專利名稱：一種可治療肝癌的藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種藥物，尤其是一種可治療肝癌的藥物。
背景技術：
肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡排位中僅次于胃、食道 而居第三位；在部份地區(qū)的農村中則占第二位，僅次于胃癌。我國每年死于肝癌約11萬人， 占全世界肝癌死亡人數的45%。肝癌的治療多采用手術切除，放療和化療相結合的方式，目前常用的化療藥為順 氯銨鉬、阿霉素或表阿霉素、絲裂霉素、5-氟脲嘧啶或氟苷等，這些藥物在殺傷腫瘤細胞的 同時，對正常組織和細胞產生了很大的損傷，使病人不能耐受。因此，尋找高效、高選擇性、 低毒的抗腫瘤化療藥成為當前抗癌藥物研究的方向和迫切任務。從天然物質中尋找抗腫瘤 藥物被認為是一種有效的途徑，對天然活性物質進行抗腫瘤作用的研究，尤其在抑制增殖 及誘導凋亡和分化方面進行探索，將有助于獲得理想的抗腫瘤藥物。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠通過啟動凋亡機制治療肝癌的藥物，它對人肝癌 細胞可產生選擇性殺傷，而對人正常肝細胞影響卻較小。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了殼聚糖亞硒酸酯在制備一種可治療肝癌的 藥物中的應用。其中殼聚糖亞硒酸酯為藥物的有效成分。進一步的，上述治療肝癌的藥物可為片劑、膠囊、混懸劑。其中，片劑的制備方法為殼聚糖亞硒酸酯50 IOOmg/片、硬脂鎂0.65mg/片、無 水乳糖80mg/片，將殼聚糖亞硒酸酯過200目篩，與硬脂鎂，無水乳糖混勻、壓片。膠囊的制備方法為殼聚糖亞硒酸酯50 IOOmg/膠囊、淀粉150mg/膠囊、硬脂鎂 Img/膠囊，將殼聚糖亞硒酸酯過200目篩，與硬脂鎂，淀粉混勻，裝入2號硬空心膠囊?；鞈覄┑闹苽浞椒闅ぞ厶莵單狨?0 100mg/5ml、單硬脂酸鋁75/5ml、椰子 油5ml，將殼聚糖亞硒酸酯過200目篩，單硬脂酸鋁均勻分散于椰子油中加熱至攝氏115度， 放冷后加入過篩后的殼聚糖亞硒酸酯及適量的校味劑。再進一步的，所述殼聚糖亞硒酸酯的口服劑量范圍為每日1000毫克至4克。有益效果本發(fā)明所述的一種殼聚糖亞硒酸酯在制備治療肝癌的藥物中的應用，通過研究表 明硒是人和動物體內必需的微量元素之一，硒對多種腫瘤都具有顯著的預防和治療作用。 而殼聚糖[β (1，4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是存在于自然界中的一種堿性生物多 糖，在酸性條件下帶正電，與腫瘤細胞表面的陰離子可以通過吸附放電進行中和，抵制其生 長，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等多種生物活性，且生物相容性良好，幾乎無毒性，沒有其它不 良反應，殼聚糖亞硒酸酯是將硒酸根吸附于殼聚糖單體2-ΝΗ2和6-0Η制備成的低分子量有 機硒，可有效克服無機硒不易被細胞吸收，活性和毒性范圍較窄，致死量LC5tl相對較小，具有蓄積性毒性和致突變作用，使用時劑量難以控制等缺點。因此，殼聚糖亞硒酸酯比無機硒 具有更強的抗腫瘤作用，且毒副作用也小得多。
具體實施例方式以下通過對具體實施例的研究分析進一步分析、確認本發(fā)明。實施例1 殼聚糖亞硒酸酯對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞增殖抑制作用及對人正常肝 細胞的影響。取對數生長期的人肝癌細胞SMMC-7721和人正常肝細胞L02接種于96孔培養(yǎng)板 上，每孔接種量分別為3000 4000個/100 μ L和6000個/100 μ L，培養(yǎng)24h后，實驗組加入 不同濃度的殼聚糖亞硒酸酯100 μ L，每個濃度做三個復孔；陰性對照組加培養(yǎng)液100μ L， 作用不同時間(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT 20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，甩去上清，每孔 加二甲亞砜150 μ L。用DG-3022型酶標儀(中國南京)測定550nm處各孔的吸光度值，各 組取平均值，計算抑制率。生長抑制率=(空白組光密度-實驗組光密度)/空白組光密 度X 100%。用SPSS13.0軟件進行統計學分析，并計算IC5(I。結果殼聚糖亞硒酸酯對人肝 癌細胞SMMC-7721具有明顯的增殖抑制作用，并呈劑量依賴性和時間依賴性，其4 和7 的IC5tl值分別為35. 25%和12. 71% ；而殼聚糖亞硒酸酯對人正常肝細胞抑制作用則較小， 其4 和72h的IC5tl值分別大于80%和40%?？梢姎ぞ厶莵單狨Ω伟┘毎哂忻黠@ 的選擇性抑制作用。實施例2 殼聚糖亞硒酸酯對體外培養(yǎng)的人肝癌細胞誘導凋亡作用。(1)殼聚糖亞硒酸酯對人肝癌細胞形態(tài)的影響①熒光顯微鏡觀察不同濃度的殼聚糖亞硒酸酯處理12J4和7 后的肝癌細胞 用丫啶橙(AO)和溴化乙錠(EB)混合熒光染料染色后，分別接種于多個蓋玻片上，在熒光顯 微鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化。結果鏡下可觀察到早、中期凋亡細胞的細胞核或細胞質內 有濃染致密的顆粒狀黃綠色熒光，核染色質濃縮，核破裂，凋亡小體釋放等典型的凋亡細胞 形態(tài)學改變；同時凋亡有時間及劑量依賴關系。②電子顯微鏡觀察100mg/L殼聚糖亞硒酸酯處理人肝癌細胞4 后為實驗組，不 加硒化殼聚糖及殼聚糖處理的肝癌細胞為對照組，兩組細胞經0. 25%胰酶消化后，離心收 集細胞沉淀，用4°C預冷的2. 5%戊二醛加多聚甲醛混合液固定，鋨酸后固定，環(huán)氧 樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬鉛染色，日立HU-12A型透射電鏡觀察并拍照。結果不 同濃度的殼聚糖亞硒酸酯處理后的肝癌細胞出現典型的凋亡形態(tài)學改變，細胞變小，細胞 質濃縮，內質網擴張，核仁消失，細胞核內染色質邊聚集于核膜下，可見核固縮、核破裂和凋 亡小體；凋亡細胞約占10%至20%。(2)流式細胞儀分析收集殼聚糖亞硒酸酯作用后的細胞，加70%乙醇lml，-20°C 固定Mh，加入碘化丙錠(PI)(終濃度為50ul/ml)和RNA酶(終濃度為0. 25mg/ml)，室溫下 避光孵育30min后，用Epics Elite ESP型流式細胞儀作DNA分析，以DNA含量低于Gl期 的亞Gl期細胞為凋亡細胞，以ModFit LT軟件分析，擬合計算出各時相細胞的百分比。結 果肝癌細胞經不同濃度殼聚糖亞硒酸酯作用對和4 后，可見到典型的亞二倍體凋亡峰， 且呈明顯的時間和劑量依賴性。軟件分析可見隨著殼聚糖亞硒酸酯劑量的增加，GO-Gl期細 胞的比例由對照的35. 4%上升到58. 2%，S期細胞的比例由對照的58. 5%下降至41. 4%,而G2-M期細胞的比例則由對照的6. 下降至0. 4%，細胞受阻于GO-Gl期。(3)片段化DNA的瓊脂糖凝膠電泳測定收集3X IO6個實驗組和對照組細胞， 用PBS離心洗滌，置_20°C冰箱放置IOmin后，加入Iml細胞裂解液(lOmmol/LTris. HCL PH8. 0,0. lmmol/L EDTA, 10mmol/L NaCL, 1% SDS)中，再加入蛋白酶 K 至終濃度為 lg/L，輕 輕振搖使溶液混勻呈粘糊狀，50°C過夜，待其冷卻至室溫后，加入等體積的飽合酚溶液，混 合兩相，IO5g離心lOmin，小心吸出上層水相，再加入等體積飽合酚溶液重復抽提1次，直 到無蛋白混入，吸上清加入氯仿異戊醇(1 1)按上述方法再抽提1次后，取水相層加入 1/10體積3mol/L醋酸鈉溶液，混勻后加入2. 5倍體積的冰冷無水乙醇混合置_20°C中放 置30min，IO5g離心IOmin沉淀DNA，棄去無水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，將EP管倒置于 吸水紙上，吸干乙醇，加入 200 μ ITE 緩沖液(lmmol/L EDTA, lOmmol/LTris. HCLPH7. 8)溶 解DNA，再加入25ulRNA酶(10g/L)放置37°C中，30min后，置4°C冰箱保存。瓊脂糖凝膠電 泳用TBE (lmmol/L EDTA PH 8.0,45mmol/L Tris.硼酸)緩沖液配制1. 8%瓊脂糖凝膠，取 10 μ IDNA樣品與含0. 25%溴酚蘭、4%蔗糖的上樣緩沖液混勻后加樣。電壓60V，電泳Ih 后，以終濃度為0. 5mg/L溴化乙錠(EB)染色，紫外燈下觀察并拍照。結果對照組在靠近加 樣孔的地方出現了一個大分子條帶，而殼聚糖亞硒酸酯100、200mg/L作用4 可引起肝癌 細胞DNA的降解，見明顯的凋亡特征性梯狀條帶。結果表明，殼聚糖亞硒酸酯對肝癌細胞具有顯著的誘導凋亡作用。實施例3 殼聚糖亞硒酸酯對肝癌細胞CaSpaSe-3、8、9酶活性影響。收集3 X IO6個實驗組和對照組細胞，加預冷)細胞裂解液05 μ L/106個細 胞)混勻，冰浴IOmin后IO5g離心lmin，吸取上清存于冰水浴管中，用于測定Caspase酶 活性及蛋白含量。按順序加入50 μ L上清，50 μ L反應液(臨用前每ImL反應液加IOyL DTT)、5 μ L底物于96孔板中，37°C溫育池，酶標儀檢測405nm波長光密度。設無上清孔及陰 性對照孔，實驗重復三次。結果殼聚糖亞硒酸酯100、200mg/L作用肝癌細胞24h、4 !后， Caspase-3,9酶活性較對照組顯著升高，且隨藥物劑量增加及時間延長酶活性也相應升高， 存在一定的劑量和時間依賴關系。而Caspase-8酶活性與對照比較無意義。說明殼聚糖亞 硒酸酯能夠激活肝癌細胞CaspaseU，而不能激活Caspase-8。實施例4 殼聚糖亞硒酸酯對小鼠灌胃或皮下注射的半數致死量(LD5tl)測定。以小鼠能允許的最大濃度10%的殼聚糖亞硒酸酯混懸液0.%il/10g灌胃或皮下 注射測不出ID5tl，根據新藥審批辦法中對急性毒性的要求，進行了最大耐受量的測定，當給 予殼聚糖亞硒酸酯16g/kg. Mh，對小鼠未見明顯毒性反應，表明其最大耐受量大于16g/ kg，毒性很低。實施例5 殼聚糖亞硒酸酯對動物肝癌腹水瘤的抑制作用。選擇腫瘤生長良好，全身狀態(tài)較好的肝癌腹水瘤荷瘤小鼠，頸椎脫白處死，固定后 碘酒酒精消毒，無菌條件下抽取腹水，按1 4比例加入無菌生理鹽水，取0.2mL接種于ICR 小鼠(合格證書SCXK(鄂)2007-0001)腹腔中，接種腫瘤后，小鼠按體重隨機分組，設陽性 對照組、陰性對照組及不同劑量給藥組。陽性對照組給予氟尿嘧啶，陰性對照組給予等量溶 劑，給藥組給予不同劑量殼聚糖亞硒酸酯。于接種當日開始給藥，連續(xù)10d。記錄實驗小鼠 生存時間，并計算生命延長率。生命延長率％=(藥物組平均生存時間/陰性對照組平均 生存時間-1) X 100%，將結果進行統計學處理。結果大、中、小劑量殼聚糖亞硒酸酯(3、2、
5lg/kg)皮下注射對肝癌腹水瘤荷瘤小鼠生命延長率分別是36. 3%,21.9%,19. 3%;而灌胃 給藥生命延長率則分別是39.4%, 31. 5%和20. 4% ο綜上所述，本發(fā)明所涉及的殼聚糖亞硒酸酯可通過激活肝癌細胞CaspaseU從 而啟動凋亡，對人肝癌細胞產生選擇性殺傷作用，而對人正常肝細胞影響較小。本發(fā)明中所述的殼聚糖亞硒酸酯的制備方法參見篇名為《硒化殼聚糖的制備及其 表征》，期刊為海峽藥學STRAIT PHARMACEUTICAL JOURNAL 2005年17卷3期的文章。文中 所述的硒化殼聚糖化學名稱為殼聚糖亞硒酸酯。
權利要求
1.殼聚糖亞硒酸酯在制備一種可治療肝癌的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述殼聚糖亞硒酸酯 為藥物的有效成分。
3.根據權利要求1或2所述的所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述藥物 為片劑、膠囊、混懸劑。
4.根據權利要求3所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述片劑是由殼聚糖 亞硒酸酯50 IOOmg/片、硬脂鎂0. 65mg/片、無水乳糖80mg/片組成，將殼聚糖亞硒酸酯 過200目篩，與硬脂鎂、無水乳糖混勻，然后壓片。
5.根據權利要求3所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述膠囊是由殼聚糖 亞硒酸酯50 IOOmg/膠囊、淀粉150mg/膠囊、硬脂鎂Img/膠囊組成，將殼聚糖亞硒酸酯 過200目篩，與硬脂鎂、淀粉混勻，裝入2號硬空心膠囊。
6.根據權利要求3所述的一種可治療肝癌的藥物，其特征在于所述混懸劑是由殼聚 糖亞硒酸酯50 100mg/5ml、單硬脂酸鋁75/5ml、椰子油5ml組成，將殼聚糖亞硒酸酯過 200目篩，單硬脂酸鋁均勻分散于椰子油中加熱至攝氏115度，放冷后加入過篩后的殼聚糖 亞硒酸酯及適量的校味劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了殼聚糖亞硒酸酯在制備一種可治療肝癌的藥物中的應用。通過研究表明硒是人和動物體內必需的微量元素之一，硒對多種腫瘤都具有顯著的預防和治療作用。而殼聚糖[β(1，4)-2-氨基-2-去氧-D-葡萄糖]是存在于自然界中的一種堿性生物多糖，在酸性條件下帶正電，與腫瘤細胞表面的陰離子可以通過吸附放電進行中和，抵制其生長，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等多種生物活性，且生物相容性良好，幾乎無毒性，沒有其它不良反應，殼聚糖亞硒酸酯是將硒酸根吸附于殼聚糖單體2-NH2和6-OH制備成的低分子量有機硒，具有較強的抗腫瘤作用，且毒副作用也小得多。
文檔編號A61P35/00GK102078324SQ20091027294
公開日2011年6月1日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權日2009年11月27日
發(fā)明者余開峰, 曹鳳軍, 曾小華, 李林均, 李芳 , 潘東風, 王一平, 蔡曉軍, 鄧守恒, 陳萍 申請人:鄖陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院