專利名稱：椎間盤的修復(fù)和/或重建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及個(gè)體中椎間盤修復(fù)和重建的方法，本發(fā)明的方法在治療特征為椎間盤 退變的脊柱疾病狀況中是有用的。
背景技術(shù)：
椎間盤(IVD)是人體內(nèi)最大的主要無血管、無神經(jīng)并且無淋巴的結(jié)構(gòu)。椎間盤對(duì) 于脊柱的正常功能至關(guān)重要，因?yàn)槠湓谳S向壓縮、彎曲和伸展中提供柔韌性和機(jī)械穩(wěn)定性。 IVD由數(shù)種特定的結(jié)締組織組成(i)軟骨終板(CEPs)的透明軟骨，所述軟骨終板覆蓋位于 椎間盤上方和下方的脊椎骨(體)的表面；(ii)封裝髓核(NP)的纖維軟骨纖維環(huán)(AF)；和 (iii)中央膠狀的髓核(NP)，盡管其含有軟骨樣細(xì)胞，但其不是透明軟骨。已經(jīng)鑒定出移行 區(qū)(TZ)，正如其名稱所指，其位于AF和NP之間。纖維軟骨AF由同心膠原層(骨板)組成， 所述同心膠原層與椎體的骨邊緣連接。蛋白聚糖(PGs)和I型、II型、III型、V型、VI型、IX型、X型、XI型膠原蛋白是所 有這些椎間盤組織的主要基質(zhì)成分，但它們的相對(duì)豐度和分布取決于它們的解剖學(xué)定位。 具有對(duì)于水分子的高親和力的P(is在“健康椎間盤”的NP中最豐富。P(}S所吸收的水在NP 內(nèi)產(chǎn)生流體靜力壓，所述流體靜力壓使封裝的纖維軟骨AF“膨脹”。這些特定的結(jié)締組織及 其各自的生理化學(xué)性質(zhì)的聯(lián)合有助于IVD的水動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和粘彈性性質(zhì)，所述水動(dòng)力學(xué)性 質(zhì)和粘彈性性質(zhì)是脊柱的正常生物機(jī)械功能所必需的。在衰老和退變中，IVD發(fā)生顯著的基質(zhì)改變。對(duì)于人類尸體和脊柱手術(shù)時(shí)獲得的椎 間盤樣本的研究表明，來自中年至老年群體中的個(gè)體的椎間盤通常具有大范圍的病變(1， 2)。從這些樣本中已鑒定出三種主要類型的椎間盤病變(i)邊緣病變，即靠近于AF 與椎體邊緣的骨的連接橫截面缺損；(ii)同心(圓周)撕裂，其中環(huán)狀骨板彼此分離；和 (iii)輻射狀撕裂，其來自始于NP內(nèi)的裂口的擴(kuò)展(1，2，3)。邊緣病變尤其受到關(guān)注，因?yàn)?其較常見出現(xiàn)于青春期和成年早期，AF前部?jī)?nèi)，AF前部靠近于AF在椎骨邊緣的骨中的插 入，這提示所述邊緣病變可能是機(jī)械上介導(dǎo)的。邊緣病變的存在提示AF的早期衰竭并且是 椎間盤退變的首要原因，但對(duì)尸體樣本的研究還表明其他病理學(xué)特征(同心撕裂、囊性環(huán) 狀退變、NP脫水、椎骨邊緣韌帶骨贅和后椎間關(guān)節(jié)的骨關(guān)節(jié)炎)也在某種程度上始終存在 (1，2)。盡管這些各自的椎間盤病變的時(shí)間歷史仍然是爭(zhēng)論的主題，但公認(rèn)的是來源于P^ 及其相關(guān)的水從NP的丟失是椎間盤退變的早期病因?qū)W決定因素G)。如已經(jīng)所討論的，椎間盤作為柔韌的水彈性墊發(fā)揮功能，其很大程度上受NP中水 分子的吸取所調(diào)節(jié)。NP水含量的減少并由此的膨脹壓的減少將導(dǎo)致強(qiáng)加于AF的超生理機(jī) 械壓迫，導(dǎo)致局部衰竭。90%的人口在他們生活的某些時(shí)間會(huì)發(fā)生起因于椎間盤退變的背部和頸部疼痛 相關(guān)的醫(yī)學(xué)問題(5，6)。在人類中，足夠的嚴(yán)重程度而需要醫(yī)療介入的背部或頸部疼痛的發(fā) 生率在30多歲和40多歲時(shí)增加，在50多歲時(shí)達(dá)到高峰并在此后下降(5)。在美國(guó)，背部疼痛是就診的第二位最常見原因，并且背部和頸部疼痛相關(guān)的醫(yī)學(xué)
3狀況造成多于任何其他肌肉骨骼病癥的住院治療。背部疼痛是損失工作時(shí)間的首要原因。 例如，在英國(guó)，據(jù)估計(jì)每年由于該疾病損失超過一千一百萬的工作天數(shù)。此外，由于在接下 來的幾十年人口的長(zhǎng)壽增加，所以預(yù)計(jì)背部和頸部疼痛問題會(huì)相應(yīng)增加。盡管在當(dāng)今社會(huì)中，頸部和背部疼痛具有高發(fā)生率和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但是原因仍了解 很少。然而，達(dá)成共識(shí)的是，IVD的退變和/或衰竭是疼痛的首要原因，該疼痛或者直接來 自于外部AF中存在的神經(jīng)或者來自由于椎間盤水彈性功能的丟失而變?yōu)闄C(jī)械上受損的鄰 近的脊柱結(jié)構(gòu)(7，8，9，10)。椎間盤疾病是所有下背部疼痛病例中23%-40%的原因(11， 12)。外部AF受神經(jīng)支配并且神經(jīng)纖維可以延伸到其內(nèi)部三分之一的深度，因此外部AF的 任何病理學(xué)改變可能引起疼痛(13，14，15)。用于治療椎間盤來源的背部或頸部疼痛的已有模式是以經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)的，其致力于 生活方式的改變或者使用抗炎藥/鎮(zhèn)痛藥緩解癥狀或者可能需要切除退變組織或用于限 制運(yùn)動(dòng)的脊柱關(guān)節(jié)融合術(shù)的手術(shù)介入。盡管用于緩解頸部或下背部疼痛的脊柱融合術(shù)被廣 泛使用，但是已知這并不是無害的手術(shù)，因?yàn)橥ㄟ^越過椎間盤間隙引入剛性節(jié)段而強(qiáng)加于 鄰近椎間盤的機(jī)械壓迫加速鄰近椎間盤中的退變改變，這在稍后的階段可能變?yōu)橛邪Y狀的 (16)。顯然需要治療的備選方法。據(jù)報(bào)道，在通過實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生退變后，蛋白，即成骨蛋白-I(OP-I)(骨形態(tài)形成蛋 白-7)的椎間盤內(nèi)給藥可以刺激椎間盤基質(zhì)修復(fù)。通過將去聚合酶軟骨素酶ABC預(yù)先注射 入椎間盤NP中在兔中產(chǎn)生椎間盤退變，該步驟被稱為化學(xué)髓核溶解術(shù)(17)?；瘜W(xué)髓核溶解 術(shù)后，發(fā)現(xiàn)NP和AF細(xì)胞在重建功能性基質(zhì)中更加高效。發(fā)現(xiàn)嵌在正常密度的細(xì)胞外基質(zhì) 中的椎間盤細(xì)胞很大程度上對(duì)于OP-I對(duì)PG合成的刺激效應(yīng)沒有反應(yīng)(17)。使用自體軟骨細(xì)胞，檢測(cè)潛在細(xì)胞治療以實(shí)現(xiàn)退變的犬和人IVD的修復(fù)的研究已 有報(bào)道(18，19)。所用的細(xì)胞是從相同物種的健康NP收獲的軟骨細(xì)胞并且隨后再植入到缺 損的椎間盤中。所述方法的缺點(diǎn)在于用于該用途的細(xì)胞需要從鄰近的健康椎間盤或從相同 物種的其他供體收獲。AF的違背需要獲得這些細(xì)胞并且該過程不僅損傷AF結(jié)構(gòu)而且從NP 中移除活細(xì)胞會(huì)加速該組織中的退行性改變。顯然，該方法具有受限的人類應(yīng)用。發(fā)明概述本申請(qǐng)首次描述了體內(nèi)應(yīng)用STRO-Γ專能細(xì)胞以促進(jìn)退變椎間盤的髓核和纖維環(huán) 重建。STRO-Γ專能細(xì)胞來源于同種異體來源并且在本研究使用的動(dòng)物模型中良好耐受。這 提示來自供體的STRO-Γ專能細(xì)胞可以大量生長(zhǎng)并且開發(fā)為用于治療退變椎間盤的“現(xiàn)成”產(chǎn)品。因此，本發(fā)明提供了修復(fù)和/或重建個(gè)體中椎間盤的方法，所述方法包括將間充 質(zhì)前體細(xì)胞(STRO-r專能細(xì)胞)和/或其后代細(xì)胞給予椎間盤。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞給予椎間盤的髓 核中。優(yōu)選地，STRO-Γ專能細(xì)胞也是 TNAP+、VCAM-r、THY-r、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或其任意組合。STRO-I+專能細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞可以來源于自體來源、同種異體或異種來源。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞來源于同種異體來源。本發(fā)明方法還包括將糖胺聚糖(GAG)給予椎間盤，所述糖胺聚糖例如透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)(透明質(zhì)酸(hyaluronan)) (HA)、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、 肝素、硫酸肝素。GAG可以與STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞在相同或不同的組合物中 進(jìn)行給藥。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明方法可以在任何脊椎動(dòng)物上實(shí)施。例如，個(gè)體可以為哺乳動(dòng)物， 諸如人、狗、貓、馬、牛、或綿羊。本發(fā)明方法可以用于特征為椎間盤退變的脊柱疾病狀況的治療或預(yù)防，所述脊柱 疾病狀況例如下背部疼痛，年齡相關(guān)的椎間盤改變或椎骨脫離。在本說明書各處，詞語“包括(comprise)”或諸如“包括”(comprises)或“包 括”(comprising)的變體應(yīng)理解為是指，包括所闡明的元件、整體或步驟、或元件組、整體組 或步驟組，但不排除任何其它的元件、整體或步驟、或元件組、整體組或步驟組。在下文中，通過以下非限制性實(shí)施例并參照附圖描述本發(fā)明。附圖簡(jiǎn)要說明

圖1.所有綿羊組中用STR0-1細(xì)胞治療的腰椎脊柱節(jié)段的示意圖。圖2.放射學(xué)測(cè)定的椎間盤高度指數(shù)(DHI)。基線時(shí)和軟骨素酶ABC誘導(dǎo)退變3個(gè) 月后(3個(gè)月，STR0-1細(xì)胞前)，接受低劑量㈧和高劑量⑶的STR0-1細(xì)胞的綿羊組的X 射線測(cè)定的椎間盤高度指數(shù)OHI)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖3. MRI測(cè)定的注射軟骨素酶ABC的椎間盤的總椎間盤退變?cè)u(píng)分。注射軟骨素酶 ABC后，用低劑量STR0-1細(xì)胞+HA或單獨(dú)HA治療3個(gè)月㈧或6個(gè)月⑶之前，MRI測(cè)定 的總椎間盤退變?cè)u(píng)分的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4. MRI測(cè)定的注射軟骨素酶ABC的椎間盤的總椎間盤退變?cè)u(píng)分。注射軟骨素酶 ABC后，用低劑量STR0-1細(xì)胞+HA或單獨(dú)HA治療3個(gè)月㈧或6個(gè)月⑶之前，MRI測(cè)定 的總椎間盤退變?cè)u(píng)分的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖5.總組織病理學(xué)椎間盤退變?cè)u(píng)分。對(duì)于低劑量STR0-1細(xì)胞，3個(gè)月㈧和6 個(gè)月(B)時(shí)的總組織病理學(xué)椎間盤退變?cè)u(píng)分的平均值。#表示與對(duì)照存在顯著性差異ρ
<0. 001，Ω表示與STRO-Γ細(xì)胞存在顯著性差異ρ < 0. 01。圖6.總組織病理學(xué)椎間盤退變?cè)u(píng)分。對(duì)于高劑量STR0-1細(xì)胞，3個(gè)月(A)和6 個(gè)月(B)時(shí)的總組織病理學(xué)椎間盤退變?cè)u(píng)分的平均值。#表示與對(duì)照存在顯著性差異ρ
<0. 001，Ω表示與STRO-Γ細(xì)胞存在顯著性差異ρ < 0. 01。圖7.總MRI椎間盤退變?cè)u(píng)分。對(duì)于低劑量STR0-1細(xì)胞，3個(gè)月(A)和6個(gè)月(B) 時(shí)的總MRI椎間盤退變?cè)u(píng)分。#表示與對(duì)照存在顯著性差異ρ < 0. 05，Ω表示與STRO-Γ 細(xì)胞存在顯著性差異P < 0. 05。圖8.總MRI椎間盤退變?cè)u(píng)分。對(duì)于高劑量STR0-1細(xì)胞，3個(gè)月㈧和6個(gè)月⑶ 時(shí)的總MRI椎間盤退變?cè)u(píng)分。#表示與對(duì)照存在顯著性差異ρ < 0. 05，Ω表示與STRO-Γ 細(xì)胞存在顯著性差異P < 0. 05。圖9.髓核(NP)組織病理學(xué)退變?cè)u(píng)分。對(duì)于低劑量STR0-1細(xì)胞，3個(gè)月㈧和6 個(gè)月(B)時(shí)的NP組織病理學(xué)退變?cè)u(píng)分的平均值。圖10.髓核(NP)組織病理學(xué)退變?cè)u(píng)分。對(duì)于高劑量STR0-1細(xì)胞，3個(gè)月(A)和6 個(gè)月(B)時(shí)的NP組織病理學(xué)退變?cè)u(píng)分的平均值。圖11.生化測(cè)定的髓核的糖胺聚糖(GAG)含量。生化測(cè)定的用低劑量或高劑量STR0-1細(xì)胞注射3個(gè)月(A)或6個(gè)月(B)的椎間盤的髓核的糖胺聚糖(GAG)含量的平均值 士標(biāo)準(zhǔn)差。#表示與對(duì)照存在顯著性差異(P < 0. 05)。圖12.放射學(xué)測(cè)定的椎間盤高度指數(shù)(DHI)。A 軟骨素酶ABC誘導(dǎo)的退變椎間 盤在HA或HA+低劑量STR0-1細(xì)胞注射后3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)X射線測(cè)定的椎間盤高度指 數(shù)(DHI)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。B 軟骨素酶ABC誘導(dǎo)的退變椎間盤在HA或HA+高劑量 STR0-1細(xì)胞注射后3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)X射線測(cè)定的椎間盤高度指數(shù)(DHI)的平均值士標(biāo)
準(zhǔn)誤差。發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述通用技術(shù)和所詵擇的定義除非另外特別定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語應(yīng)當(dāng)認(rèn)為具有與本領(lǐng)域技術(shù) 人員通常理解的相同的含義。(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、干細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫 組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)和生物化學(xué)中)。除非另外表明，本發(fā)明中使用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)和免疫技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù) 人員公知的標(biāo)準(zhǔn)操作。下述資源中的文獻(xiàn)中描述和解釋了這些技術(shù)，例如J.Pertal， A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆操作指南)，John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al, Molecular Cloning :A Laboratory Manual ( ^ ^ 隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)，T. A. Brown (編輯)， Essential Molecular Biology :A Practical Approach (基礎(chǔ)分子生物學(xué)操作方法)， Volumes 1 and 2，IRL Press (1991)，D. Μ. Glover and B. D. Hames (編輯)，DNA Cloning A Practical Approach (DNA 克隆操作方法)，Volumes 1-4, IRL Press (1995 禾Π 1996)，以 R F. Μ. Ausubel et al.(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子 生物實(shí)驗(yàn)方法)，Greene Pub. Associates and WileyHnterscience (1988，包括至今的所 有更新)，Ed Harlow and David Lane (編輯)Antibodies :A Laboratory Manual (抗體 實(shí)驗(yàn)手冊(cè))，Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)，和 J. E. Coligan et al.(編輯) Current Protocols in Immunology (3'^ ' ), John Wiley & Sons ( 今的所有更新)。如本文使用的術(shù)語“治療(treating) ”、“治療(treat) ”或“治療(treatment) ”包 括給予足以減少或消除所規(guī)定的疾病狀況的至少一種癥狀的治療有效量的STRO-Γ專能細(xì) 胞和/或其后代細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語“預(yù)防(preventing)”、“預(yù)防(prevent)”或“預(yù)防 (prevention)”包括給予足以停止或阻礙所規(guī)定的疾病狀況的至少一種癥狀的發(fā)展的治療 有效量的STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞。STRO-Ii專能細(xì)胞或后代細(xì)胞如本文所使用的短語“STRO-Γ專能細(xì)胞”應(yīng)當(dāng)認(rèn)為表示能形成專能細(xì)胞克隆的 STRO-I+和/或TNAP+祖細(xì)胞。STRO-Γ專能細(xì)胞是見于骨髓、血液、牙髓細(xì)胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰腺、腦、腎、 肝、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結(jié)、胸腺、骨、韌帶、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中中的細(xì) 胞；并且能分化為生殖系，例如中胚層和/或內(nèi)胚層和/或外胚層。因此，STRO-Γ專能細(xì) 胞能分化為大量細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型包括，但不限于，脂肪組織、骨組織、軟骨組織、彈性組織、肌肉組織和纖維結(jié)締組織。這些細(xì)胞進(jìn)入的特定譜系定型和分化途徑取決于來自 機(jī)械影響和/或諸如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的內(nèi)源生物活性因子和/或宿主組織建立的局部 微環(huán)境條件的各種影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，STRO-Γ專能細(xì)胞為非造血祖細(xì)胞，其分裂產(chǎn) 生后代細(xì)胞，所述后代細(xì)胞為干細(xì)胞或最終會(huì)不可逆地分化產(chǎn)生表型細(xì)胞的前體細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，獲自個(gè)體的樣品中的STRO-Γ專能細(xì)胞是富集的，所述個(gè)體 例如待治療的個(gè)體或相關(guān)個(gè)體或不相關(guān)個(gè)體(無論是相同物種還是不同物種)。本文中使 用的術(shù)語“富集的(enriched)”、“富集(enrichment) ”或其變體描述這樣的細(xì)胞群體，其中 與未治療的群體相比，一種特定細(xì)胞類型的比例或多個(gè)特定細(xì)胞類型的比例增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的細(xì)胞表達(dá)一種或多種標(biāo)志物，所述標(biāo)志物 分別地或共同地選自 TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+ 或其任意組合。“分別地”表示本發(fā)明單獨(dú)地包括列舉的標(biāo)志物或標(biāo)志物組，并且盡管分別的標(biāo)志 物或標(biāo)志物組在本文中可能未單獨(dú)地列出，但是附加權(quán)利要求可以單獨(dú)地并且彼此可分開 地定義這些標(biāo)志物或標(biāo)志物組?！肮餐亍北硎颈景l(fā)明包括任意數(shù)量或組合的列舉的標(biāo)志物或肽組，并且盡管這些 數(shù)量或組合的標(biāo)志物或標(biāo)志物組在本文中可能未具體列出，但是附加權(quán)利要求可以單獨(dú)地 并且與任意其他組合的標(biāo)志物或標(biāo)志物組可分開地定義這些組合或亞組合。優(yōu)選地，STRO-I+細(xì)胞為 STR0-1 亮(STRO-Ibright)(同 STRO-Ibri)。優(yōu)選地，STRO-1 亮 細(xì)胞另外為TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+和/或CD146+中的一種或多種。在一個(gè)實(shí)施方案中，STRO-Γ專能細(xì)胞是WO 2004/85630中定義的外周血間充質(zhì)前 體細(xì)胞。被稱為對(duì)于給定的標(biāo)志物是“陽性”的細(xì)胞，其根據(jù)細(xì)胞表面上所述標(biāo)志物存在的 程度可以表達(dá)低(Io或暗(dim))或高水平(亮，bri)的該標(biāo)志物，其中該術(shù)語涉及細(xì)胞分 選過程中使用的熒光或其它標(biāo)志物的強(qiáng)度。lo(或暗(dim)或暗(dull))和bri的區(qū)別應(yīng) 當(dāng)理解為在所分選的特定細(xì)胞群體上使用的標(biāo)志物的背景中。被稱為對(duì)于給定的標(biāo)志物是 “陰性”的細(xì)胞未必完全不存在于該細(xì)胞。該術(shù)語表示該細(xì)胞以相對(duì)非常低的水平表達(dá)所述 標(biāo)志物，并且當(dāng)可檢測(cè)地標(biāo)記所述標(biāo)志物時(shí)，其產(chǎn)生非常低的信號(hào)或者在背景水平以上無 法檢測(cè)。本文中使用的術(shù)語“亮”是指當(dāng)可檢測(cè)地標(biāo)記標(biāo)志物時(shí)，細(xì)胞表面上產(chǎn)生相對(duì)高信 號(hào)的標(biāo)志物。不希望受到理論限制的同時(shí)，被提出的是，“亮”細(xì)胞比樣品中其他細(xì)胞表達(dá)更 多的靶標(biāo)志物蛋白(例如，STR0-1識(shí)別的抗原)。例如，當(dāng)用FITC結(jié)合的STR0-1抗體進(jìn)行 標(biāo)記時(shí)，按照熒光激活細(xì)胞分選(FACQ分析所測(cè)定的，STRO-Itoi細(xì)胞比非亮細(xì)胞(STR0-1
(STRO-Idull7diffl))產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光信號(hào)。優(yōu)選地，“亮”細(xì)胞構(gòu)成起始樣品中含有的最亮 標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞的至少約0. 1%。在其它的實(shí)施方案中，“亮”細(xì)胞構(gòu)成起始樣品中含 有的最亮標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞的至少約0. 1%、至少約0. 5%、至少約1%、至少約1. 5%或 至少約2%。在優(yōu)選實(shí)施方案中，STRO-Is細(xì)胞相對(duì)于“背景”即STRO-Γ的細(xì)胞，具有2對(duì) 數(shù)幅度O log magnitude)的更高表達(dá)的的STR0-1表面表達(dá)。通過比較，STR0-1 和/或 STR0-1 具有比“背景”少于2對(duì)數(shù)幅度O log magnitude)的更高于表達(dá)的的STR0-1表 面表達(dá)，通常約1對(duì)數(shù)或少于“背景”。本文中使用的術(shù)語“TNAP”意圖包括組織非特異性堿性磷酸酶的所有同種型。例
7如，該術(shù)語包括肝同種型(LAP)、骨同種型(BAP)和腎同種型(KAP)。在優(yōu)選實(shí)施方案中， TNAP是BAP。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文使用的TNAP是指由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的能與 STR0-3抗體結(jié)合的分子，所述雜交瘤細(xì)胞系根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2005年12月19日 保藏于ATCC，保藏登錄號(hào)為PTA-7^2。在一個(gè)實(shí)施方案中，STRO-I+專能細(xì)胞能產(chǎn)生克隆生成的CFU-F。相當(dāng)比例的STRO-Γ專能細(xì)胞能分化為至少兩種不同的生殖系是優(yōu)選的。專能細(xì) 胞可以定型為的系的非限制性實(shí)例，包括骨前體細(xì)胞；肝細(xì)胞祖細(xì)胞，其對(duì)于膽管上皮細(xì)胞 和肝細(xì)胞是專能的；神經(jīng)限制性細(xì)胞，其能產(chǎn)生發(fā)展為少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的神 經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞；發(fā)展為神經(jīng)元的神經(jīng)元前體細(xì)胞；心肌和心肌細(xì)胞、葡萄糖響應(yīng)的胰島 素分泌胰腺β細(xì)胞系的前體。其它系包括但并不限于，成齒質(zhì)細(xì)胞、牙質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞和軟骨 細(xì)胞、和下列的前體細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、諸如角質(zhì)化細(xì)胞的皮膚細(xì)胞、 樹突狀細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、腎管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞、睪丸祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì) 胞、腱、韌帶、軟骨、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓間質(zhì)、心肌、平滑肌、骨骼肌、周皮細(xì)胞、脈 管、上皮、神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，STRO-I+專能細(xì)胞不能通過培養(yǎng)成為造血細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞取自待治療的個(gè)體，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體外培養(yǎng)，并且用于獲得 上清或者可溶因子或者擴(kuò)增的細(xì)胞作為自體或同種異體組合物給予個(gè)體。在可選的實(shí)施方 案中，使用了一種或多種建立的人細(xì)胞系的細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)有用的實(shí)施方案中，使 用了非人的動(dòng)物細(xì)胞(或者如果患者不是人，則來自另一個(gè)物種)。本發(fā)明還考慮使用獲自或源自STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其體外培養(yǎng)產(chǎn)生的后代細(xì) 胞(后者也被稱為擴(kuò)增的細(xì)胞)的上清或可溶因子。本發(fā)明擴(kuò)增的細(xì)胞根據(jù)培養(yǎng)條件(包 括培養(yǎng)基中刺激因子的數(shù)量和/或種類)、傳代次數(shù)等可能具有多種表型。在某些實(shí)施方案 中，從母代群體傳代約2代、約3代、約4代、約5代、約6代、約7代、約8代、約9代或者約 10代后獲得所述后代細(xì)胞。然而，可以從母代群體傳代任意代數(shù)后獲得后代細(xì)胞?？梢酝ㄟ^在任何合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得后代細(xì)胞。關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)使用的術(shù)語 “培養(yǎng)基”包括細(xì)胞周圍環(huán)境的組分。培養(yǎng)基可以是固體、液體、氣體或者相態(tài)和材料的混合 物。培養(yǎng)基包括液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及不支持細(xì)胞生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基還包括膠狀培 養(yǎng)基，例如瓊脂、瓊脂糖、明膠和膠原蛋白基質(zhì)。示例性的氣體培養(yǎng)基包括生長(zhǎng)于陪替氏培 養(yǎng)皿或其它固體或半固體載體上的細(xì)胞所暴露于的氣相。術(shù)語“培養(yǎng)基”還指意圖用于細(xì) 胞培養(yǎng)的材料，即使其未與細(xì)胞接觸。換言之，為細(xì)菌培養(yǎng)制備的營(yíng)養(yǎng)富集液體是培養(yǎng)基。 當(dāng)粉末混合物與水或其它液體混合時(shí)變?yōu)檫m合培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，所述粉末混合物可以稱為“粉 末培養(yǎng)基”。在實(shí)施方案中，通過使用磁珠標(biāo)記的STR0-3抗體從骨髓中分離TNAP+STRO-Γ專能 細(xì)胞，并且隨后培養(yǎng)擴(kuò)增該分離的細(xì)胞獲得對(duì)本發(fā)明方法有用的后代細(xì)胞。(對(duì)于合適培養(yǎng) 條件的實(shí)例，參見 Gronthos et al. Blood 85 :929-940,1995) 在一個(gè)實(shí)施方案中，這種擴(kuò)增的細(xì)胞(后代)(優(yōu)選地，至少5代以后)可以是 TNAP\ CC9+、I+ 類 HLA、ΙΓ 類 HLA、CD14\ CD19\ CD3\ CDlla^T、CD31\ CD86\ CD34"和 / 或 CD80—。然而，在不同于本文描述的那些培養(yǎng)條件的培養(yǎng)條件下，不同標(biāo)志物的表達(dá)可以變 化是可能的。此外，在這些表型的細(xì)胞在擴(kuò)增的細(xì)胞群體中可能占優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，并不表示少數(shù)比例的細(xì)胞沒有該表型(例如，少量百分比的擴(kuò)增的細(xì)胞可以是CC9_)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 方案中，擴(kuò)增的細(xì)胞仍然有分化為不同細(xì)胞類型的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于獲得上清或可溶因子或細(xì)胞本身的擴(kuò)增的細(xì)胞群體包括 這樣的細(xì)胞，其中細(xì)胞的至少25%，更優(yōu)選為至少50%為CC9+。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于獲得上清或可溶因子或細(xì)胞本身的擴(kuò)增的細(xì)胞群體包 括這樣的細(xì)胞，其中細(xì)胞的至少40%，更優(yōu)選為至少45%為STR0-1+。在另一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增的細(xì)胞可以表達(dá)一種或多種標(biāo)志物，所述標(biāo)志物共同 地或分別地選自LFA-3、THY-I、VCAM-I、ICAM-I、PECAM-1、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、3G5、 CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整聯(lián)蛋白 β 6-19、血 栓調(diào)節(jié)蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、TOF-R、瘦素-R(STR0_2 =瘦 素-R)、RANKL, STR0-1胃和⑶146或這些標(biāo)志物的任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，后代細(xì)胞是如WO 2006/032092定義和/或描述的專能擴(kuò)增 STRO-Γ 專能細(xì)胞后代(MEMPs)。WO 01/04268 和 WO 2004/085630 中描述了制備 STRO-Γ 專 能細(xì)胞的富集群體的方法，后代可以來源于所述STRO-Γ專能細(xì)胞。在體外背景下，STRO-Γ 專能細(xì)胞很少以絕對(duì)純的制備物存在，并且通常與其它細(xì)胞一起存在，所述其它細(xì)胞為組 織特異性定型細(xì)胞(TSCCs)。WO 01/04268涉及以約0. 到90%的純度水平從骨髓中收 獲這樣的細(xì)胞。包括后代所源自的STRO-Γ專能細(xì)胞的群體可以直接從組織來源中收獲， 或者可選擇地，其可以是已經(jīng)離體擴(kuò)增的群體。例如，可以從收獲的、未擴(kuò)增的、基本上純化的STRO-Γ專能細(xì)胞的群體中獲得后 代，所述基本上純化的STRO-Γ專能細(xì)胞構(gòu)成其存在的群體的總細(xì)胞的至少約0. 1%、1%、 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 或 95%。例如，通過選擇對(duì)于至少一種標(biāo) 志物是陽性的細(xì)胞可以達(dá)到該水平，所述標(biāo)志物分別地或共同地選自TNAP、STR0-1氣3G5+、 VCAM-I、THY-I、CD146 和 STR0-2。MEMPs與新鮮收獲的STRO-Γ專能細(xì)胞的區(qū)別在于MEMPS對(duì)于標(biāo)志物STRO-Itoi為 陽性并且對(duì)于標(biāo)志物堿性磷酸酶(ALP)為陰性。相比之下，新鮮分離的STRO-Γ專能細(xì)胞 對(duì)STRO-Itoi和ALP都是陽性的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，至少15 %、20 %、30 %、40 %、 50 %、60%、70%、80%、90%或95%的給藥細(xì)胞具有表型STRO-Itoi，ALP_。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí) 施方案中，MEMPs對(duì)于標(biāo)志物Ki67、⑶44和/或⑶49c/tD^、VLA-3、α 3 β 1中的一種或多 種為陽性。在仍然另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，MEMPs不表現(xiàn)TERT活性和/或?qū)τ跇?biāo)志物CD18 是陰性的。STRO-I+專能細(xì)胞初始群體可以源于任意一種或多種WO 01/04268或WO 2004/085630中所示的組織類型，即骨髓、牙髓細(xì)胞、脂肪組織和皮膚；或可能更廣泛地源 于脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胰腺、 骨、韌帶、骨髓、腱和骨骼肌。應(yīng)當(dāng)理解，在實(shí)施本發(fā)明中，通過很多不同的方法可以實(shí)現(xiàn)攜帶任何給定細(xì)胞表 面標(biāo)志物的細(xì)胞的分離，然而，優(yōu)選方法依賴于結(jié)合劑(例如抗體或其抗原結(jié)合片段)與關(guān) 心的標(biāo)志物的結(jié)合，然后分離表現(xiàn)出結(jié)合的那些，所述結(jié)合為高水平結(jié)合或低水平結(jié)合或 未結(jié)合。最方便的結(jié)合劑是抗體或基于抗體的分子，優(yōu)選為單克隆抗體或由于這些后述試 劑的特異性而基于單克隆抗體?？贵w可以用于兩個(gè)步驟，然而也可以使用其他試劑，從而這
9些標(biāo)記物的配體也可以用于富集攜帶所述標(biāo)記物或缺少所述標(biāo)記物的細(xì)胞?？梢詫⒖贵w或配體連接于固體載體以允許粗分離。優(yōu)選地，分離技術(shù)最大化保留 待收集的組分的活力?？梢允褂镁哂胁煌实母鞣N技術(shù)以獲得相對(duì)粗的分離。使用的具 體技術(shù)取決于分離效率、相關(guān)細(xì)胞毒性、實(shí)施的簡(jiǎn)易性和速度以及對(duì)于先進(jìn)設(shè)備和/或技 術(shù)技能的需要。分離操作可以包括，但并不限于，使用抗體包被的磁珠的磁分離、親和色譜 法和用連接于固體基質(zhì)的抗體的“淘洗(panning)”。提供準(zhǔn)確分離的技術(shù)包括但并不限于 FACS。實(shí)施FACS的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。針對(duì)每一本文描述的標(biāo)志物的抗體都是商業(yè)可獲得的(例如，針對(duì)STR0-1的單克 隆抗體可以購自R&D Systems, USA)，可獲自ATCC或其他保藏機(jī)構(gòu)和/或可以用本領(lǐng)域公 認(rèn)的技術(shù)制備。優(yōu)選地，分離STRO-Γ專能細(xì)胞的方法，例如，包括固相分選步驟的第一步驟，該步 驟使用例如識(shí)別STR0-1高表達(dá)的磁性活化細(xì)胞分選(MACS)。如果需要，接著進(jìn)行第二分選 步驟，從而產(chǎn)生如專利說明書WO 01/14268所描述的更高水平的前體細(xì)胞表達(dá)。該第二分 選步驟可以涉及使用兩種或更多種標(biāo)志物。獲得STRO-Γ專能細(xì)胞的方法還可以包括在第一富集步驟之前使用已知技術(shù)收獲 細(xì)胞來源。從而手術(shù)去除組織。包含該來源組織的細(xì)胞隨后被分離至所謂的單細(xì)胞懸液。 通過物理手段和/或酶學(xué)手段可以實(shí)現(xiàn)該分離。一旦獲得合適的STRO-Γ專能細(xì)胞群體，可以通過任何合適的方法進(jìn)行培養(yǎng)或擴(kuò) 增以獲得MEMI3S。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞取自待治療的個(gè)體，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行體外培養(yǎng)并且用 于獲得上清或者可溶因子或者擴(kuò)增的細(xì)胞，用于作為自體的或同種異體的組合物給予個(gè) 體。在可選的實(shí)施方案中，一種或多種建立的人細(xì)胞系的細(xì)胞被用于獲得上清或者可溶因 子。在本發(fā)明的另一個(gè)有用的實(shí)施方案中，非人的動(dòng)物細(xì)胞(或者如果患者不是人，則來自 另一個(gè)物種)被用于獲得上清或者可溶因子。使用來自任何非人的動(dòng)物物種的細(xì)胞可以實(shí)施本發(fā)明，所述細(xì)胞包括但并不限 于，非人的靈長(zhǎng)類細(xì)胞、有蹄動(dòng)物、犬類、貓類、兔類、嚙齒類、鳥類和魚類細(xì)胞。可以用于實(shí) 施本發(fā)明的靈長(zhǎng)類細(xì)胞包括但并不限于，猩猩、狒狒、食蟹猴和任意其它的新大陸猴或舊大 陸猴?？梢杂糜趯?shí)施本發(fā)明的有蹄動(dòng)物細(xì)胞包括但并不限于牛細(xì)胞、豬細(xì)胞、綿羊細(xì)胞、山 羊細(xì)胞、馬細(xì)胞、水牛細(xì)胞和野牛細(xì)胞?？梢杂糜趯?shí)施本發(fā)明的嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞包括但并不 限于小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、豚鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞和沙鼠細(xì)胞?？梢杂糜趯?shí)施本發(fā)明的兔類物 種的實(shí)例包括家兔、長(zhǎng)腿野兔、野兔、棉尾兔，雪地兔和鼠兔。雞(Gallus gallus)是可以用 于實(shí)施本發(fā)明的鳥類物種的實(shí)例。在使用前或獲得上清或可溶因子前，可以保存對(duì)本發(fā)明方法有用的細(xì)胞。保 留或保存真核細(xì)胞并且特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法和流程是本領(lǐng)域已知的(參照，例 如，Pollard，J. W. and Walker, J. Μ. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition (基本細(xì)胞培養(yǎng)方案，第二版)，Humana Press, Totowa, N. J. ；Freshney, R. I. (2000)Culture of Animal Cells, Fourth Edition(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，第四版)， ffiley-Liss,Hoboken,N. J.)。保持諸如間充質(zhì)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的分離的干細(xì)胞或其后代的 生物活性的任何方法都可以結(jié)合本發(fā)明使用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過冷凍保存來保
10持和保存細(xì)胞。給藥和組合物給予的STRO-Γ專能細(xì)胞或其后代的劑量可以根據(jù)例如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個(gè) 體體重的因素而變化。可以調(diào)整劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。例如，可以給予單一大丸 劑、可以隨時(shí)間給予數(shù)個(gè)分開的劑量或根據(jù)治療狀況的緊急程度相應(yīng)地減少或增加劑量。 為了給藥的方便和劑量的均一性，以劑量單位形式配制腸胃外組合物是有利的。本文所用 的“劑量單位形式”是指適于作為用于待治療個(gè)體的單位劑量的物理上分離的單位；每個(gè)單 位含有計(jì)算出的預(yù)定量的活性化合物，從而與需要的藥學(xué)載體聯(lián)合產(chǎn)生所需的治療效果。在一個(gè)實(shí)例中，給予的STRO-Γ專能細(xì)胞的劑量范圍為0. IX IO6至4. OX IO6個(gè)細(xì) 胞。例如，劑量可以為0.5X IO6個(gè)細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，在被添加到椎間盤間隙之前，可以將STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其后代加 工成各種形式(例如溶液懸液、固體、多孔的、編織的、非編織的、顆粒、凝膠、膏劑等)?？紤]將許多生物材料和合成材料用于與STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其后代共注 射入髓核，以對(duì)于受損椎間盤修復(fù)正常機(jī)械和/或生理性質(zhì)。例如，可以向髓核中直接 注射一種或多種天然的或合成的糖胺聚糖(GAGs)或者粘多糖中的，例如透明質(zhì)酸(HA)、 硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸肝素、硫酸半乳糖胺葡萄糖醛酸聚糖 (galactosaminoglycuronglycan sulfate) (GGGS)，參見之前的改變和其它，包括它們的生 理鹽。已有提示，HA在刺激滑膜細(xì)胞的內(nèi)源HA合成和軟骨細(xì)胞的蛋白聚糖合成中起作用、 抑制軟骨降解酶的釋放并作為氧自由基的清除劑，所述氧自由基在軟骨退化中起作用。硫 酸軟骨素和氨基葡萄糖注射劑相似地表現(xiàn)出阻斷關(guān)節(jié)軟骨退變的進(jìn)展?？烧撟C地，其它GAG 可以提供相似的具有治療價(jià)值的保護(hù)或修復(fù)性質(zhì)，該治療價(jià)值使它們成為用于注射入經(jīng)歷 退行性椎間盤疾病的椎間盤中的理想的候選者。GAG的另一個(gè)有價(jià)值的性質(zhì)是其強(qiáng)吸引和 保留水的能力。因此，將GAG與水或其它水性材料混合以形成的粘稠凝膠是合適的，然后， 所述粘稠凝膠可以被注射入由髓核的抽吸產(chǎn)生的間隙中，或者可選擇地，作為補(bǔ)充物被添 加到已有髓核。從而形成天然“水凝膠”，其能夠三維填充間隙并且起到類似于抵抗擠壓并 且使椎間盤能夠吸收活動(dòng)相關(guān)的震動(dòng)的填塞材料的作用。諸 如 Euflexxa ， (Ferring Pharmaceuticals)或 Restylane ⑧.(Q-Med Aktiebolag Co. , Sweden)的合成的透明質(zhì)酸凝膠適于用在本發(fā)明中?？梢杂糜诠餐o藥的其它可注射的合成材料的實(shí)例包括醫(yī)學(xué)級(jí)硅樹脂， Bioplastique φ.(懸浮于聚乙烯吡咯烷酮載體中的固體硅樹脂顆粒Wroplasty BV, Netherlands)、Art印last (懸浮于明膠載體中的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球；Artcs Medical,USA) ,Artecoll (懸浮于牛軟骨載體中的光滑 PMMA 球；Artepharma Pharmazeu Tische, GMBH Co.，Germany)。此外，合成的水凝膠組合物可以用作填充材料來對(duì)椎間盤修 復(fù)正常形狀，從而修復(fù)正常的生物機(jī)械功能。具有已知的軟骨保護(hù)能力的抗氧化劑也是用于注射入髓核的候選者。這些抗氧 化劑的實(shí)例包括生育酚(維生素E)、超氧化物岐化酶(SOD)、抗壞血酸(維生素C)、過氧 化氫酶及其它。此外，本文也考慮用于注射的藻酸鈉的兩性衍生物等。此外，重組成骨蛋 白-I(OP-I)，由于其促進(jìn)髓核和纖維環(huán)細(xì)胞的蛋白聚糖富集基質(zhì)的形成，因此是良好的用 于注射的候選者。
還考慮到合成注射劑的使用。這些合成注射劑特別適合于主要目的為修復(fù)椎間盤 生物機(jī)械功能的情況。透明質(zhì)酸單獨(dú)或與其他糖胺聚糖的組合可以被用作載體來遞送生物活性材料。在 優(yōu)選實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸和/或其它GAGs被用作用于STRO-Γ專能細(xì)胞或其后代細(xì)胞的 載體。將透明質(zhì)酸/GAG組合物的濃度和粘性常規(guī)調(diào)整為適合給定的用途。在另一個(gè)實(shí)例中，可以遞送STRO-Γ專能細(xì)胞或其后代細(xì)胞和纖維蛋白膠的混合 物。本文使用的術(shù)語“纖維蛋白膠”是指在鈣離子存在下，纖維蛋白聚合物的交聯(lián)而形成的 不溶基質(zhì)。纖維蛋白膠可以從以下形成來源于形成纖維蛋白基質(zhì)的生物組織或液體的纖 維蛋白原或其衍生物或代謝物、纖維蛋白(可溶的單體或聚合物)和/或其復(fù)合物?？蛇x 擇地，纖維蛋白膠可以從以下形成重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的纖維蛋白原或其衍生物或代謝物 或纖維蛋白。通過纖維蛋白原和纖維蛋白膠形成的催化劑(例如凝血酶和/或因子XIII)的相 互作用也可以形成纖維蛋白膠。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在催化劑(例如凝血酶)的存 在下纖維蛋白原被蛋白水解切割并轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白單體。隨后纖維蛋白單體可以形成聚合 物，該聚合物可以交聯(lián)形成纖維蛋白膠基質(zhì)。諸如因子XIII的催化劑的存在可以增強(qiáng)纖維 蛋白聚合物的交聯(lián)。纖維蛋白膠形成的催化劑可以來自血漿、冷凝沉淀物或含有纖維蛋白 原或凝血酶的其它血漿組分?？蛇x擇地，可以通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生催化劑。凝塊形成速率取決于與纖維蛋白原混合的凝血酶的濃度。作為酶依賴性反應(yīng)，溫 度越高(直至37°C)，凝塊形成速率越快。凝塊的抗張強(qiáng)度取決于所用的纖維蛋白原的濃 度。當(dāng)纖維蛋白凝塊是在透明質(zhì)酸的存在下產(chǎn)生的時(shí)，其經(jīng)歷相互作用并且變?yōu)榕c交 聯(lián)基質(zhì)相互交錯(cuò)。已知該基質(zhì)在組織再生中起主要作用并且在組織修復(fù)中執(zhí)行細(xì)胞調(diào)節(jié) 功能[Weigel PH, Fuller GM, LeBoeuf RD. (1986)A model for the role of hyaluronic acid and fibrin in the early events during the inflammatory response and wound healing(透明質(zhì)酸和纖維蛋白在炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷愈合的早期事件中的作用模型).J Theor Biol. 119 :219-34]。在HA-纖維蛋白基質(zhì)中，透明質(zhì)酸的溶解速率也會(huì)延長(zhǎng)，這在延長(zhǎng)該 GAG的治療效果中是有益的(Wadstrom J and Tengblad A(1993)Fibrin glue reduces the dissolution rate of sodium hyaluronate (纖維蛋白膠降低透明質(zhì)酸鈉的溶解速率)， Upsala J Med Sci. 98 :159-167)。數(shù)個(gè)出版物描述了將纖維蛋白膠用于治療劑的遞送。例如，美國(guó)專利第4，983，393 號(hào)公開了用作陰道內(nèi)插入物的組合物，其包含瓊脂糖、瓊脂、鹽溶液糖胺聚糖、膠原蛋白、纖 維蛋白和酶。此外，美國(guó)專利第3，089，815號(hào)公開了由纖維蛋白原和凝血酶組成的可注射 藥物制劑，并且美國(guó)專利第6，468，527號(hào)公開了促進(jìn)各種生物和非生物試劑到體內(nèi)特定部 位的遞送的纖維蛋白膠。然而，應(yīng)用纖維蛋白+透明質(zhì)酸+促進(jìn)STRO-Γ同種異體細(xì)胞的 軟骨形成分化至今還沒有描述。包含STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞的組合物被“手術(shù)添加”到椎間盤間隙。 即，通過醫(yī)務(wù)人員介入添加所述材料，這與通過機(jī)體自然生長(zhǎng)或再生過程的“添加”不同。手 術(shù)操作優(yōu)選包括通過皮下注射針的注射，但也可以使用將基于膠原蛋白的材料引入椎間盤 的其它手術(shù)方法。例如，可以通過以下將所述材料引入椎間盤通過擴(kuò)大的環(huán)狀開口的擠出、通過導(dǎo)管的輸注、通過創(chuàng)傷或手術(shù)切開產(chǎn)生的開口的插入或通過將所述材料侵入性或 低侵入性安放入椎間盤間隙的其他手段。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用細(xì)胞組合物治療開始前，抑制患者的免疫反應(yīng) 可能不是必需的或不是所期望的。的確，本文提供的結(jié)果顯示，綿羊中同種異體的STRO-Γ 專能細(xì)胞的移植在不存在免疫抑制的情況下是良好耐受的。然而，在其它情況下，在開始細(xì)胞治療前，用藥物抑制患者的免疫反應(yīng)是可取的或 適合的。可以通過使用系統(tǒng)或局部免疫抑制劑來實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，或可以通過遞送在封裝的裝置 中的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。可以將細(xì)胞封裝入膠囊，所述膠囊對(duì)細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)和氧氣以及治 療因子是可通透的，細(xì)胞對(duì)免疫體液因子和細(xì)胞是不可通透的。優(yōu)選地，密封劑是低變應(yīng)原 的，容易并穩(wěn)定地位于靶組織中并且對(duì)植入結(jié)構(gòu)提供更多的保護(hù)。用于降低或消除對(duì)于移 植細(xì)胞的免疫應(yīng)答的這些手段和其它手段是本領(lǐng)域已知的。作為選擇，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺 傳修飾以降低其免疫原性。應(yīng)當(dāng)理解，STRO-I+專能細(xì)胞或其后代可以和其它有益藥物或生物分子(生長(zhǎng)因 子、營(yíng)養(yǎng)因子)一起給藥。當(dāng)和其它試劑一起給藥時(shí)，它們可以在單一藥物組合物中共同 給藥，或在分別的藥物組合物中與其他試劑同時(shí)或按順序給藥(在其它試劑給藥之前或之 后)?？梢怨餐o藥的生物活性因子包括抗凋亡劑(例如，ΕΡ0、ΕΡ0模擬體、TPO、IGF-I 和IGF-II、HGF、半胱氨酸蛋白酶(caspase)抑制劑)；抗炎劑(例如，p38 MAI3K抑制劑、 TGF-β抑制劑、他汀類藥物、IL-6和IL-I抑制劑、哌羅來斯、曲尼司特、類克、西羅莫司和 NSAIDs (非留類抗炎藥，例如，替泊沙林、托美汀、舒洛芬)；免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)劑(例如， 鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢霉素、他克莫司)；mTOR抑制劑(例如，西羅莫司、依維莫司)； 抗增殖劑(例如，硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；皮質(zhì)留類(例如，潑尼松龍、氫化可的松)；抗體， 例如單克隆抗IL-2Ra受體抗體(例如，巴利昔單抗、達(dá)珠單抗)，多克隆抗T細(xì)胞抗體(例 如，抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)；抗淋巴球蛋白(ALG)；單克隆抗T細(xì)胞抗體0KT3))；抗血栓 形成劑(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、 抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林、雙嘧達(dá) 莫、魚精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制劑和血小板抑制劑)；和抗氧化劑(例如，普羅布考、維 生素A、抗壞血酸、生育酚、輔酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)和局部麻 醉劑。遺傳修飾細(xì)胞在一個(gè)實(shí)施方案中，STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞是遺傳修飾的，例如，用于 表達(dá)和/或分泌目的蛋白，所述目的蛋白例如是提供治療和/或預(yù)防益處的蛋白，例如胰島 素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素抑制素、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂 肪酶或淀粉酶或增強(qiáng)的血管發(fā)生相關(guān)的或是增強(qiáng)的血管發(fā)生的原因的多肽或細(xì)胞分化為 胰腺細(xì)胞或血管細(xì)胞的相關(guān)的多肽。遺傳修飾細(xì)胞的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。例如，將細(xì)胞中待表達(dá) 的核酸與啟動(dòng)子可操作地連接用于在所述細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)。例如，將核酸連接至在多種個(gè) 體細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子例如病毒啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子(例如CMV-IE啟 動(dòng)子)或SV-40啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的并且應(yīng)當(dāng)進(jìn)行必要的改動(dòng)來應(yīng) 用在本發(fā)明的實(shí)施方案上。
優(yōu)選地，以表達(dá)構(gòu)建體的形式提供核酸。本文中使用的術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”是指具 有賦予細(xì)胞內(nèi)核酸(例如，報(bào)告基因和/或相反選擇報(bào)告基因)的表達(dá)的能力的核酸，該核 酸被可操作地連接到所述被賦予表達(dá)的核酸。在本發(fā)明的背景中，應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)構(gòu)建體可 以包括或可以是質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒亞基因組或基因組片段或能夠以可表達(dá) 的方式保持和/或復(fù)制異源DNA的其它核酸。構(gòu)建用于實(shí)施本發(fā)明的合適的表達(dá)構(gòu)建體的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易 見的并且描述于，例如，Ausubel et al (In ；Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn) 代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法).Wiley Interscience, ISBN 047 150338,1987)或 Sambrook et al (In :Molecular Cloning :Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn) 手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratories,New York，第三版 2001)。例如，使用例如 PCR 從合適的模板核酸擴(kuò)增表達(dá)構(gòu)建體的每個(gè)組分并隨后克隆至諸如質(zhì)粒或噬菌粒的合適的 表達(dá)構(gòu)建體中。適于該表達(dá)構(gòu)建體的載體是本領(lǐng)域已知的和/或本文中描述的。例如，哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中適合本發(fā)明方法的表達(dá)載體為，例如，hvitrogen提供的pcDNA載體套裝的載體、 pCI載體套裝的載體(Promega)、pCMV載體套裝的載體(Clontech)、pM載體(Clontech)、 pSI 載體(Promega)、VP16 載體(Clontecti)或 pcDNA 載體套裝的載體 Qnvitrogen)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道其他載體和這些載體的來源，例如^witrogen Corporation、Clontech 或 Promega0將分離的核酸分子或包含其的基因構(gòu)建體引入細(xì)胞用于表達(dá)的手段是本領(lǐng)技術(shù) 人員已知的。用于給定生物的技術(shù)依賴于已知的成功技術(shù)。將重組DNA引入細(xì)胞內(nèi)的手段 包括顯微注射、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、諸如通過使用lipofectamine(GibCO，MD，USA)和 /或cellfectin (Gibco, MD, USA)的脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、PEG-介導(dǎo)的DNA攝取、電穿孔和諸 如通過使用DNA包被的鎢顆粒或金顆粒(Agracetus Inc. ,WI, USA)等的微顆粒轟擊?？蛇x擇地，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體是病毒載體。合適的病毒載體是本領(lǐng)域已知的并 且可以商業(yè)購買。用于遞送核酸并將所述核酸整合入宿主細(xì)胞基因組的常規(guī)基于病毒的系 統(tǒng)包括，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體或腺相關(guān)病毒載體。可選擇地，腺病毒載體對(duì)于 將保持游離的核酸引入宿主細(xì)胞是有用的。病毒載體是靶細(xì)胞和組織中基因轉(zhuǎn)移的有效且 多功能的方法。此外，在很多不同細(xì)胞類型和靶組織中觀察到了高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常包含順式作用長(zhǎng)末端重復(fù)(LTRs)，其包裝能力高達(dá) 6-10kb的外源序列。最小的順式作用LTRs對(duì)于載體的復(fù)制和包裝是足夠的，隨后，所述載 體被用于將表達(dá)構(gòu)建體整合入靶細(xì)胞中以提供長(zhǎng)期表達(dá)。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包 括基于鼠白血病病毒(MuLV)、長(zhǎng)臂猿白血病病毒(feLV)、類人猿免疫缺陷病毒(SrV)、人 免疫缺陷病毒(HIV)及其組合的那些載體(參見，例如Buchscher et al.，J Virol. 56 2731-2739(1992) ；Johann et al, J.Virol. 65 :1635-1640(1992) ；Sommerfelt et al, Virol. 76 :58-59(1990) ；Wilson et al, J. Virol. 63 :274-2318(1989) ；Miller et al.， J.Virol. 65 :2220-2224(1991) ；PCT/US94/05700 ；MiIler and Rosman BioTechniques 7 980-990,1989 ；Miller, A. D. Human Gene Therapy 7 :5-14,1990 ；Scarpa et al Virology 75 :849-852,1991 ；Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 :8033-8037,1993)。已經(jīng)開發(fā)出了用于核酸遞送的各種腺相關(guān)病毒(AAV)載體系統(tǒng)。使用本領(lǐng)域已知技術(shù)可以容易地構(gòu)建AAV載體。參見，例如，美國(guó)專利第5，173，414號(hào)和第5，139，941號(hào)； 國(guó)際公布第 WO 92/01070 號(hào)和第 WO 93/03769 號(hào)；Lebkowski et al. Molec. Cell. Biol. 5 3988-3996,1988 ；Vincent et al. (1990)Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ；Carter Current Opinion in Biotechnology 5 :533-539,1992 ；Muzyczka. Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158 :97-129,1992 ；Kotin, Human Gene Therapy 5 :793-801,1994 ；Shelling and Smith Gene Therapy 7 :165-169，1994 ；以及 Zhou et al. J Exp. Med. 179 :1867-1875，1994。對(duì)于遞送本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體有用的其他病毒載體包括，例如，來源于諸如牛痘 病毒和鳥痘病毒的病毒的痘家族或甲病毒屬或接合病毒載體(例如，描述于Fisher-Hoch et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA 56 :317-321,1989)的那些載體。
實(shí)施例實(shí)施例1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)24 只綿羊接受了將 1. OIU 軟骨素酶 ABC(cABC) (Seikagaku Corporation, Japan) 注射入3個(gè)相鄰的腰椎間盤內(nèi)(名稱為L(zhǎng)3-L4、L4-L5和L5-L6)以起始進(jìn)行性椎間盤退變。 剩余的腰椎間盤(名稱為L(zhǎng)1-L2和L2-L3)未注射cABC并作為正常對(duì)照。給予cABC 15周 后(士3周)，將混合了等體積的Euflexxa 透明質(zhì)酸(Ferring Pharmaceuticals)的高或 低劑量(分別為4 X IO6或0. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞)的STRO-Γ專能細(xì)胞或ProFreeze NOA凍存 培養(yǎng)基(Lonza Walkersville Md.)的注射直接給予椎間盤的髓核內(nèi)(表1)。注射后3個(gè) 月或6個(gè)月對(duì)動(dòng)物進(jìn)行尸體剖檢。圖1為用于研究的脊柱節(jié)段和治療方案的示意圖。表1:研究設(shè)計(jì)摘要
權(quán)利要求
1.重建和/或修復(fù)個(gè)體中椎間盤的方法，所述方法包括將STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其 后代細(xì)胞給予椎間盤。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述STRO-Γ專能細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞給予至 椎間盤的髓核中。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述STRO-Γ專能細(xì)胞對(duì)于TNAP+(STR0-3)、VCAM_1+、 ΤΗΥ-Γ、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+或其任意組合也是陽性的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述STRO-Γ專能細(xì)胞衍生自同種異體來源。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括將糖胺聚糖(GAG)給予椎間盤。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述GAG選自透明質(zhì)酸(HA)、硫酸軟骨素、硫酸皮膚 素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸肝素和硫酸半乳糖胺葡萄糖醛酸聚糖(GGGS)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體具有特征為椎間盤退變的脊柱疾病狀況。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述脊柱疾病狀況是下背部疼痛、椎間盤的年齡相 關(guān)改變或椎骨脫離。
全文摘要
本發(fā)明涉及個(gè)體中椎間盤的修復(fù)和重建的方法，所述方法包括給予STRO-1+專能細(xì)胞。本發(fā)明的方法在治療特征為椎間盤退變的脊柱疾病狀況中是有用的。
文檔編號(hào)A61P19/02GK102099043SQ200980124157
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者彼得·高希 申請(qǐng)人:成血管細(xì)胞系統(tǒng)公司