專利名稱：抗-cMET抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的能夠特異性結(jié)合人C-Met受體和/或能夠特異性抑制所述受體的酪氨酸激酶活性的二價(jià)抗體，以及編碼所述抗體的氨基酸和核酸序列。更特別地，根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠抑制c-Met 二聚化。本發(fā)明同樣包括所述抗體作為癌癥或與所述受體的超表達(dá)相關(guān)的任何病狀的預(yù)防和/或治療處理的藥物的用途，以及用于與c-Met超表達(dá)相關(guān)疾病的診斷的方法或試劑盒中的用途。本發(fā)明最后涉及包含這些抗體以及針對涉及腫瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移的其他生長因子的其他抗體和/或化合物和/或化合物和/或抗癌劑或與毒素偶聯(lián)的藥劑的產(chǎn)品和/或組合物，及其用于特定癌癥的預(yù)防和/或治療的用途。
背景技術(shù)：
受體酪氨酸激酶(RTK)靶向藥劑，如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗、伊馬替尼和吉非替尼抑制劑已經(jīng)說明了將該蛋白類別用于選定癌癥治療的興趣。c-Met是還包括RON和SEA的RTK亞家族的原型成員。c_Met RTK家族在結(jié)構(gòu)上不同于其他RTK家族，并且是唯一已知的肝細(xì)胞生長因子(HGF)(也稱為散射因子(SF)) 的高親和性受體[D. P. Bottaro 等，Science 1991,251 :802-804 ；L. Naldini 等，Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991,10 :2867-2878] c_Met和HGF在各種組織中廣泛表達(dá)，并且它們的表達(dá)通常分別限于上皮和間葉來源的細(xì)胞[M. F. Di Renzo等，Oncogene 1991，6 :1997-2003 ； E. Sonnenberg等，J. Cell. Biol. 1993,123 :223-235]。它們都是正常的哺乳動(dòng)物發(fā)育所需的，并且已經(jīng)顯示出在細(xì)胞遷移、形態(tài)分化和三維管構(gòu)造的組織以及生長和血管生成中特別重要[F. Baldt 等，Nature 1995,376 :768-771 ；C. Schmidt 等，Nature. 1995 :373 699-702 ；Tsarfaty 等，Science 1994，263 :98-101]。c_Met 和 HGF 的受控調(diào)節(jié)已經(jīng)顯示出在哺乳動(dòng)物發(fā)育、組織維持和修復(fù)中是重要的[Nagayama T.，Nagayama M.，Kohara S.， Kamiguchi H. , Shibuya M.，Katoh Y.，Itoh J. , Shinohara Y.，Brain Res. 2004,5 ；999 (2) 155-66 ；Tahara Y. , Ido A. , Yamamoto S. , Miyata Y. , Uto H. , Hori Τ. , Hayashi K., Tsubouchi H.，J Pharmacol Exp Ther. 2003,307(1) :146-51]，它們的調(diào)節(jié)異常涉及癌癥的進(jìn)展。由c-Met的不當(dāng)激活驅(qū)動(dòng)的異常信號是在人癌癥中觀察到的最常見的變化之一并且在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用[Birchmeier等，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003,4 915-925 ;L.Trusolino 禾口 Comoglio P. Μ. , Nat Rev. Cancer. 2002,2(4) :289-300]。不當(dāng)?shù)腸-Met激活可能由配體-依賴性和無關(guān)性機(jī)制引起，其包括c-Met的超表達(dá)和/或旁分泌或自分泌激活，或通過功能突變獲得[J. G. Christensen, Burrows J.和 Salgia R.，Cancer Latters. 2005,226 :1-26]。然而，在配體的存在或不存在下，c-Met 受體的低聚是調(diào)節(jié)激酶對ATP和含酪氨酸的肽底物的結(jié)合親和性和結(jié)合動(dòng)力學(xué)所需的[Hays JL, Watowich SJ，Biochemistry，2004 年 8 月 17 日，43 10570-8]。激活的 c-Met 募集信號效應(yīng)物至其位于細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的多塢(multidocking)位點(diǎn)，導(dǎo)致幾個(gè)關(guān)鍵信號途徑的激活，包括 Ras-MAPK、PI3K、Src 和 Mat3[Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005,15(1)49-51 ；Furge KA, Zhang Yff, Vande Woude GF, Oncogene. 2000,19(49) :5582-9]。這些途徑對于腫瘤細(xì)胞增殖、入侵和血管生成以及對于避免凋亡是必需的[Furge KA, Zhang Yff, Vande Woude GF,Oncogene,2000,19(49) :5582-9,Gu H. ,Neel BG,Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3) :122-30, Fan S.，Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q.，Cao Y.，Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM，Oncogene. 2000 年 4 月 27 日，19 (18) :2212-23]。此外，c_Met 信號相對于其他RTK的獨(dú)特方面是所報(bào)道的與焦點(diǎn)粘連復(fù)合物和非激酶結(jié)合伴侶的相互作用， 非酶結(jié)合伴侶如 α6β4 整聯(lián)蛋白[Trusolino L. ,Bertotti A. ,Comoglio PM，Cell. 2001， 107 :643-54]> CD44v6[Van der Voort R. , Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren Μ. , Prevo R. , Smit L. , David G. , Hartmann G. , Gherardi Ε. , Pals ST, J. Biol. Chem. 1999, 274 (10) 6499-506]、叢蛋白 Bl 或 semaphorin[Giordano S. , Corso S. , Conrotto P. , Artigiani S. , Gilestro G. , Barberis D. , Tamagnone L. , Comoglio PM, Nat Cell Biol.2002,4(9) 720-4 ；Conrotto P. , Valdembri D. , Corso S. , Serini G. , Tamagnone L. , Comoglio PM, Bussolino F. , Giordano S. , Blood. 2005,105 (11) :4321-9 ；Conrotto P. , Corso S., Gamberini S.，Comoglio PM, Giordano S.，Oncogene. 2004,23 :5131-7]，其可以進(jìn)一步增加這種受體對細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。最后，近期的數(shù)據(jù)證明c-Met可能涉及對吉非替尼或埃羅替尼的腫瘤抗性，表明同時(shí)靶向EGFR和c-Met的化合物的組合可能是非常令人感興趣的[Engelman JA 等，Science, 2007，316 1039-43]。在過去的一些年中，已經(jīng)研發(fā)了許多不同策略來削弱癌細(xì)胞系中的c-Met信號。 這些策略包括 i)中和對抗 c-Met 或HGF/SF 的抗體[Cao B. ,Su Y.，Oskarsson M.，Zhao P.， Kort EJ,Fisher RJ,ffang LM,Vande Woude GF,Proc Natl Acad Sci U S A. 2001，98 (13) 7443-8 ；Martens Τ. ,Schmidt NO,Eckerich C,Fillbrandt R. ,Merchant Μ. ,Schwall R.， Westphal Μ.，Lamszus K.，Clin Cancer Res. 2006,12(20) :6144-52]或使用 HGF/SF 拮抗劑 NK4,以防止配體結(jié)合 c-Met [Kuba K.，Matsumoto K.，Date K.，Shimura H.，Tanaka M.， Nakamura T.，Cancer Res. ,2000,60 :6737-43]，ii)阻斷激酶活性的 c_Met 的小 ATP結(jié)合位點(diǎn)抑制劑[Christensen JG, Schreck R. , Burrows J. , Kuruganti P. , Chan Ε, Le P. , Chen J. , Wang Χ. , Ruslim L. , Blake R. , Lipson KE, Ramphal J. , Do S. , Cui JJ, Cherrington JM,Mendel DB,Cancer Res. 2003，63 :7345-55]，iii)干擾接近多塢位點(diǎn)的工程化 SH2 結(jié)構(gòu)域多肽和降低受體或配體表達(dá)的RNAi或核酶。這些方法中的大部分顯示出c-Met的選擇性抑制，這導(dǎo)致腫瘤抑制，并顯示出c-Met對于癌癥中的治療干預(yù)是令人感興趣的。在對于c-Met靶向產(chǎn)生的分子內(nèi)，一些是抗體。最廣泛描述的是由Genentech產(chǎn)生的抗-c-Met 5D5抗體[W096/38557]，其在各種模型中單獨(dú)加入時(shí)，表現(xiàn)為有效的激動(dòng)劑， 并且用作Fab片段時(shí)，表現(xiàn)為拮抗劑。描述為一臂5D5(0A5D5)并作為重組蛋白在大腸桿菌中產(chǎn)生的該抗體的單價(jià)工程化形式也是Genentech專利申請的主題[W02006/015371]。然而，因?yàn)槠涮貏e的支架而不能認(rèn)為是抗體的這種分子也展示出在人體中可能是免疫原性的突變。就活性而言，這種未糖基化的分子缺乏效應(yīng)物功能，并且最后，沒有明顯的數(shù)據(jù)證明 0A5D5抑制c-Met的二聚化。此外，在體內(nèi)模型中在G55中測試時(shí)，G55是表達(dá)c-Met但不表達(dá)HGF mRNA和蛋白并且與配體無關(guān)地生長的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，一臂抗-c_Met對G55 腫瘤生長沒有明顯作用，表明0A5D5主要通過阻斷HGF結(jié)合起作用，并且不能夠靶向與HGF 無關(guān)的被激活的腫瘤[Martens Τ.等，Clin. Cancer Res. ,2006,12(20) :6144-6152]。
另一種靶向c-Met的抗體由Pfizer描述為“主要作為c_Met拮抗劑作用的抗體， 并且在一些情況中，作為c-Met激動(dòng)劑” [W02005/016382]。在該申請中沒有描述顯示出 Pfizer抗體在c-Met 二聚化中的任何作用的數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的創(chuàng)造性方面之一是生產(chǎn)沒有內(nèi)在激動(dòng)劑活性并抑制c-Met 二聚化的嵌合和/或人源化單克隆抗體。更特別地，本發(fā)明的一個(gè)創(chuàng)造性方面是生產(chǎn)具有拮抗劑活性并抑制c-Met 二聚化的嵌合和/或人源化單克隆抗體。除了靶向配體-依賴性腫瘤，該方法還將削弱C-Met的配體無關(guān)性激活，這種激活是由于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的超表達(dá)或突變引起的，該胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛盘柸匀灰蕾囉诘途刍?。該抗體活性的另一個(gè)方面立體地阻礙c-Met與其伴侶相互作用，從而導(dǎo)致c-Met功能削弱。將抗體優(yōu)選但不限于人源化和工程化為人IgGl，以獲得除與c-Met受體的特定阻斷相關(guān)的功能以外的效應(yīng)物功能，如ADCC和⑶C。令人^C訝地，第一次，發(fā)明人設(shè)法生成了能夠結(jié)合C-Met而且還能夠抑制C-Met 二聚化的嵌合和/或人源化單克隆拮抗劑抗體，所述單克隆抗體是二價(jià)的，這與現(xiàn)有的針對 c-Met的拮抗劑抗體相反。在現(xiàn)有技術(shù)中，如果是真實(shí)的，有時(shí)候表明能夠抑制c-Met與其伴侶二聚化的抗體是令人感興趣的，但從未公開過，或清楚地表明能夠進(jìn)行這些的抗體。此外，關(guān)于抗體特異性，根本沒有證據(jù)成功地產(chǎn)生了這樣的活性二價(jià)抗體。如之前所解釋的，c-Met 二聚化的抑制是本發(fā)明的重要方面，因?yàn)檫@些抗體將呈現(xiàn)出真實(shí)的對較大患者群的興趣。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗體不僅可以治療配體依賴性激活的c-Met癌癥，因?yàn)槠涫侵敝帘景l(fā)明的情況，而且還可以治療配體無關(guān)性激活的c-Met癌癥。通過對同時(shí)表達(dá)c-Met-RLuc/c-Met-YFP的細(xì)胞的BRET分析來評價(jià)抗體，并選擇它們抑制至少40 %，優(yōu)選45 %、50 %、55 %和最優(yōu)選60 %的BRET信號的能力。BRET技術(shù)已知為代表性的蛋白二聚化[Angers等，PNAS，2000，97 :3684-89]。BRET技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并將在一些實(shí)施例中詳述。更特別地， BRET(生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)是在生物發(fā)光供體(Renilla熒光酶(Rluc))和熒光受體 (GFP(綠色熒光蛋白)或YFP(黃色熒光蛋白)的突變體)之間發(fā)生的非放射性能量轉(zhuǎn)移。 在本發(fā)明的情況中，使用了 EYFP(增強(qiáng)的黃色熒光蛋白)。轉(zhuǎn)移的效率取決于方向以及供體和受體之間的距離。然后，只有兩個(gè)分子非常近(I-IOnm)，才會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。將這種特性用于產(chǎn)生蛋白-蛋白相互作用試驗(yàn)。實(shí)際上，為了研究兩個(gè)伴侶之間的相互作用，通常將第一個(gè)與Renilla熒光酶融合，而將第二個(gè)于GFP的黃色突變體融合。融合蛋白通常但不必須在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在其膜滲透性底物(coelenterazine)存在下，IUuc發(fā)射出藍(lán)光。如果GFP突變體離開IUuc近于lOnm，將發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，并且可檢測到另外的黃色信號。作為受體發(fā)射的光和供體發(fā)射的光之間的比例來測量BRET信號。因此，隨著兩個(gè)融合蛋白變近，或如果構(gòu)象變化使得mUC和GFP突變體更近，BRET信號將增加。如果BRET分析存在于優(yōu)選的實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法可以用來測量c-Met 二聚化。沒有限制，可以提及以下的技術(shù)FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)、 HTRF(均相時(shí)間分辨熒光)、FLIM(熒光壽命成像顯微鏡)或SW-FCCS單波長熒光交叉相關(guān)
也可以使用其他傳統(tǒng)技術(shù)，如共同免疫沉淀、α篩選、化學(xué)交聯(lián)、雙雜交、親和性色譜、ELISA或Far蛋白印跡。術(shù)語“一種抗體”、“多種抗體”或“免疫球蛋白，，以最寬意思互換使用，并且包括單克隆抗體(例如，全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價(jià)抗體或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要它們呈現(xiàn)出所需的生物活性)。更特別地，這樣的分子由糖蛋白組成，所述糖蛋白包含通過二硫鍵鏈間連接的至少兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈。每個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)(在此縮寫為HCVR 或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CHI、CH2和CH3組成。每個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成超可變性區(qū)，稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，散布更保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，以以下順序從氨基端排列至羧基端FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和典型補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。免疫球蛋白的重鏈可以分成三個(gè)功能區(qū)Fd區(qū)、鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)(可結(jié)晶片段)。 Fd區(qū)包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域，并且結(jié)合輕鏈，形成Fab-抗原結(jié)合片段。Fc片段負(fù)責(zé)免疫球蛋白效應(yīng)物功能，其包括，例如，補(bǔ)體固定和結(jié)合效應(yīng)物細(xì)胞的同源Fc受體。在IgG、IgA和 IgD免疫球蛋白類別中發(fā)現(xiàn)的鉸鏈區(qū)作為柔性間隔物，使Fab部分在相對于Fc區(qū)的空間中自由移動(dòng)。鉸鏈結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上是多變的，在免疫球蛋白類別和亞類中的序列和長度都有變化。根據(jù)結(jié)晶研究，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)可以在結(jié)構(gòu)和功能上進(jìn)一步細(xì)分成三個(gè)區(qū)上鉸鏈、核心和下鉸鏈(Shin等，Immunological Reviews 130:87,1992)。上鉸鏈包括從CHl 羧基端至限制運(yùn)動(dòng)的鉸鏈中第一個(gè)殘基的氨基酸，通常為兩個(gè)重鏈之間形成鏈間二硫鍵的第一個(gè)半胱氨酸殘基。上鉸鏈區(qū)的長度與抗體的片段柔性相關(guān)。核心鉸鏈區(qū)含有重鏈間二硫橋鍵。下鉸鏈區(qū)連接CH2結(jié)構(gòu)域的氨基端，并包括CH2結(jié)構(gòu)域中的殘基。人IgGl的核心鉸鏈區(qū)含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通過二硫鍵形成二聚化時(shí)，形成環(huán)八肽，認(rèn)為這作為樞軸，由此給予柔性。由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽序列的結(jié)構(gòu)和柔性產(chǎn)生的構(gòu)象變化可能影響抗體Fc部分的效應(yīng)物功能。術(shù)語“單克隆抗體”根據(jù)其通常的意思來使用，并且表示從基本上同源的抗體群獲得的抗體，即，構(gòu)成群的單獨(dú)抗體是相同的，除了可能少量存在的天然產(chǎn)生的突變。換句話說，單克隆抗體是從單個(gè)細(xì)胞克隆(例如，雜交瘤細(xì)胞、用編碼同源抗體的DNA轉(zhuǎn)染的真核宿主細(xì)胞、用編碼同源抗體的DNA轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞等)的增殖產(chǎn)生的同源抗體組成，并且通常特征在于單個(gè)類別和亞類的重鏈以及單種類型的輕鏈。單克隆抗體是高度特異性的，針對單種抗原。此外，與通常包括針對不同決定簇或表位的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每個(gè)單克隆抗體針對抗原上的單個(gè)決定簇。在本發(fā)明的描述中，術(shù)語與抗體化合物或其序列相連的多肽、多肽序列、氨基酸序列、肽和蛋白質(zhì)可互換。本發(fā)明涉及能夠抑制C-Met 二聚化的單克隆抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，并且包含重鏈和輕鏈，重鏈包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3或與序列SEQ IDN0. 1、2和3最佳比對后具有至少80%同一性的序列的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3 ；輕鏈包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或與序列SEQ ID NO. 5、6和7最佳比對后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗體進(jìn)一步的特征在于其還包含鉸鏈區(qū)，鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID No. 56。更特別地，本發(fā)明涉及如上所述的單克隆抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于還包含鉸鏈區(qū)，鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。換句話說，本發(fā)明涉及能夠抑制C-Met 二聚化的單克隆抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，并且包含重鏈和輕鏈，重鏈包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No.l、2和3或與序列SEQ ID NO. 1、2和3最佳比對后具有至少80%同一性的序列的CDR-HU CDR-H2和 CDR-H3 ；輕鏈包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或與序列SEQ ID NO. 5、6和7 最佳比對后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗體進(jìn)一步的特征在于其還包含鉸鏈區(qū)，鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。更特別地，本發(fā)明涉及如上所述的單克隆抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于還包含鉸鏈區(qū)，鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。換句話說，本發(fā)明涉及能夠抑制C-Met 二聚化的單克隆抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，并且包含重鏈和輕鏈，重鏈包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No.l、2和3或與序列SEQ ID NO. 1、2和3最佳比對后具有至少80%同一性的序列的CDR-HU CDR-H2和 CDR-H3 ；輕鏈包含各自具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7或與序列SEQ ID NO. 5、6和7 最佳比對后具有至少80%同一性的序列的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ；所述抗體進(jìn)一步的特征在于其還包含鉸鏈區(qū)，鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚的，共有序列(consensus sequence) SEQ ID No. 57和21 包含在共有序列SEQ ID No. 56中。表 1
#01#02#03#04#05#06#07#08#09#10#11#12#13#14SEQID NO 56XlX2X3CX5X6X7X8X9CXllX12CX14SEQ ID NO 57XlX2X3CX5X6X7X8X9CPPCPSEQID NO 21XlX2X3CX5-CX8X9CXllX12CX14對于 SEQ ID No. 56 Xl:P，R，C，-X5:D, C，G，-X8 :H, V, K,-X12 :P,-
X2:K，C，R，-X6:K, C，-X9 :T, C, E, P,-X14 :P,T
X3:S，C，D，-X7:T, C，-Xll :P, I表述“功能性片段和衍生物”將在之后的本發(fā)明說明書中詳細(xì)限定。如通過IMGT限定的，⑶R區(qū)或⑶R，用來表示免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的超變區(qū)。無論哪一種抗原受體、鏈類型或物種，已經(jīng)限定IMGT獨(dú)特的編號來比較可變結(jié)構(gòu)域[Lefranc M. -P., Immunology Today 18,509(1997) ；Lefranc Μ. -P., The Immunologist,7,132-136 (1999) ；Lefranc, Μ. -P. , Pommie, C, Ruiz, Μ. , Giudicelli, V., Foulquier, Ε. , Truong, L. , Thouvenin-Contet, V.禾口 Lefranc, Dev. Comp. Immunol,27,55-77 (2003)]。在IMGT獨(dú)特的編號中，保守氨基酸通常具有相同的位置，例如，半胱氨酸 23 (第一 -CYS)、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104 (第二 -CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118CJ-PHE或J-TRP)。IMGT獨(dú)特的編號提供了框架區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化劃界(FR1-IMGT 位置 1 至洸，F(xiàn)R2-IMGT :39 至 55，F(xiàn)R3-IMGT :66 至 104 和 FR4-IMGT :118 至 128)和互補(bǔ)決定區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化劃界CDR1_IMGT :27 至 38，CDR2-IMGT :56 至 65 和 CDR3-IMGT :105 至 117。因?yàn)槿笨诒硎疚凑紦?jù)的位置，⑶R-IMGT長度(顯示于括號中并由點(diǎn)分開，例如，[8.8. 13])成為關(guān)鍵信息。將IMGT獨(dú)特的編號用于2D繪圖表示中，稱為IMGT Colliers de Perles [Ruiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ. -P.，Immunogenetics，53，857—883 (2002) ；Kaas, Q.禾口 Lefranc，Μ. -P.， Current Bioinformatics，2，21_3(K2007)]，和用于 IMGT/3D 結(jié)構(gòu)-DB 的 3D 結(jié)構(gòu)中[Kaas， Q. , Ruiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ·-P.，T cell receptor and MHC structural data(T 細(xì)胞受體和 MHC 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù))，Nucl. Acids. Res.，32，D208-D210 (2004)]。存在三個(gè)重鏈⑶R和3個(gè)輕鏈⑶R。在此使用術(shù)語⑶R或⑶Rs為了根據(jù)情況來表示這些區(qū)域中的一個(gè)或這些區(qū)域中的幾個(gè)或甚至全部，其含有負(fù)責(zé)通過抗體對其識別的抗原或表位的親和性而結(jié)合的大部分氨基酸殘基。在本發(fā)明的意思中，兩個(gè)核酸或氨基酸序列之間的“同一性百分比”用來表示最佳比對(最優(yōu)比對)后獲得的待比較的兩個(gè)序列之間的核苷酸或相同的氨基酸殘基的百分比，該百分比純粹是統(tǒng)計(jì)學(xué)的并且兩個(gè)序列之間的差異是隨機(jī)分布的并在其整個(gè)長度中。傳統(tǒng)上，通過以最優(yōu)方式比對后比較這些序列來進(jìn)行兩個(gè)核酸或氨基酸序列之間的序列比較，所述比較能夠通過片段或通過“比較窗口 ”來進(jìn)行。除了人工地，可以通過 Smith 和 Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 :482]的局部同源性算法、通過 Neddleman 和 Wunsch(1970) [J. Mol. Biol. 48 :443]的局部同源性算法、通過 Pearson 和 Lipman(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444]的相似性研究方法、通過使用這些算法的計(jì)算機(jī)軟件(Wisconsin Genetics 軟件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI，或通過 BLAST N 或 BLAST P 比較軟件)來進(jìn)行用于比較的序列最優(yōu)比對。通過比較以最優(yōu)方式比對的這兩個(gè)序列來測定兩個(gè)核酸或氨基酸序列之間的同一性百分比，并且其中相對于這兩個(gè)序列之間的最優(yōu)比對的參照序列，待比較的核酸或氨基酸序列可以包含添加或刪除。通過測定兩個(gè)序列之間相同的核苷酸或氨基酸殘基的相同位置的數(shù)量，將該相同位置的數(shù)量除以比較窗口中位置的總數(shù)并將所獲得的結(jié)果乘以100， 來計(jì)算同一性百分比，以獲得這兩個(gè)序列之間的同一性百分比。例如，可以使用BLAST 程序，"BLAST 2 序列”(Tatusova 等，"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences，，(Blast 2 序列-用于比較蛋白和核苷酸序列的新工具)，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247-250)，可在站點(diǎn)http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/bl2. html獲得，所用的參數(shù)是默認(rèn)給出的那些(特別是對于參數(shù)“開放缺口懲罰” 5，和“延伸缺口懲罰” 2;所選的基質(zhì)是，例如，由程序提出的基質(zhì) "BL0SUM 62”)，通過程序直接計(jì)算待比較的兩個(gè)序列之間的同一性百分比。與參照氨基酸序列具有至少80 %，優(yōu)選85 %、90 %、95 %和98 %同一性的氨基酸序列，優(yōu)選對于參照序列具有特定修飾的那些，特別是至少一個(gè)氨基酸的刪除、添加或置換，平截或延伸。在一個(gè)或多個(gè)連續(xù)或非連續(xù)氨基酸置換的情況中，優(yōu)選其中置換的氨基酸由“等價(jià)”氨基酸替代的置換。表述“等價(jià)氨基酸”在此針對描述能夠用一個(gè)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的氨基酸置換的任何氨基酸，然而沒有實(shí)質(zhì)性地改變相應(yīng)抗體的生物活性，并且這將在此后限定，尤其是在實(shí)施例中?？梢酝ㄟ^依賴于與它們替代的氨基酸的結(jié)構(gòu)同源性或能夠進(jìn)行的不同抗體之間的生物活性的比較試驗(yàn)結(jié)果來確定這些等價(jià)氨基酸。例如，提及能夠進(jìn)行的置換的可能性，而沒有導(dǎo)致相應(yīng)修飾的抗體的生物活性的明顯改變。作為非限制性實(shí)例，以下的表2給出了能想到的置換可能性，保持了修飾抗體的生物活性。當(dāng)然，在相同的條件下，反過來的置換也是可能的。表權(quán)利要求
1.一種能夠抑制c-Met 二聚化的單克隆抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，所述抗體包含重鏈和輕鏈，重鏈包含分別具有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3的⑶R-H1、⑶R-H2和 ⑶R-H3，輕鏈包含分別具有氨基酸序列SEQ ID No. 5、6和7的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3， 所述抗體進(jìn)一步的特征在于包含鉸鏈區(qū)，其包含氨基酸序列SEQ ID No. 56。
2.如權(quán)利要求1的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于所述鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID No. 57。
3.如權(quán)利要求1的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于所述鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID No. 21。
4.如權(quán)利要求1的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于所述鉸鏈區(qū)包含選自SEQ ID No. 22至沘和SEQID No. 72至86的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求1的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其由嵌合抗體組成。
6.如權(quán)利要求1的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其由人抗體組成。
7.如權(quán)利要求1的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其由人源化抗體組成。
8.如權(quán)利要求7的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 8、9或10的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
9.如權(quán)利要求8的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 8的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的鉸鏈區(qū)。
10.如權(quán)利要求8的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 9的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的鉸鏈區(qū)。
11.如權(quán)利要求8的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 22的鉸鏈區(qū)。
12.如權(quán)利要求8的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 8的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的鉸鏈區(qū)。
13.如權(quán)利要求8的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 9的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的鉸鏈區(qū)。
14.如權(quán)利要求8的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 4的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；和含有氨基酸序列SEQ ID No. 28的鉸鏈區(qū)。
15.一種分離的核酸，其特征在于選自以下的核酸a)編碼權(quán)利要求1至14之一中所要求的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物的核酸、 DNA 或 RNA ；b)包括含有序列SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13 和序列 SEQ ID No. 15、 SEQ ID No. 16 和 SEQ ID No. 17 的 DNA 序列的核酸；c)包括含有序列SEQID No. 14和SEQ ID No. 18、19或20的DNA序列的核酸；d)b)或c)中限定的核酸的相應(yīng)RNA核酸；e)a)、b)和c)中限定的核酸的互補(bǔ)核酸；f)能夠在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與序列SEQID No. 11至13和15至17的⑶R中的至少一個(gè)雜交的至少18個(gè)核苷酸的核酸。
16.一種分離的核酸，其特征在于選自以下的核酸-編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體，或其功能性片段或衍生物之一的核酸、DNA或RNA，并且其中編碼所述抗體鉸鏈區(qū)的核酸序列包含或具有選自序列SEQ ID No.四至35和SEQ ID No. 73 至87的序列。
17.一種包含權(quán)利要求15或16中所要求的核酸的載體。
18.—種包含權(quán)利要求17中所要求的載體的宿主細(xì)胞。
19.一種除了人以外的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其包含至少一個(gè)通過權(quán)利要求17中所要求的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
20.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1至14之一中要求的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物的方法，其特征在于包括以下階段a)在培養(yǎng)基和合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)權(quán)利要求18中所要求的細(xì)胞；和b)收集由培養(yǎng)基或所述培養(yǎng)的細(xì)胞開始生產(chǎn)的所述抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物。
21.一種能夠通過權(quán)利要求20中所要求的方法獲得的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物。
22.權(quán)利要求1至14和21的抗體，作為藥物。
23.一種組合物，其包作為活性成分的含權(quán)利要求1至14、21或22之一中所要求的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物組成的化合物。
24.如權(quán)利要求23的組合物，其特征在于另外包含作為組合產(chǎn)品，用于同時(shí)、分開或按序使用的抗腫瘤抗體。
25.如權(quán)利要求23的組合物，其特征在于另外包含作為組合物產(chǎn)品，用于同時(shí)、分開或按序使用的細(xì)胞毒性/細(xì)胞抑制劑。
26.如權(quán)利要求23的組合物，其特征在于所述抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物中的至少一個(gè)與細(xì)胞毒素和/或放射性元素偶聯(lián)。
27.如權(quán)利要求25或沈的組合物，其特征在于所述細(xì)胞毒性/細(xì)胞抑制劑或所述毒素和/或放射性元素與用于同時(shí)使用的所述組合物的至少一種元素在化學(xué)上偶聯(lián)。
28.如權(quán)利要求23至27之一中所要求的組合物，作為藥物。
29.如權(quán)利要求1至14、21或22的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，或權(quán)利要求 23至觀的組合物在用于制備旨在抑制腫瘤細(xì)胞的生長和/或增殖的藥物中的應(yīng)用。
30.如權(quán)利要求1至14、21或22的抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，或權(quán)利要求23 至觀的組合物，或權(quán)利要求四的用途在用于制備旨在防止或治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
31.如權(quán)利要求30的用途，其特征在于所述癌癥是選自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宮內(nèi)膜癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或結(jié)腸癌的癌癥。
32.如權(quán)利要求30或31的用途，其特征在于所述的癌癥是HGF依賴性和無關(guān)性Met-激活相關(guān)的癌癥。
33.一種體外診斷由起源于懷疑其中異常存在c-Met受體的生物樣品的c-Met受體的超表達(dá)或低表達(dá)誘導(dǎo)的疾病的方法，其特征在于所述方法包括將所述生物樣品與權(quán)利要求 1至14，21或22的抗體接觸的步驟，如果需要，可以將所述抗體標(biāo)記。
全文摘要
能夠特異性結(jié)合人c-Met受體和/或能夠特異性抑制所述受體的酪氨酸激酶活性的抗體，所述抗體具有提高的拮抗活性，所述抗體包含修飾的鉸鏈區(qū)。包含這樣的c-Met的抗體拮抗劑的組合物及其作為用于治療癌癥的藥物的用途。
文檔編號A61P35/00GK102227446SQ200980148150
公開日2011年10月26日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者C·貝斯, L·格奇, T·沃琴 申請人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司