專利名稱：促進(jìn)血管完整性的微rna及其用途的制作方法
促進(jìn)血管完整性的微RNA及其用途
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求2008年8月11號(hào)提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/087，886的優(yōu)先權(quán)， 其全部公開內(nèi)容通過引用以整體并入本文。本發(fā)明在國(guó)立衛(wèi)生研究院經(jīng)費(fèi)號(hào)為HL53351-06的支持下進(jìn)行。政府對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán)利。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及心臟病學(xué)、病理學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及在內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞中通過miR-U6進(jìn)行的基因調(diào)控和細(xì)胞生理。此miRNA對(duì)保持血管完整性和促進(jìn)血管修復(fù)有重要的作用，因此可將其作為用于疾病治療的調(diào)節(jié)劑的靶標(biāo)。2.相關(guān)技術(shù)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)排列在血管結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面，并在血管發(fā)育、功能和疾病中具有關(guān)鍵性作用(Carmeliet，2003)。在稱為小血管發(fā)生(vasculogenesis)的血管形成過程中， EC增殖、遷移并聯(lián)合形成初始的血管網(wǎng)絡(luò)以作為募集平滑肌細(xì)胞的框架。通過血管發(fā)生 (angiogenesis)隨后進(jìn)行的血管出芽使血管系統(tǒng)進(jìn)一步擴(kuò)張并使組織血管化。許多生長(zhǎng)因子肽通過增強(qiáng)EC的遷移、增殖、存活和細(xì)胞間相互作用來促進(jìn)血管發(fā)生。在胚胎發(fā)生和成體期的新血管發(fā)生中需要VEGF和FGF，其為最強(qiáng)的血管發(fā)生生長(zhǎng)因子(Cross和Claesson-Welsh，2001)。這些因子與其細(xì)胞表面受體的結(jié)合激活MAP激酶通路，該通路促進(jìn)血管發(fā)生性生長(zhǎng)和成熟。與之相反，MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制降低血管發(fā)生(Eliceiri等，1998 ；Giroux等，1999 ；Hood等，2002)，并已將其開發(fā)為抗血管發(fā)生療法 (Hood 等.，2002 ；Panka 等，2006)。盡管有了這些進(jìn)展，但是對(duì)涉及血管發(fā)生以及血管完整性和修復(fù)的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍然十分不足。因此，對(duì)這些過程的更完整認(rèn)識(shí)將非常有助于鑒定可在體內(nèi)調(diào)節(jié)這些功能(例如在疾病治療中)的物質(zhì)。發(fā)明概述因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了促進(jìn)血管完整性和/或內(nèi)皮修復(fù)的方法，其包括向有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)或具有血管損傷的對(duì)象施用miR-U6功能的激動(dòng)劑。具有血管損傷的對(duì)象可能患有心臟組織中血管損傷，如缺血事件，包括包含下列之一的事件梗塞、缺血再灌注損傷或動(dòng)脈狹窄。血管損傷可以是非心臟組織，可包括外傷或血管滲漏?；蛘?，當(dāng)對(duì)象有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，該對(duì)象可能具有高血壓、心臟肥大、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)退變、纖維化或呼吸窘迫。所述方法還可包括向所述對(duì)象施用第二療法。所述對(duì)象可以是非人動(dòng)物或人。所述激動(dòng)劑可以是miR-U6或miR_U6模擬物。 所述激動(dòng)劑也可以是包含miR-U6編碼核酸區(qū)段的表達(dá)載體，所述區(qū)段處于在靶細(xì)胞(如心臟細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或造血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或心外膜細(xì)胞)中有活性的啟動(dòng)子控制之下。所述啟動(dòng)子可以是組織選擇性/特異性啟動(dòng)子，組織選擇性/特異性啟動(dòng)子是在心臟細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或心外膜細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子。 所述表達(dá)載體可以是病毒載體或非病毒載體。施用可包括全身性施用，如經(jīng)口、靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)途徑。施用也可通過滲透泵或?qū)Ч苓M(jìn)行?？梢灾苯拥鼗蚓植康厥┯玫窖軗p傷組織或有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)的組織，如心臟組織、 血管組織、骨組織、神經(jīng)組織、呼吸系統(tǒng)組織、眼組織或胎盤組織。激動(dòng)劑可以與患者、組織或部位接觸多于 1 次，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或 100次。激動(dòng)劑可以與所述組織接觸2、3、4、5或6天，1、2、3或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10 或 11 個(gè)月、或 1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25 年。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了抑制病理性血管化的方法，其包括使有病理性血管化風(fēng)險(xiǎn)或具有病理性血管化的對(duì)象與miR-U6拮抗劑接觸?；加胁±硇匝芑膶?duì)象可能患有動(dòng)脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病、癌癥或中風(fēng)。有病理性血管化風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象可能患有動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖、哮喘、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和/或失明。所述對(duì)象可以是非人動(dòng)物或人。所述拮抗劑可以是miR-126的拮抗性miRNA(antag0mir)。靶組織可以是血管系統(tǒng)、平滑肌、眼組織、造血組織、骨髓、肺組織或心臟外膜組織。所述方法還可包括向所述對(duì)象施用第二抗血管發(fā)生療法。施用包括全身性施用，如經(jīng)口、靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)途徑。也可直接地或局部地施用到病理性血管化或具有病理性血管化風(fēng)險(xiǎn)的組織，例如眼組織中、血管組織、骨組織、脂肪組織或肺組織。施用也可通過滲透泵或?qū)Ч苓M(jìn)行。拮抗劑可以與患者、組織或部位接觸多于 1 次，如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90 或 100 次。拮抗劑可以與所述組織接觸2、3、4、5或6天，1、2、3或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)月、或 1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或 25 年。當(dāng)在權(quán)利要求和/或說明書中，術(shù)語“包含”、“包括”未加數(shù)量限制時(shí)，可以指“一”， 但也可以與“一或更多”、“至少一”以及“一或多于一”的意義相同。應(yīng)理解，本文討論的任何實(shí)施方案可以參照任何本發(fā)明方法或組合物實(shí)施，反之亦然。此外，可以采用本發(fā)明的組合物或藥盒實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“約”用于表示某值，其包括用于確定該值的裝置或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)差。在權(quán)利要求中術(shù)語“或”的使用表示“和/或”，除非明確指明其僅表示可替代方案或者所述可替代方案是互斥的，但本公開內(nèi)容支持表示僅有的可替代方案和“和/或”的定義。在本說明書和權(quán)利要求中使用的詞語“包含”(以及其任何變形)、“具有”(以及其任何變形)、“包括”(以及其任何變形、“含有”(以及其任何變形)是包括性或開放性的， 不排除另外的未列舉的要素或方法步驟。從以下詳述中可以明確本發(fā)明的其他目的、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。然而應(yīng)理解，當(dāng)說明具體的本發(fā)明實(shí)施方案時(shí)，詳細(xì)描述和具體實(shí)施例僅通過示例的方式給出，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員能通過本詳述明確在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種變化和修改。


通過參照這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)并結(jié)合本文具體實(shí)施方案，可更好地理解本發(fā)明。
圖IA-B。miR-126的內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)和基因結(jié)構(gòu)。(圖1A)用RNA印跡
5(northern blot)所檢測(cè)到的不同組織和細(xì)胞系中miR-126的表達(dá)。U6或5s rRNA作為上樣對(duì)照。箭頭表示前體miR-126 (pre-miR-126)的位置，三角形表示成熟miR-126。SMC, 小鼠平滑肌細(xì)胞系；HUVEC，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EC)系；P19CL6，P19胚胎癌細(xì)胞的衍生物； C2C12，小鼠成肌細(xì)胞系；MSl，用SV40大T抗原轉(zhuǎn)化的小鼠原代胰島內(nèi)皮細(xì)胞；HAEC，人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；SVEC，SV40轉(zhuǎn)化的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系；Ε0ΜΑ，小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤衍生細(xì)胞系。(圖1B)(SEQ ID N0:1)小鼠Egfl7基因的結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生內(nèi)含子7所編碼的莖環(huán)形式的 miR-126 (miR-126-3p)和(miR-U6_5p)。顯示miR_U6 的進(jìn)化保守性(SEQ ID NO 2)。
圖2A-C。指導(dǎo)Egfl7/miR-126內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的順式調(diào)控序列。(圖2A) E12. 5 轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎，其帶有由Egfl7/miR-U6基因上游的5. 4kb 50側(cè)翼DNA控制的LacZ轉(zhuǎn)基因。顯示下列項(xiàng)的EC特異性IacZ表達(dá)(a)胚胎整體，以及(b)軟骨膜區(qū)域、(c)真皮、 (d)腦和(e)流出道的矢狀切面。比例尺=50mm。(圖2B)在E12. 5的轉(zhuǎn)基因小鼠中針對(duì) IacZ調(diào)節(jié)所測(cè)的Egfl7/miR-U6基因上游基因組區(qū)段的示意圖。顯示了顯示IacZ內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因胚胎的部分。下方顯示了 Egfl7/miR-126 50側(cè)翼區(qū)域的進(jìn)化保守性。用粉紅和淺藍(lán)突出顯示保守的ETS結(jié)合位點(diǎn)。(SEQ ID NO :3_8)。(圖2C)通過C0S-7 細(xì)胞中編碼Ksl或缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之Ksl突變體(Etsl mut)的表達(dá)質(zhì)粒數(shù)量的增加來檢測(cè)調(diào)控區(qū)域1 (區(qū)域I-Luc)的基因組片段的激活。將缺失突變引入到ETS結(jié)合位點(diǎn)中(區(qū)域1 (mut) -Luc) ο Etsl激活區(qū)域I-Luc但不激活區(qū)域1 (mut) -Luc，MEtsl mut不激活任一構(gòu)建體。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖3A-G。miR-126基因的靶向。(圖3A)通過同源重組生成miR_U6突變體小鼠的策略。用側(cè)翼為IoxP位點(diǎn)的新霉素抗性表達(dá)盒(Neo)替換含有miR-126的96bp Egfl7內(nèi)含子 序列。通過將雜合小鼠與CAG-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交來去除小鼠生殖細(xì)胞系中的Neo。 DTA,白喉毒素A。(圖3B)ES細(xì)胞基因組DNA的DNA印跡(southern blot)分析。用ka I 消化DNA。采用50探針或30探針，野生型和突變體(miR-126ne°等位基因)的大小分別為 11.4kb和13.4kb?；蛐驮谏戏斤@示。(圖3C)通過RT-PCR檢測(cè)，分析miR-126nWne?；蛐∈蟮男呐K(左)或肺(右)中的Egf 17轉(zhuǎn)錄本。在底部顯示Egf 17基因結(jié)構(gòu)和外顯子編號(hào)。RT-PCR所用的引物基于正向(F)或反向(R)的外顯子編號(hào)命名。在上方顯示基因型。用GAPDH作為對(duì)照。應(yīng)注意，如在以7F和8R、6F和9R、8F和10R為引物的RT-PCR 所顯示的，HiiR-I^wne。突變體中Egfl7的表達(dá)受到干擾，以及如使用所示引物的RT-PCR所示，相對(duì)于neo表達(dá)盒缺失的歸一化。(圖3D)通過WT和miR_126K0小鼠心臟提取物的蛋白質(zhì)印跡(western blot)對(duì)EGFL7和GAPDH蛋白質(zhì)的檢測(cè)。(圖3E)通過心臟和肺的RNA 印跡分析對(duì)miR-U6轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)。5S rRNA為上樣對(duì)照。(圖3F)miR_126v_互交子代的基因型。顯示了在標(biāo)示階段每種基因型小鼠的實(shí)際和預(yù)期數(shù)量。(圖3G)miR-126v_互交胚胎的基因型。顯示了每個(gè)年齡所分析的miR-126v-子代的數(shù)量。嚴(yán)重血管缺陷被定義為水腫、出血、嚴(yán)重生長(zhǎng)遲緩和死亡。少于的野生型或miR-126v_胚胎或新生小鼠顯示出血管異常。
圖4A-F。miR-126無效(Null)小鼠的血管異常。(圖4Α)Ε15· 5的野生型(WT)和 miR-126+(KO)胚胎。如箭頭所示，KO胚胎的亞組顯示出全身水腫和出血。(圖4B)E10. 5 的WT和miR-126K0胚胎顱區(qū)的側(cè)視圖。箭頭指示的表面腦血管在WT胚胎中很明顯，但在突變體中嚴(yán)重缺陷。在右邊顯示了方框指示的顱區(qū)中的血管數(shù)(η = 6)。(圖4C)P2的視網(wǎng)膜血管化，通過PECAM染色顯示。視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈的位置通過白色虛線界定，突變體中視網(wǎng)膜血管的末端用紅色箭頭指示。標(biāo)尺=200mm。在右邊顯示相對(duì)血管覆蓋(n =幻。(圖4D) 標(biāo)示基因型的Ε15. 5胚胎的真皮和肝及新生小鼠的肺的矢狀切面Η&Ε染色。上圖和中間圖的比例尺為200mm，下圖的比例尺為500mm。大括號(hào)指示KO胚胎組織空間中紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞對(duì)真皮的加厚。三角形指示與WT肝臟相比KO肝臟的紅細(xì)胞過剩。箭頭指向肺，其中在KO小鼠中肺泡無法擴(kuò)張。星號(hào)指示KO新生小鼠胸腔中的水腫。(圖4E)E15. 5的WT和 KO胚胎中毛細(xì)血管的電子顯微鏡照片。括號(hào)顯示KO胚胎中血管的損壞。綠箭頭指向WT內(nèi)皮細(xì)胞的緊密聯(lián)結(jié)，紅箭頭指向在KO胚胎血管外漂浮的紅細(xì)胞，而三角形指示KO胚胎血管內(nèi)皮層變薄。EC，內(nèi)皮細(xì)胞；rbc，紅細(xì)胞。(圖4F)E15. 5的KO胚胎中的內(nèi)皮細(xì)胞增殖。與 WT胚胎相比，在KO胚胎中觀察到的BrdU(紅色)和PECAMl (綠色)雙陽性細(xì)胞顯著減少。 紅箭頭指向PECAM/BrdU雙陽性細(xì)胞，而白箭頭指向PECAM單陽性細(xì)胞。用DAPI (藍(lán)色)對(duì)細(xì)胞核染色。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。在柱圖中顯示了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(P = 0.014)。
圖5A-E。miR_126K0內(nèi)皮細(xì)胞中警損的血管發(fā)牛。(圖5A)顯示了從4-6日齡野生型(WT)和miR-126+(K0)小鼠中分離的培養(yǎng)的主動(dòng)脈環(huán)的代表性圖像。在WT外植體中可見大量的內(nèi)皮生長(zhǎng)，但在突變體中沒有。對(duì)每種條件下的相對(duì)遷移活性進(jìn)行了定量，在統(tǒng)計(jì)柱圖中顯示。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(圖5B)顯示了所示基因型小鼠中植入的基質(zhì)膠栓 (matrigel plug)的PECAMl (綠色)染色的代表性圖像。與WT小鼠相比，在KO小鼠中有 FGF-2的基質(zhì)膠中觀察到的血管發(fā)生顯著減少。在WT和KO小鼠無FGF-2的基質(zhì)膠栓中沒有觀察到顯著的血管發(fā)生。比例尺=60mm。(圖5C)通過用Image J軟件確定PECAM染色面積來定量基質(zhì)膠栓測(cè)定中血管發(fā)生的程度。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。KO與WT基質(zhì)膠塞相 Kp = O. 0008。(圖5D)在MI后WT和KO小鼠的存活。MI后1周和3周KO小鼠的存活率與WT相比，ρ值為0. 05和0. 014。(圖5E)MI后WT和KO小鼠心臟的組織學(xué)分析。圖a_d 顯示了穿過右心室(RV)和左心室(LV)的縱切片。注意突變體心臟心房處的血栓塊，表示心力衰竭。圖e-f顯示用Masson三色法染色的橫切面，以顯示瘢痕形成。注意KO小鼠中心肌的大量缺失。圖g和h顯示了 e和f中加框顯示梗死區(qū)的PECAMl染色。注意MI后KO 小鼠的血管系統(tǒng)缺陷。圖a-f中的比例尺等于1cm，圖g和h中的比例尺等于40mm。
圖6A-I。miR_U6對(duì)血管發(fā)生生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。(圖6A)miR_U6增強(qiáng)了 FGF依賴性ERK1/2磷酸化。用表達(dá)LacZ或miR-126的腺病毒感染HUVEC細(xì)胞，并用 FGF-2 (lOng/ml)處理標(biāo)示的時(shí)間。用所示的抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡以確定磷酸化的和總的ERKl/^2水平。Ad-miR-U6增強(qiáng)了 FGF-2依賴性ERKl/^2磷酸化。(圖6B)miR_U6 的敲除減少了 VEGF依賴性ERK1/2磷酸化。用2，-O-甲基-miR_U6反義寡核苷酸或?qū)φ展押塑账徂D(zhuǎn)染HAEC細(xì)胞，并用VEGF(lOng/ml)處理10分鐘。用所示的抗體對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡以確定磷酸化的和總的ERK1/2水平。用GAPDH為上樣對(duì)照。(圖6C) miR-126 與不同物種中Spred-I 30非翻譯區(qū)(UTR) (SEQ ID NOS :9_14)的序列比對(duì)。(圖6D)通過 E15. 5WT和miR-U6K0胚胎的卵黃囊提取物的蛋白質(zhì)印跡對(duì)Spred-1、CRK和GAPDH的檢測(cè)。 (圖 6E)miR-U6 靶向 Spred-I 30UTR。將 Spred-ImRNA 的 3，UTR，以及在與miR_U6種子區(qū)域 (seed region) (GGTACGA至TTGGAAG)互補(bǔ)的區(qū)域中經(jīng)改造具有突變的Spred m3，UTR，插入到pMIR-REPORT載體(Ambion)。miR_U6突變體(miR_U6m)構(gòu)建物由下列項(xiàng)組成突變?yōu)镚CATGG 的 miR-U6-3p 序列 CGTACC，以及突變?yōu)?CCATGC 的 miR-U6_5p 序列 GGTACG。用標(biāo)示的質(zhì)粒組合進(jìn)行C0S-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。用CMV-bGAL作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)對(duì)照。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯示了 P值；ns，不顯著。(圖6F)miR-126過表達(dá)或敲除后的相對(duì)Spred-ImRNA表達(dá)水平。將HUVEC或HAEC細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)示的處理，通過實(shí)時(shí)PCR確定Spred-ImRNA的水平。GAPDH 為對(duì)照。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯示了 P值。(圖6G)miR-126+內(nèi)皮細(xì)胞中Spred-ImRNA 的上調(diào)。用實(shí)時(shí)PCR以L7作為對(duì)照確定了 Spred-ImRNA的水平。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。KO 與WT相比，ρ = 0.01。(圖6H)顯示了從5和6日齡的野生型(WT)和miR_U6K0小鼠中分離的培養(yǎng)的主動(dòng)脈環(huán)的代表性圖像。在WT外植體中Spred-I的腺病毒過表達(dá)損害了內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，而miR-126K0小鼠外植體中siRNA介導(dǎo)的Spred-I敲低(knockdown)增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。如在統(tǒng)計(jì)柱圖中所示，對(duì)每種條件下的相對(duì)遷移活性進(jìn)行定量。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(圖61) HUVEC細(xì)胞對(duì)VEGF應(yīng)答的劃痕測(cè)定(scratch-wound assay)。用反義RNA敲低miR-U6的表達(dá)削弱了 EC的遷移，而在miR_U6反義RNA的存在下，用siRNA 敲低Spred-I恢復(fù)了遷移。用紅色虛線指示了劃痕的邊緣。定量了遷移的細(xì)胞，如在統(tǒng)計(jì)柱圖中所示。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖7。miR-126在血管發(fā)牛中功能的樽型。VEGF和FGF與其在EC上受體的結(jié)合激活了 MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，所述通路到達(dá)細(xì)胞核激活參與血管發(fā)生的基因的轉(zhuǎn)錄。miR-126 抑制Spred-I的表達(dá)，Spred-I是Ras/MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控子。因此，miR_U6功能的喪失減弱了應(yīng)答于VEGF和FGF的MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而miR_U6功能的獲得增強(qiáng)了血管發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖8。Pri-miR-126及其宿主基因Etf 17的內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)。用內(nèi)含子7作為 pri-miR-126的探針，用Egfl7cDNA片段作為Egfl7的探針。標(biāo)記表示E8. 5、E10. 5和E14. 5 的節(jié)間血管(黑色三角形)、背主動(dòng)脈(黑色箭頭)、心內(nèi)膜(白色三角形)和肝(白色箭頭) 中pri-miR-126和Egf 17的內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)。黑色標(biāo)尺=200 μ m，白色標(biāo)尺=1600 μ m。
具體實(shí)施例方式近期的研究顯示，微RNA在心血管系統(tǒng)對(duì)損傷和脅迫的應(yīng)答中起重要作用 (Latronico 等，2007 ；van Rooij 和 Olson, 2007)。miRNA 表示一類 22 個(gè)核苷酸的非編碼 RNA，其通過靶向mRNA以實(shí)現(xiàn)切割或翻譯抑制來調(diào)控基因表達(dá)(Bartel，2004)。在人和其他真核物種中已鑒定到多于500種miRNA，其中約三分之一由蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子所編碼。miRNA首先轉(zhuǎn)錄為大pri-miRNA，其通過連續(xù)的步驟被加工產(chǎn)生雜合雙鏈RNA。雜合雙鏈的 miRNA 鏈并入 RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex (RISC))中，在其中它能夠通過在3’非翻譯區(qū)的互補(bǔ)序列靶向特異性mRNA (He和Harmon，2004)。雜合雙鏈中的相對(duì)鏈(稱為星(*)鏈)通常被降解。
現(xiàn)在，發(fā)明人證明內(nèi)皮細(xì)胞特異性miRNA——miR-126——在體內(nèi)調(diào)控血管發(fā)生。 在突變小鼠亞組中，小鼠中miR-126的靶向缺失導(dǎo)致血管滲漏、出血和胚胎死亡。這些血管異?？梢詺w因于血管發(fā)生生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的降低，從而導(dǎo)致EC生長(zhǎng)、出芽和粘附的減少。存活的突變體動(dòng)物亞組易于在具有梗死的缺陷性血管化的心肌梗死后發(fā)生心臟破裂以及死亡。miR-126的促血管發(fā)生作用與其對(duì)Spred-I (MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)物)的抑制相關(guān)。因此，在不存在miR-126時(shí)，Spred-I的表達(dá)提高，減少了 VEGF和FGF的細(xì)胞內(nèi)血管發(fā)生信號(hào)的傳遞。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人認(rèn)為miR-126的作用是血管發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)物。在疾病期間，內(nèi)皮在心血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)和重構(gòu)(remodeling)中起到多種多樣的作用，包括控制血管伸縮性和滲透性、平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、白細(xì)胞粘附、凝結(jié)和血栓形成。 已經(jīng)提出miRNA在體外調(diào)控EC基因的表達(dá)和功能(KuetAacher等，2007 ；Suarez等，2007)， 但是還沒有針對(duì)在體內(nèi)miRNA在EC生物學(xué)中功能的研究。在血管完整性和血管發(fā)生以及 MI后存活中需要miR-U6的發(fā)現(xiàn)提示，在缺血的心肌中提高miR-U6可以增強(qiáng)心臟的修復(fù)。 相反地，減少miR-126的表達(dá)可能在調(diào)節(jié)病理性血管化中有效，所述病理性血管化如癌癥、 動(dòng)脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病和中風(fēng)。最近，已有報(bào)道稱miR-U6抑制腫瘤發(fā)生，以及在轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤中下調(diào)，盡管沒有確定其下調(diào)的具體細(xì)胞類型和可能介導(dǎo)這些作用的miR-U6靶標(biāo)(Tavazoie等，2008)。本發(fā)明人認(rèn)為，將會(huì)發(fā)現(xiàn)miR_U6和其他miRNA在組織重構(gòu)和疾病中起重要作用。下面更詳細(xì)地討論本發(fā)明的這些和其他方面。
I. miRNA A.背景 2001年，多個(gè)小組采用新的克隆方法在秀麗隱桿線蟲(C. elegans)、果蠅 (Drosophila)和人中分離和鑒定了一大類“微 RNA”(miRNA) (Lagos-Quintana 等，2001 ；Lau 等，2001 ；Lee和Ambros，2001)。已經(jīng)在似乎不具有內(nèi)源性siRNA的植物和動(dòng)物(包括人) 中鑒定出幾百種miRNA。因此，盡管與siRNA類似，但是miRNA仍然是不同的。
目前為止觀察到的miRNA的長(zhǎng)度約為21_22個(gè)核苷酸，它們來自于更長(zhǎng)的前體，所述前體轉(zhuǎn)錄自非蛋白質(zhì)編碼基因。參見Carrington等的綜述^00 。所述前體形成在自互補(bǔ)區(qū)域彼此折回的結(jié)構(gòu)；而后它們被核酸酶所加工，在動(dòng)物中是Dicer，在植物中是DCL1。 miRNA分子通過與其靶標(biāo)的精確或非精確堿基配對(duì)來干擾翻譯。
miRNA由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，可來自于個(gè)體miRNA基因、蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子或者經(jīng)常編碼多個(gè)緊密相關(guān)的miRNA的多順反子轉(zhuǎn)錄本。在細(xì)胞核中由RNase Drosha 將通常幾百個(gè)堿基長(zhǎng)度的前體miRNA加工成70-100nt的發(fā)夾狀前體。在轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后， 所述發(fā)夾被Dicer進(jìn)一步加工生成雙鏈miRNA。而后成熟的miRNA鏈整合入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)，在其中miRNA通過堿基互補(bǔ)與其靶標(biāo)mRNA結(jié)合。相對(duì)較少的情況是，miRNA 堿基對(duì)與mRNA靶標(biāo)完全配對(duì)，則其促進(jìn)mRNA的降解。更常見的是，miRNA與靶標(biāo)mRNA形成不完全配對(duì)的雜合雙鏈，這影響mRNA的穩(wěn)定性或抑制mRNA的翻譯。
miRNA的5’部分跨越2-8個(gè)堿基，稱為“種子(seed) ”區(qū)，其對(duì)靶標(biāo)識(shí)別尤其重要 (Krenz和Robbins，2004 ；Kiriazis和Krania，2000)。種子的序列以及靶標(biāo)序列的進(jìn)化保守性形成了目前多個(gè)靶標(biāo)預(yù)測(cè)模型的基礎(chǔ)。盡管有越來越多可用的預(yù)測(cè)miRNA及其靶標(biāo)的復(fù)雜計(jì)算方法，但是靶標(biāo)的預(yù)測(cè)仍是重大的挑戰(zhàn)并需要實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。由于單個(gè)miRNA具有與數(shù)百種潛在的高親和性和低親和性mRNA靶標(biāo)堿基配對(duì)的能力，以及多個(gè)miRNA靶向單個(gè) mRNA,因此使得將miRNA的功能歸于調(diào)控特異性mRNA靶標(biāo)更為復(fù)雜。
第一個(gè)miRNA被鑒定為秀麗隱桿線蟲中發(fā)育時(shí)序的調(diào)控子，這表明，一般來講， miRNA可能通過關(guān)閉特異性靶標(biāo)而在不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)換中起決定性調(diào)控作用(!^atkin 等，2000 ；Lowes等，1997)。然而，隨后的研究提出，除了用作打開-關(guān)閉的“開關(guān)”之外，
9miRNA更常見的功能是通過抑制對(duì)特定細(xì)胞類型來說不適宜的蛋白質(zhì)的表達(dá)，或通過調(diào)整蛋白質(zhì)的量，來調(diào)節(jié)或微調(diào)細(xì)胞表型。還提出miRNA通過避免基因表達(dá)的劇烈波動(dòng)來為細(xì)胞表型提供健壯性(robustness)。
隨著科學(xué)家開始理解這些分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中所起的廣泛作用，針對(duì)微 RNA的研究正在增加。兩個(gè)研究最透徹的miRNA(lin-4和let_7)通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵mRNA家族的翻譯來調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲的發(fā)育時(shí)序(在I^Squinelli，2002中綜述)。已經(jīng)在秀麗隱桿線蟲、果蠅和人中鑒定出幾百種miRNA。如對(duì)于調(diào)控基因表達(dá)的分子可以預(yù)計(jì)的，已經(jīng)顯示在組織和發(fā)育階段之間miRNA的水平有不同。此外，一項(xiàng)研究顯示兩種miRNA的表達(dá)下降與慢性淋巴細(xì)胞性白血病緊密相關(guān)，這為miRNA和癌癥提供了可能的聯(lián)系(Calin，2002)。 盡管該領(lǐng)域還很年輕，仍然認(rèn)為在高等真核生物中miRNA在調(diào)控基因表達(dá)上與轉(zhuǎn)錄因子同樣重要。
對(duì)于miRNA在細(xì)胞分化、早期發(fā)育以及如凋亡和脂肪代謝的細(xì)胞過程中起重要作用有幾個(gè)實(shí)例。在秀麗隱桿線蟲發(fā)育中，lin-4和let-7均調(diào)控從一個(gè)幼蟲狀態(tài)到另一個(gè)的轉(zhuǎn)化過程(Ambros，2003)。Mir-14和bantam是果蠅中調(diào)控細(xì)胞死亡的miRNA，其調(diào)控顯然是通過調(diào)控參與凋亡的基因表達(dá)(Brennecke等，2003，Xu等，2003)。已經(jīng)提出miR-14參與脂肪代謝(Xu等，200 。Lsy-6和miR-273是秀麗隱桿線蟲中調(diào)節(jié)感化性神經(jīng)元不對(duì)稱性的miRNA (Chang等，2004)。另一種調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的動(dòng)物miRNA是miR-181，其指導(dǎo)造血細(xì)胞分化(Chen等，2004)。這些分子代表了已知功能的動(dòng)物miRNA的全部范圍。毋庸置疑， 對(duì)miRNA功能的進(jìn)一步理解將揭示作用于正常發(fā)育、分化、細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞、細(xì)胞周期、血管發(fā)生、凋亡以及許多其它細(xì)胞過程的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?？紤]到它們?cè)诒姸嗌锕δ苤械闹匾饔?，miRNA有可能為治療干預(yù)或診斷分析提供重要意義。
表征諸如miRNA的生物分子的功能通常涉及將該分子引入細(xì)胞或?qū)⒎肿訌募?xì)胞中去除并測(cè)定結(jié)果。如果將miRNA引入細(xì)胞后導(dǎo)致凋亡，則該miRNA毫無疑問地參與了凋亡通路。已經(jīng)描述了在細(xì)胞中引入或去除miRNA的方法。兩個(gè)近期的出版物描述了可以用于抑制特定miRNA活性的反義分子(Meister等，2004 ；Hutvagner等，2004)，其他人已經(jīng)在心臟中證明了它們的功能性，在心臟中它們有效地敲低miR-133和miR-1 (Care等2007 ；Yang 等2007)。其它出版物描述了由內(nèi)源RNA聚合酶所轉(zhuǎn)錄并在轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后產(chǎn)生特定miRNA 的質(zhì)粒的用途Geng等，2002)。這兩套試劑已經(jīng)用于單個(gè)miRNA的評(píng)估。
B. miR-126 根據(jù)近期將miRNA與心血管發(fā)育和疾病聯(lián)系起來的研究，本發(fā)明人檢索了公共數(shù)據(jù)庫以尋找顯示為限制于心血管組織的miRNA。在幾個(gè)此類miRNA中，miR-U6在具有高血管組分的組織(如心臟和肺)中顯示出富集(Lagos-Quintana等，2002)。對(duì)斑馬魚miRNA 表達(dá)譜的研究也顯示miR-U6對(duì)血管系統(tǒng)特異(Wienholds等，2005)。
RNA印跡分析顯示miR_U6在大范圍的組織中表達(dá)，在肺和心臟中表達(dá)最多，這與之前的研究一致(Harris 等，2008 ；Lagos-Quintana 等，2002 ；Musiyenko 等，2008)。 miR-126*只檢測(cè)到痕量水平的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)細(xì)胞系的調(diào)查顯示miR-U6在原代人臍靜脈EC (HUVEC)和多種EC細(xì)胞系中表達(dá)，包括MS1、HAEC和EOMA細(xì)胞系，但不在SV40 轉(zhuǎn)化EC(SVEC)或非內(nèi)皮細(xì)胞類型中表達(dá)。
從河豚到人(Homosapiens)中，miR_U6 (也稱為 miR-U6_3p)和
10miR-126* (miR-126-5p)是保守的(microrna. sanger. ac. uk/sequences/index, shtml)。在哺乳動(dòng)物和鳥類中，由EGF樣結(jié)構(gòu)域7 (Egf 17)基因的內(nèi)含子7編碼miR-126和miR-126*, 所述Egf 17基因編碼EC特異性分泌肽，已有報(bào)道稱所述分泌肽是平滑肌細(xì)胞遷移的化學(xué)吸引劑和抑制劑(Campagnolo 等，2005 ；Fitch 等，2004 ；Parker 等，2004 ；Soncin 等，2003)。 miR-126在組織和細(xì)胞系中的表達(dá)譜與Egf 17的平行(Fitch等，2004 ；Soncin等，2003)，這與該miRNA加工自前體Egfl7mRNA的內(nèi)含子RNA序列的結(jié)論相符。
已經(jīng)鑒定了來自于多種不同生物體(小鼠、人、大鼠、狗、雞、斑馬魚、河豚)的 miR-126，它們的序列完全保守 UCGUACC⑶GAGUAAUAAUGCG (SEQ ID NO 1) C. miR-126的激動(dòng)劑和拮抗劑 miR-U6的激動(dòng)劑通常采用三種形式的一種。第一種是miR-126自身。這種分子可以通過如注射或輸注的方式遞送到靶細(xì)胞，任選地在如脂質(zhì)(如脂質(zhì)體或脂質(zhì)乳劑)的遞送載體中。第二種，可以采用驅(qū)動(dòng)miR-U6表達(dá)的表達(dá)載體。多種表達(dá)載體的組成和結(jié)構(gòu)將在本文的其他部分描述。第三種，可以采用區(qū)別于miR-126的起上調(diào)、穩(wěn)定或增強(qiáng)miR-126 活性功能的試劑，包括小分子。這些分子包括“模擬物”，模擬物是模擬miR-U6的功能以及有可能模擬其形式的分子，但是在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與其不同。
可以通過“拮抗miRNA(antagomir) ”實(shí)現(xiàn)miRNA功能的拮抗。由Kriitzfeldt及同事首先描述(Kriltzfeldt等.，2005)，拮抗miRNA是單鏈經(jīng)化學(xué)修飾的核糖核苷酸，其與 miRNA序列至少部分互補(bǔ)。拮抗miRNA可以包含一個(gè)或更多經(jīng)修飾的核苷酸，如2’ -0-甲基-糖修飾。在一些實(shí)施方案中，拮抗miRNA只包含經(jīng)修飾的核苷酸。拮抗miRNA還可以包含一個(gè)或更多硫代磷酸酯連接以得到部分或全部的硫代磷酸酯骨架。為了便于體內(nèi)遞送和穩(wěn)定，可以在其3’端將拮抗miRNA與膽固醇部分連接。適于抑制miRNA的拮抗miRNA長(zhǎng)度可以是約15至約50個(gè)核苷酸，長(zhǎng)度更優(yōu)選約18至約30個(gè)核苷酸，長(zhǎng)度最優(yōu)選約20至約25個(gè)核苷酸?！安糠只パa(bǔ)”是指序列與目的多核苷酸序列至少約75% ΑΟ^Αδ^ΑΟ^、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %互補(bǔ)。拮抗miRNA與成熟miRNA序列可以至少約75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，拮抗miRNA可以與成熟miRNA序列基本互補(bǔ)，即與靶標(biāo)多核苷酸序列至少約95 %、96 %、97 %、98 %或99 %互補(bǔ)。 在另一些實(shí)施方案中，拮抗miRNA與成熟miRNA序列100%互補(bǔ)。
還可以通過施用反義寡核苷酸對(duì)miRNA的功能進(jìn)行抑制。所述反義寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。優(yōu)選地，所述反義寡核苷酸具有至少一個(gè)化學(xué)修飾。反義寡核苷酸可以包括一個(gè)或更多“鎖核酸(locked nucleic acid) ”?！版i核酸”(LNA)是經(jīng)修飾的核糖核苷酸，其在核糖部分的2’和4’碳之間含有額外的連接，導(dǎo)致“鎖(locked) ”構(gòu)型， 其使含有LNA的寡核苷酸的熱穩(wěn)定性提高?；蛘撸戳x寡核苷酸可以包含肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)，其包含基于肽的骨架而不是糖-磷酸骨架。反義寡核苷酸可以包含的其他化學(xué)修飾包括但不限于糖修飾，如2’ -0-烷基(如2’ -0-甲基、2’ -0-甲氧乙基)、 2’ -氟代，和4’硫代修飾；以及骨架修飾，如一個(gè)或更多硫代磷酸酯、嗎啉代或膦酰羧酸酯鍵(參見，例如，美國(guó)專利6，693，187和7，067，641，其通過全文引用并入本文)。在一些實(shí)施方案中，適合的反義寡核苷酸是2’ -0-甲氧乙基“間隔體(gapmer) ”，其在5’和3’端均含有2’ -0-甲氧乙基修飾的核糖核苷酸，并且中間至少有十個(gè)脫氧核糖核苷酸。這些“間隔體”能夠引發(fā)RNA靶標(biāo)的RNase H依賴性降解機(jī)制。其他增強(qiáng)穩(wěn)定性并提高有效性的反義寡核苷酸修飾(如在美國(guó)專利6，838，觀3中描述的，其通過全文引用并入本文)為本領(lǐng)域已知并適合用于本發(fā)明的方法中。用于抑制microRNA活性的特定反義寡核苷酸的長(zhǎng)度為約19至約25個(gè)核苷酸。反義寡核苷酸可以包含與成熟miRNA序列至少部分互補(bǔ)的序列，例如，與成熟 miRNA 序列至少約 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸可以與成熟miRNA序列基本互補(bǔ)，即與靶標(biāo)多核苷酸序列至少約95%、96(%、97(%、98(%或99(%互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包含與成熟miRNA序列100%互補(bǔ)的序列。
另一種抑制miR_U6功能的方法是施用抑制性RNA分子，其與成熟miR_U6序列具有至少部分序列同一性。該抑制性RNA分子可以是雙鏈、小干擾RNA(siRNA)或包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA分子(shRNA)。抑制性RNA分子的雙鏈區(qū)可以包含與成熟miRNA序列具有至少部分同一性的序列，如約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。在一些實(shí)施方案中，抑制性RNA的雙鏈區(qū)包含與成熟miRNA序列至少具有顯著同一性。 “顯著同一性”是指與目的多核苷酸序列具有至少約95196197198%或99%同一性的序列。在其他一些實(shí)施方案中，抑制性RNA分子的雙鏈區(qū)可與靶標(biāo)miRNA序列具有100%的同一性。
在本發(fā)明的其他一些實(shí)施方案中，miR-126的抑制劑可以是抑制性RNA分子，如核酶、siRNA或shRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-499的抑制劑是含有雙鏈區(qū)的抑制性RNA分子，其中雙鏈區(qū)所含的序列與成熟miR-U6序列具有100%的同一性。在一些實(shí)施方案中， 抑制劑是含有雙鏈區(qū)的抑制性RNA分子，其中所述雙鏈區(qū)包含與成熟miR-U6序列具有約 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的序列。
II.血管發(fā)生，miR-126 和 Sprechl 以下報(bào)告的研究結(jié)果顯示miR_U6在體內(nèi)血管發(fā)生和血管完整性的保持上具有重要作用。miR-126的作用似乎反映(至少部分地)在其對(duì)用作血管發(fā)生強(qiáng)力誘導(dǎo)劑的 VEGF和FGF下游的MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)(圖7)。作為Ras/MAP激酶通路細(xì)胞內(nèi)抑制劑的Spred-I用作miR-126的抑制靶標(biāo)。因此，無miR-126存在時(shí)，Spred-I表達(dá)提高，導(dǎo)致血管發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。相反，miR-126的過表達(dá)緩解了 Spred-I對(duì)VEGF和FGF激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制作用，利于血管發(fā)生。
與這些發(fā)現(xiàn)一致，EC中Spred-I的過表達(dá)削弱了血管發(fā)生和細(xì)胞遷移，與miR-126 功能喪失表型類似，而在培養(yǎng)的EC中，敲低Spred-I的表達(dá)增強(qiáng)了血管發(fā)生并挽救miR-126 功能喪失表型。有意思的是，只有miR-126+胚胎的亞組死于因血管破裂的胚胎死亡，而其他存活到成年，這表明該miRNA調(diào)控基因表達(dá)程序，而不是作為血管發(fā)生的“打開-關(guān)閉”開關(guān)。
除了在胚胎發(fā)生時(shí)的正常血管發(fā)育中必需之外，在MI后，當(dāng)在梗塞部位的損傷血管引發(fā)新血管發(fā)生以恢復(fù)流向受損心肌壁的血流時(shí)，miR-U6的功能似乎很重要。在脅迫條件下，如MI后的心臟，由于需要新血管發(fā)生(neoangiogenesis)的血管發(fā)生信號(hào)，miR-126 的作用可能更加重要。關(guān)于這點(diǎn)，應(yīng)答于心肌的局部缺血，VEGF和FGF的表達(dá)升高，這對(duì)局部缺血的心肌中側(cè)支血管的發(fā)育很關(guān)鍵(Semenza，2003)。心臟損傷除了激活臨近EC的遷移和增殖外，也導(dǎo)致循環(huán)的造血祖細(xì)胞歸巢到局部缺血部位并幫助心臟修復(fù)(Kocher等，2001 ；Takahashi等，1999)。miR_U6在造血干細(xì)胞中表達(dá)，并因此可能在該細(xì)胞類群的再生功能中起作用(Garzon 等，2006 ；Landgraf 等，2007)。
A. miR-126對(duì)血管發(fā)生的控制 例如VEGF和FGF的血管發(fā)生生長(zhǎng)因子通過激活MAP激酶通路來調(diào)節(jié)EC的增殖、 遷移和粘附，MAP激酶通路終止于細(xì)胞核以提高血管發(fā)生和血管完整性所需基因的表達(dá)。 與miR-U6功能喪失相關(guān)的異常與在EC中抑制MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而導(dǎo)致的血管缺陷類似 (Hayashi 等，2004)。
與miR-U6通過阻礙Spred-I的表達(dá)而促進(jìn)血管發(fā)生的結(jié)論一致，Spred-I抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和Mio介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白再組織(Miyoshi等，2004)，這兩者是對(duì)血管發(fā)生很重要的過程。Spred-I和其他Spred家族成員作為生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)之ERK激活的膜結(jié)合抑制子起作用，并阻斷應(yīng)答于生長(zhǎng)因子信號(hào)的細(xì)胞增殖和遷移(Wakioka等，2001)。Spred蛋白質(zhì)的抑制性作用通過干擾Raf的磷酸化和激活介導(dǎo)，Raf是MAP激酶通路的上游激活子。在三種 Spred蛋白質(zhì)中，只有Spred-I包含miR-126的預(yù)測(cè)靶序列。盡管這些結(jié)果與Spred-I作為miR-U6促血管發(fā)生作用的中介物發(fā)揮重要作用的結(jié)論一致，但miR-126的作用有可能反映為多個(gè)調(diào)節(jié)血管發(fā)生和血管完整性的靶蛋白的聯(lián)合作用。
因此，本發(fā)明提供了在有此需要的對(duì)象中促進(jìn)血管發(fā)生的方法，其包括向所述對(duì)象施用至少一種miR-126的激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括施用第二促血管發(fā)生劑。所述第二促血管發(fā)生劑可包括但不限于VEGF、FGF、IL-8、CCNl和Ang_2。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在細(xì)胞中調(diào)控MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其包括將細(xì)胞與至少一種miR-U6活性調(diào)節(jié)劑相接觸。在一些實(shí)施方案中，在與miR-U6拮抗劑接觸的細(xì)胞中MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低。在另一些實(shí)施方案中，在與miR-U6激動(dòng)劑接觸的細(xì)胞中MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
B. miR-126的生物發(fā)生 根據(jù)miR-U6和Egfl7mRNA的共表達(dá)，以及本發(fā)明人對(duì)miR_U6產(chǎn)生自Egfl7前體mRNA亞群中保留內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)(未發(fā)表數(shù)據(jù))，本發(fā)明人得出了 miR-U6來自Egf 17前體mRNA的結(jié)論。盡管具有獨(dú)立于其宿主基因轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子miRNA，但是至今為止發(fā)現(xiàn)的所有這些miRNA均轉(zhuǎn)錄自mRNA的相對(duì)鏈，這與miR_U6和Egfl7mRNA相反。此外，內(nèi)皮特異性表達(dá)需要Ets結(jié)合位點(diǎn)，但在Egfl7基因的內(nèi)含子7中沒有這類位點(diǎn)。
最近，已有報(bào)道稱Egf 17敲除小鼠顯示出與miR-126無效小鼠極其類似的血管異常(khmidt等，2007)。已有報(bào)道稱這些小鼠中的缺失突變導(dǎo)致Egfl7轉(zhuǎn)錄本的缺乏，這提示miR-126的表達(dá)也被阻止。然而，沒有檢測(cè)miR-126的表達(dá)。因此，這些突變體小鼠的表型真實(shí)地反映miR-U6功能喪失的可能性有待考察。
日益明顯的是，miRNA整合進(jìn)蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子代表了 miRNA的表達(dá)和調(diào)節(jié)性功能與蛋白質(zhì)表達(dá)基因相互協(xié)調(diào)的普遍機(jī)制。作為這類共調(diào)節(jié)的另一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明人之前提出，由α-肌球蛋白重鏈(MHC)基因的內(nèi)含子編碼的miR-208在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中用于控制心臟脅迫應(yīng)答(van Rooij等，2007)。miRNA并入組織特異性基因的內(nèi)含子為確保 miRNA與其所調(diào)控的基因程序的共調(diào)節(jié)提供了有效機(jī)制。
III.治療疾病狀態(tài)的方法 本發(fā)明提供了通過向?qū)ο笫┯胢iR_U6激動(dòng)劑或拮抗劑來治療多種疾病狀態(tài)的方法。出于本申請(qǐng)的目的，治療包括減少與以下討論的疾病狀態(tài)相關(guān)的一個(gè)或更多癥狀。任何水平的改善都視為治療，并且對(duì)改善的具體水平或“治愈”沒有要求。如果癥狀穩(wěn)定，即疾病狀態(tài)沒有惡化，對(duì)于治療也是足夠的。
本發(fā)明提供了促進(jìn)血管完整性和/或血管修復(fù)的方法，其包括向患有血管病癥的對(duì)象施用miR-U6功能的激動(dòng)劑。所述血管病癥可以包括但不限于心肌梗死、缺血再灌注損傷、狹窄、纖維化、血管外傷以及血管滲漏。
A.損害血管完整性和/或?qū)е滦枰苄迯?fù)的病癥 如以上所討論的，本發(fā)明提供了 miR_U6激動(dòng)劑用于改善血管組織完整性以及在損傷(包括缺血損傷)后促進(jìn)血管修復(fù)和新血管形成(neovascularization)的用途。尤其考慮用本發(fā)明治療以下疾病狀態(tài)/病癥，但這些不是限制性的。
治療方案會(huì)根據(jù)臨床情況而變化。然而，在大部分情況下，似乎適合長(zhǎng)期維持治療。也可能需要用miR-U6的調(diào)節(jié)劑間歇地治療血管病癥，如在疾病發(fā)展的短暫窗口期內(nèi)。
心肌梗死。在供向部分心臟的血液供給受阻時(shí)發(fā)生心肌梗死(Myocardial infarcti0n，MI)。這通常是由于易損的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂后的冠狀動(dòng)脈閉塞(阻塞)， 所述動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是動(dòng)脈壁上脂類(如膽固醇)和白細(xì)胞(尤其是巨噬細(xì)胞)的不穩(wěn)定集合體。如果在足夠長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)沒有治療，所導(dǎo)致的缺血(血液供應(yīng)受限)和氧氣缺乏可造成心臟肌肉組織(心肌)的損傷和/或死亡(梗死)。
急性心肌梗死(AMI)的典型癥狀包括突發(fā)胸痛(通常波及到左臂或脖子的左側(cè))、 呼吸急促、惡心、嘔吐、心悸、流汗和焦慮(通常描述為末日將近的感覺)。女性發(fā)生的典型癥狀可能比男性少，最普遍的是呼吸急促、虛弱、消化不良感和疲勞。所有心肌梗死中大約四分之一是無癥狀的，沒有胸痛或其他癥狀。心臟病發(fā)作是醫(yī)療緊急事件，建議發(fā)生胸痛的人通知其緊急醫(yī)療機(jī)構(gòu)，因?yàn)檠杆俚刂委熓怯欣摹?br> 對(duì)疑似急性心肌梗死的立即治療包括氧氣、阿司匹林以及舌下施用三硝酸甘油 (口語中稱為硝化甘油并簡(jiǎn)寫為NTG或GTN)。經(jīng)常還給予疼痛緩解劑，典型的是硫酸嗎啡。 患者將接受多種診斷檢測(cè)，如心電圖(ECG、EKG)、胸部X光透視和檢查心臟標(biāo)記物升高的血液檢測(cè)(檢查心肌損傷的血液檢測(cè))。最經(jīng)常采用的標(biāo)記物是肌酸激酶-MB (CK-MB)級(jí)分和肌鈣蛋白I(TnI)或肌鈣蛋白T(TnT)水平?；贓CG，區(qū)分ST段抬高心肌梗死(STEMI)或非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)。大部分STEMI病例用溶栓進(jìn)行治療，或者，如果可能，用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI，血管成形術(shù)和支架植入)進(jìn)行治療，只要醫(yī)院有冠狀動(dòng)脈造影設(shè)備。 NSTEMI用藥物治療，盡管在入院時(shí)經(jīng)常實(shí)施PCI。在具有多個(gè)阻塞并相對(duì)穩(wěn)定的患者中，或在少數(shù)極端緊急的病例中，對(duì)阻塞的冠狀動(dòng)脈進(jìn)行搭橋手術(shù)是一種選擇。
缺血再灌注損傷。至少部分缺血再灌注損傷是由于損傷組織的炎性應(yīng)答。被新返回的血液輸送到區(qū)域中的白細(xì)胞應(yīng)答于組織損傷而釋放大量炎性因子(例如白細(xì)胞介素) 以及自由基?；謴?fù)的血流將氧重新引入細(xì)胞，其損傷細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和細(xì)胞膜。繼而，細(xì)胞膜的損傷可導(dǎo)致更多自由基的釋放。這些活性反應(yīng)成分也可以在氧化還原信號(hào)中間接作用以啟動(dòng)凋亡。白細(xì)胞也可能在小毛細(xì)血管中堆積、阻塞毛細(xì)血管并導(dǎo)致進(jìn)一步的缺血。
再灌注損傷在腦的缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起作用，所述級(jí)聯(lián)反應(yīng)在中風(fēng)和腦損傷中涉及。還認(rèn)為缺血與再灌注損傷的重復(fù)發(fā)作是導(dǎo)致慢性創(chuàng)傷(如褥瘡和糖尿病性足部潰瘍)
14形成和不能愈合的因素。持續(xù)的壓力限制血液供應(yīng)并導(dǎo)致缺血，而在再灌注過程中發(fā)生炎癥。當(dāng)此過程重復(fù)時(shí)，其最終會(huì)損傷組織以致形成創(chuàng)傷。
已經(jīng)在研究來源于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和小麥醇溶蛋白的膳食補(bǔ)充物Glisodin緩解缺血再灌注損傷的能力。對(duì)作為心臟手術(shù)常見程序的主動(dòng)脈夾閉(aortic cross-clamping)的研究證明了很大的潛在益處，進(jìn)一步研究正在進(jìn)行中。
狹窄。狹窄是血管或其他管狀器官或結(jié)構(gòu)的異常變窄。血管類型的狹窄常伴隨著流經(jīng)狹窄血管的湍流引起的噪音(雜音)?？赏ㄟ^聽診器聽到該雜音。其他或更可靠的診斷狹窄的方法是影像方法，包括超聲、磁共振成像/磁共振血管造影、計(jì)算機(jī)斷層照相/CT-血管造影，其將解剖學(xué)成像(即血管的可見狹窄)與血流現(xiàn)象的顯示(使體液通過身體結(jié)構(gòu)的運(yùn)動(dòng)可視化)相組合。血管狹窄包括間歇性跛行綜合癥(外周動(dòng)脈狹窄)、心絞痛(冠狀動(dòng)脈狹窄)、易于導(dǎo)致中風(fēng)和短暫腦缺血發(fā)作的頸動(dòng)脈狹窄和腎動(dòng)脈狹窄。
其他病癥?？梢杂胢iR_U6或其激動(dòng)劑治療的病癥還有外傷和血管滲漏。
風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明還設(shè)想治療具有任何上述疾病狀態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象。這些對(duì)象可包括那些患纖維化、高血壓、心肌肥厚、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)退變和/或呼吸窘迫的人。
B.病理性新血管形成 如以上所述，本發(fā)明提供miR-126的拮抗劑用于阻止導(dǎo)致或有助于疾病發(fā)生的新血管形成的用途。尤其設(shè)想根據(jù)本發(fā)明的治療用于以下疾病狀態(tài)/病癥，但不限制于此。
本發(fā)明提供在有此需要的對(duì)象中抑制病理性血管形成的方法，其包括向?qū)ο笫┯?miR-126的拮抗劑。與病理性血管形成相關(guān)的病癥包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病、 癌癥和中風(fēng)。
早期動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化是影響動(dòng)脈血管的疾病。其是動(dòng)脈壁上的慢性炎性應(yīng)答，很大程度上是由于在功能性高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL) 沒有從巨噬細(xì)胞充分去除脂肪和膽固醇的情況下巨噬細(xì)胞類白細(xì)胞的積累，并且由低密度 (尤其是小顆粒)脂蛋白(攜帶膽固醇和甘油三酯的血漿蛋白質(zhì))所促進(jìn)。其通常被稱為動(dòng)脈“硬化”。是由于動(dòng)脈內(nèi)多個(gè)斑塊的形成所導(dǎo)致的。
動(dòng)脈粥樣硬化由低密度脂蛋白膽固醇(LDL) ( 口語中成為“壞膽固醇”)發(fā)展而來。 當(dāng)該脂蛋白通過動(dòng)脈壁時(shí)，氧自由基與其反應(yīng)形成氧化-LDL。身體的免疫系統(tǒng)通過派遣專門的白細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)吸收氧化-LDL來應(yīng)答。但是，這些白血細(xì)胞不能處理氧化-LDL，并最終漲大并破裂，將更大量的氧化膽固醇沉積入動(dòng)脈壁。這誘發(fā)了更多的白細(xì)胞，并繼續(xù)此循環(huán)。最終，動(dòng)脈發(fā)炎。膽固醇斑使肌細(xì)胞增大并在所影響的區(qū)域形成硬蓋。此硬蓋導(dǎo)致動(dòng)脈的狹窄，減少血流并使血壓升高。
動(dòng)脈粥樣硬化通常起始于青春期早期，并經(jīng)常在大部分主動(dòng)脈中發(fā)現(xiàn)，但其是無癥狀的并且在一生中不能被大部分診斷方法所檢測(cè)到。緊鄰急性動(dòng)脈粥樣硬化前的階段稱為亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化。最常在干擾供應(yīng)心臟的冠脈循環(huán)或供應(yīng)腦的腦循環(huán)時(shí)成為嚴(yán)重的癥狀，一般來講，認(rèn)為其是導(dǎo)致中風(fēng)、心臟病發(fā)作、多種心臟病包括充血性心力衰竭和大部分心血管疾病的最重要原因。手臂中或者更常見于腿部動(dòng)脈中的導(dǎo)致血流減少的粉瘤 (atheroma),稱為夕卜周云力脈閉塞性疾病(peripheral artery occlusive disease, PA0D)。 大部分動(dòng)脈血流中斷事件發(fā)生于具有少于50%腔變窄(平均 20%狹窄)的位置。
盡管此病程傾向于在數(shù)十年內(nèi)緩慢進(jìn)展，但是其通常保持為無癥狀直到粉瘤阻礙了動(dòng)脈中的血流。這通常是粉瘤的破裂，形成凝塊和腔內(nèi)凝塊的纖維組織化，覆蓋破裂但仍產(chǎn)生狹窄，或者隨著時(shí)間以及重復(fù)破裂后，導(dǎo)致持久的通常是局部的狹窄。狹窄可以是緩慢進(jìn)展的，而斑塊破裂是突發(fā)事件，其尤其發(fā)生在具有較薄/較弱的已變得“不穩(wěn)定”的纖維帽的粉瘤中。
隨著時(shí)間產(chǎn)生大多數(shù)狹窄的過程如下，未引發(fā)整個(gè)腔閉塞的重復(fù)斑塊破裂與破裂上的凝塊補(bǔ)片和穩(wěn)定該凝塊的愈合應(yīng)答相組合。狹窄區(qū)域傾向于變得更穩(wěn)定，盡管在這些狹窄區(qū)血流速度增加。絕大部分血流停止事件發(fā)生于大的斑塊，其在破裂前產(chǎn)生非常少的狹窄(如果有的話)。
根據(jù)臨床試驗(yàn)，隨后破裂導(dǎo)致完全的動(dòng)脈封閉的斑塊處狹窄平均為20%。大部分嚴(yán)重的臨床事件不發(fā)生在產(chǎn)生高程度狹窄的斑塊。根據(jù)臨床試驗(yàn)，只有14%的心臟病發(fā)作由在血管封閉之前產(chǎn)生75%或更多狹窄的斑塊處的動(dòng)脈封閉產(chǎn)生。
如果將軟的粉瘤與動(dòng)脈血流分開的纖維蓋破裂的話，則暴露并釋放組織片段，血液進(jìn)入壁內(nèi)的粉瘤，并且有時(shí)導(dǎo)致粉瘤大小的突然膨脹。組織片段非常促進(jìn)凝塊形成，其含有膠原蛋白和組織因子；它們激活血小板并激活凝血系統(tǒng)。結(jié)果是形成覆蓋粉瘤的血栓 (血液凝塊)，其嚴(yán)重地阻礙血流。隨著血流的阻礙，下游組織缺乏氧和養(yǎng)分。如果這發(fā)生在心肌，則會(huì)產(chǎn)生心絞痛(心部胸痛)或心肌梗死(心臟病發(fā)作)。
如果動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致癥狀，則可治療一些癥狀例如狹心痛。非藥物手段通常是治療的第一方法，如戒煙和經(jīng)常進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。如果這些方法不奏效，藥物通常是治療心血管疾病的下一步驟，并且隨著改進(jìn)，其越來越多地成為長(zhǎng)期內(nèi)最有效的方法。然而，藥物通常因它們的價(jià)格、專利控制和偶發(fā)的不利作用而受批評(píng)。
通常，稱為他汀類(statins)的一組藥物是最常用的并最廣泛地被用于治療動(dòng)脈粥樣硬化。它們具有相對(duì)較少的短期或長(zhǎng)期不利副作用，并且多個(gè)比較性治療/安慰劑試驗(yàn)相當(dāng)一致地顯示，在臨床試驗(yàn)中其在降低動(dòng)脈粥樣硬化疾病“事件”中有很好的作用并具有通常 25%的比較性死亡率降低，盡管一項(xiàng)研究設(shè)計(jì)(ALLHAT)不是十分有利。
通過IVUS (血管內(nèi)超聲評(píng)估)，最新的他汀——羅舒伐他汀(rosuvastatin)首先證實(shí)消退冠狀動(dòng)脈中的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。進(jìn)行該研究證明了在患活躍期/有癥狀疾病的人中2年的時(shí)間段內(nèi)主要針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化體積的作用(心絞痛頻率也顯著降低)，而非對(duì)預(yù)計(jì)需要更長(zhǎng)試驗(yàn)時(shí)間的整體臨床結(jié)果的作用；這些更長(zhǎng)期的試驗(yàn)仍在進(jìn)行中。
然而對(duì)于大部分人，將它們的生理行為從通常高風(fēng)險(xiǎn)變?yōu)闃O大降低的風(fēng)險(xiǎn)需要無限期地每天服用幾種化合物的組合。越來越多的人治療試驗(yàn)已完成以及正在進(jìn)行，其證明采用更復(fù)雜和有效的治療方案對(duì)這些人的結(jié)局有改善，所述治療方案將生理行為模式改變?yōu)楦朴谌嗽谥緱l紋開始形成之前的童年時(shí)期所顯示的。
視網(wǎng)膜病。視網(wǎng)膜病是表示眼部視網(wǎng)膜一些非炎性損傷形式的通用術(shù)語。最常見的是血液供應(yīng)問題導(dǎo)致此病癥的形成。視網(wǎng)膜病經(jīng)常是全身性疾病的眼部表現(xiàn)。視網(wǎng)膜病在眼底檢查時(shí)由驗(yàn)光師或眼科學(xué)家所診斷。治療取決于疾病的成因。
視網(wǎng)膜病的主要原因是糖尿病-糖尿病性視網(wǎng)膜?。桓邉?dòng)脈壓-高血壓性視網(wǎng)膜??；新生兒早熟-早熟視網(wǎng)膜病(retinopathy of prematurity, R0P)；鐮刀形紅細(xì)胞白血??；遺傳性視網(wǎng)膜病；直接陽光暴露-陽光視網(wǎng)膜病；醫(yī)藥產(chǎn)品-藥物相關(guān)視網(wǎng)膜??；以及視網(wǎng)膜靜脈或動(dòng)脈閉塞。視網(wǎng)膜病的很多類型是進(jìn)展性的并可導(dǎo)致失明或嚴(yán)重視覺喪失或損傷，尤其是如果影響了角膜斑翳。
中風(fēng)。中風(fēng)是由于向腦供血的血管障礙導(dǎo)致的快速發(fā)生的腦功能喪失。這可以是因?yàn)橛裳ㄐ纬苫蛩ㄈ麑?dǎo)致的缺血(血液供應(yīng)缺乏)，或由于出血。如果不迅速診斷并治療，其可導(dǎo)致永久性神經(jīng)損傷、并發(fā)癥和死亡。中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)因素包括高齡、高血壓(血壓高)、中風(fēng)病史或短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack，TIA)、糖尿病、高膽固醇、吸煙、心房纖維性顫動(dòng)、含雌激素形式的激素避孕、有先兆的偏頭痛、和血栓形成傾向 (血栓形成的傾向)、卵圓孔未閉和幾種罕見疾病。高血壓是最重要的可變中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)因素。
世界衛(wèi)生組織在1970年間提出的中風(fēng)的傳統(tǒng)定義為“持續(xù)超過M小時(shí)或在M 小時(shí)內(nèi)致死的腦血管神經(jīng)功能缺損”。該M小時(shí)限制將中風(fēng)與短暫性腦缺血發(fā)作區(qū)分，短暫性腦缺血發(fā)作是在M小時(shí)內(nèi)完全消退的中風(fēng)癥狀的相關(guān)綜合征。隨著在早期給予時(shí)可減輕中風(fēng)嚴(yán)重程度的治療的獲得，許多人現(xiàn)在更愿采用替代性概念，如腦中風(fēng)發(fā)作(brain attack)和急性缺血性腦血管綜合征(分別取自心臟病發(fā)作和急性冠狀動(dòng)脈綜合征)，其反映了中風(fēng)癥狀的緊急性和快速處理的需要。
有時(shí)將中風(fēng)與溶栓(“去除凝塊”)一起治療，但是通常伴隨支持性治療(如物理療法或工作療法)以及用抗血小板藥物(阿斯匹林和經(jīng)常用的潘生丁)、血壓控制、他汀類和抗凝劑的二級(jí)預(yù)防(在選定的患者中)。
可以將中風(fēng)分為兩個(gè)主要類型缺血性和出血性。缺血性的是由于供血的中斷，而出血性是由于血管或異常血管結(jié)構(gòu)的破裂。80%的中風(fēng)是由于缺血；剩余的是由于出血。
在缺血性中風(fēng)中，對(duì)部分腦的供血減少，導(dǎo)致該區(qū)域腦組織的功能障礙和壞死。這種情況的產(chǎn)生原因有4個(gè)血栓形成(由局部形成的血液凝塊導(dǎo)致的血管阻礙)、栓塞(同上，由于來自身體其他部位的栓塞，參見下述)、全身性灌注不足(供血的總體下降，例如休克中)和靜脈血栓形成。無明顯解釋的中風(fēng)稱為“隱源性”(原因未知)。
在血栓形成性中風(fēng)中，通常在粥樣硬化斑塊周圍形成血栓(血液凝塊)。由于動(dòng)脈是逐漸堵塞的，有癥狀的血栓性中風(fēng)的發(fā)作更慢。如果血栓破裂，血栓自身(即使未遮蔽血管)可導(dǎo)致栓塞中風(fēng)(見下文)，此時(shí)稱其為“栓塞”。血栓形成性中風(fēng)可根據(jù)形成血栓的血管類型分為兩類-大血管病或小血管病。
栓塞型中風(fēng)是指栓塞對(duì)動(dòng)脈的阻塞，栓塞是源自別處的在動(dòng)脈血流中運(yùn)動(dòng)的顆?；蛩槠?。栓塞最常見的是血栓，但是還可以是一些其他物質(zhì)，包括脂肪(例如，來自斷骨中的骨髓)、氣體、腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌團(tuán)(通常來自感染性內(nèi)心膜炎)。由于栓塞來自于別處，局部治療只臨時(shí)解決問題。因此，必須鑒定栓塞的來源。由于栓塞堵塞是突然發(fā)生的，癥狀通常在開始時(shí)就是最嚴(yán)重的。癥狀也可以是暫時(shí)的，因?yàn)樗ㄈ徊糠衷傥找约斑\(yùn)動(dòng)到不同的位置或者完全分散。栓塞最常見產(chǎn)生自心臟(尤其在心房纖維性顫動(dòng)中)，但也可來源于動(dòng)脈樹的其他位置。在反常栓塞(paradoxical embolism)中，深靜脈血栓栓塞通過心臟中房間隔缺損或室間隔缺損進(jìn)入腦。
心臟起因可分為高和低風(fēng)險(xiǎn) 高風(fēng)險(xiǎn)心房纖維性顫動(dòng)和陣發(fā)性心房纖維性顫動(dòng)，二尖瓣風(fēng)濕性疾病或主動(dòng)脈瓣疾病，人工心臟瓣膜，心房或心室的已知心臟血栓，病態(tài)竇房結(jié)綜合征，持久的心房撲動(dòng)， 近期的心肌梗死，慢性心肌梗死并且射血分?jǐn)?shù)< 觀％，有癥狀的充血性心力衰竭并且射血分?jǐn)?shù)< 30%，擴(kuò)張性心肌病，Libman-Sacks心內(nèi)膜炎，Marantic心內(nèi)膜炎，感染性心內(nèi)膜炎，乳頭狀彈性纖維瘤，左心房粘液瘤和冠狀動(dòng)脈搭橋(coronary artery bypass graft, CABG)手術(shù)。
低風(fēng)險(xiǎn)/潛在二尖瓣環(huán)的鈣化，卵圓孔未閉(patent foramen ovale，PF0)，房間隔動(dòng)脈瘤，具有卵圓孔未閉的房間隔動(dòng)脈瘤，無血栓的左心室動(dòng)脈瘤，超聲波心動(dòng)描記法中分離的左心房“煙霧狀”(無二尖瓣狹窄或心房纖維性顫動(dòng))，升主動(dòng)脈或近端拱(proximal arch)的復(fù)雜粉瘤。
全身性灌注不足是身體的所有部分血流減少。最經(jīng)常是由于心動(dòng)停止或心律失常導(dǎo)致的心臟泵功能衰竭，或由于心肌梗塞、肺栓塞、心包積液或出血導(dǎo)致的心臟輸出降低。 低氧(血液氧含量低)可促成灌注不足。由于血流減少是全身性的，腦的所有部分都可受影響，尤其是“水源”區(qū)域-由主要腦動(dòng)脈供血的邊界區(qū)區(qū)域。流向這些區(qū)域的血流不一定停止，而是可能減少到腦損傷發(fā)生的程度。此現(xiàn)象也可被稱為“最后的草場(chǎng)”，這是指在灌溉中最后的草場(chǎng)得到最少量的水。
腦靜脈竇血栓由于局部靜脈壓的增加而導(dǎo)致中風(fēng)，增加的局部靜脈壓超過了動(dòng)脈產(chǎn)生的壓力。梗死更有可能導(dǎo)致缺血性轉(zhuǎn)化(血液向受損區(qū)域滲漏)而不是其他類型的缺血性中風(fēng)。
缺血性中風(fēng)是由于阻塞腦動(dòng)脈的血栓(血液凝塊)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)這種類型的中風(fēng)時(shí)，根據(jù)原因，給予患者抗血小板藥物(阿斯匹林、氯吡格雷、潘生丁)或抗凝結(jié)藥物(華法令)。 必須用醫(yī)學(xué)影像排除出血性中風(fēng)，因?yàn)檫@種治療對(duì)出血性中風(fēng)患者有害。
在中風(fēng)中保護(hù)腦的其他即時(shí)措施包括確保血糖盡可能地正常(如在已知的糖尿病患者開始進(jìn)行胰島素按比例增減(sliding scale))，并且使中風(fēng)患者得到充分的氧和靜脈流體?？梢苑胖没颊咭允顾蛩念^部在擔(dān)架上水平，而不是坐起，因?yàn)檠芯匡@示這增加到腦的血流。缺血性中風(fēng)的另外療法包括阿斯匹林(每天50至325mg)，氯吡格雷(每天 75mg)和阿斯匹林和潘生丁的組合的緩釋O5/200mg，每天兩次)。
在中風(fēng)后血壓立即提高是常見的。研究顯示盡管高血壓導(dǎo)致中風(fēng)，但是這在緊急情況下實(shí)際上是有利的，其使血更好地流往大腦。
如果研究顯示為頸動(dòng)脈狹窄，并且患者在受影響一側(cè)有殘留功能，則若在中風(fēng)后快速實(shí)施頸動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)(手術(shù)去除狹窄)，可降低復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。
如果中風(fēng)是具有心源性栓塞的心律失常的結(jié)果，則治療心律失常并用華法令或高劑量阿斯匹林抗凝血可降低復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)CHADS/CHADS2系統(tǒng)確定對(duì)普通心律失常、心房纖維性顫動(dòng)的中風(fēng)預(yù)防治療。
在越來越多的中風(fēng)初級(jí)處理中心，采用藥物組織纖溶酶原激活劑(tPA)的藥理性溶栓(“凝塊破裂”)用于溶解凝塊并解除動(dòng)脈阻礙。然而，在急性中風(fēng)中采用tPA是有爭(zhēng)議的。對(duì)急性缺血性中風(fēng)的另一種干預(yù)是直接去除侵害性血栓。這通過向股動(dòng)脈插入導(dǎo)管， 將其導(dǎo)入腦循環(huán)，并采用螺旋鉆樣裝置套住凝塊，然后將凝塊從身體中取出來實(shí)現(xiàn)?？鼓深A(yù)防中風(fēng)復(fù)發(fā)。在患非瓣膜心房纖維性顫動(dòng)的患者中，抗凝血可減少中風(fēng)60%，而抗血小板劑可減少中風(fēng)20%。然而，近期的元(meta)分析顯示在栓塞性中風(fēng)后過早抗凝血是有害的。
癌癥。癌癥包含一類疾病，其中一組細(xì)胞顯示失控的生長(zhǎng)(分裂超出了正常限制)、侵襲(侵入并破壞鄰近組織)以及有時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)移(通過淋巴或血液擴(kuò)散到身體的其他
18位置)。癌癥的這三個(gè)惡性特征將他們與良性腫瘤區(qū)分，良性腫瘤是自限性的，不侵襲或轉(zhuǎn)移。大部分癌癥形成腫瘤但是一些癌癥不會(huì)，如白血病。涉及癌癥研究、診斷、治療和預(yù)防的醫(yī)學(xué)分支是腫瘤學(xué)。
幾乎所有的癌癥都是由轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳物質(zhì)異常引起的。這些異?？赡苁怯捎谥掳┪锏挠绊懀缥鼰?、放射、化學(xué)物或感染性物質(zhì)。其他促成癌癥的遺傳異?？赡茉贒NA復(fù)制錯(cuò)誤中隨機(jī)地獲得，或者是遺傳的，并因而在出生時(shí)的所有細(xì)胞中存在。癌癥的遺傳性通常受致癌物和宿主基因組復(fù)雜相互作用的影響。已越來越多地認(rèn)識(shí)到癌癥發(fā)病機(jī)理遺傳學(xué)的新方面的重要性，如DNA甲基化和微RNA。
診斷通常需要病理學(xué)家對(duì)組織活檢樣本進(jìn)行組織學(xué)檢查，盡管起初的惡性指征可能是癥狀或放射照相的異常。根據(jù)具體的類型、部位和階段，大部分癌癥可被治療，一些可治愈。一旦被診斷，通常用手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法的組合治療癌癥。
放射療法(也稱為放療、X-射線治療或輻射)是用電離輻射殺死癌癥細(xì)胞并縮小腫瘤。放射治療可通過體外放射治療(external beam radiotherapy,EBRT)在外部施用或通過近距放射治療在內(nèi)部施用。放療可用于治療幾乎每一種類型的實(shí)體瘤，包括腦、胸、子宮頸、喉、肺、胰、前列腺、皮膚、胃、子宮或軟組織肉瘤癌癥。放療也可用于治療白血病和淋巴瘤。對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的放療劑量取決于多個(gè)因素，包括每個(gè)癌癥類型的放射敏感性以及是否在附近存在可被放射損傷的組織和器官。因此，像每種形式的治療一樣，放射治療不是沒有副作用的。
化學(xué)療法是用可損傷癌細(xì)胞的藥物治療癌癥。在目前的應(yīng)用中，術(shù)語“化學(xué)療法” 通常指普遍影響正在快速分裂的細(xì)胞的細(xì)胞毒藥物，其與靶向治療相對(duì)(見以下所述)。 化學(xué)療法藥物以多種可能的方式干擾細(xì)胞分裂，如干擾DNA復(fù)制或新形成染色體的分離。 大部分形式的化學(xué)療法靶向所有快速分裂細(xì)胞并不對(duì)癌細(xì)胞有特異性，盡管其由于下述原因可具有一定程度的特異性許多癌細(xì)胞無法修復(fù)DNA損傷，而正常細(xì)胞通?？梢?。因此，化學(xué)療法有損傷健康組織的可能，尤其是具有高更新速度的那些組織(例如，腸內(nèi)層 (intestinal lining))。這些細(xì)胞通常在化學(xué)療法后自我修復(fù)。因?yàn)橐恍┧幬锫?lián)用時(shí)比單獨(dú)使用效果更好，所以經(jīng)常同時(shí)給予兩種或更多種藥物。這稱為“聯(lián)合化學(xué)療法”，并且事實(shí)上，大部分化學(xué)療法方案是以組合給出的。
靶向治療最早在1990年代末期出現(xiàn)，它對(duì)一些類型的癌癥治療有顯著的影響，并且是目前非?；钴S的研究領(lǐng)域。靶向治療使用對(duì)癌細(xì)胞失調(diào)蛋白質(zhì)具有特異性的藥劑。小分子靶向治療藥物通常是癌細(xì)胞中突變、過表達(dá)或其他關(guān)鍵蛋白質(zhì)中酶結(jié)構(gòu)域的抑制劑。 著名的實(shí)例是酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼和吉非替尼。
單克隆抗體治療是另一種策略，其中治療劑是與癌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)特異結(jié)合的抗體。實(shí)例包括在乳腺癌中采用的抗HER2/neU抗體曲妥珠單抗(赫賽汀)以及在多種B細(xì)胞惡性腫瘤中采用的抗CD20抗體利妥昔單抗。
靶向治療還可涉及小肽作為“歸巢裝置”，其可與細(xì)胞表面受體結(jié)合或影響腫瘤周圍的細(xì)胞外基質(zhì)。連接到這些肽上的放射性核素(如RGD)如果在癌細(xì)胞周圍衰變的話，則最終殺傷細(xì)胞。這些結(jié)合基序的寡聚體或多聚體尤其受到關(guān)注，因?yàn)槠淇蓪?dǎo)致腫瘤特異性和親和性的增加。
光動(dòng)力治療(photodynamic therapy,PDT)是涉及光敏劑、組織氧和光(通常采用激光)的三重性癌癥治療。PDT可用于治療基底細(xì)胞癌(basal cell cancer, BCC)或肺癌； PDT還可用于去除手術(shù)切除大型腫瘤后的微量惡性組織。
癌癥的免疫治療表示設(shè)計(jì)成誘導(dǎo)患者自身的免疫應(yīng)答來抵抗腫瘤的一類多種多樣的治療策略。目前用于產(chǎn)生針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答的方法包括對(duì)淺表性膀胱癌的膀胱內(nèi) BCG免疫治療，以及采用干擾素或其他細(xì)胞因子在腎細(xì)胞癌和黑素瘤患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。 產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答的疫苗是針對(duì)多種腫瘤的大量研究的主題，特別是惡性黑素瘤和腎細(xì)胞癌。Sipulencel-T是處于后期臨床研究的針對(duì)前列腺癌的類疫苗策略，其中在來自患者的樹突細(xì)胞中裝載前列腺酸性磷酸酶肽以誘導(dǎo)對(duì)前列腺來源細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。
可認(rèn)為異體造血干細(xì)胞移植(來自遺傳學(xué)不同供體的“骨髓移植”)是免疫治療的一種形式，因?yàn)樵谝阎囊浦参飳?duì)抗腫瘤作用現(xiàn)象中，供體的免疫細(xì)胞經(jīng)常會(huì)攻擊腫瘤。因此，對(duì)于幾種癌癥類型，異體HSCT與自體移植相比具有更高的治愈率，盡管副作用也更嚴(yán)重。
可通過提供或阻斷某些激素來抑制一些癌癥的生長(zhǎng)。激素敏感腫瘤的常見實(shí)例包括一些類型的乳腺和前列腺癌。去除或阻斷雌激素或睪酮通常是重要的額外治療。在一些癌癥中，施用激素激動(dòng)劑(如孕激素)可對(duì)治療有利。
血管發(fā)生抑制劑阻止腫瘤存活所需的血管大量生長(zhǎng)(血管發(fā)生)。它們中的一些 (如貝伐單抗)已被批準(zhǔn)且正在臨床應(yīng)用?？寡馨l(fā)生藥物的一個(gè)主要問題是在普通細(xì)胞和癌癥中，許多因素刺激血管生長(zhǎng)?？寡馨l(fā)生藥物只靶向一個(gè)因素，因此其他因素繼續(xù)刺激血管生長(zhǎng)。其他問題包括給藥途徑、穩(wěn)定性和活性的保持以及對(duì)腫瘤血管系統(tǒng)的靶向。
風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明還設(shè)想治療具有任何上述疾病狀態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象。這些對(duì)象包括患動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖癥、哮喘、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和/或失明的人。
C.聯(lián)合治療 在另一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)計(jì)將miR-126的調(diào)節(jié)劑與其他治療形式組合使用。因此， 除以上所述的治療外，還可對(duì)患者提供更多的“標(biāo)準(zhǔn)”藥物治療。組合可通過將細(xì)胞、組織或?qū)ο笈c單一組合物或包含兩種藥劑的藥物制劑接觸來實(shí)現(xiàn)，或者通過將細(xì)胞與兩種不同的組合物或制劑同時(shí)接觸來實(shí)現(xiàn)，其中一種組合物包含表達(dá)構(gòu)建體，另一個(gè)包含藥劑。或者，采用miR-U6調(diào)節(jié)劑的治療可在施用其他藥劑之前或之后間隔幾分鐘至幾周進(jìn)行。在其他藥劑和表達(dá)構(gòu)建體分開施用到細(xì)胞的實(shí)施方案中，通常確保每次遞送之間的時(shí)間段不太長(zhǎng)，以使藥劑和表達(dá)構(gòu)建體仍能在細(xì)胞、組織或?qū)ο笾邪l(fā)揮有力的組合作用。在這些情況下，預(yù)計(jì)通常應(yīng)將細(xì)胞與兩種形式在約12-24小時(shí)的時(shí)間間隔內(nèi)接觸，更優(yōu)選地，在約6-12 個(gè)小時(shí)的時(shí)間間隔內(nèi)，最優(yōu)選延遲時(shí)間僅約12小時(shí)。然而在一些情況下，理想的是顯著延長(zhǎng)治療時(shí)間間隔，在各個(gè)施用之間間隔幾天0、3、4、5、6或7)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或 8)。
另外可預(yù)計(jì)，將需要多于一次的miR_U6調(diào)節(jié)劑或其他藥劑的施用。為此，可采用多種組合。例如，當(dāng)miR-126的調(diào)節(jié)劑為“A”，另一種藥劑為“B”時(shí)，下列基于3和4次總施用的排列是示例性的 A/'KB/%/BB/'KA/%/BB/%'KA/%/BB/7B/%'KB/%%/B A/7A//BA/%7A//BA/%%'KB/%%B/%%/AB/%/BB/%'K A/%%/BB/%%A/%'KA/%'KA//BB/7A//BB/%/B 同樣設(shè)想了其他組合。
D.藥物治療劑 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知藥物治療劑和給藥方法、劑量等(參見如，“I^hysicians Desk Reference,，，Klaassen "The Pharmacological Basis of Therapeutics,，，“Remington's Pharmaceutical Sciences,，，禾口"The Merck Index,Eleventh Edition,，，,相關(guān)部分通過弓| 用并入本文)，并可參考本文的公開內(nèi)容與本發(fā)明向結(jié)合。根據(jù)接受治療的對(duì)象的情況會(huì)對(duì)劑量進(jìn)行一些必要的變更。在任何情況下，負(fù)責(zé)給藥的人員應(yīng)確定對(duì)單個(gè)對(duì)象的適合劑量， 并且這種對(duì)象確定在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。
可用于本發(fā)明的藥物治療劑的非限制性實(shí)例包括抗高脂蛋白劑、抗動(dòng)脈粥樣硬化劑、抗血栓形成/溶纖劑、凝血?jiǎng)⒖剐穆墒С?、抗高血壓劑、血管收縮劑、充血性心力衰竭的治療劑、抗心絞痛劑、抗菌劑或其組合。還設(shè)想將以上IIIA-B部分討論的藥劑/療法與miR-U6調(diào)節(jié)劑相組合。
E.治療的調(diào)節(jié) 本發(fā)明還設(shè)想在治療后除去或清除miR_U6激動(dòng)劑或拮抗劑的方法。該方法可包括在靶組織中過表達(dá)miR-U6拮抗劑的結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在治療后除去或清除miR-126的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在靶組織中過表達(dá) miR-126的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域。所述結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域優(yōu)選地包含miR-U6種子區(qū)序列。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)可包含來自miR-U6 —個(gè)或更多靶標(biāo)(Spred-I)的3’ UTR的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在miR-U6后施用miR-U6拮抗劑以減弱或停止miRNA的功能。
F.藥物制劑和施用給患者的途徑 當(dāng)設(shè)想臨床應(yīng)用時(shí)，會(huì)將藥物組合物制備成適于預(yù)定應(yīng)用的形式。一般而言，這要求制備的組合物基本無熱原并且沒有其他會(huì)對(duì)人和動(dòng)物造成損害的雜質(zhì)。
一般需要使用適合的鹽和緩沖液以使遞送載體穩(wěn)定并允許被靶細(xì)胞所攝入。當(dāng)將重組細(xì)胞引入患者中時(shí)也會(huì)利用緩沖液。本發(fā)明的含水組合物包含有效量的載體或細(xì)胞， 其溶解或分散在可藥用載體或含水基質(zhì)中。用詞“可藥用”或“藥理學(xué)可接受”是指當(dāng)施用給動(dòng)物或人時(shí)，不產(chǎn)生不利的、過敏的或其他不理想反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。如本文所用，“可藥用載體”包括可用于制備藥物(例如適于施用給人的藥物)的溶劑、緩沖液、溶液、 分散基質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲或延遲吸收劑等。這些介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除非任何傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑與本發(fā)明活性成分不相容，否則考慮將其用于治療組合物中。只要不使組合物的載體或細(xì)胞失活，也可在組合物中并入補(bǔ)充性活性成分。
本發(fā)明的活性化合物可以包含經(jīng)典的藥物制劑。可通過任何常見途徑進(jìn)行本發(fā)明這些組合物的施用，只要通過這些途徑可抵達(dá)靶組織。這包括口服、鼻內(nèi)或口含?；蛘?，可通過真皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射施用，或通過直接注射入心臟組織施用。這些組合物通常以可藥用組合物的形式施用，如以上所述。
活性化合物還可腸胃外或腹膜內(nèi)施用。例如，游離堿或可藥用鹽形式的活性化合物溶液可在適當(dāng)?shù)嘏c表面活性劑(例如羥丙基纖維素)混合的水中制備。也可在甘油、液體聚乙二醇和其混合物以及在油中制備分散體系。在正常的儲(chǔ)藏和使用條件下，這些制劑通常包含防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。
適于注射用途的藥物形式包括，例如，無菌水溶液或懸液和用于臨時(shí)制備無菌注射溶液或懸液的無菌粉末。一般地，這些制劑是無菌的，并且為易于注射程度的流體。制劑在制造和儲(chǔ)存條件下應(yīng)是穩(wěn)定的，并且應(yīng)針對(duì)抗微生物(如細(xì)菌和真菌)污染作用進(jìn)行保存。適合的溶劑或分散介質(zhì)可包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，適合的其混合物，以及植物油。可以通過使用包衣(如卵磷脂)，就分散體系的情況來說通過維持所需的顆粒大小以及通過使用表面活性劑，來維持合適的流動(dòng)性。預(yù)防微生物的作用可通過多種抗菌劑和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)，如苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，如糖或氯化鈉。注射組合物的延長(zhǎng)吸收可通過在組合物中使用延遲吸收劑來實(shí)現(xiàn)，如單硬脂酸鋁和明膠。
可通過根據(jù)需要將適當(dāng)量的活性化合物和任何其他成分(例如以上列舉的)并入溶劑中，然后過濾除菌，來制備無菌注射用溶液。一般地，通過將多種無菌活性成分并入包含有基本分散基質(zhì)和其他所需的成分(如以上列舉的)的無菌載體中來制備分散劑。對(duì)于用于制備無菌注射用溶液的無菌粉末的情況，優(yōu)選的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其從預(yù)先過濾除菌的溶液中產(chǎn)生活性成分及任何額外所需成分的粉末。
對(duì)于口服施用，本發(fā)明的多肽通?？膳c賦形劑合并，并且以非食用的漱口水和潔牙劑的形式使用。可通過將所需量的活性成分整合入適合的溶劑(如硼酸鈉溶液(Dobell 溶液))中來制備漱口水。或者，可將活性成分合并入含有硼酸鈉、甘油和碳酸氫鈉的抗菌洗液中?；钚猿煞忠部煞稚⒃跐嵮绖┲校浒z、膏劑、粉劑和漿劑?？蓪⒅委熡行Я康幕钚猿煞旨尤胙栏嘀?，其中可包含水、粘合劑、磨料、調(diào)味劑、起泡劑和濕潤(rùn)劑。
本發(fā)明的組合物通?？芍苽涑芍行曰螓}形式?？伤幱名}包括，例如，源自無機(jī)酸 (如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成鹽(通過蛋白質(zhì)的游離氨基形成)。以蛋白質(zhì)的游離羧基形成的鹽也可源自無機(jī)堿(如鈉、鉀、銨、鈣、鐵的氫氧化物)或有機(jī)堿(如異丙胺、三甲胺、組胺、普魯卡因等)。
制備后，溶液優(yōu)選以與制劑相容的方式并且以治療有效的量施用。制劑可以多種劑型方便地施用，如注射用溶液、藥物釋放膠囊等。例如對(duì)于在水溶液中的腸胃外施用，通常該溶液被合適地緩沖并且稀釋溶液使其等滲，例如采用足夠的鹽水或葡萄糖。這些含水溶液可用于，例如，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的， 尤其是在本發(fā)明公開內(nèi)容的啟發(fā)下，可采用無菌含水基質(zhì)。例如，單次劑量可溶解在Iml 的等滲NaCl溶液中，并加到IOOOml皮下輸注流體中或注射到預(yù)定的輸注位置(參見，例如，“Remington' s Pharmaceutical Sciences"第 15 版，1035-1038 和 1570-1580 頁)。 根據(jù)接受治療的對(duì)象的情況會(huì)對(duì)劑量進(jìn)行一些必要的變更。在任何情況下，負(fù)責(zé)給藥的人員會(huì)確定對(duì)單個(gè)對(duì)象的適合劑量。此外，對(duì)于人的給藥，制劑應(yīng)符合FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)要求的無菌性、熱原性、普遍安全性和純度的標(biāo)準(zhǔn)。
IV.藥盒 本文所述的任何組合物可包含在藥盒中。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，將單獨(dú)的miRNA 調(diào)節(jié)劑(例如，miRNA、表達(dá)構(gòu)建體、拮抗miRNA)包含在藥盒中。所述藥盒還可包含水和雜交緩沖液以便于miRNA兩條鏈的雜交。所述藥盒還可包含一種或更多種轉(zhuǎn)染試劑以便于將 miRNA遞送到細(xì)胞。
藥盒的組分可包裝在含水基質(zhì)中或以冰凍干燥的形式包裝。藥盒的容器裝置通常包括至少一個(gè)小管、試管、燒瓶、小瓶、注射器或其他容器裝置，組分可放入其中，優(yōu)選地其為合適分裝的。當(dāng)藥盒中存在多于一種成分時(shí)(標(biāo)記試劑和標(biāo)記物可包裝在一起)，所述藥盒通常還包含第二、第三或其他額外的容器，其中分別放置額外的組分。然而，在一個(gè)管中可包含組分的多種組合。本發(fā)明的藥盒通常還包括含有核酸的裝置，以及其他任何密封的試劑容器以用于銷售。這些容器可包括注射或吹塑塑料容器，其中裝有所需的管。
當(dāng)在一種和/或更多種液體溶液中提供藥盒的組分時(shí)，液體溶液為水溶液，尤其優(yōu)選無菌水溶液。
然而，藥盒的組分可以干粉形式提供。當(dāng)試劑和/或組分以干粉形式提供時(shí)，可通過加入合適的溶劑重構(gòu)干粉。設(shè)想溶劑可在另外的容器裝置中提供。
容器裝置通常包括至少一個(gè)小管、試管、燒瓶、小瓶、注射器和/或其他容器裝置， 其中放置核酸制劑，優(yōu)選地，其被恰當(dāng)?shù)胤峙?。藥盒還可包含第二容器裝置用于包含無菌的，可藥用緩沖液和/或其他稀釋液。
本發(fā)明的藥盒還通常包含用于將小瓶密封以銷售的裝置，例如，注射和/或吹塑塑料容器，其中裝有所需的管。
這些藥盒還可包含保護(hù)或維持miRNA或使其免于降解的成分。這些成分可無 RNase或保護(hù)其受RNase作用。這些藥盒通常包括在合適的工具中的對(duì)每個(gè)單獨(dú)的試劑或溶液的分別的容器。
藥盒還包括使用藥盒組分及使用其他任何未包含在藥盒中的試劑的說明書。說明書中可包含可實(shí)施的變化。
這些試劑包含在本發(fā)明藥盒的實(shí)施方案中。然而，這些藥盒不限于以上定義的特定項(xiàng)，并可包含任何用于處理或測(cè)定miRNA的試劑。
V.篩選方法 本發(fā)明還包括在預(yù)防或治療上述疾病中所用的鑒定miR-U6調(diào)節(jié)劑的方法。這些測(cè)定可包括隨機(jī)地篩選候選物質(zhì)的大型文庫；或者，測(cè)定可用于關(guān)注特定化合物類別，該特定化合物類別的選擇是著眼于認(rèn)為能使它們更有可能調(diào)節(jié)miR-U6的表達(dá)和/或功能的結(jié)構(gòu)特性。
為了鑒定miR_U6的調(diào)節(jié)物，通常會(huì)測(cè)定miR_U6在存在或缺乏候選物質(zhì)時(shí)功能。 例如，方法通常包括 (a)提供候選調(diào)節(jié)物； (b)將候選調(diào)節(jié)物與miR_U6混合； (c)測(cè)量 miR-126 的活性 (d)將步驟(C)的活性與缺乏候選調(diào)節(jié)物的活性相比。
其中所測(cè)量活性的差異表明候選調(diào)節(jié)物的確是miR-126的調(diào)節(jié)物。
測(cè)定還可在分離的細(xì)胞、器官或在活生物體中進(jìn)行。
當(dāng)然，應(yīng)理解，本發(fā)明的所有篩選方法本身均是可用的，盡管的確可能發(fā)現(xiàn)不了有效的候選。本發(fā)明提供篩選這些候選的方法，不只是發(fā)現(xiàn)它們的方法。
A.調(diào)節(jié)物 如本文所用，術(shù)語“候選物質(zhì)”是指任何可潛在地調(diào)控miR-126的血管發(fā)生調(diào)節(jié)方面的分子。通常需要多種商業(yè)來源的分子文庫，認(rèn)為它們“窮舉”鑒定有效化合物的能力滿
23足有效藥物的基本標(biāo)準(zhǔn)。篩選這些文庫(包括組合產(chǎn)生的文庫(如拮抗miRNA文庫))是篩選大量相關(guān)(和不相關(guān))化合物活性的快速有效方法。組合方法還通過對(duì)有活性但其他方面不理想的化合物產(chǎn)生第二、第三和第四代化合物來使自身快速地發(fā)展為潛在的藥物。
B.體外測(cè)定 快速、經(jīng)濟(jì)且簡(jiǎn)便的進(jìn)行操作的測(cè)定是體外測(cè)定。這些測(cè)定通常使用分離的分子， 可快速以及大量地進(jìn)行，因而增加了在短時(shí)間內(nèi)獲得的信息量。可采用多種載體進(jìn)行測(cè)定， 包括試管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿和其他表面，如量尺或珠子。
在WO 84/03564中描述了高通量篩選化合物的技術(shù)?？稍诠腆w基質(zhì)(如塑料釘或其他表面)上合成大量的小核酸。可快速篩選這些分子抑制miR-126的能力。
C.細(xì)胞內(nèi)(In cyto)測(cè)定 本發(fā)明還包括根據(jù)化合物在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)miR_U6活性和表達(dá)的能力來對(duì)化合物進(jìn)行的篩選?？刹捎枚喾N細(xì)胞系(包括那些從內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞衍生的細(xì)胞系)來進(jìn)行這些篩選測(cè)定，包括為此目的特別改造的細(xì)胞。
本發(fā)明還包括對(duì)miR-126靶基因表達(dá)的檢測(cè)，以確定miR_U6的活性是否被調(diào)節(jié)。 因此，作為篩選策略的一部分，可檢測(cè)在表3或4中給出的任何基因靶標(biāo)，并且有利地可檢測(cè)多個(gè)這些靶標(biāo)。
D.體內(nèi)測(cè)定 體內(nèi)測(cè)定涉及上述血管疾病的多種動(dòng)物模型的使用，包括經(jīng)改造以具有特定缺陷，或攜帶標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述標(biāo)記可用于測(cè)量候選物質(zhì)到達(dá)并作用生物體內(nèi)不同細(xì)胞的能力。由于小鼠的大小，方便處理，以及其生理和遺傳組成方面的信息，小鼠是優(yōu)選的實(shí)施方案，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠。然而，其他動(dòng)物也適合，包括大鼠、兔、倉鼠、豚鼠、沙鼠、土撥鼠、貓、狗、綿羊、山羊、豬、牛、馬和猴(包括黑猩猩、長(zhǎng)臂猿和狒狒)?？刹捎迷醋匀魏芜@些物種的動(dòng)物模型進(jìn)行抑制劑的測(cè)定。
用檢測(cè)化合物處理動(dòng)物將涉及向動(dòng)物施用合適形式的化合物。施用可以通過任何可用于臨床目的的途徑。在體內(nèi)確定化合物的有效性可能涉及多種不同標(biāo)準(zhǔn)。并且，與體外或細(xì)胞內(nèi)測(cè)定相比，可在動(dòng)物中以更有意義的方式測(cè)定毒性和劑量反應(yīng)。
VI.用于克隆、基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的載體 在一些實(shí)施方案中，采用表達(dá)載體來表達(dá)miR_U6或相關(guān)分子(如拮抗miRNA)。表達(dá)需要在載體中提供合適的信號(hào)，并包括多種調(diào)控元件，如病毒和哺乳動(dòng)物來源的增強(qiáng)子/ 啟動(dòng)子來引導(dǎo)目的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。還定義了設(shè)計(jì)為優(yōu)化信使RNA在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定性和翻譯能力的元件。還提供了使用多個(gè)顯性藥物選擇標(biāo)記來建立永久、穩(wěn)定表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞克隆的情況，以及將藥物選擇標(biāo)記的表達(dá)與多肽的表達(dá)相連的元件。
A.調(diào)控元件 在本申請(qǐng)中，術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”是指任何類型的基因構(gòu)建體，其含有編碼基因產(chǎn)物的核酸，所述產(chǎn)物中部分或全部核酸編碼序列能被轉(zhuǎn)錄。通常，編碼基因產(chǎn)物的核酸在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下?！皢?dòng)子”是指被細(xì)胞的合成機(jī)器或引入的合成機(jī)器(需要其來起始特定基因的轉(zhuǎn)錄)識(shí)別的DNA序列。術(shù)語“在轉(zhuǎn)錄控制下”是指啟動(dòng)子相對(duì)于核酸處于正確的位置和方向從而控制RNA聚合酶起始和基因表達(dá)。
本文所用術(shù)語啟動(dòng)子是指一組轉(zhuǎn)錄控制模塊，其聚集在RNA聚合酶II的起始位點(diǎn)周圍。有關(guān)啟動(dòng)子如何組織的大部分理論都來自于對(duì)幾個(gè)病毒啟動(dòng)子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單元的啟動(dòng)子。更多的近期工作豐富了這些研究，并顯示啟動(dòng)子包括分離的功能模塊，每個(gè)由約7_20bp的DNA組成，并包含一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活或抑制蛋白的識(shí)別位點(diǎn)。
在每個(gè)啟動(dòng)子中至少一個(gè)模塊的功能是提供RNA合成的起始位點(diǎn)。最熟知的實(shí)例是TATA盒，但在一些沒有TATA盒的啟動(dòng)子中(如哺乳動(dòng)物晚期脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子和SV40晚期基因的啟動(dòng)子)，與起始位點(diǎn)自身重疊的分離的元件幫助固定起始位置。
另外的啟動(dòng)子元件調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常這些位于起始位點(diǎn)上游30_110bp 區(qū)域，盡管近期顯示許多啟動(dòng)子在起始位點(diǎn)下游也含有功能元件。啟動(dòng)子元件之間的間隔經(jīng)常是可改變的，因而當(dāng)元件相對(duì)于彼此顛倒或移動(dòng)時(shí)，啟動(dòng)子仍保有功能。在tk啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子元件之間的間隔可增加至50bp，再增加活性才會(huì)開始降低。根據(jù)啟動(dòng)子，似乎單個(gè)元件可共同或分別行使功能來激活轉(zhuǎn)錄。
在其他一些實(shí)施方案中，可采用人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子、SV40 早期啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)、大鼠胰島素啟動(dòng)子和3-磷酸甘油醛脫氫酶來獲得目的編碼序列的高水平表達(dá)。還設(shè)想采用本領(lǐng)域公知的其他病毒或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或噬菌體啟動(dòng)子來獲得目的編碼序列表達(dá)的用途，只要對(duì)于給定目的來說表達(dá)水平是足夠的。
通過采用具有公知特性的啟動(dòng)子，可優(yōu)化轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后目的蛋白質(zhì)表達(dá)的水平和模式。而且，選擇應(yīng)答于特定生理信號(hào)而調(diào)控的啟動(dòng)子可允許基因產(chǎn)物的可誘導(dǎo)表達(dá)。表 1和2列出了在本發(fā)明內(nèi)容中可用于調(diào)控目的基因表達(dá)的幾種調(diào)控元件。該列表不是為了窮舉在基因表達(dá)啟動(dòng)中涉及的所有可能元件，而僅為其示例。
增強(qiáng)子是提高啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的基因元件，其位于同一 DNA分子的較遠(yuǎn)位置。增強(qiáng)子的構(gòu)成與啟動(dòng)子十分相似。即，他們包括很多單獨(dú)的元件，每個(gè)結(jié)合一種或更多種轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)。
增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的基本區(qū)別是在作用上。增強(qiáng)子區(qū)域作為整體必須能在遠(yuǎn)端刺激轉(zhuǎn)錄；這對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域或其組成元件來說是不需要的。另一方面，啟動(dòng)子必須具有一個(gè)或更多個(gè)在特定位點(diǎn)并以特定方向指導(dǎo)RNA合成起始的元件，而增強(qiáng)子沒有這些特點(diǎn)。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子經(jīng)常重疊或連續(xù)，經(jīng)常顯示出類似的模塊結(jié)構(gòu)。
以下是可與表達(dá)構(gòu)建體中編碼目的基因的核酸組合使用的病毒啟動(dòng)子、細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的列表(表1和表幻。此外，還可采用任何啟動(dòng)子/ 增強(qiáng)子組合(按照真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫EPDB)來指導(dǎo)基因表達(dá)。如果提供適合的細(xì)菌聚合酶 (作為遞送復(fù)合物的一部分或額外的基因表達(dá)構(gòu)建體)，則真核細(xì)胞可支持一些細(xì)菌啟動(dòng)子的胞漿轉(zhuǎn)錄。

權(quán)利要求
1.促進(jìn)血管完整性和/或血管修復(fù)的方法，其包括向有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)或患有血管損傷的對(duì)象施用miR-126功能的激動(dòng)劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述對(duì)象患有血管損傷。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述血管損傷發(fā)生在心臟組織。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述血管損傷包括缺血性事件。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述缺血性事件包括梗塞、缺血再灌注損傷或動(dòng)脈狹窄。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述血管損傷發(fā)生在非心臟組織。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述血管損傷包括外傷或血管滲漏。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述對(duì)象有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述對(duì)象患高血壓、晚期動(dòng)脈粥樣硬化心臟肥大、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)退變、纖維化或呼吸窘迫。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述對(duì)象為非人動(dòng)物。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述對(duì)象是人。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述激動(dòng)劑是miR-126。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述激動(dòng)劑是miR-126的模擬物。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述激動(dòng)劑是表達(dá)載體，其包含處于在靶細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子控制之下的miR-U6編碼核酸區(qū)段。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述靶細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞或造血細(xì)胞。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述啟動(dòng)子是組織選擇性/特異性啟動(dòng)子。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述組織選擇性/特異性啟動(dòng)子在內(nèi)皮細(xì)胞或造血細(xì)胞中有活性。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述表達(dá)載體是病毒載體。
19.權(quán)利要求14的方法，其中所述表達(dá)載體是非病毒載體。
20.權(quán)利要求1的方法，其還包括向所述對(duì)象施用第二治療。
21.權(quán)利要求1的方法，其中施用包括全身性施用。
22.權(quán)利要求21的方法，其中全身性施用是經(jīng)口、靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)施用。
23.權(quán)利要求1的方法，其中施用是通過滲透泵或?qū)Ч苓M(jìn)行。
24.權(quán)利要求1的方法，其中施用是直接或局部施用到血管損傷組織或有血管損傷風(fēng)險(xiǎn)的組織。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述組織是心臟組織、血管組織、骨組織、神經(jīng)組織、呼吸系統(tǒng)組織、眼組織或胎盤組織。
26.在有此需要的對(duì)象中抑制病理性血管化的方法，其包括向有病理性血管化風(fēng)險(xiǎn)或患有病理性血管化的對(duì)象施用miR-126的拮抗劑。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述對(duì)象患有病理性血管化。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述病理性血管化包括早期動(dòng)脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病、癌癥或中風(fēng)。
29.權(quán)利要求沈的方法，其中所述對(duì)象具有病理性血管化的風(fēng)險(xiǎn)。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述對(duì)象患高脂血癥、肥胖癥、哮喘、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和/ 或失明。
31.權(quán)利要求沈的方法，其中所述對(duì)象是非人動(dòng)物。
32.權(quán)利要求沈的方法，其中所述對(duì)象是人。
33.權(quán)利要求沈的方法，其中所述拮抗劑是miR-U6拮抗miRNA。
34.權(quán)利要求沈的方法，其中所述拮抗劑被遞送到血管組織、平滑肌、眼組織、造血組織、骨髓、肺組織或心外膜組織。
35.權(quán)利要求沈的方法，其還包括向所述對(duì)象施用第二抗血管發(fā)生治療。
36.權(quán)利要求沈的方法，其中施用包括全身性施用。
37.權(quán)利要求36的方法，其中全身性施用是經(jīng)口、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)施用。
38.權(quán)利要求沈的方法，其中所述施用是直接或局部施用到病理性血管化或具有病理性血管化風(fēng)險(xiǎn)的組織。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述組織是眼組織、血管組織、骨組織、脂肪組織或肺組織。
40.權(quán)利要求沈的方法，其中施用通過滲透泵或?qū)Ч苓M(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及稱為miR-126的微RNA的鑒定，其是內(nèi)皮細(xì)胞血管完整性的調(diào)節(jié)劑。該內(nèi)皮細(xì)胞限制性微RNA在體內(nèi)介導(dǎo)發(fā)育性血管發(fā)生，在小鼠中miR-126的靶向缺失使得因血管完整性的喪失以及內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管發(fā)生的缺陷而導(dǎo)致血管滲漏、出血和部分胚胎死亡。這些血管異常類似于血管發(fā)生生長(zhǎng)因子例如VEGF和FGF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低所造成的后果。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)涉及血管發(fā)生異常和血管滲漏的多種疾病是重要的治療啟示。本文公開了通過調(diào)節(jié)miR-126的功能治療特征為局部缺血、血管損傷和病理性新血管形成的疾病的方法。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK102186483SQ200980137927
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月11日
發(fā)明者埃里克·奧爾松, 王樹生 申請(qǐng)人:德克薩斯大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì)