專利名稱：阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物在治療抗性癌癥患者中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療抗性(resistant)癌癥患者的新策略。

背景技術(shù)：
由于腫瘤細(xì)胞對(duì)放射和或化學(xué)療法的抗性，抗癌療法常常無(wú)效。當(dāng)抗性是在治療過(guò)程中獲得時(shí)，其通常表現(xiàn)為相同劑量下(輻射(radiation)或細(xì)胞毒性物質(zhì))的腫瘤消退的量減少或等量腫瘤消退所需的劑量增加。當(dāng)抗性是內(nèi)在的，即不是在抗癌治療過(guò)程中獲得或誘導(dǎo)的，腫瘤細(xì)胞原本已經(jīng)對(duì)一種或多種抗癌藥物或電離輻射缺乏敏感性。癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性通常因人而異。例如對(duì)于胰腺癌而言，已知僅25%的全部患者受益于抗癌藥物吉西他濱。其余75%對(duì)該化學(xué)療法有內(nèi)在性抗性(intrinsic resistance)。具有內(nèi)在化學(xué)抗性或輻射抗性的其他腫瘤細(xì)胞的實(shí)例為成膠質(zhì)細(xì)胞瘤或黑色素瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞對(duì)放射療法和/化學(xué)療法的內(nèi)在性抗性或獲得性抗性(或不響應(yīng))可以有多種原因，并且如上所示可以因人而異。盡管已進(jìn)行了大量研究，確切機(jī)制仍然不清楚。 然而已知單個(gè)突變，例如在藥物結(jié)合位點(diǎn)或細(xì)胞解毒過(guò)程中的突變可以被解釋為化學(xué)敏感性缺乏或降低。對(duì)多種抗癌藥物的交叉抗性通常限制抗癌治療的有效性。所謂的多重抗藥性(MDR)具有重要的臨床意義。根據(jù)這一觀點(diǎn)，膜蛋白，即ATP結(jié)合區(qū)(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，諸如P-糖蛋白或多重抗藥性相關(guān)蛋白(MRP)表達(dá)增加，從而導(dǎo)致藥物經(jīng)細(xì)胞膜的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)流出增加。表現(xiàn)出多重抗藥性的患者常常對(duì)廣譜細(xì)胞毒性藥物有抗性?？剐圆幌抻诨瘜W(xué)治療或抗癌藥物，癌癥患者還可以表現(xiàn)出對(duì)在放射療法中應(yīng)用的離子化放射(irradiation)的內(nèi)在性或獲得性抗性。已知存在例如來(lái)自于黑色素瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的內(nèi)在輻射抗性?？梢酝ㄟ^(guò)暴露于小劑量或分次劑量的離子化輻射誘導(dǎo)輻射抗性。多項(xiàng)研究在體外甚至是人類細(xì)胞中以及多個(gè)動(dòng)物模型中證明了該效應(yīng)?？赡苡胁煌募?xì)胞放射防護(hù)機(jī)制參與，諸如某些細(xì)胞質(zhì)和核蛋白的改變，增加的基因表達(dá)或DNA修復(fù)過(guò)程。因此腫瘤學(xué)非常需要新的可以使癌癥治療更有效的策略。特別地，本發(fā)明的目的是提供治療癌癥患者的新方法，所述患者表現(xiàn)出對(duì)常規(guī)抗癌療法，諸如抗癌藥物(化學(xué)療法)或放射療法的抗性，或提供治療具有凋亡(apoptosis)抗性細(xì)胞的癌癥患者的新方法。目前發(fā)現(xiàn)能夠抑制細(xì)胞增殖或癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)的阿片樣物質(zhì)可以戰(zhàn)勝這些細(xì)胞中的抗性，因此通過(guò)在治療放射療法和/或化學(xué)療法抗性癌癥患者的過(guò)程中使用阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。因此這些阿片樣物質(zhì)提供了治療患者的新策略， 所述患者到目前為止被認(rèn)為是通過(guò)常規(guī)抗癌方法無(wú)法治療的或無(wú)法有效治療的。該組被稱為無(wú)法治療的癌癥患者也可以被稱為“無(wú)響應(yīng)者”、“響應(yīng)差者”或“非-化學(xué)敏感性的”或 “非-放射敏感性的”癌癥患者。
進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)阿片樣物質(zhì)和阿片樣物質(zhì)模擬物可以戰(zhàn)勝癌癥細(xì)胞的凋亡抗性，因此可以有效地在臨床上用作抗癌物質(zhì)。特別地，最令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)阿片樣物質(zhì)，特別是美沙酮，對(duì)非抗性(即敏感性)白血病細(xì)胞的效果與常規(guī)化學(xué)療法(例如多柔比星)和輻射治療相同，并且正常外周血淋巴細(xì)胞在治療后存活。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，阿片樣物質(zhì)也可有效地殺死腫瘤細(xì)胞，但基本上不影響患者的正常健康細(xì)胞。 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“阿片樣物質(zhì)”被定義為一組在化學(xué)上不同的天然、合成或半合成物質(zhì)，起激動(dòng)或拮抗的作用，全部可以結(jié)合于已知的阿片受體，優(yōu)選結(jié)合于μ 阿片受體并且能夠阻止癌細(xì)胞增殖。阿片樣物質(zhì)組包括天然阿片，諸如生物堿，如嗎啡、二氫可待因、可待因和蒂巴因，以及衍生自天然麻醉劑(opiate)的半合成阿片(例如氫嗎啡酮、氫可酮、羥考酮、羥嗎啡酮、二氫脫氧嗎啡、二乙酰嗎啡(海洛因)、尼可嗎啡、二丙?；鶈岱?dipropanoylmorphine)、芐嗎啡和乙基嗎啡)，或全合成阿片樣物質(zhì)，諸如芬太尼、哌替啶和美沙酮、曲馬多或右丙氧芬。還包括內(nèi)源性阿片肽，其是可以在體內(nèi)天然生成的內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽或腦啡肽，也可以被合成。已知阿片樣物質(zhì)用作鎮(zhèn)痛劑。事實(shí)上以前已知阿片受體，特別是μ阿片受體參與導(dǎo)致凋亡的信號(hào)通路的活化(Polakiewicz等人，1998)。在過(guò)去的十年中，發(fā)現(xiàn)阿片樣物質(zhì)可以促進(jìn)凋亡(Hatsukari等人，2003)。進(jìn)一步討論了使用阿片樣物質(zhì)在小肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(Heusch&Maneckjee 1999)。然而，潛在的機(jī)制并未揭示，那些結(jié)果也未顯示應(yīng)用阿片樣物質(zhì)克服對(duì)常規(guī)抗癌治療的抗性。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，阿片樣物質(zhì)能夠抑制癌細(xì)胞增殖和/或生長(zhǎng)。該活性包括，例如細(xì)胞抑制(cytostatic)或細(xì)胞毒活性以及細(xì)胞和/或腫瘤生長(zhǎng)阻滯活性。癌細(xì)胞增殖是細(xì)胞分化抑制的結(jié)果。特別地，阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物誘導(dǎo)腫瘤中的細(xì)胞死亡。本發(fā)明上下文中的細(xì)胞死亡包括所有類型的細(xì)胞死亡。這可以包括壞死性以及凋亡性細(xì)胞死亡或自吞噬。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞死亡由半胱天冬酶依賴性或半胱天冬酶非依賴性通路的活化而誘導(dǎo)。然而，阿片樣物質(zhì)可以通過(guò)多種通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿片樣物質(zhì)在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。一般而言，已知可以通過(guò)兩種主要的生物化學(xué)通路誘導(dǎo)凋亡?！八劳鍪荏w通路”(或外源性通路)包括TNF-受體誘導(dǎo)(腫瘤壞死因子)的模型和Fas-受體誘導(dǎo)的模型(Fas-受體還被稱作Apo-I或⑶95)。結(jié)合于這些受體導(dǎo)致細(xì)胞中形成死亡-誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括半胱天冬酶_8的活化?！熬€粒體通路”(或內(nèi)源性通路)涉及細(xì)胞色素c從線粒體中釋放，與Apaf-I結(jié)合以及前-半胱天冬酶_9活化。已知數(shù)種調(diào)節(jié)劑可活化或滅活凋亡通路， 諸如促凋亡蛋白Bax和Bak或抗凋亡蛋白Bcl_2、Bcla或XIAP。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“阿片樣物質(zhì)模擬物”被定義為這樣的物質(zhì)，該物質(zhì)能夠在癌細(xì)胞中直接或間接誘導(dǎo)基本上與阿片樣物質(zhì)相同效應(yīng)，特別是鑒于阿片樣物質(zhì)與阿片受體(例如μ受體)結(jié)合和/或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，尤其是通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)。 術(shù)語(yǔ)“阿片樣物質(zhì)模擬物”還包括導(dǎo)致阿片受體超表達(dá)的物質(zhì)，諸如，例如可卡因，以及以此間接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的物質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物通過(guò)下述一種或多種機(jī)制誘導(dǎo)凋亡i.切割腫瘤細(xì)胞中的半胱天冬酶-3和PARPii.切割半胱天冬酶-9并下調(diào)XIAPiii.下調(diào) BcIxl根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，阿片樣物質(zhì)是美沙酮組的成員，包括D-/L-美沙酮、左美沙酮、左旋乙酰美沙酮和哌腈米特。這些阿片樣物質(zhì)均能作為鹽使用。D-/ L-美沙酮的外消旋形式優(yōu)選以鹽酸鹽的形式提供。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿片樣物質(zhì)美沙酮在癌細(xì)胞中通過(guò)線粒體通路誘導(dǎo)凋亡。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“抗性”、“輻射抗性”或“化學(xué)抗性”被定義為癌細(xì)胞對(duì)至少一種常規(guī)癌癥療法，即抗癌藥物或放射療法的敏感性降低?；加写祟惏┌Y的患者被確定為“抗性”癌癥患者。由于抗性可以是內(nèi)在性的或獲得性的，因此所觀察的敏感性的降低是與完全敏感的“正?！卑┘?xì)胞比較，所述“正常”癌細(xì)胞與治療開始時(shí)初始敏感性相比對(duì)所應(yīng)用的治療有效量抗癌藥物和/或放射有響應(yīng)。在后一種情況中，抗性表現(xiàn)為相同劑量(放射或抗癌藥物)下腫瘤消退的量減少或等量腫瘤消退所需要的劑量增加。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物用于治療表現(xiàn)出一種或多種下述抗性的癌癥患者〇凋亡抗性〇多重抗藥性〇抗癌藥物抗性〇細(xì)胞毒性藥物抗性〇對(duì)活性氧類別的抗性〇對(duì)DNA損傷劑的抗性〇對(duì)毒性抗體的抗性〇多柔比星抗性〇單一或交叉抗性，特別是對(duì)一種或多種下述藥品的抗性甲氨蝶呤、阿糖胞苷、 順鉬、依托泊苷、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇(泰素)、卡鉬、替尼泊苷、地塞米松、潑尼松龍、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、巰嘌呤、氟達(dá)拉濱、5-氟尿嘧啶〇放射抗性(例如α、β、Y或俄歇電子)因此，在本發(fā)明的上下文中“抗性”可以是全部的或部分的；換言之，根據(jù)本發(fā)明認(rèn)為可以治療的患者可以表現(xiàn)出對(duì)常規(guī)抗癌治療敏感性降低或甚至完全缺乏敏感性。這些患者還可以被定義為“無(wú)應(yīng)答者”或“應(yīng)答差者”。“抗性”癌癥或腫瘤的進(jìn)一步的同義詞是“難治”型癌癥，其可以是完全或部分難治的。內(nèi)在性抗性因此還可以被確定為“原發(fā)性難治性癌癥”。一種特殊形式的難治性或抗性癌癥細(xì)胞是所謂的“動(dòng)態(tài)難治性細(xì)胞”；這是一種已知例如來(lái)白血病細(xì)胞的現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞首次被殺死后可迅速?gòu)?fù)發(fā)以至于幾乎不可能獲得有效的治療。如本發(fā)明上下文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“常規(guī)”治療或療法是指基于過(guò)去的研究結(jié)果和 /或法規(guī)批準(zhǔn)，目前公認(rèn)的并廣泛使用的對(duì)于確定類型癌癥的治療。常規(guī)抗癌藥物包括可以殺死癌癥細(xì)胞或減少和/或停止其生長(zhǎng)或增殖的細(xì)胞毒和細(xì)胞抑制劑。這些抗癌藥物的作用模式可以不同；實(shí)例包括抗代謝劑(例如阿糖胞苷、甲氨蝶呤、巰嘌呤或氯法拉濱)、DNA交聯(lián)劑(例如順鉬及其衍生物)、DNA嵌入物 (intercalating substance)(例如多柔比星)、拓?fù)洚悩?gòu)酶毒劑(例如依托泊苷)、激酶抑制劑(例如西妥昔單抗)、留類(steroids)(例如地塞米松)或有絲分裂抑制劑(例如長(zhǎng)春新堿)。一個(gè)白血病常規(guī)抗癌治療的實(shí)例是給予多柔比星。常規(guī)放療還可以包括放射療法，S卩，使用來(lái)自X-射線，α、β、Y射線，俄歇電子， 紫外線，中子，質(zhì)子和其他輻射源的高能輻射殺死癌細(xì)胞和使腫瘤萎縮。輻射可以源自身體外部的設(shè)施(外線束放射療法)或其可以源自放置在身體內(nèi)部癌細(xì)胞附近的輻射源(內(nèi)部放射療法)。全身性放射療法使用能夠在血流中移動(dòng)至靶組織的放射性物質(zhì)，諸如放射標(biāo)記的單克隆抗體。輻射抗性癌細(xì)胞對(duì)這些治療無(wú)響應(yīng)或僅有部分響應(yīng)。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，使用阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物克服或“破壞”癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)抗癌治療和/或放射治療的內(nèi)在性抗性或獲得性抗性或凋亡抗性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明認(rèn)為可治療的癌細(xì)胞表達(dá)阿片受體，特別是μ 阿片受體。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，癌癥包括但不限于白血病、乳腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、 前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、腦癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌。根據(jù)本發(fā)明認(rèn)為可治療的對(duì)放射具有內(nèi)在性抗性的癌癥類型的實(shí)例為成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、黑素瘤或胰腺癌細(xì)胞。乳腺癌、膀胱癌或白血病通常對(duì)化學(xué)療法有抗性。常常獲得抗性的癌癥類型的實(shí)例為黑色素瘤、結(jié)腸癌、腦瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腦癌、胰腺癌、肝癌、卵巢癌、乳房癌、肺癌、慢性白血病或骨肉瘤(osteosarkoma)。在本發(fā)明一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物可以與常規(guī)抗癌物質(zhì)或治療，例如細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒物質(zhì)或放療聯(lián)用，即作為合成物(composite)使用。例如阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物可以與天然和/或合成抗癌物質(zhì)、天然和/或合成細(xì)胞毒物質(zhì)、抗生素、細(xì)胞毒抗體、激素、精神藥物、天然或基因修飾的有機(jī)體以及來(lái)自有機(jī)體的物質(zhì)(例如植物、微生物、水果)、治療疼痛的物質(zhì)和/或不同種類的與底物(例如抗體)結(jié)合或未結(jié)合的輻射聯(lián)用?；颊呖梢詫?duì)該治療有抗性或無(wú)抗性?！昂铣晌铩笔侵负兄委熡行Я康母鶕?jù)本發(fā)明定義的阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物(組分A)和至少一種其它的抗癌物質(zhì)(組分B)的藥物制劑。該“合成物”可以由單一組合物或至少兩種組合物構(gòu)成，可以同時(shí)或相繼給予患者。上述物質(zhì)優(yōu)選與美沙酮組合使用。本發(fā)明的合成物可有利的用于癌細(xì)胞的有效治療，其原因在于與單一組合物相比，其可以表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。特別地，合成物具有美沙酮作為組分A，并且下述藥劑之一可能作為組分B 甲氨蝶呤、阿糖胞苷、順鉬、依托泊苷、長(zhǎng)春新堿。此外，組合治療還可能包括放射治療。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，阿片樣物質(zhì)用于治療抗性或敏感性非實(shí)體癌癥，即影響血液、骨髓和淋巴結(jié)的全部惡性血液病，包括急性成淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和所有白血病的前體形式(pro-form)、毛樣細(xì)胞白血病(hairy cell leukaemia)、霍奇金病、非-霍奇金病、多發(fā)性骨髓瘤。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 使用美沙酮處理白血病細(xì)胞，特別是處理常規(guī)療法中常規(guī)抗癌藥物未能殺死的白血病細(xì)胞。藥物和試劑每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)臨用前將D，L-美沙酮鹽酸鹽(美沙酮，Sigma, Taufkirchen，Germany) 溶解于無(wú)菌蒸餾水中確保制劑的恒定質(zhì)量。細(xì)胞培養(yǎng)人髓性白血病細(xì)胞系HL-60和人成淋巴細(xì)胞白血病T-細(xì)胞系CEM在37 °C和 5% CO2 條件下生長(zhǎng)于含有 10%胎牛血清(Biochrom，Berlin, Germany)、pH 7. 3 的 IOmM HEPES (Biochrom)、100U/mL 青霉素(GIBCO)、100 μ g/mL 鏈霉素(GIBCO)和 2mM L-谷氨酰胺 (Biochrom)的 RPMI 1640 (GIBC0, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)中。CEMcd95k 對(duì) 1 μ g/ mL 抗-CD95 (Friesen 等人，1996)有抗性，CEMdoxoe 對(duì) 0. 1 μ g/mL 多柔比星(Friesen 等人， 2004)有抗性。CEMqi95k是凋亡抗性的并且具有多重抗藥性。CEMqi95k對(duì)諸如甲氨蝶呤、阿糖胞苷、順鉬、依托泊苷和長(zhǎng)春新堿的數(shù)種抗癌藥以及Y-和β-放射有交叉抗性(Friesen 等人，1996，Los等人，1997，F(xiàn)riesen等人，2007)。本研究中使用的所有細(xì)胞系均不含支原體。誘導(dǎo)凋亡在15011^培養(yǎng)瓶或96孔板中用30、20、15、1(^11美沙酮處理白血病細(xì)胞(IXlO5 個(gè)細(xì)胞/mL)。24h和48h后，如文獻(xiàn)所述通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量凋亡的定量(Carbonari等人， 1994，F(xiàn)riesen等人，2003)。簡(jiǎn)言之，為測(cè)定凋亡，如Nicoletti等(1991)所述用含有0. 1% 檸檬酸鈉加0. Triton X-100和50 μ g/mL碘化丙啶的Nicoletti緩沖液裂解細(xì)胞。 通過(guò)亞二倍體DNA(subGl)或FSC/SSC分析測(cè)定凋亡細(xì)胞百分比(Nicoletti等人，1991， Carbonari 等人，1994)。通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)分析被碘化丙啶(PI)染色的核或細(xì)胞的前向散射/側(cè)向散射(FSC/SSC)圖。分離外周血淋巴細(xì)胞從健康人的新鮮血液中分離外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)。在96孔板中用30、20、15、 10 μ M美沙酮處理PBLs (ImL中含有1 X IO6個(gè)細(xì)胞)。24h和48h后如文獻(xiàn)描述通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡進(jìn)行定量(Carbonari等人，1994)。抑制美沙酮誘導(dǎo)的通過(guò)zVAD. fmk的半胱天冬酶的活化如以前文獻(xiàn)的描述進(jìn)行半胱氨酸酶活化抑制實(shí)驗(yàn)(Friesen等人，2007)。簡(jiǎn)言之，使用濃度為50ymol/L的半胱氨酸酶廣譜三肽抑制劑zVAD. fmk(苯甲酰基羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮，Enzyme Systems Products,Dubli,USA) 美沙酮處理前 Ih 用 zVAD. fmk預(yù)孵育HL-60和CEM細(xì)胞。24h和48h后通過(guò)亞二倍體DNA (subGl)或FSC/SSC分析測(cè)定凋亡細(xì)胞百分比。通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)分析被碘化丙啶(PI)染色的核(Nicoletti等人，1991)或細(xì)胞的前向散射/側(cè)向散射(FSC/SSC)圖(Carbonari 等人，1994)。蛋白質(zhì)印跡分析如文獻(xiàn)所述進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析(Friesen等人，2004，F(xiàn)riesen等人，2003)。使用兔抗-PARP多克隆抗體(1 5000，如(1^)、小鼠-抗-半胱天冬酶-3單克隆抗體(1 1000，Cell-Signalling)、小鼠-抗-半胱天冬酶-8 單克隆抗體(1 1000，Cell-Signalling)、 兔-抗-活性-半胱天冬酶-9多克隆抗體(1 1000，Cell-Signalling)、小鼠-抗-XIAP 單克隆抗體(1 1000, Transduction-Laboratories, Lexington, Kentucky)、小 - ^L -Fas( -CD95) 胃■㈱ # (1 1000， Transduction-Laboratories) > /]、 鼠-抗-Fas配體(抗-CD95-配體)單克隆抗體(1 250，BD, Pharmingen)、兔-抗-Bax 多克隆抗體(1 250，Oncogene，Cambridge)、兔- 抗-Bcl-Xs/L 多克隆抗體(1 1000， Santa-Cruz-Biotechnology, Santa-Cruz, CA)、兔—抗 _p21 多克隆抗體(1 1000, Santa-Cruz)和小鼠抗-β -肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(Sigma)對(duì)PARP、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-8、XIAP、CD95、CD95-L、BaX、Bcl-XL和β _肌動(dòng)蛋白進(jìn)行免疫檢測(cè)。以過(guò)氧化物酶-結(jié)合的山羊-抗-小鼠IgG或過(guò)氧化物酶-結(jié)合的山羊-抗-兔IgG(l 5000， Santa-Cruz)作為第二抗體用于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL，Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)。通過(guò)檢測(cè)β _肌動(dòng)蛋白控制蛋白的等量上樣。美沙酮通過(guò)凋亡在CEM和HL-60細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷而在非白血病PBLs中無(wú)毒性效應(yīng)研究顯示抗癌藥物在白血病和實(shí)體瘤中誘導(dǎo)凋亡并抑制增殖 (Kaufmann&Earnshaw 2000)。因此，分析與已知的確定的抗癌藥物相比，治療用阿片樣藥物美沙酮是否能夠在人成淋巴細(xì)胞白血病T-細(xì)胞系CEM和人髓性白血病細(xì)胞系HL-60中抑制增殖并引起凋亡(圖1A，B)。用不同濃度美沙酮(30、20、15、10μΜ)處理24h和48h后， 在CEM和HL-60細(xì)胞中檢測(cè)到強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)(圖1A)和強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制(圖1B)。然后分析美沙酮是否也在非白血病外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)中誘導(dǎo)凋亡(圖1C)。用不同濃度美沙酮 (30、20、15、10μ M)孵育分離的PBLs。美沙酮處理24h和48h后發(fā)現(xiàn)與在處理諸如CEM的白血病細(xì)胞中使用的美沙酮濃度相當(dāng)?shù)臐舛炔荒軞⑺繮BLs(圖1C)。這證明美沙酮在白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡而對(duì)非白血病細(xì)胞無(wú)毒性效應(yīng)。美沙酮破壞白血病細(xì)胞中的多柔比星抗性、⑶95-抗性和多重抗藥性對(duì)抗癌藥物的抗性是治療白血病和腫瘤患者的限制性因素(Bergman&Harris 1997，F(xiàn)riesen等人，2003)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)美沙酮表現(xiàn)出強(qiáng)效的抗白血病活性并有效殺死白血病細(xì)胞。因此，分析美沙酮是否也可以在具有凋亡抗性的多柔比星抗性白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。用不同濃度的美沙酮(30、20、15、10μΜ)處理多柔比星抗性CEM白血病細(xì)胞 (CEMd_k)。美沙酮處理24h和48h后，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞死亡。用30、20、15μΜ美沙酮處理后，在多柔比星抗性細(xì)胞CEMD°X°K中測(cè)定出強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)，與在敏感性白血病細(xì)胞 CEM中觀察到的相似(圖2)，說(shuō)明美沙酮克服多柔比星抗性和凋亡抗性。然后分析美沙酮是否也可以殺死具有多重抗藥性的白血病細(xì)胞。因此用不同濃度美沙酮(30、20、15、10 μ Μ)處理⑶95-抗性白血病細(xì)胞CEMgd95k,其對(duì)多種藥物有抗性，諸如依托泊苷、順鉬、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、多柔比星、長(zhǎng)春新堿。用30、20、15 4 11美沙酮處理241! 和48h后，在CD95-抗性白血病細(xì)胞CEMgd95k中測(cè)定出強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)，與在敏感性白血病細(xì)胞 CEM中觀察到的相似(圖2)。這表明美沙酮不僅在敏感性白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，還可殺死常規(guī)抗癌藥物未能殺死的多柔比星抗性白血病細(xì)胞和CD95-抗性白血病細(xì)胞(Friesen 等人，1996，Los 等人，1997)。美沙酮在敏感性的、多柔比星抗性、⑶95-抗性和多重抗藥性白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)半胱天冬酶依賴性細(xì)胞死亡并活化線粒體 美沙酮在敏感性和抗性白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡而分子機(jī)制未知。因此要在白血病細(xì)胞中檢測(cè)其機(jī)制和可能在美沙酮引起的細(xì)胞死亡中被改變的效應(yīng)物分子。半胱天冬酶在抗癌藥物誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Kaufmarm&Earnshow 2000， Hengartner 2000)。因此使用蛋白質(zhì)印跡分析法檢測(cè)美沙酮在HL-60和CEM白血病細(xì)胞、具有凋亡抗性的多柔比星抗性白血病細(xì)胞CEMdmtok、具有多重抗藥性和凋亡抗性的⑶95-抗性白血病細(xì)胞CEMqi95k中是否活化半胱天冬酶。用不同濃度美沙酮(20、15μΜ)處理后，HL-60 和CEM白血病細(xì)胞(圖3A)、以及多柔比星抗性白血病細(xì)胞CEMD°x°KjP⑶95-抗性白血病細(xì)胞CEMgd95k(圖3B)中半胱天冬酶_3和PARP被切割?？拱┧幬锟稍诎籽〖?xì)胞中誘導(dǎo)半胱天冬酶-8的活化，美沙酮處理后未見其活化。為研究美沙酮在半胱天冬酶活化中的關(guān)鍵作用，用廣譜半胱天冬酶抑制劑zVAD. fmk預(yù)孵育CEM和HL-60細(xì)胞。用zVAD. fmk孵育幾乎完全抑制美沙酮-誘導(dǎo)的凋亡(圖3C)，說(shuō)明半胱天冬酶在美沙酮-誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究已經(jīng)顯示抗癌藥物在白血病和腫瘤細(xì)胞中活化線粒體通路和配體/受體通路(Kaufmann&Earnshow 2000)。研究線粒體是否在美沙酮誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮作用。用不同濃度美沙酮(20、15μΜ)處理CEM、HL-60、多柔比星-抗性白血病細(xì)胞CEMd_k 和CD95-抗性白血病細(xì)胞CEMcd95e(圖4)。24h和48h后，在HL-60和CEM白血病細(xì)胞(圖 4A)、以及多柔比星-抗性白血病細(xì)胞CEMd°x°k*⑶95-抗性白血病細(xì)胞CEMqi95k中可見強(qiáng)的半胱天冬酶-9切割(37kDa片段)和強(qiáng)的半胱天冬酶抑制蛋白XIAP(X-連接的凋亡抑制蛋白)下調(diào)(圖4B)。通過(guò)促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族成員調(diào)節(jié)線粒體的改變。用不同濃度美沙酮(20、 15 μ M)處理24h和48h后，在HL-60和CEM白血病細(xì)胞(圖4A)、以及多柔比星-抗性白血病細(xì)胞CEMd_k和⑶95-抗性白血病細(xì)胞CEMgd95k中可見強(qiáng)的下調(diào)(圖4B)。美沙酮處理后在白血病細(xì)胞中未見Bax上調(diào)。更進(jìn)一步地，抗癌藥物已經(jīng)顯示上調(diào)的死亡_誘導(dǎo)配體和死亡_誘導(dǎo)受體，諸如 CD95，在美沙酮處理后的白血病細(xì)胞中未見上調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。這說(shuō)明美沙酮在敏感性以及抗性白血病細(xì)胞中通過(guò)直接活化內(nèi)源性線粒體通路誘導(dǎo)凋亡。實(shí)施例2 美沙酮在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡成膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最具侵略性并且最常見的原發(fā)性腦部腫瘤。已知成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法和放射有高度抗性。治療可以涉及化學(xué)療法和放療，但僅為緩解性措施，而無(wú)法治愈。此外，很多藥物無(wú)法穿過(guò)血腦屏障，因此在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療中無(wú)效。美沙酮能夠穿過(guò)血腦屏障。檢測(cè)了美沙酮對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的效應(yīng)。更進(jìn)一步地，檢測(cè)了美沙酮與治療濃度的多柔比星聯(lián)用對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的效應(yīng)。人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系A(chǔ)172生長(zhǎng)于37°C、5% 0)2條件下，含有10%胎牛血清(Biochrom，Berlin，Germany)、pH 7.3 的 IOmMHEPES(Biochrom)、100U/mL 青霉素(Invitrogen)、100 μ g/mL 鏈霉素(Invitrogen)和 2mM L-谷氨酰胺(Biochrom)的 DMEN(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中。在美沙酮處理前，將成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞以7000 個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種，接種24h后處理細(xì)胞。在75cm2培養(yǎng)瓶中，用30、20 μ g/mL美沙酮處理成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞A172 (7000個(gè)細(xì)胞/cm2)。120h、144h、168h后，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量。為測(cè)定凋亡，用含有0. 1 % 檸檬酸鈉加0. 1% TritonX-IOO和50 μ g/mL碘化丙啶的Nicoletti緩沖液裂解細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析碘化丙啶(PI)染色的核(FACSCalibur，Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)。

120h、144h、168h后，通過(guò)亞二倍體DNA分析測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比。如下計(jì)算特定的細(xì)胞死亡百分比100X (細(xì)胞培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)性死亡細(xì)胞(％ )-自發(fā)性死亡細(xì)胞(％ ))/ (100%-培養(yǎng)基中自發(fā)性死亡細(xì)胞(％))。20 μ g/mL美沙酮處理120h后導(dǎo)致超過(guò)20%細(xì)胞死亡，168h后導(dǎo)致超過(guò)80%細(xì)胞死亡。30 μ g/mL美沙酮處理120h后導(dǎo)致超過(guò)85%細(xì)胞死亡，168h后導(dǎo)致接近100%細(xì)胞死亡(圖5)。在三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。這證明美沙酮在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)高比例的凋亡。實(shí)施例3 在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中美沙酮與多柔比星聯(lián)用顯示出協(xié)同誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)用治療濃度的0. 1 μ g/mL多柔比星(多柔比星，白色柱)、低濃度的1 μ g/mL美沙酮(美沙酮，黑色柱)、和0. 1 μ g/mL多柔比星加1 μ g/mL美沙酮(多柔比星+美沙酮， 陰影柱)處理成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞A172 (7000個(gè)細(xì)胞/cm2)。72h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量。為測(cè)定凋亡，用含有0. 枸櫞酸鈉加0. Trion X-100和50 μ g/mL碘化丙啶的Nicoletti-緩沖液裂解細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)分析被碘化丙啶(PI)染色的核。治療濃度的多柔比星與低濃度美沙酮聯(lián)用對(duì)受試的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞有強(qiáng)的凋亡效應(yīng)(圖6)。該測(cè)定表明美沙酮與其他化學(xué)療法藥物，此處為多柔比星聯(lián)用時(shí)顯示出協(xié)同效應(yīng)。實(shí)施例4 用可卡因在白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡用1000 μ g/mL可卡因處理CEM (白色柱)和HL_60(黑色柱)細(xì)胞。48h后通過(guò)亞二倍體DNA分析測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比。如下計(jì)算特殊的細(xì)胞死亡百分比100 X (培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)性死亡細(xì)胞(％)_自發(fā)性死亡細(xì)胞(％))/(100%_培養(yǎng)基中自發(fā)性死亡細(xì)胞(％))。 數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定的平均值，其具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。如圖7所示，結(jié)果表明可卡因能夠在CEM細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。實(shí)施例5 單獨(dú)用D，L-美沙酮或聯(lián)用氟達(dá)拉濱在從患者活體內(nèi)分離出的癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡從患者活體內(nèi)分離出B-ALL(B-細(xì)胞淋巴性白血病)和CLL(慢性淋巴性白血病) 細(xì)胞。用不同濃度的D，L-美沙酮或D，L-美沙酮加氟達(dá)拉濱處理這些細(xì)胞。在第一項(xiàng)研究中，用30、20、15、10μΜ美沙酮處理B-ALL(B-細(xì)胞淋巴性白血病) 細(xì)胞(50000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。48h和72h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。結(jié)果顯示 10 μ M美沙酮足以在處理72h的細(xì)胞中誘導(dǎo)高至超過(guò)80%的凋亡(見圖8)。在第二項(xiàng)研究中，單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5,0. 3和0. 1 μ g/mL美沙酮或添加 0. 1 μ M氟達(dá)拉濱處理CLL (慢性淋巴性白血病)細(xì)胞(50000個(gè)細(xì)胞/200 μ 1)。24h和48h 后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。結(jié)果顯示3 μ g/mL美沙酮與0. 1 μ M氟達(dá)拉濱聯(lián)用在 24h后即可在100%細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(見圖9)。
在第三項(xiàng)研究中，單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5,0. 3和0. 1 μ g/mL美沙酮或添加 0. 1 μ M氟達(dá)拉濱處理CLL (慢性淋巴性白血病)細(xì)胞(50000個(gè)細(xì)胞/200 μ 1)。24h和48h 后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。結(jié)果顯示3 μ g/mL美沙酮與0. 1 μ M氟達(dá)拉濱聯(lián)用在 48h后即可在接近50%細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。30 μ g/mL美沙酮與0. 1 μ M氟達(dá)拉濱聯(lián)用時(shí)，48h 后可在超過(guò)90%細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(見圖10)。因 此，這些研究顯示在從患者活體內(nèi)分離出的癌細(xì)胞中美沙酮單用或與細(xì)胞抑制劑聯(lián)用是成功的。實(shí)施例6 丁丙諾啡與多柔比星聯(lián)用在白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡在體外HL-60白血病細(xì)胞中成功地使用丁丙諾啡與多柔比星聯(lián)用誘導(dǎo)凋亡。丁丙諾啡是半合成的阿片樣物質(zhì)藥物，也用作鎮(zhèn)痛劑。它是部分μ-阿片受體激動(dòng)劑。單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5,0. 3,0. 1 μ g/mL 丁丙諾啡或聯(lián)用 0. 003 μ g/mL 或 0. 001 μ g/mL多柔比星處理人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞系(5000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。144h 或168h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。結(jié)果顯示144h后20μ g/mL 丁丙諾啡足以在超過(guò)90%細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。加入 0. 003 μ g/mL多柔比星可獲得同樣的結(jié)果。10 μ g/mL 丁丙諾啡與0. 003 μ g/mL多柔比星聯(lián)用并孵育細(xì)胞168h后可在接近100%的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(見圖13)。實(shí)施例7 使用芬太尼與多柔比星聯(lián)用在白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡在體外CEM白血病細(xì)胞中成功地使用芬太尼與多柔比星聯(lián)用誘導(dǎo)凋亡。芬太尼是合成的阿片樣物質(zhì)，常作為鎮(zhèn)痛劑用于治療癌癥疼痛。芬太尼是μ型阿片受體激動(dòng)劑。單獨(dú)用30、10、5、3、1、0. 5、0. 3、0. 1 μ g/mL 芬太尼或添加 0. 02 μ g/mL 多柔比星處理人T-細(xì)胞白血病CEM細(xì)胞系(10000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。48h和72h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。結(jié)果顯示30 μ g/mL芬太尼與0. 02 μ g/mL多柔比星聯(lián)用時(shí)，72h后芬太尼在超過(guò) 85%的細(xì)胞中成功誘導(dǎo)凋亡(見圖14)。實(shí)施例8 使用嗎啡在白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡在HL-60白血病細(xì)胞中單獨(dú)用嗎啡或聯(lián)用多柔比星成功地誘導(dǎo)凋亡。嗎啡是目前作為鎮(zhèn)痛劑用于治療癌癥疼痛的麻醉劑。嗎啡是μ型阿片受體激動(dòng)劑。在第一項(xiàng)研究中，用30、10、5、3、1、0. 5,0. 3,0. 1,0. 03,0. 01 μ g/mL 嗎啡處理人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞(5000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。120h或144h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。結(jié)果顯示應(yīng)用40 μ g/mL嗎啡144h后在40%細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(見圖15)。在第二項(xiàng)研究中，用1、0. 5,0. 3,0. 1,0. 03,0. 01 μ g/mL嗎啡處理人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞(5000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。96h、120h、144h和168h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量。結(jié)果顯示應(yīng)用1 μ g/mL嗎啡168h后在超過(guò)50%細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(見圖16)。在第三項(xiàng)研究中，單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5,0. 3,0. 1 μ g/mL嗎啡或添力口 0. 003 μ g/mL或0. 001 μ g/mL多柔比星處理人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞(5000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。168h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。結(jié)果顯示應(yīng)用1 μ g/mL嗎啡與 0. 001 μ g/mL多柔比星聯(lián)用可在50%細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(見圖17)。因此，如這些研究所示，麻醉劑和μ受體激動(dòng)劑嗎啡可用于在白血病細(xì)胞中成功地誘導(dǎo)凋亡。
下述在本文中引用的文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文Bergmann JP, Harris D. Radioresistance, chemoresistance and apoptosis resistance. Radiation Oncology 1997 ；27 :47-57·Carbonari M， Cibati M， Cherchi M， etal.Detection and characterization of apoptotic peeipheral blood lymphocytes in human immunodeficiency virus-infection and cancer chemotherapy by a novel flow immunocytometric method. Blood 1994 ；83 1268-77.Friesen C，Glatting G，Koop B，et al· Breaking chemo-and radioresistance with [213Bi] anti~CD45 antibodies in leukaemia cells. Cancer Res 2007 ；67 (5) 1950-8.Friesen C, Herr LKrammer PHiDebatin KM. Involvement of the CD95(AP0-1/ FAS)receptor/1igand system in drug-induced apoptosis in leukaemia cells. Nat Med 1996 ；2 (5) 574-7.Friesen C，Kiess Y，Debatin KM. A critical role of glutathione in deterninin gapoptosis sensitivity and resistance in leukaemia cells. Cell Death Differ 2004 ;11 (Suppl 1) :S73-85.Friesen C， Lubatschofski A， Kotzerke J， Buchmann I， Reske SN, Debatin KM. Beta-irradiation used forsystemic radioimmunotherapy induces apoptosis and activates apoptosis pathways in leukaemia cells. Eur J Nucl Med 2003 ；30 1251-61.Hatsukari I，Hitosugi N，Matsumoto I，Nagasaka H，Sakagami H. Induction of early apoptosis marker by morphine in human lung and breast carcinoma cell lines.Anticancer Res. 2003May-Jun ；23(3B) :2413_7.Hengartner M0. Thebiochemistry of apoptosis. Nature 2000 ；407 (6805) 770-6.Heusch WL, Maneckjee R.Effects of bombesin on methadone-induced apoptosis in lung cancer cells. Cancer Lett 1999;136:177-85·Kaufmann SH, Eamshaw WC. Induction of apoptosis by cancer therapy. Experimental Cell Research 2000 ；256 :42_9.Los M， Herr I， Friesen C， Fulda S， Schulze-Osthoff K， Debatin K-M. Cross-resistance of CD95-and drug-induced apoptosis as a consequence of deficient activation of caspases (ICE/Ced-3 proteases). Blood 1997 ；90 (8) 3118-29.Milas L，Raju U，Liao Z，Ajani J.Targeting molecular determinants of tumour chemo-radioresistance. Semin Oncol 2005 ；32 :78-8LNicoletti IiMigliorati GiPagliacci MCiGrignani FiRiccardi C. Arapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Meth 1991 ；139 :271-9.Polakiewicz RD, Schieferl SM, Gingras AC，Sonenberg N，Comb MJ. Mu-Opioidreceptor activates signalling pathways implicated in cell survival and translational control. J Biol Chem. 1998 S印 4;273(36) :23534_41.


圖1:圖1表明阿片樣物質(zhì)美沙酮在白血病細(xì)胞中有效地誘導(dǎo)凋亡，但不影響非白血病 的健康的PBL細(xì)胞。IA 用所示不同濃度的美沙酮處理CEM和HL-60細(xì)胞。24h(白色條)和48h (黑色條)后通過(guò)亞二倍體DNA分析測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比。如下計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比100X (培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)性死亡細(xì)胞(％)_自發(fā)性死亡細(xì)胞(％))/(100%_培養(yǎng)基中自發(fā)性死亡細(xì)胞 (%))。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定的平均值，其具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。IB 用所示不同濃度的美沙酮處理CEM和HL-60細(xì)胞(2X IO5個(gè)細(xì)胞/mL)或未作處理(Co，對(duì)照)。0h(白色條)、24h(黑色條)以及48h(陰影條)后，計(jì)數(shù)ImL中的細(xì)胞數(shù)。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定的平均值，其具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。IC 用所示不同濃度美沙酮處理CEM細(xì)胞(黑色條)和PBLs (白色條)。24h和 48h后通過(guò)亞二倍體DNA分析測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比。用如圖IA中的方法計(jì)算特定細(xì)胞死亡的百分比。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定的平均值，其具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。圖2:圖2表明阿片樣物質(zhì)美沙酮在⑶95-抗性(CEMqi95k)和多柔比星-抗性(CEMD_K) 細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，其凋亡率與親代敏感性CEM白血病細(xì)胞相當(dāng)。用所示不同濃度美沙酮處理CEM(黑色條hCEM 5、白色條)和CEMD°X°K(陰影條) 白血病細(xì)胞。24h和48h后通過(guò)亞二倍體DNA分析測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比。用如圖IA中的方法計(jì)算特定細(xì)胞死亡的百分比。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定的平均值，其具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。圖3:圖3表明阿片樣物質(zhì)美沙酮在敏感性的(HL-60，CEM)、以及具有多重抗藥性和凋亡抗性的多柔比星-抗性(CEMd°x°k)和⑶95-抗性(CEMqi95k)白血病細(xì)胞中誘導(dǎo)半胱天冬酶依賴性死亡。3A 和3B 美沙酮在HL_60、CEM、CEMD°X°K和CEMqi95k細(xì)胞中誘導(dǎo)半胱天冬酶_3活化和PARP切割。用所示不同濃度的美沙酮處理A、HL-60、CEM、B、CEMd_k、CEMqi95k細(xì)胞或未做處理(對(duì)照)。24h和48h后進(jìn)行半胱天冬酶_3和PARP的蛋白質(zhì)印跡分析。檢測(cè)到半胱天冬酶-3的 19和17kDa活性片段以及PARP的 85kDa切割產(chǎn)物。用抗-β-肌動(dòng)蛋白抗體控制等量蛋白上樣。3C 在CEM和HL-60細(xì)胞中用zVAD. fmk抑制半胱天冬酶活化可阻斷美沙酮誘導(dǎo)的凋亡。用所示不同濃度的美沙酮在不含有(黑色條，培養(yǎng)基)或含有(白色條，50 μ Mz VAD. fmk) 50 μ Mz VAD. fmk的情況下處理CEM和HL-60細(xì)胞。48h后通過(guò)亞二倍體DNA分析測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比。用如圖IA中的方法計(jì)算特定細(xì)胞死亡的百分比。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定的平均值，其具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。圖4:圖4表明阿片樣物質(zhì)美沙酮在敏感性的(HL-60，CEM)、以及具有多重抗藥性和凋亡抗性的多柔比星-抗性(CEMd_k)和⑶95-抗性(CEMqi95k)白血病細(xì)胞中活化線粒體通路。4A和4B 美沙酮在HL_60、CEM、CEMD°X°K和CEMqi95k細(xì)胞中誘導(dǎo)半胱天冬酶_9活化， 下調(diào) XIAP 和 Bc1-Xl。用所示不同濃度的美沙酮處理HL-60、CEM(4A)、CEMD_K、CEMcd95e細(xì)胞(4B)或未做處理(對(duì)照)。24h和48h后進(jìn)行半胱天冬酶_9、XIAP和Bel-、的蛋白質(zhì)印跡分析。檢測(cè)到半胱天冬酶_9的 37kDa活性片段、XIAP的 58kDa活性片段以及的 30kDa 活性片段。用抗肌動(dòng)蛋白抗體控制等量蛋白上樣。圖5:圖5表明阿片樣物質(zhì)美沙酮在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。用所述不同濃度的美沙酮處理Α172成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞。120h(白色柱)、144h(黑色柱)和168h(陰影柱)后通過(guò)亞二倍體DNA分析測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比。如下計(jì)算特殊的細(xì)胞死亡百分比100X (培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)性死亡細(xì)胞(％)_自發(fā)性死亡細(xì)胞(％))/(100%-培養(yǎng)基中自發(fā)性死亡細(xì)胞(％))。數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定的平均值，其具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。圖6:圖6表明使用治療濃度的多柔比星與低濃度美沙酮聯(lián)用可在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中成功地誘導(dǎo)凋亡。用治療濃度的0. 1 μ g/mL多柔比星(多柔比星，白色柱)、低濃度的1 μ g/mL美沙酮(美沙酮，黑色柱)、0. 1 μ g/mL多柔比星加1 μ g/mL美沙酮(多柔比星+美沙酮，陰影柱)處理成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞A172 (7000個(gè)細(xì)胞/cm2)。72h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。為測(cè)定凋亡，用含有0. 枸櫞酸鈉加0. Triton X-100和50 μ g/mL碘化丙啶的Nicoletti-緩沖液裂解細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)分析被碘化丙啶(PI)染色的核。圖7:圖7表明使用阿片樣物質(zhì)可卡因可在CEM細(xì)胞中成功的誘導(dǎo)凋亡。用1000 μ g/mL可卡因處理CEM (白色柱)和HL_60(黑色柱)細(xì)胞。48h后通過(guò)亞二倍體DNA分析測(cè)量凋亡細(xì)胞百分比。如下計(jì)算特殊的細(xì)胞死亡百分比100 X (培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)性死亡細(xì)胞(％ )_自發(fā)性死亡細(xì)胞(％ ))/(100% -培養(yǎng)基中自發(fā)性死亡細(xì)胞(％ ))。 數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測(cè)定的平均值，其具有低于10%的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得相似的結(jié)果。圖8:圖8表明D，L-美沙酮在從患者活體內(nèi)分離出的前體B-ALL(B-細(xì)胞淋巴性白血病)細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。用30、20、15、10 μ M美沙酮處理B-ALL (B-細(xì)胞淋巴性白血病)細(xì)胞(50000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。48h (黑色條)和72h (白色條)后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡定量測(cè)量。
圖9:
圖9表明D，L_美沙酮聯(lián)用氟達(dá)拉濱在從患者活體內(nèi)分離出的抗性CLL (慢性淋巴性白血病)細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5,0. 3,0. 1 μ g/mL美沙酮(白色條)或添加0. 1 μ M氟達(dá)拉濱(黑色條)處理CLL (慢性淋巴性白血病)細(xì)胞(50000個(gè)細(xì)胞/200 μ 1)。24h和48h 后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。圖 10 圖10表明D，L-美沙酮聯(lián)用氟達(dá)拉濱在從患者活體內(nèi)分離出的抗性CLL(慢性淋巴性白血病)細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5,0. 3,0. 1 μ g/mL美沙酮(白色條)或添加0. 1 μ M氟達(dá)拉濱(黑色條)處理CLL (慢性淋巴性白血病)細(xì)胞(50000個(gè)細(xì)胞/200 μ 1)。24h和48h 后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。圖 11 圖11顯示在體外多柔比星+美沙酮處理的人B細(xì)胞白血病細(xì)胞系Tanoue中誘導(dǎo)凋亡。單獨(dú)用30、10、5、3、lyg/mL美沙酮(白色條)或添加0. 03 μ g/mL多柔比星(黑色條)處理B-ALL (B-細(xì)胞淋巴性白血病)細(xì)胞系Tanoue (5000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。96h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。圖 12 圖12顯示在體外多柔比星+美沙酮處理的人B細(xì)胞前體白血病細(xì)胞系Nalm6中誘導(dǎo)凋亡。單獨(dú)用30、10、5、3、1 μ g/mL美沙酮(白色條)或添加0. 01 μ g/mL多柔比星(黑色條)處理B-ALL (B-細(xì)胞淋巴性白血病)細(xì)胞系Nalm6(5000個(gè)細(xì)胞/100μ 1)。96h、120h、 144h、168h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。圖 13 圖13顯示在體外多柔比星+ 丁丙諾啡處理的人急性髓性白血病細(xì)胞系HL-60中
誘導(dǎo)凋亡。單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5、0· 3、0. 1 μ g/mL 丁丙諾啡(白色條)或添加 0. 003 μ g/ mL或0. 001 μ g/mL多柔比星(黑色條)處理人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞系(5000個(gè)細(xì)胞 /100 μ 1)。144h或168h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。圖 14 圖14顯示在體外多柔比星+芬太尼處理的人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系CEM中誘導(dǎo)凋亡。單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5、0· 3、0. 1 μ g/mL 芬太尼(白色條)或添加 0. 02 μ g/mL 多柔比星(黑色條)處理人T細(xì)胞白血病CEM細(xì)胞系(10000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。48h或72h 后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。圖 15 圖15顯示在體外用嗎啡處理的人急性髓性白血病細(xì)胞系HL-60中誘導(dǎo)凋亡。用30、10、5、3、1、0· 5,0. 3,0. 1,0. 03,0. 01 μ g/mL 嗎啡處理人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞系(5000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。120h (白色條)或144h (黑色條)后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。圖 16 圖16顯示在體外用嗎啡處理的人急性髓性白血病細(xì)胞系HL-60中誘導(dǎo)凋亡。用1、0. 5、0. 3、0. 1、0. 03、0. 01 μ g/mL嗎啡處理人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞系 (5000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。96h (白色條)、120h (黑色條)、144h (陰影條)、168h (灰色條)后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。圖 17 圖17顯示在體外用多柔比星+嗎啡處理的人急性髓性白血病HL-60中誘導(dǎo)凋亡。單獨(dú)用30、10、5、3、1、0· 5,0. 3,0. 1μ g/mL 嗎啡(白色條)或添加 0. 003 μ g/mL (黑色條)或0. 001 μ g/mL多柔比星(灰色條)處理人急性髓性白血病HL-60細(xì)胞系(5000個(gè)細(xì)胞/100 μ 1)。168h后通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡定量測(cè)量。
權(quán)利要求
1.能夠抑制癌細(xì)胞增殖的阿片樣物質(zhì)在制備用于治療抗性癌癥患者的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述癌癥患者表現(xiàn)出至少一種選自下組的抗性凋亡抗性、化學(xué)抗性、輻射抗性。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求至少一項(xiàng)的用途，其中所述患者表現(xiàn)出內(nèi)在性抗性或獲得性抗性。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述患者表現(xiàn)出一種或多種下述抗性i.凋亡抗性ii.多重抗藥性iii.抗癌藥物抗性iv.細(xì)胞毒性藥物抗性v.對(duì)活性氧類別的抗性vi.對(duì)DNA損傷劑的抗性vii.對(duì)毒性抗體的抗性viii.多柔比星抗性ix.單一或交叉抗性，特別是對(duì)下述一種或多種藥品的抗性甲氨蝶呤、阿糖胞苷、順鉬、依托泊苷、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇(泰素)、卡鉬、替尼泊苷、地塞米松、潑尼松龍、環(huán)磷酰胺、 異環(huán)磷酰胺、多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、巰嘌呤、氟達(dá)拉濱、5-氟尿嘧啶X.放射抗性(例如α、β、Y或俄歇電子)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求至少一項(xiàng)的用途，其中所述患者患有下述一種癌癥白血病、腦癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌、乳房癌、肺癌、慢性白血病或骨肉瘤。
6.阿片樣物質(zhì)在制備用于治療選自下組的非實(shí)體瘤的藥物中的用途急性成淋巴細(xì)胞白血病、B-淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、白血病的前體形式、毛樣細(xì)胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求至少一項(xiàng)的用途，其中所述阿片樣物質(zhì)能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的線粒體凋亡通路。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途，其中所述阿片樣物質(zhì)能夠通過(guò)下列的至少一種反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡i.切割腫瘤細(xì)胞中的半胱天冬酶_3和PARP .切割半胱天冬酶_9并下調(diào)XIAP iii.下調(diào) BclXL。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求至少一項(xiàng)的用途，其中所述阿片樣物質(zhì)屬于美沙酮組。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求至少一項(xiàng)的用途，其中所述阿片樣物質(zhì)是D-/L-美沙酮的鹽酸鹽形式。
11.藥物制劑，包括治療有效量的阿片樣物質(zhì)(組分A)和至少另一種抗癌劑(組分B)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物制劑，其中所述組分A是美沙酮并且組分B選自甲氨蝶呤、 阿糖胞苷、順鉬、依托泊苷、長(zhǎng)春新堿、特別是多柔比星、α-粒子放射器放射、β放射、γ放射或俄歇電子放射。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到8中至少一項(xiàng)的用途，其中所述阿片樣物質(zhì)選自芬太尼、丁丙諾啡和嗎啡。
14.可卡因在制備用于治療抗性癌癥患者的藥物中的用途。
全文摘要
建議使用阿片樣物質(zhì)或阿片樣物質(zhì)模擬物制備用于治療抗性癌癥患者的藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102159212SQ200980136278
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日
發(fā)明者A·阿爾特, C·弗里森, E·米爾特納 申請(qǐng)人:烏爾姆大學(xué)