末形式回收。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述肽在水性有機溶劑中的溶液從制備型HPLC、LPLC 或MPLC獲得。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述肽在水性有機溶劑中的溶液從制備型HPLC獲得。
4.根據(jù)權利要求1至3的方法，其中所述噴霧干燥過程包括步驟a)從供應槽(1)經(jīng)濾器( 進料所述肽在水性有機溶劑中的溶液；b)在霧化器的幫助下在噴霧室(3)中霧化過濾的溶液；c)將霧化的混合物與經(jīng)過入口( 進料的熱干燥氣體混合，由此導致溶劑蒸發(fā)和肽粉末沉淀；和d)進料所述氣體粉末混合物到旋風分離器(6)中，其中所述肽能夠作為可自由流動的均一的粉末收集。
5.根據(jù)權利要求1至4的方法，其中所述水性有機溶劑是20%至80%w/w的水和20% 至80% w/w的脂肪醇的混合物。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述脂肪醇是甲醇或乙醇。
7.根據(jù)權利要求1至6的方法，其中所述肽的溶液含有緩沖劑。
8.根據(jù)權利要求1至6的方法，其中所述肽的溶液含有乙酸鹽。
9.根據(jù)權利要求1至6的方法，其中所述肽的溶液含有0.4至0. 6% w/w的乙酸鹽。
10.根據(jù)權利要求1至6的方法，其中所述肽的溶液含有低于0.15% w/w的乙酸鹽。
11.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述噴霧干燥過程的步驟a)中所述肽的溶液以lkg/ h至20kg/h的進料速度經(jīng)濾器( 從供應槽(1)進料。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中所述肽的溶液具有5°C至35°C的溫度。
13.根據(jù)權利要求4，11和12中任意一項的方法，其中在所述噴霧干燥過程的步驟a) 中所述濾器O)的大小在0. 2 μ m至4. 0 μ m的范圍。
14.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述噴霧干燥過程的步驟b)中使用轉輪霧化器。
15.根據(jù)權利要求14的方法，其中所述霧化器的速度在10’OOOrpm至30’OOOrpm的范圍中選擇。
16.根據(jù)權利要求4的方法，其中在所述噴霧干燥過程的步驟c)中100°C至200°C溫度的氮氣用作熱干燥氣體。
17.根據(jù)權利要求4和16中任意一項的方法，其中所述熱干燥氣體以300kg/h至 500kg/h的進料速度進料。
18.根據(jù)權利要求4的方法，其中在所述噴霧干燥過程的步驟d)中進料到旋風分離器 (6)中的氣體具有50°C至110°C的溫度。
19.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述噴霧干燥過程另外還包括下述氣體回收步驟e)用濾器(7)純化離開旋風分離器(6)的氣體；f)在冷凝器(8)中冷凝所述水性有機溶劑；g)在加熱器(9)中加熱離開冷凝器(8)的氣體并將熱干燥氣體再次引入到噴霧室(3)中。
20.根據(jù)權利要求1至19中任意一項的方法，其中所述GLP-I肽類似物選自由下列各項組成的組GLP-I (7-37)，GLP-I (7-36) NH2, (Gly8) GLP-I (7-37), (Gly8) GLP-I (7-36)，(Ser34)GLP-I (7-37)，(Val8)GLP-I (7-37) , (Val8, Glu22) GLP-I (7-37), (Aib8'35)hGLP-1 (7_36)NH2, (N-ε-(y -Glu (N- α -十六烷酰)))-Lys26Arg34-GLP-I (7-37)， D-Ala8Lys37-(2-(2-馬來酰亞胺基丙酰胺基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))GLP-I (7_37)， 毒蜥外泌肽-3，毒蜥外泌肽-4，毒蜥外泌肽-4酸，毒蜥外泌肽-4 (1-30)，毒蜥外泌肽-4(1-30)酰胺，毒蜥外泌肽-4(1-28)，毒蜥外泌肽-4(1-28)酰胺，14Leu,25Phe毒蜥外泌肽-4酰胺和14Leu, 25Phe毒蜥外泌肽_4(1_28)酰胺和AVE-0010。
21.根據(jù)權利要求1至19中任意一項的方法，其中所述GLP-I肽類似物是(Aib8’35) hGLP-1(7-36)NH2。
22.可用權利要求1至19的方法獲得的GLP-I肽類似物。
23.(Aib8'35)hGLP-1 (7-36)NH2的可自由流動的均一的粉末形式。
24.根據(jù)權利要求23的(Aib8’35)hGLP-Ι (7-36)冊2的可自由流動的均一的粉末形式，其中顆粒具有0. 5m2/g至5m2/g的比表面積(BET)。
25.根據(jù)權利要求22和23的(Aib8’35)hGLP-1 (7-36) NH2的可自由流動的均一的粉末形式，其中90%的顆粒具有低于200 μ m的直徑。
26.本文上文所描述的新方法和新粉末形式。
全文摘要
本發(fā)明包括產(chǎn)生GLP-1肽類似物的可自由流動的均一的粉末形式的方法。所述方法的特征在于使所述肽類似物在水性有機溶劑中的溶液(優(yōu)選地其直接從層析純化過程中獲得)進行噴霧干燥過程并以可自由流動的均一的粉末形式回收。
文檔編號A61K9/16GK102256598SQ200980151638
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權日2008年12月23日
發(fā)明者丹尼爾·施特魯布, 克里斯蒂安·瓦爾克, 安德烈·赫爾, 弗朗西斯·維克斯, 彼得·施泰德勒, 萊米·施佩克爾, 邁克爾·羅泰, 邁克爾·詹森 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司