專利名稱：：Pcl-pla-tpgs共聚物及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物材料
技術領域：
，特別是涉及PCL-PLA-TPGS共聚物及制備方法和應用。
背景技術：
：聚e-己內酯(PCL，Polyc即rolactone)是美國FDA批準的藥用輔料，具有優(yōu)良的藥物透過性、優(yōu)異的生物可降解性和生物相容性。但線性PCL具有較高的結晶度，親水性較差，降解速率慢，影響了其應用范圍。因此有必要通過結構的改變和引入親水性鏈段來降低PCL的結晶性，提高其親水性能，以使其成為更為有效的藥物傳遞材料。聚乳酸(Polylactide，PLA)亦稱為聚丙交酯，是一種具有優(yōu)良的生物相容性和可生物降解性的合成高分子材料，也已經被美國FDA批準用于人體內使用，與PCL共聚可以用于調節(jié)降解、機械和物理性能。VitaminETPGS(TPGS)是聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(D_a-tocopherolpolyethyleneglycol1000succinate)的簡稱，是維生素E的水溶性衍生物，由維生素E琥珀酸酯(T0S)的羧基與聚乙二醇1000(PEG1000)酯化而成，相對分子量約為1513，分子結構如圖1所示，已載入《美國藥典》。TPGS最早由美國Eastman公司生產并上市，在國外現已廣泛應用于制劑研究中，TPGS是淡黃色的蠟狀固體，近乎無味，它是一種兩親分子，有一個親水的極性頭部和一個疏水的脂肪族碳鏈尾部分子，能溶于水，也能溶于大多數極性有機溶劑。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種可以降低PCL的結晶性，提高其親水性能的PCL-PLA-TPGS共聚物。本發(fā)明的第二個目的是提供一種PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法。本發(fā)明的第三個目的是提供一種PCL-PLA-TPGS共聚物的用途。本發(fā)明的技術方案概述如下PCL-PLA-TPGS共聚物，具有下式結構ODOf>h和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(II)其中n=30-60a=2-490b=2-380c=2-380d=2-490。PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)的制備方法，包括如下步驟按質量百分比取2%_95%的e己內酯單體、2%-95%的丙交酯單體和3%-40%的聚乙二醇IOOO維生素E琥珀酸酯為原料放入聚合設備中，加入所述原料質量的0.1X-1^的催化齊U，抽真空，充氮氣，在密閉的聚合設備中，在140-16(TC反應12-20小時，即獲得分子量為3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)。還可以將PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)溶于二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入甲醇或石油醚使PCL-PLA-TPGS共聚物沉淀，過濾，將沉淀于30-50°C真空干燥，即獲得分子量為3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)。丙交酯單體為外消旋丙交酯、左旋丙交酯或右旋丙交酯。催化劑可以是辛酸亞錫、有機胍、金屬鋅、三丁基氯化錫、乙酰丙酮鐵、乳酸鋅、納米氧化鋅、?；撬?、乙醇鐵、正丙醇鐵、異丙醇鐵或正丁醇鐵。抽真空，充氮氣的次數為1-3次。反應溫度以145。C為最佳。分子量為3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)在制備藥用輔料中的應用。本發(fā)明的PCL-PLA-TPGS共聚物具有良好的生物相容性，生物可降解性。本發(fā)明的方法制備簡單，無污染。本發(fā)明的PCL-PLA-TPGS共聚物應用于藥物制劑(例如載藥納米粒，凝膠和載藥微球等等)和組織工程領域(例如人工器官，手術縫線和血管支架等)。圖1為VitaminETPGS的化學結構式。圖2為PCL-PLA-TPGS共聚物合成示意圖。圖3為PCL-PLA-TPGS與VitaminETPGS的傅里葉變換紅外光譜圖。圖4為PCL-PLA-TPGS共聚物與VitaminETPGS的核磁共振光譜圖。圖5為PCL-PLA-TPGS共聚物與VitaminETPGS的凝膠色譜圖。圖6為PCL-PLA-TPGS共聚物與VitaminETPGS的熱重分析儀表征結果。圖7為載多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS納米粒的FESEM圖。圖8為激光粒度儀檢測載藥PCL-PLA-TPGS納米粒的粒徑和粒徑分布結果。圖9為Zeta電位儀測量載藥PCL_PLA_TPGS納米粒的結果。圖10為差示掃描量熱儀表征多烯紫杉醇晶體及載多烯紫杉醇PCL與PCL-PLA-TPGS納米粒的結果。圖11為以0.03%TPGS為乳化劑制備載藥量為10%的載多烯紫杉醇PCL和PCL-PLA-TPGS納米粒的體外藥物釋放曲線。圖12.24小時后，載多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS納米粒、Taxotere⑧(與載藥納米粒相同多烯紫杉醇劑量)以及空白PCL-PLA-TPGS納米粒(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)對Hela細胞的細胞活力實驗結果。圖13.48小時后，載多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS納米粒、Taxotere⑧(與載藥納米粒相同多烯紫杉醇劑量)以及空白PCL-PLA-TPGS納米粒(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)對Hela細胞的細胞活力實驗結果圖14.72小時后，載多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS納米粒、Taxotere⑧(與載藥納米粒相同多烯紫杉醇劑量)以及空白PCL-PLA-TPGS納米粒(與載藥納米粒相同納米粒懸液濃度)對Hela細胞的細胞活力實驗結果圖15.激光共聚焦掃描電子顯微鏡觀察用PCL-PLA-TPGS共聚物材料制備的載香豆素_6納米粒在37t:下孵育4小時的Hela細胞。細胞核用DAPI染成藍色，載香豆素_6納米顆粒是綠色的，分別通過EGFP通道和DAPI通道觀察細胞攝取情況左圖是通過EGFP通道觀察的情況(A);中圖是通過DAPI通道觀察的情況(B);右圖是通過EGFP通道和通過DAPI通道觀察的圖像重疊后的結果(C)。圖16.載紫杉醇PCL-PLA-TPGS微球的掃描電鏡(SEM)圖。圖17.各種PCL-PLA-TPGS共聚物在37。C的PBS溶液中的體外降解(n=3)。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，包括如下步驟按質量百分含量取2%的e己內酯單體、95%的外消旋丙交酯單體和3%聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯為原料，放入聚合管中，加入原料質量0.5X的醋酸四甲基二丁基胍，抽真空，充氮氣，聚合管封管，在145t:加熱，反應16小時，即獲得分子量為46000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)。圖2所示為PCL-PLA-TPGS共聚物的合成反應式。VitaminETPGS作為引發(fā)劑。圖3為PCL-PLA-TPGS共聚物與VitaminETPGS的傅里葉變換紅外光譜圖。TPGS的羰基峰在1739cm—1處，而在PCL-PLA-TPGS共聚物中TPGS的羰基峰移至1731cm—1左右。2880cm—1處是TPGS的亞甲基的碳氫伸縮振動峰，2867-2947cm—1處是PCL亞甲基的碳氫伸縮振動峰，2945cm—1左右是PLA亞甲基的碳氫伸縮振動峰，在PCL-PLA-TPGS共聚物中，這三個峰有部分重疊。3400-3650cm—1處是共聚物端羥基的峰，1045-1295cm—1處是碳氧伸縮振動峰，其中1241cm—1處是不對稱碳氧碳伸縮振動峰，1295cm—1處的峰通常用來研究PCL中結晶性能的改變。傅里葉變換紅外分析結果說明PCL-PLA-TPGS共聚物合成成功。實施例2PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，包括如下步驟按質量百分含量取58%的己內酯單體、2%的左旋丙交酯單體和40%聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯為原料放入聚合管中，加入所述原料質量的1%的鋅粉，抽真空，充氮氣，聚合管封管，在145t:加熱，反應12小時，即獲得分子量為4200的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(11)。將PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)溶于二氯甲烷中，加入甲醇使PCL-PLA-TPGS共聚物沉淀，過濾，將沉淀于50°C真空干燥，即獲得分子量為4200的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)禾口(11)。實施例3PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，包括如下步驟按質量百分含量取95%的己內酯單體、2%的右旋丙交酯單體和3%聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯為原料放入聚合管中，加入所述原料質量0.2%的乙醇鐵，抽真空，充氮氣，在密閉的聚合設備中，在15(TC加熱，反應12小時，即獲得分子量為51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)禾P(II)。將PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)溶于乙酸乙酯中，加入石油醚使PCL-PLA-TPGS共聚物沉淀，過濾，將沉淀于3(TC真空干燥，即獲得分子量為51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)禾口(11)。實施例4PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，包括如下步驟準確稱取7.5g己內酯單體(e-Caprolactone)、1.5g外消旋丙交酯單體(DL-lactide)、lgVitaminETPGS為原料，取原料質量O.1%的催化劑辛酸亞錫催化劑加入聚合管中，進行抽真空脫氣和氮氣置換過程，重復三次，將聚合管封口，于145°C油浴加熱下進行開環(huán)聚合反應。聚合反應16小時后，產物經冷卻溶于二氯甲烷中，并加入過量甲醇使共聚物沉淀。過濾除去甲醇未反應的單體和VitaminETPGS。將所得沉淀于45。C真空干燥48小時即得聚合產物PCL-PLA-TPGS共聚物。傅里葉變換紅外光譜、核磁共振氫譜、凝膠色譜和熱重分析結果證明PCL-PLA-TPGS共聚物合成成功。通過核磁共振氫譜可以計算出PCL-PLA-TPGS共聚物中各組分的含量及其數均分子量。圖4為PCL-PLA-TPGS共聚物與VitaminETPGS的核磁共振光譜圖。3.65卯m(c峰)是TPGS聚乙二醇中_CH2的峰，這是TPGS的特征峰?；瘜W位移值比較低區(qū)域的幾個小矮峰分別歸屬于維生素E分子中不同化學環(huán)境下的質子。聚乳酸(PLA)在5.lppm處會出現一個特征峰，在PCL-PLA-TPGS共聚物中這個峰由于反應后化學環(huán)境的改變而移到5.2ppm。5.2ppm(a峰)和1.69ppm(e峰)這兩個峰分別是PLA的-CH和-CH3的質子峰。4.06ppm(b峰)、2.31ppm(d峰)、1.6-1.7ppm(e峰)禾P1.4ppm(f峰)是聚己內酯(PCL)中-0CH2、_C0CH2、_CH2(4H)、_CH2(2H)質子的特征峰。核磁共振氫譜分析結果亦說明PCL-PLA-TPGS共聚物合成成功。如圖4所示，通過PCL-PLA-TPGS共聚物中PLA的特征峰5.2卯m(a峰)、PCL的特征峰4.06ppm(b峰)和TPGS的特征峰3.65卯m(c峰)的峰面積比值可以計算出PCL-PLA-TPGS共聚物中所含各成分的比例分別為8.87%(PLA)、69.5%(PCL)和21.63%(TPGS)，再根據TPGS的分子量1513及在PCL-PLA-TPGS共聚物中與丙交酯單體、己內酯單體的摩爾比例可以計算出PCL-PLA-TPGS共聚物的數均分子量是34987。圖5為PCL-PLA-TPGS共聚物與VitaminETPGS的凝膠色譜圖。從圖中可以看出，反應產物不是丙交酯單體、己內酯單體和維生素ETPGS的物理混合物，而是PCL-PLA-TPGS共聚物。其中，TPGS的出峰時間為28.23min，而PCL-PLA-TPGS共聚物的的出峰時間為17.51min。PCL-PLA-TPGS共聚物的GPC結果中檢測不到TPGS的峰，而僅出現一個狹窄的單峰。通過凝膠滲透色譜圖計算出PCL-PLA-TPGS共聚物的數均分子量是35209，與由核磁共振譜圖計算得出的結果(34987)相吻合。圖6為PCL-PLA-TPGS共聚物與VitaminETPGS的熱重分析儀表征結果。熱重分析儀檢測的是隨溫度的變化，樣品中成分因蒸發(fā)裂解等造成重量變化的情況。從圖中可以看出，VitaminETPGS僅在380-450。C有一個拐點，而PCL-PLA-TPGS的圖有三個拐點，每個拐點代表聚合物中的一個成分因加熱而失重，200-38(TC和380-45(TC的失重峰分別是由聚合物中的PLA-PCL和VitaminETPGS部分造成的，其中PLA和PCL的失重溫度有所重合。熱重分析檢測結果進一步證明PCL-PLA-TPGS(I)和(II)共聚物合成成功。實施例5PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，包括如下步驟按質量百分含量取2%的e己內酯單體、58%的左旋丙交酯單體和40%的聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯為原料放入聚合設備中，加入所述原料質量的0.5%的催化劑三丁基氯化錫，抽真空，充氮氣，再抽真空，充氮氣，在密閉的聚合設備中，在15(TC反應20小時，即獲得分子量為3600的PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)。本實施例的催化劑還可以采用乙酰丙酮鐵、乳酸鋅、納米氧化鋅、?；撬?、正丙醇鐵、異丙醇鐵或正丁醇鐵進行催化反應。分子量為9000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)和(II)在制備藥用輔料中的應用。實施例6利用超聲乳化/溶劑揮發(fā)法制備了載多烯紫杉醇(Docetaxel)PCL-PLA-TPGS納米粒。制備方法如下準確稱取100mgPCL-PLA-TPGS共聚物和一定量的多烯紫杉醇藥物，溶于8ml二氯甲烷中。在攪拌條件下，將該溶液加入到120ml的0.03%TPGS水溶液中。在冰浴條件下以25w功率超聲分散120s，形成水包油型乳液，減壓揮發(fā)除去有機溶劑。22000rpm離心20min，用去離子水洗滌三次，以除去乳化劑和游離的藥物。所得沉淀重懸于10m去離子水中，冷凍干燥得載多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS納米粒產品。掃描電鏡結果顯示(圖7)，納米粒子大小較均一，外表光滑，呈球形，粒徑大約在200nm左右。如圖8所示，納米粒粒度分布較窄，粒徑大約在200nm左右，進一步證實了掃描電鏡的觀察結果。如圖9所示，納米粒的Zeta電位在-20!^左右，表面電荷的絕對值比較高，顆粒之間相互排斥作用較強，因而在分散相中高度穩(wěn)定。如表1所示，使用0.03%TPGS作為乳化劑制備載藥量為10%的載多烯紫杉醇納米粒，可以使包封率達到90%以上。如圖IO所示，多烯紫杉醇晶體的吸熱峰在173°C，而載多烯紫杉醇PCL和PCL-PLA-TPGS納米粒均未見多烯紫杉醇晶體的吸熱峰，說明多烯紫杉醇被包裹在納米粒中，其吸熱峰消失了。如圖ll所示，載多烯紫杉醇PCL和PCL-PLA-TPGS納米粒具有相似的釋放曲線，呈兩相釋放特征并伴隨初始的"突釋效應"。如圖12、13和14所示，不載藥的空白PCL-PLA-TPGS納米粒具有良好的生物相容性，因為在不同納米粒懸液濃度下它對細胞均沒有明顯的毒性；在48h和72h后，載多烯紫杉8醇PCL-PLA-TPGS納米粒比商業(yè)多烯紫杉醇制劑Taxoter^在藥物濃度相同情況下對Hela細胞的毒性要大得多；隨著孵育時間增加，載藥納米粒和Taxoter^處理后的細胞存活率都明顯下降。例如，在12.5mg/l的藥物濃度下，24h后用載藥納米顆粒處理的細胞存活率為86.22X，對于Taxotere⑧相同條件下的細胞存活率是78.35%，也就是說24h后載藥納米顆粒的細胞毒性比Taxotere⑧的細胞毒性低36.35%。在相同藥物濃度下，48h和72h后用載藥納米粒處理的細胞毒性比丁&乂(^^@的細胞毒性高65.4%和120.65%。MTT實驗結果說明載多烯紫杉醇PCL-PLA-TPGS納米粒對Hela細胞的毒性具有時間和濃度依賴性。表1.用PCL-PLA-TPGS共聚物材料制備載多烯紫杉醇納米粒過程中，載藥量與乳化劑對納米粒包封率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例7利用超聲乳化/溶劑揮發(fā)法制備載香豆素_6的PCL-PLA-TPGS納米粒。制備方法如下準確稱取lOOmg實施例4制備的PCL-PLA-TPGS共聚物和12mg的香豆素_6，溶于8ml二氯甲烷中。在攪拌條件下，將該溶液加入到120ml的0.03%TPGS水溶液中。在冰浴條件下以25w功率超聲分散120s，形成水包油型乳液，減壓揮發(fā)除去有機溶劑。22000rpm離心20min，用去離子水洗滌三次，以除去乳化劑和游離的香豆素-6。所得沉淀重懸于10m去離子水中，冷凍干燥得載香豆素_6的PCL-PLA-TPGS納米粒產品。納米粒粒徑在200納米左右。利用DAPI對細胞核染色，可以在細胞攝取實驗中通過對細胞核的定位來確定載香豆素-6納米粒在細胞中的位置。圖15是用激光共聚焦掃描電子顯微鏡觀察Hela細胞對由PCL-PLA-TPGS制備的載香豆素_6納米顆粒的攝取結果。從圖中可以看出，僅僅在與細胞孵育4小時后，納米粒就已經被細胞所攝取。從圖A與圖B合并得到的圖C可以清楚得看到，呈綠色的納米粒大多數位于細胞質中，緊緊包圍著呈藍色的細胞核。實施例8利用溶劑揮發(fā)法制備載紫杉醇(Paclitaxel)PCL-PLA-TPGS微球。制備方法如下準確稱取200mg實施例4制備的PCL-PLA-TPGS共聚物和50mg的紫杉醇粉末，溶于16ml二氯甲烷中。在攪拌條件下，將該溶液加入到500ml的1%聚乙烯醇水溶液中。1000rpm轉速下攪拌兩小時，形成水包油型乳液，800rpm轉速下揮發(fā)過夜。2000rpm離心15min，用去離子水洗滌三次，以除去乳化劑和游離的藥物。所得沉淀重懸于10m去離子水中，冷凍干燥得載紫杉醇PCL-PLA-TPGS微球制劑。如圖16所示，載紫杉醇PCL-PLA-TPGS微球表面光滑，粒徑在10微米左右。紫杉醇PCL-PLA-TPGS微球的載藥量為20%，包封率在80%以上。實施例9通過本發(fā)明的方法合成了多種PCL-PLA-TPGS共聚物，然后研究其體外降解行為。其中，PCL-PLA-TPGS(50:47:3)的數均分子量為48900，PCL-PLA-TPGS(50:42:8)的數均分子量為17937，PCL-PLA-TPGS(50:38:12)的數均分子量為12500。10mg聚合物置于含有1.5mLPBS的離心管中，在37t:恒溫水浴中振蕩。定期取樣，冷凍干燥，稱重。使用GPC對結果進行分析。如圖17所示，TPGS含量高的PCL-PLA-TPGS共聚物的降解速率更快。30天后，PCL-PLA-TPGS(50:38:12)、PCL-PLA-TPGS(50:42:8)、PCL-PLA-TPGS(50:47:3)和PLGA(分子量50000)分別降解了38.1%、35.5%、27.9%和14.3%。權利要求PCL-PLA-TPGS共聚物，其特征是具有下式結構和其中n＝30-60a＝2-490b＝2-380c＝2-380d＝2-490。F2009102286290C00011.tif,F2009102286290C00012.tif2.權利要求1的PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，其特征是包括如下步驟按質量百分比取2%-95%的e己內酯單體、2%-95%的丙交酯單體和3%-40%的聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯為原料放入聚合設備中，加入所述原料質量的0.1%-1%的催化劑，抽真空，充氮氣，在密閉的聚合設備中，在140-16(TC反應12-20小時，即獲得分子量為3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(11)。3.根據權利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，其特征是還包括將PCL-PLA-TPGS共聚物粗品(I)和(II)溶于二氯甲烷或乙酸乙酯中，加入甲醇或石油醚使PCL-PLA-TPGS共聚物沉淀，過濾，將沉淀于30-5(TC真空干燥，即獲得分子量為3000-51000的PCL-PLA-TPGS共聚物(I)禾P(11)。4.根據權利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，其特征是丙交酯單體為外消旋丙交酯、左旋丙交酯或右旋丙交酯。5.根據權利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，其特征是所述催化劑為辛酸亞錫、有機胍、金屬鋅、三丁基氯化錫、乙酰丙酮鐵、乳酸鋅、納米氧化鋅、?；撬?、乙醇鐵、正丙醇鐵、異丙醇鐵或正丁醇鐵。6.根據權利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，其特征是所述抽真空，充氮氣的次數為1-3次。7.根據權利要求2所述的PCL-PLA-TPGS共聚物的制備方法，其特征是所述反應溫度為145°C。8.權利要求1的PCL-PLA-TPGS共聚物在制備藥用輔料中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種PCL-PLA-TPGS共聚物及制備方法和應用PCL-PLA-TPGS共聚物具有下式結構本發(fā)明的PCL-PLA-TPGS共聚物具有良好的生物相容性，生物可降解性。應用于藥物制劑和組織工程領域。文檔編號A61L27/00GK101717495SQ200910228629公開日2010年6月2日申請日期2009年11月20日優(yōu)先權日2009年11月20日發(fā)明者張明明,梅婉,梅林,梅紅衛(wèi)申請人:梅林