專利名稱：當(dāng)歸-川芎超臨界CO₂提取物中純化的生物堿部位的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳統(tǒng)中草藥領(lǐng)域，具體涉及“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的 生物堿部位的制備方法，以及由該方法制得的生物堿部位。本發(fā)明也涉及由該生物堿部位 經(jīng)冷凍干燥得到的凍干物。本發(fā)明還涉及所述生物堿部位或所述凍干物在制備抗心肌缺 血、抗血栓、降血脂和改善動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinerisis (Oliv. ) Diels的干燥根。當(dāng)歸歸肝、 心、脾經(jīng)，藥性甘、辛、溫，具有補血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便的作用。用于血虛萎黃，眩暈心 悸，月經(jīng)不調(diào)，閉經(jīng)痛經(jīng)，虛寒腹痛，腸燥便秘，風(fēng)濕痹痛，跌打損傷，癰疽瘡瘍。當(dāng)歸是傳統(tǒng) 中藥，臨床應(yīng)用廣泛，有效部位及藥理作用明確。近年來，國內(nèi)外學(xué)者采用了植物化學(xué)、分子 生物學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)等技術(shù)，開展了當(dāng)歸的化學(xué)成分及藥理學(xué)研究，取得長足進(jìn)展，為 當(dāng)歸的應(yīng)用提供了依據(jù)。川芎為傘形科植物L(fēng)igusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，具有行氣活血、祛 風(fēng)止痛的功效。為活血化瘀常用中藥。其化學(xué)成分的研究，國內(nèi)外報道較多。川芎主要成 分的藥理學(xué)研究表明總生物堿為川芎的主要有效部位。當(dāng)歸、川芎同屬傘形科，具有相似的治療作用和相近的化學(xué)成分，臨床上作為藥 對，經(jīng)常配伍使用。其配伍使用，能增加有效成分的提出，更能有效地發(fā)揮藥物功效，并減 低、制約藥物本身的毒性及副作用，符合中醫(yī)藥的七情配伍理論，臨床發(fā)揮協(xié)同作用。含當(dāng) 歸、川芎配伍的使用在《中華人民共和國藥典》(2005年版一部)收載的中成藥組方達(dá)52次， 屬于頻率最高的組合?！爱?dāng)歸-川芎”藥對則主要通過其有苯酞類、有機酸類、生物堿類等化學(xué)成分多環(huán) 節(jié)、多途徑地作用于機體而發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，尤其是川芎嗪等生物堿成分具有具有擴(kuò)張血管、 降低血壓、抗血小板聚集、改善微循環(huán)等作用，抗心肌缺血、調(diào)血脂、抗動脈粥樣硬化及抗肝 損傷作用，成為國內(nèi)、外學(xué)者關(guān)注的熱點?，F(xiàn)代藥理研究證明，川芎嗪具有擴(kuò)血管，降低全 血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、纖維蛋白原，改善血液流變學(xué)，降低血黏稠度，為治療冠心病的理 想藥物之一 W，5]。文獻(xiàn)周宇.川芎嗪注射液治療冠心病心絞痛40例[J].四川醫(yī)學(xué)， 2005,23(6) 70.胡國芬，王建平.川芎嗪的藥理作用及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國藥物與臨 床，2006，6 (10) :773-774.目前，文獻(xiàn)中的報道僅局限于對川芎單味藥中生物堿及川芎嗪的研究，對“當(dāng) 歸-川芎”藥對中生物堿及川芎嗪的相關(guān)研究文獻(xiàn)報道較少。而本課題組前期研究表明 混合提取所得的提取物中總生物堿及川芎嗪含量均高于單獨提取(詳見許玫.復(fù)方當(dāng)歸 有效部位的研究[D].上海醫(yī)藥工業(yè)研究院學(xué)位論文，2007 :58-59.),為“當(dāng)歸-川芎”藥 對的混合超臨界提供依據(jù)。文獻(xiàn)表明具有丙二醛(MDA)生成抑制活性與抗心肌缺血、抗 血栓、降血脂和改善動脈粥樣硬化方面的活性有著密切的聯(lián)系，詳見文獻(xiàn)報道(鄭玉云，張朝，郭曉華，等.超氧化物歧化酶和丙二醛在幾種心血管疾病中的變化[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué) 報，2002,18(3) :175-176.；王浩，李儒漢.冠心病患者血液脂質(zhì)過氧化有關(guān)酶變化的臨床 意義[J].中華心血管病雜志，1992，2(K2) :104-105.；蘇耀勛，羅顯田，容石嬋，等.心血管 病患者SOD和MDA變化及其意義探討[J] ·海軍醫(yī)高專學(xué)報，1995，17 (3) :233-234.)。

發(fā)明內(nèi)容
為了得到一種具有丙二醛(MDA)生成抑制活性、并且總生物堿、川芎嗪含量較高 的“當(dāng)歸-川芎”超臨界ω2提取物中生物堿部位，提高現(xiàn)有技術(shù)生物堿部位中總生物堿和 川芎嗪的含量，使“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中生物堿部位的提取物適合于各種劑型 的應(yīng)用，本發(fā)明人對其進(jìn)行了深入研究，用超臨界CO2法提取其中的生物堿部位，并用大孔 吸附樹脂富集生物堿部位，制備得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中生物堿部位及其凍 干物。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)第一方面，本發(fā)明提供一種“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位 的制備方法，包括如下步驟a)以“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中總生物堿部位為原材料，用有機溶劑萃取， 得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中的生物堿部位；b)以步驟a)的“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中生物堿部位作為上柱液，用洗脫 劑經(jīng)大孔吸附樹脂進(jìn)行洗脫，收集含藥洗脫液，回收洗脫劑，得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2 提取物中純化的生物堿部位。根據(jù)本發(fā)明，步驟a)中所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2總生物堿部位的提取物的 制備工藝已申請專利(具體請參見CN200710045683. 2)。該提取物用有機溶劑萃取，目的是 去除小極性部分，以得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中的生物堿部位。以上所述的用于萃取“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2總生物堿部位的提取物的有機溶劑 可以包括石油醚、環(huán)己烷或乙醚，優(yōu)選石油醚，其中石油醚沸程可以是30-60°C或60-90°C。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)中所述大孔吸附樹脂可以選自AB-8或HPD100。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)中所述洗脫過程中使用的洗脫劑為乙醇。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)中所述上柱液的濃度為總生物堿含量為40-52重量％。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)中所述上柱液中川芎嗪質(zhì)量濃度為200-320mg/mL。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)中所述上柱液的pH值為8-10。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)中所述上柱液的上柱流速為2_4BV/h，所述洗脫劑的洗脫流 速為 l-2BV/h。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)中所述上柱液的洗脫液質(zhì)量濃度為35% -85% (體積百分 比)。第二方面，本發(fā)明提供一種根據(jù)以上所述制備方法得到的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2 提取物中純化的生物堿部位。所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的生物堿部位采用酸堿染料比色法 測得其總生物堿含量為總重量的58% -78%。所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的生物堿部位采用高效液相色譜法測定的川芎嗪含量為總重量的35%以上。第三方面，本發(fā)明提供一種“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位 的凍干物，該凍干物由以上所述的純化的生物堿部位冷凍干燥后得到。第四方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求以上所述的“當(dāng) 歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位或“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純 化的生物堿部位凍干物和藥學(xué)上可接受的輔料。根據(jù)不同需要，所述藥物組合物可以制備成片劑、膠囊、顆粒劑、粉針或注射劑。第五方面，本發(fā)明提供所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部 位或“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位凍干物在制備抗心肌缺血、抗血 栓、降血脂和改善動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明以總生物堿、川芎嗪的含量為指標(biāo)，綜合比較了多種樹脂對“當(dāng) 歸-川芎”藥對的生物堿部位的吸附性能，遴選出適宜的乙醇洗脫溶液及洗脫體積，采用正 交試驗優(yōu)化影響樹脂吸附的重要因素，確定了大孔吸附樹脂分離純化“當(dāng)歸-川芎”超臨界 混合提取物的生物堿部位的工藝流程。得到純化的生物堿部位，并測定了由上述方法得到 的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位凍干物的MDA生成抑制活性，為進(jìn) 一步研究其相關(guān)藥理活性提供了必要的前提。


圖1為“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中生物堿部位的HPLC圖譜。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明 本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明中，提取物中的含量的測定生物堿采用酸堿染料 比色法，川芎嗪生物堿采用HPLC法(方法參見許玫.復(fù)方當(dāng)歸有效部位的研究[D].上海 醫(yī)藥工業(yè)研究院學(xué)位論文，2007 :50-52.)，MDA生成抑制活性采用小鼠服藥后的含藥血清 體外抑制肝MDA生成法?！爱?dāng)歸-川芎”超臨界CO2總生物堿部位的提取物的制備步驟詳見專利 CN200710045683. 2，作為進(jìn)一步研究的樣品。以“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2總生物堿部位的提取物為原材料，加有機溶劑例如石 油醚、環(huán)己烷或乙醚萃取以去除小極性部分，得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中生物堿 部位；將其進(jìn)行大孔吸附樹脂分離純化考察，采用大孔吸附樹脂按最佳條件進(jìn)行洗脫，收集 洗脫液，較低溫度下回收洗脫劑，得到純化的生物堿部位。將上述生物堿部位冷凍干燥，即 得“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的凍干物。實施例1 取“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2總生物堿部位的提取物，加石油醚(沸程30 60°C ) 萃取以去除小極性部分，得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界ω2提取物中生物堿部位，調(diào)節(jié)上柱液 PH值8，測得其中總生物堿含量為40%，川芎嗪質(zhì)量濃度為200mg/mL ；將其上柱大孔吸附樹 脂AB-8、以上柱流速2BV/h上樣、以乙醇的體積濃度35%、洗脫流速lBV/h洗脫，收集含藥 洗脫液，較低溫度下回收乙醇，得到純化的生物堿部位，酸堿染料比色法測得其總生物堿含量為58%，其中，高效液相色譜法測定川芎嗪占37%。實施例2 將實施例1所得的純化的生物堿部位冷凍干燥，即得“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的生物堿部位的凍干物。實施例3 取“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2總生物堿部位的提取物，加石油醚(沸程60 90°C ) 萃取以去除小極性部分，剩余“當(dāng)歸-川芎”超臨界ω2提取物中生物堿部位，調(diào)節(jié)上柱液 PH值10，測得其中總生物堿含量為52%，川芎嗪質(zhì)量濃度為320mg/mL ；將其上柱大孔吸附 樹脂HPD100、以上柱流速4BV/h上樣、以乙醇的體積濃度85%、洗脫流速2BV/h洗脫，收集 含藥洗脫液，較低溫度下回收有機溶劑，得到純化的生物堿部位，酸堿染料比色法測得其總 生物堿含量為65%，其中，高效液相色譜法測定川芎嗪占36%。實施例4 將實施例3所得的純化的生物堿部位冷凍干燥，即得“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的生物堿部位的凍干物。實施例5:取“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2總生物堿部位的提取物，加環(huán)己烷萃取以去除小極性 部分，得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中生物堿部位，調(diào)節(jié)上柱液PH值9，測得其中總 生物堿含量為48%，川芎嗪質(zhì)量濃度為^Omg/mL ；將其上柱大孔吸附樹脂AB-8、以上柱流 速2. 5BV/h上樣、以乙醇的體積濃度50%、洗脫流速1. OBV/h洗脫，收集含藥洗脫液，較低溫 度下回收乙醇，得到純化的生物堿部位，酸堿染料比色法測得其總生物堿含量為72%，其 中，高效液相色譜法測定川芎嗪占38%。實施例6 將實施例5所得的純化的生物堿部位冷凍干燥，即得“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的生物堿部位的凍干物。實施例7 取“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2總生物堿部位的提取物，加無水乙醚萃取以去除小極 性部分，得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中生物堿部位，調(diào)節(jié)上柱液pH值9. 5，測得其中 總生物堿含量為48%，川芎嗪質(zhì)量濃度為300mg/mL ；將其上柱大孔吸附樹脂AB-8、以上柱 流速3. 2BV/h上樣、以乙醇的體積濃度75%、洗脫流速1. OBV/h洗脫，收集含藥洗脫液，較低 溫度下回收乙醇，得到純化的生物堿部位，酸堿染料比色法測得其總生物堿含量為78%， 其中，高效液相色譜法測定)I丨芎嗪占40 %。實施例8 將實施例7所得的純化的生物堿部位冷凍干燥，即得“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的生物堿部位的凍干物。實施例9 取禁食IOh的小鼠，脫頸椎處死后，快速取肝臟，用4°C生理鹽水沖液血跡后，稱 重，用4°C生理鹽水制成5%的肝勻漿。取0. 6mL肝勻漿加50 μ L待測樣品，混勻后，于37°C 水浴中放置1.證，取出后，快速加0. 6mL 20%三的三氯醋酸終止反應(yīng)?；靹?，3500r · mirT1 離心，取上清液1. OmL, jjp ImL 0. 67%硫代巴比妥酸，95°C水浴加熱lOmin，冷卻后于532nm處測得吸光值，以四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品，折算每克肝組織中丙二醛(MDA)的生成量。小鼠隨機分成若干組，每組動物數(shù)10只，禁食IOh后，按0. 3mL · lOg—1體重ig等 生藥量OOg生藥· lkg—1)的不同方法所得的提取物，給藥后45min摘眼球取血，分取血清 50μ L，混勻后，于37°C水浴中放置1. 5h，取出后，快速加0. 6mL 20%三的三氯醋酸終止反 應(yīng)?；靹?，3500r IirT1離心，取上清液1. OmL，加ImL 0. 67%硫代巴比妥酸，95°C水浴加熱 IOmin,冷卻后于532nm處測得吸光值，以四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品，折算每g肝組織中丙二醛 (MDA)的生成量，并以生理鹽水組鼠為對照，計算MDA生成抑制活性。結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制備方法，包括如下步驟a)以“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中總生物堿部位為原材料，用有機溶劑萃取，得 到“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中的生物堿部位；b)以步驟a)的“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中生物堿部位作為上柱液，用洗脫劑 經(jīng)大孔吸附樹脂進(jìn)行洗脫，收集含藥洗脫液，回收洗脫劑，得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提 取物中純化的生物堿部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟a)中所述溶劑為石油醚、環(huán)己烷或無水乙醚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟a)中所述溶劑為石油醚。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，所述石油醚沸程選自30-60°C或60-90°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述大孔吸附樹脂選自AB-8或HPD100。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述洗脫劑為乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述上柱液的濃度為總生物堿含量為40-52重量％。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述上柱液中川芎嗪質(zhì)量濃度為200-320mg/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述上柱液的pH值為8-10。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述上柱液的流速為2-4BV/h。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的 制備方法，其特征在于，步驟b)中所述洗脫液的流速為l_2BV/h。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的制 備方法，其特征在于，步驟b)中所述洗脫劑的濃度為35-85體積％。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任何一項制備方法得到的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中 純化的生物堿部位。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位，其 特征在于，采用酸堿染料比色法測得其總生物堿含量為總重量的58% -78%。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位，其 特征在于，采用高效液相色譜法測定的川芎嗪含量為總重量的35%以上。
16.“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位的凍干物，其特征在于，其由 權(quán)利要求13所述的純化的生物堿部位冷凍干燥后得到。
17.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求13所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純 化的生物堿部位或根據(jù)權(quán)利要求16所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物 堿部位凍干物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為片劑、膠囊、 顆粒劑、粉針或注射劑。
19.權(quán)利要求13所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的生物堿部位或權(quán)利 要求16所述的“當(dāng)歸-川芎”超臨界(X)2提取物中純化的生物堿部位凍干物在制備抗心肌 缺血、抗血栓、降血脂和改善動脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的生物堿部位的制備方法，包括如下步驟a)以“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中總生物堿部位為原材料，用有機溶劑萃取，得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中的生物堿部位；b)以步驟a)的“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中生物堿部位作為上柱液，用洗脫劑經(jīng)大孔吸附樹脂進(jìn)行洗脫，收集含藥洗脫液，回收洗脫劑，得到“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的生物堿部位。本發(fā)明提供的“當(dāng)歸-川芎”超臨界CO2提取物中純化的生物堿部位具有含有效成分量高等特點。
文檔編號A61P7/02GK102038727SQ20091019696
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月10日
發(fā)明者馮敬騫, 楊義芳 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院