專利名稱：黑水纈草有效部位提取物及其質(zhì)量控制方法和醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中草藥有效部位提取物，尤其涉及黑水繩草(&/en'a"a amwre">s& Smir. ex Kom.)抗老年癡呆癥有效部位提取物及其制備方法和質(zhì)量 控制方法，本發(fā)明還涉及該黑水纈草有效部位提取物在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退 ^f亍性疾病中的用途，屬于纈草屬有效部位^是取物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黑水纈草為敗醬科纈草屬(Valeriana L.)植物黑水纈草(j^/en'am mm^wm's Smir. ex Kom.)的干燥根及才艮莖。黑水纈草主要分布于中國東北地 區(qū)，在大興安嶺地區(qū)資源豐富。其同屬植物早已被用來治療失眠等多種疾 病，而且在神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管及抗腫瘤等方面也有不同的藥理作用，最新 研究發(fā)現(xiàn)纈草屬中化學(xué)成分對神經(jīng)退行性疾病老年癡呆有治療作用。但至今 未見黑水纈草抗老年癡呆的有效部位制備方法及質(zhì)量控制的相關(guān)凈艮道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種黑水纈草有效部位提取物；
本發(fā)明目的之二是提供一種制備上述黑水纈草有效部位提取物的方法；
本發(fā)明目的之三是提供一種黑水纈草有效部位提取物的質(zhì)量控制方法，
包括以超高效液相進(jìn)行指紋圖譜測定的質(zhì)量控制方法等；
本發(fā)明目的之四是提供黑水纈草有效部位提取物的一種醫(yī)藥用途，即
將其用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾??；
本發(fā)明目的之五是提供一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物組合
物，該藥物組合物含有上述黑水纈草有效部位提取物； 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 黑水纈草有效部位提取物，該有效部位提取物中總木脂素類物質(zhì)的含量占提取物總重量的50%以上；其中，所述的總木脂素類物質(zhì)包括以下化合 物(+ )松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂素-4'-0-卩-D-葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂素-4-0-(3-D-葡萄吡喃糖苷、(+ )松脂 素-S-OP-D-葡萄吡喃糖苷、(+ )松脂素-4-O-P-D-葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基 -松脂素、(+ ) 8, 9'-二羥基-松脂素-4'-0-p-D-葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷、橄欖樹脂素-4'-0-P-D-葡萄糖苷、落葉 松脂醇-4, 4'-0-J3-D-雙葡萄吡喃糖苷、橄欖樹脂素-4-0-p-D-葡萄吡喃糖苷、 8_羥基-落葉松脂醇-4'-0+-D-葡萄吡喃糖苷、落葉松脂醇-4-0-P-D-葡萄吡喃 糖苷；
更優(yōu)選的，所述的有效部位提取物中以(+ )松脂素-4， 4'-0-p-D-雙葡萄 吡喃糖苷和(+ )松脂素-8-0-P-D-葡萄吡喃糖苷為主要成分，二者的含量之 和占有效部位提取物總重量的在13%以上。
本發(fā)明還提供了一種制備上述黑水纈草有效部位提取物的方法，該方法 包:fe以下步驟
a, 將黑水纈草用水或乙醇回流提取2 4次，過濾，合并濾液；
b. 濾液回收溶劑至黑水纈草藥材3 6倍的體積，得乙醇提取物藥液l;
c. 將藥液l用水混懸后用石油醚萃取，分別得到石油醚萃取物和水溶液 藥液2;
d, 將水溶液藥液2上樣到大孔吸附樹脂柱色譜進(jìn)行吸附，水洗后，用30 %~70%乙醇洗脫，合并洗脫液，濃縮，即得。
上述制備方法中，步驟a中提取黑水纈草的乙醇的重量優(yōu)選是黑水纈 草藥材重量的5 20倍；所述的乙醇濃度優(yōu)選為30 100wt。/。，更優(yōu)選為50~ 95wt%;所述的回流提取時間優(yōu)選為每次回流提取1 -3小時；
步驟d中所述的大孔吸附樹脂柱色諉可選自D101， AB-8， HPD500, HPD300, NKA或H103等大孔吸附樹脂柱色譜；所述的上樣優(yōu)選在流速為每 小時l.l ~ 1.3倍柱體積的條件下將水溶液藥液2上樣到大孔吸附樹脂柱色鐠進(jìn) 行吸附；
步驟d中優(yōu)選用30 70。/o乙醇進(jìn)行洗脫，更優(yōu)選用50。/。乙醇進(jìn)行洗脫；洗脫液的流速優(yōu)選為每小時0.5 ~ 0.6倍柱體積。
本發(fā)明所述的黑水纈草為敗醬科纈草屬植物黑水纈草amw^m^ Smir. exKom.的干燥才艮及才艮莖。
本發(fā)明還提供了一種用中藥指紋圖譜技術(shù)檢測上述黑水纈草有效部位的 方法，包括下述步驟
色譜條件Waters超高效液相；色譜柱Hypersil C18柱；流動相曱 醇-水(25-35: 75-65)為流動相梯度洗脫；流速1.0 ml/min;檢測波長280 nm;柱溫30。C;
第一步，建立黑水纈草對照品液相色譜圖
① 對照品溶液的制備取經(jīng)過鑒定的(+ )杠、脂素-4, 4'-0-(3-D-雙葡萄吡 喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂素-4'-0-p-D-葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂 素-4-0-(3-D-葡萄吡喃糖苷、(+ )松脂素-8-0-p-D-葡萄吡喃糖苷、(+ )松月旨 素一4-0-l3國D-葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂素、(+ )8, 9'畫二羥基-松脂素誦 4'-0-P-D-葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂素-4, 4'-0-(3-D-雙葡萄吡喃糖苦、 橄欖樹脂素-4'-0-P-D-葡萄糖苷、落葉松脂醇-4, 4'-Op-D-雙葡萄吡喃糖苷、 橄欖樹脂素-4-O-P-D-葡萄吡喃糖苷、8-羥基-落葉松脂醇-4'-0-P-D-葡萄吡喃 糖苷、落葉松脂醇-4-0-P-D-葡萄吡喃糖苷對照品各5.0mg，用甲醇定容至2 ml,濾過，即得；
② 分別精密吸取對照品溶液溶液各注入液相色鐠儀，照高效液相 色鐠法測定，測定對照品色譜圖，建立峰面積與含量間的關(guān)系；
③ 將對照品溶液各取lOjil混合，定容至lml。取10^1,注入液相色鐠 儀，照高效液相色鐠法測定，測定混合對照品色鐠第二步，建立黑水纈草有效部位指紋圖譜共有才莫式圖鐠
① 供試品溶液的制備取經(jīng)鑒定的為黑水纈草有效部位的粉末5.0g,用 曱醇定容至2ml，濾過，即得；
② 黑水纈草有效部位指紋圖語測定分別精密吸取黑水纈草有效部位供 試品溶液溶液lOpl，注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，即得黑水纈草有效部位供試品指紋圖譜；
③ 取(+ )松脂素-4， 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷對照品10^1，再取供試 品溶液40pl中，混勻定容至0.5ml,精密吸取混合溶液lOpl,注入液相色譜 儀，進(jìn)行加樣回收測定；
④ 對所收集并經(jīng)鑒定為黑水纈草有效部位的10批樣品按供試品溶液的 制備方法制備供試品溶液，并逐一按上述方法檢測，分別得到各批黑水纈草 有效部位相應(yīng)的指紋圖譜；經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助相似性評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算，即可得 出黑水纈草有效部位共有^^莫式圖譜；
⑤ 色譜圖中應(yīng)檢出與對照指紋圖譜相同的13個共有特征峰。其中5號 峰為(+ )松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷，應(yīng)與對照品指紋圖譜一致； 供試品指紋圖譜與相應(yīng)的共有模式圖鐠經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助相似性評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行計(jì) 算，相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.9000。
將有效量的本發(fā)明黑水纈草有效部位提取物(總木脂素)與藥學(xué)上可接 受的載體或輔料組合在一起后可得到 一種治療老年癡呆性疾病的藥物有效部 位。
本發(fā)明黑水纈草抗老年癡呆及抑郁癥有效部位提取物可以加入制備不同
劑型時所需的各種輔料和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體后，以常規(guī)的中藥制
劑方法制備成任何一種適宜的臨床制劑，例如可以是注射劑、片劑、口服
液、顆粒劑、膠嚢劑、軟膠嚢、滴丸等，其中，所述的輔料可以是抗氧劑、
填充劑、骨架材料等；所述的藥學(xué)上可接受的載體是淀粉、糖粉、木糖醇、
甘露醇、乳糖、果糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐中的一種或幾種，
優(yōu)選為淀粉或乳糖。
本發(fā)明還提供一種由本發(fā)明黑水纈草有效部位提取物制備成的膠嚢劑質(zhì) 量控制方法；
一種黑水纈草有效部位提取物膠嚢劑質(zhì)量控制方法，包括以下步驟 含量測定(+ )松脂素-4, 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備稱取在60。C減壓干燥至恒重的(+ )松脂素-4， 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苦對照 品適量，加甲醇制成每lml含0.1mg的溶液，搖勻；精密量取0.5ml， l.OmI, 1.5ml, 2.5ml與3.5ml，分別置50ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；照 分光光度法，在280nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)、濃度為橫 坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
測定法取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取15mg，精密稱定，置25ml量瓶中， 加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液l ml,置25ml量瓶 中，加曱醇稀釋至刻度，搖勻；照分光光度法，在280nm的波長處分別測定 吸收度，分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中(+ )松脂素-4, 4'-0-(3-D-雙葡 萄吡喃糖普的重量，計(jì)算，即得，本品每粒含總木脂素以(+ )松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷計(jì)，不得少于150.0mg;
(+ )松脂素-4， 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷對照高效液相色譜法測定
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；25-35: 75-65曱醇-水為流動相檢測波長為280nm,理論板數(shù)按(+ )松脂素-4， 4'-O-(3-D-雙葡萄吡喃糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000;
對照品溶液的制備稱取在60。C減壓干燥至恒重的(+ )松脂素-4， 4'-O-p-D-雙葡萄吡喃糖苦對照品適量，加甲醇制成每lml含5嗎的溶液，即得；
供試品溶液的制備取本品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱定，加曱醇溶解并稀 釋至刻度，搖勻，濾過，用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即
3甘
付；
測定法，分別吸取對照品溶液與供試品溶液各20]al,注入液相色語儀， 測定，即得；本品每粒含(+ )松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苦不得少于 1.50mg。
藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明黑水纈草有效部位提取物對大鼠在Moms 水迷宮試驗(yàn)探索能力均具有增強(qiáng)的作用；能明顯提高大鼠血清中SOD活力、 MDA含量明顯降低、抑制羥自由基能力增加；可在一定程度上保護(hù)大鼠海馬 區(qū)和皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，減少各種刺激因素對其的破壞；可以減少p-APP和A卩l(xiāng)-40的陽性細(xì)胞的表達(dá)；能夠減輕iNOS過表達(dá)，抑制C0X-2活性和減少對 核因子NF-kB的激活來降低AD大鼠的腦損傷過程；能夠抑制Caspase-3的活 化，并增加Bcl-2的表達(dá)量，減少Bax的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)證明 總木脂素物質(zhì)為黑水纈草抗老年癡呆及抑郁癥的有效部位。對該部位經(jīng)口服 給藥未測出LD50,經(jīng)最大給藥量測定證明，小鼠口服給藥最大給藥量為 198.0g/kg，相當(dāng)臨床成人用量的69300倍。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨 著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成 任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下 可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均 落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1
取黑水纈草原料5000g,先用原料20倍重量的50%乙醇提取3次，每次提 取時間1.5小時，合并上述提取液，減壓回收乙醇至小于或等于15000ml，得 到藥、液1;
將藥液l水混懸后用石油醚萃取，分別得石油醚萃取物和水溶液藥液2;
將水溶液藥液2上樣到D101型大孔吸附樹脂柱色語D101 (樹脂重80g, 柱體積100ml，柱徑柱高=1: 2)進(jìn)4亍吸附，上樣流速為每小時1.2倍柱體 積，上完樣后用蒸餾水沖洗柱子，直至水洗脫液近無色，棄去水洗脫液，用 6倍柱體積含30 %的乙醇水溶液洗脫，洗脫液流速控制在每小時0.5倍柱體 積，洗脫過程中用TCL檢測是否洗脫完全；收集洗脫液，合并，減壓濃縮， 減壓干燥，得到黑水纈草總木脂素粗品200g。
上述黑水纈草總木脂素提取物經(jīng)高效液相-紫外檢測法(UV-HPLC)測定，總木脂素類化合物含量占總提取物總重量的52.5%;其中所含木脂素類 各成分占有效部位提取物總重量的百分含量分別為(+ )松脂素-4， 4'-0-j3-D-雙葡萄吡喃糖苷(11.8%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4'-0-(3-D-葡萄吡喃糖苷
(3.0%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4-0-j3-D-葡萄吡喃糖苷(2.4%)、 ( + )松脂 素-8-0-p-D-葡萄吡喃糖苷(4.6%)、 ( + )松脂素-4-0-P-D-葡萄吡喃糖苷
(5.2%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素(4.1%)、 ( + )8, 9'-二羥基-松脂素-4'-0-卩-D-葡萄吡喃糖苷(2.5%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4, 4'-0-J3-D-雙葡萄吡喃糖苷
(2.6%)、橄欖樹脂素-4'-0-卩-D-葡萄糖苷(4.8%)、落葉松脂醇-4， 4'-0-J3-D-雙葡萄吡喃糖苷(3.4%)、橄欖樹脂素-4-0-P-D-葡萄吡喃糖苷(1.7%)、 8-幾 基-落葉松脂醇-4'-0-P-D-葡萄吡喃糖苷(2.9%)、落葉松脂醇-4-0-p-D-葡萄吡 喃糖苷(3.5%)。
實(shí)施例2
取黑水纈草根及根莖粗粉原料2500g，先用原料20倍重量的70%乙醇 提取3次，每次提取時間1.5小時，合并上述提取液，減壓回收乙醇至小于 或等于7500ml,得到藥液l;
將藥液l水混懸后用石油醚萃取，分別得石油醚萃取物和水溶液藥液2;
將水溶液藥液2上AB-8型大孔吸附樹脂柱色譜(樹脂重80g,柱體積 100ml,柱徑柱高=1: 2)，流速為每小時1.3倍柱體積，上完樣后用蒸餾水 沖洗柱子，直至水洗脫液近無色，棄去水洗脫液，用6倍柱體積含40%的乙 醇洗脫，洗脫液流速控制在每小時0.5倍柱體積，洗脫過程中用TCL檢測是否 洗脫完全；收集洗脫液，合并，減壓濃縮，減壓干燥，得到黑水纈草總木脂 素粗品151g。
上述黑水纈草總木脂素提取物經(jīng)高效液相-紫外檢測法(UV-HPLC)測 定，總木脂素類化合物含量占總提取物總重量的61.1%;所含木脂素類各成分占有效部位提取物總重量的百分含量分別為(+ )松脂素-4， 4'-0-(3-D-雙 葡萄吡喃糖苷(11.2%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4'-0-P-D-葡萄吡喃糖苷
(3.6%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4-0-!3-D-葡萄吡喃糖苷(2.0%)、 ( + )松脂 素-8-0-P-D-葡萄吡喃糖苷(5.2% ) 、 ( + )松脂素-4-0-p-D-葡萄吡喃糖苷
(5.8°/。)、 ( + ) 8-羥基-松脂素(6.7%)、 ( + )8, 9'-二羥基-松脂素-4'-0-(3-0-葡萄吡喃糖苷(3.1%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷
(5.2%)、橄欖樹脂素-4'-0-P-D-葡萄糖苷(4.4%)、落葉松脂醇-4, 4'-0-(3-D-雙葡萄吡喃糖苷(4.1%)、橄欖樹脂素-4-0-P-D-葡萄吡喃糖苷(3.3%)、 8-羥 基-落葉松脂醇-4'-O-p-D-葡萄吡喃糖苷(2.9%)、落葉松脂醇-4-O-P-D-葡萄吡 喃糖香(3.6% )。
實(shí)施例3
取黑水纈草根及根莖粗粉原料2000g,先用原料20倍重量的95%乙醇提 取3次，每次提取時間1.5小時，合并上述提取液，合并上述提取液，減壓回 收乙醇至小于等于6000ml，得到藥液l;
將藥液l水混懸后用石油醚萃取，分別得石油醚萃取物和水溶液藥液2;
將水溶液藥液2上H103型大孔吸附樹脂柱色譜H103 (樹脂重80g，柱體 積100ml，柱徑柱高=1: 2)，流速為每小時l.l倍柱體積，上完樣后用蒸餾 水沖洗柱子，直至水洗脫液近無色，棄去水洗脫液，用6倍柱體積含50%的 乙醇洗脫，洗脫液流速控制在每小時0.6倍柱體積，洗脫過程中用TCL檢測是 否洗脫完全；收集洗脫液，合并，減壓濃縮，減壓干燥，得到黑水纈草總木 脂素粗品168g。
上述黑水纈草總木脂素提取物經(jīng)高效液相-紫外檢測法(UV-HPLC)測 定，總木脂素類化合物含量占總提取物總重量的54.5%;其中所含木脂素類 各成分占有效部位提取物總重量的百分含量分別為(+ )松脂素-4， 4'-0-|3-D-雙葡萄吡喃糖苷(11.2%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4'-0-P-D-葡萄吡喃糖苷 (2.4°/。)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4-0-(3-D-葡萄吡喃糖苷(1.8%)、 ( + )松脂素-8-0-P-D-葡萄吡喃糖苦(4.0%)、 ( + )松脂素-4-0-p-D-葡萄吡喃糖苷 (4.6%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素(5.5%)、 ( + )8, 9'-二羥基-松脂素-4'-0-卩-D-
葡萄吡喃糖苷(1.9%)、 ( + ) 8-羥基-松脂素-4， 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷 (5.0%)、橄欖樹脂素-4'-0-卩-D-葡萄糖苷(4.2%)、落葉松脂醇-4， 4'-O-卩-D畫
雙葡萄吡喃糖苷(4.2%)、橄欖樹脂素-4-0-P-D-葡萄吡喃糖苷(3.1%)、 8-羥
基-落葉松脂醇-4'-0-(3-D-葡萄吡喃糖苷(1.7%)、落葉松脂醇-4-0-P-D-葡萄吡
喃糖香(4.9%)。
實(shí)施例4 注射液的制備
取實(shí)施例1所制備的黑水纈草有效部位提取物適量，加入適量增溶劑，
研磨，再加少量注射用水稀釋，混勻，然后加入氯化鈉適量，溶解后再加注
射用水至規(guī)定量，濾過，灌封，滅菌，即得。
實(shí)施例5 口服液的制備
取實(shí)施例2所制備的黑水纈草有效部位提取物適量，加入適量增溶劑， 研磨，再加少量水稀釋，混勻，然后加入矯味劑及防腐劑，混勻，加水至規(guī) 定量?；靹颍盅b，滅菌，即得。
實(shí)施例6 "交嚢劑的制備
取實(shí)施例3所制備的黑水纈草有效部位提取物適量，加入輔料適量，混 勻，制成顆粒，裝月交嚢，即得。
試驗(yàn)例1本發(fā)明黑水纈草有效部位提取物的制備工藝條件的考察試驗(yàn) 一、上樣流速的考察將黑水纈草水提取液(用黑水纈草藥材5~20倍重量的水回流提取黑水 纈草2~4次制備得到)(每12.5ml提取液相當(dāng)于lg浸膏或3g原藥材)上樣 于AB-8型大孔樹脂柱(樹脂重80g,,柱體積100ml,柱徑柱高=1: 2)的 過程中，分別采用不同的流速，以Liberman試劑檢測，考察了上樣流速與吸 附量的關(guān)系，檢測結(jié)果見表l。
表l
上樣體積折合浸膏量折合原藥材量
(ml/min)(ml)(g)(g)
120001562100
215001161642
3l訓(xùn)861285
結(jié)果表明上樣液流速與上樣量呈負(fù)相關(guān)，流速越大，吸附量越小，考 慮到流速小于lml/min (1.1倍柱體積)時，耗時較長，而流速大于3ml/min (1.3倍柱體積)時，吸附量有偏低，耗用樹脂量大，所以上樣時采用 2ml/min的流速，即上樣流速為每小時1.2倍柱體積。
二、洗脫溶劑的考察
將已交換于AB-8型大孔吸附樹脂柱(樹脂重80g,柱體積100ml,柱 徑柱高=1: 2)上的黑水纈草提取液(實(shí)施例l-3所述的藥液2),分別采 用以下系統(tǒng)進(jìn)行洗脫含不同濃度的乙醇系統(tǒng)TCL檢測，考察了不同洗 脫系統(tǒng)的洗脫效率，洗脫流速采用2ml/min，其結(jié)果如下
洗脫系統(tǒng)分別用含有5%, 10%， 20%, 30%， 40%， 50%的乙醇洗 脫；10%， 20%, 30%的乙醇洗脫效率無明顯差別，40%的乙醇可見柱上有 一條棕色的色帶被洗下，洗脫至IO倍柱體積時都不能將總木脂素完全洗下， TCL陽性，樹脂顏色仍較深，呈暗紅色。50°/。的乙醇洗脫時，10倍柱體積時 能將總木脂素完全洗下，TCL陰性，樹脂顏色仍較深，呈暗紅色。50%乙醇 洗脫效率高。試驗(yàn)例2本發(fā)明膠嚢劑的質(zhì)量控制方法 供試樣品實(shí)施例6所制備的膠嚢劑；
含量測定(+ )松脂素-4, 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取在60。C減壓千燥至恒重的(+ )松脂素-4, 4'-0-(3-D-雙葡萄吡喃糖苷 對照品適量，力口曱醇制成每lml含0.1mg的溶液，搖勻；精密量取0.5ml， 1.0ml， 1.5ml, 2.5ml與3.5ml，分別置50ml量瓶中，加曱醇稀釋至刻度， 搖勻；照分光光度法，在280nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)、 濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
測定法取供試樣品，研細(xì)，取15mg,精密稱定，置25ml量瓶中，加 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液l ml,置25ml量瓶 中，加曱醇稀釋至刻度，搖勻；照分光光度法，在280nm的波長處分別測定 吸收度，分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中(+ )松脂素-4, 4'-0-p-D-雙葡 萄吡喃糖苷的重量，計(jì)算，即得，本品每粒含總木脂素以(+ )松脂素-4， 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷計(jì)，不得少于150.0mg。
(+ ) +>脂素-4, 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷對照高效液相色譜法測定
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；30: 70曱醇-水為流動相檢測波長為280nm,理論板數(shù)按(+)松脂素-4, 4，-0-卩-D-雙葡萄吡喃糖香峰計(jì)算應(yīng)不低于3000;
對照品溶液的制備，精密稱取在60。C減壓干燥至恒重的(+ )松脂素-4， 4'-0-j3-D-雙葡萄吡喃糖苷對照品適量，加曱醇制成每l ml含5嗎的溶液，即 得；
供試品溶液的制備，取本品內(nèi)容物(供試樣品)，研細(xì)，精密稱定，加 甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，收集 續(xù)濾液，即得；
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20pl，注入液相色語 儀，測定，即得，本品每粒含(+ )松脂素-4， 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苦不得 少于1.50mg。試驗(yàn)例3黑水纈草有效部位提取物對老年癡呆大鼠損傷模型的影響 造模方法
空白組不予處理；造模組與給藥組分別給予D-gal (50mg/kg.d)腹腔注 射，造成亞急性衰老，4W后先進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈反復(fù)結(jié)扎，造成腦缺血性 病灶。實(shí)驗(yàn)各組反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈阻斷血流。手術(shù)完成后，將大鼠喂養(yǎng) 3天，取未死亡的狀態(tài)良好的大鼠再腦內(nèi)注射凝聚態(tài)AJ31-40，假損傷組腹腔 注射生理鹽水4W, 4W后先進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈反復(fù)結(jié)扎，再腦內(nèi)注射等量的 生理鹽水。操作方法如下大鼠水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉，固定在 腦立體定位儀上，頭部備皮，常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)皮膚，無菌下操作，沿顱中線 做長2-3cm的切口，分離骨膜，暴露出"人，，字縫和"十，，字縫。在前自后3. 0mm,中線右側(cè)旁開2.0mm,用7號針頭鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射 器自腦表面垂直進(jìn)針4. 0mm,然后向腦組織內(nèi)緩慢注射5pl AJ31-40,垂直進(jìn) 針，注射5min，留針5min，注射后用牙科泥封堵顱骨。消炎粉消毒，縫合 皮膚。
分組及給藥方法
將155只健康的Wistar大鼠隨機(jī)分成8組空白組、假損傷組、模型 組、抗老年癡呆有效部位提取物(實(shí)施例1-3所制備)低劑量組(0.26 g/kg.d)、抗老年癡呆有效部位提取物高劑量組(0.52 g/kg.d)、中藥對照健腦 膠嚢組(2.41 g/kg'd)。空白組15只，實(shí)驗(yàn)各組每組20只?？瞻捉M不予處 理；假損傷組與模型對照組于腦內(nèi)注射A|31-40手術(shù)第3天開始灌胃2 %吐 溫-80水溶液7天，每天1次；各給藥組于手術(shù)第3天開始連續(xù)灌胃給藥7 天，每天1次。
^見察指標(biāo)及取材方法
大鼠行為學(xué)檢測(Morris水迷宮實(shí)驗(yàn))
預(yù)先在水池里注入清水使水面高出平臺l~2cm，水溫控制在24士2。C左 右。水池內(nèi)壁涂有黑漆，水池共分為4個象限。將平臺放在第一象限中間，在其他三個象限任選一點(diǎn)面向水池池壁將大鼠放入水中，試驗(yàn)歷時5天，每
天上午每個象限各測試一次，每次測試lmin。若大鼠在lmin之內(nèi)尚未找到 平臺，則將大鼠拿到平臺上并使它在上面站15s,若大鼠在l min之內(nèi)找到平 臺，也讓其在平臺上站15s,方結(jié)束一次訓(xùn)練，如此訓(xùn)練4天。在笫5天， 將平臺移走，每只大鼠游lmin,記錄每只大鼠第一次經(jīng)過原平臺的時間(潛 伏期)，每只大鼠在l min內(nèi)經(jīng)過平臺的次數(shù)、游過的總距離以及在原平臺所 在象限及其它三個象限內(nèi)逗留的時間、距離；并分別計(jì)算出在第一象限游泳 的時間(ti)和距離(h)占整個游泳時間(t總)和距離(1總)的百分比。 大鼠血清中的生化指標(biāo)的測定
在大鼠行為學(xué)檢測后，每組取8只用水合氯醛(300mg/kg)麻醉后，快 速開胸，行心臟^jk, 3500 r/min離心10min取血清，置于-70。C低溫保存。 按試劑盒說明書進(jìn)行檢測SOD、 MDA和羥自由基的含量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
黑水纈草有效部位提取物對AD大鼠Morris水迷宮行為學(xué)的影響(見表
2)
表2大鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果(^ ±s)
組另'J例數(shù)劑量潛伏期過臺次數(shù)Vt總
Cg/kg)(S)(次)(%)
空白組10一11.08±2.514.50±2.2432.58±4.97
假損傷組12_13.64±4.113.25±1.9129.78±6.02
模型組10一33.11±7.13**1.75±1.05*15.98±4.21"
有效部位低劑量110.2618.26±2.79**3.92±1.92**31.47士4.76"
有效部位高劑量120.5217.78±2.96''3.25±1.42**28.52±6.02''
中藥對照組102.4124.78土5.71"3.50士1.38"27.31±5.72**
注*與空白組、假損傷組比較pO.05; * *與空白組、假損傷組比較pO.01;、模型組比較pO.05;"與模型組比較pO.Ol
結(jié)果表明，空白組與假損傷組比較無顯著性差異(P>0.05)。與空白組 比較，模型組潛伏期延長、過臺次數(shù)減少，在第一象限逗留時間短，差異顯 著(P〈0.01),表明模型鼠空間探索能力下降。給藥組和對照組均能縮短潛伏 期、增加過臺次數(shù)，在第一象限逗留時間延長，與模型組相比具有明顯差異(P<0.05或P<0.01),說明治療有效，其中黑水纈草有效部位提取物高劑 量組效果更顯著。
黑水纈草有效部位提取物對AD大鼠血清中SOD、 MDA和羥自由基的 含量的影響(見表3)
表3大鼠血清中SOD、 MDA和羥自由基的含量(7"±s, n=8)
組另'J劑量 Cg/kgSOD C U/ml)MDA (腦ol/ml)輕自由基 (U/ml)
空白組一171.33±5.263.05±1.08906.63±79.26
假損傷組—168.92±5.863.34±1.07853.39±67.10
模型組—141.08±7.77"10.63士3.32"547.82±113.78**
有效部位低劑量0.2616楊±8.65**5.85土2.54"741.05±138.70**
有效部位高劑量0.52165.67士10.63"5.05土1.78"807.30±106.35**
中藥對照組2.41159.16±8.84**6.14±2.43**742.75±145.41'
注#與空白組、假損傷組比較fK0.05;# #與空白組、假損傷組比較pO.01; *與模型組比較pO.05; * *與模型組比較pO.Ol
結(jié)果表明，空白組與假損傷組比較無顯著性差異(P〉0.05)。與空白組 比較，模型組血清SOD活力明顯降低(P<0.01), MDA含量升高，抑制羥 自由基能力降低(P<0.01 );與模型組比較，給藥組和對照組大鼠血清中 SOD活力明顯增加(P<0.01), MDA含量明顯降低，抑制羥自由基能力增 加(P<0.05或P<0.01),其中黑水纈草有效部位提取物高劑量組效果更顯 著。
權(quán)利要求
1、黑水纈草(Valeriana amurensis Smir.ex Kom.)有效部位提取物，其特征在于所述有效部位提取物中總木脂素類物質(zhì)的含量占提取物總重量的50％以上；其中，所述的總木脂素類物質(zhì)包括以下化合物(+)松脂素-4，4′-O-β-D-雙葡萄吡喃糖苷、(+)8-羥基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羥基-松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)松脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羥基-松脂素、(+)8，9′-二羥基-松脂素-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、(+)8-羥基-松脂素-4，4′-O-β-D-雙葡萄吡喃糖苷、橄欖樹脂素-4′-O-β-D-葡萄糖苷、落葉松脂醇-4，4′-O-β-D-雙葡萄吡喃糖苷、橄欖樹脂素-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、8-羥基-落葉松脂醇-4′-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、落葉松脂醇-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。
2、 按照權(quán)利要求l所述的黑水纈草有效部位提取物，其特征在于所述 的有效部位提取物中以(+ )松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷和(+ )松 脂素-8-0-P-D-葡萄吡喃糖苷為主要有效成分，二者的含量之和占有效部位提 取物總重量的13%以上。
3、 一種制備權(quán)利要求1或2述黑水纈草有效部位提取物的方法，包括以 下步驟a. 將黑水纈草用水或乙醇回流提取2 4次，過濾，合并濾液；b. 濾液回收溶劑至黑水纈草藥材3 6倍的體積，得乙醇提取物藥液1;c. 將乙醇提取物藥液l用水混懸后用石油醚萃取，分別得到石油醚萃取 物和水'溶、液藥液2;d. 將水溶液藥液2上樣到大孔吸附樹脂柱色譜進(jìn)行吸附，水洗后，用30 %~70%乙醇洗脫，合并洗脫液，濃縮，即得。
4、 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟a中回流提取黑水纈 草的乙醇的重量是黑水纈草藥材重量的5 ~20倍；所述的乙醇濃度為30-100wt%,優(yōu)選為50 95wt。/o;所述的回流提取時間為每次回流提取l-3小 時；步驟d中所述的大孔吸附樹脂柱色譜選自D101， AB-8, HPD500，HPD300, NKA或H103大孔吸附樹脂柱色謙；所述的上樣在流速為每小時 1.1 ~ 1.3倍柱體積的條件下將水溶液藥液2上樣到大孔吸附樹脂柱色譜進(jìn)行吸 附。
5、 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟d中用30 70。/。乙醇進(jìn) 行洗脫，優(yōu)選用50%乙醇進(jìn)行洗脫；洗脫液的流速為每小時0.5 0.6倍柱體積。
6、 權(quán)利要求1或2所述的黑水纈草有效部位提取物的質(zhì)量控制方法， 包括下述步驟色i普條件Waters超高效液相；色譜柱Hypersil C18柱；流動相曱 醇-水為流動相梯度洗脫，其中甲醇和水的體積比為25-35: 75-65;流速1.0 ml/min;檢測波長280nm; ^主溫30。C;第一步，建立黑水纈草對照品液相色譜圖①對照品溶液的制備取經(jīng)過鑒定的(+ )松脂素-4, 4'-0-p-D-雙葡萄 吡喃糖苷、(+ ) 8-幾基-松脂素-4'-0-(3-D-葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂 素-4-0-(3-D-葡萄吡喃糖苷、(+ )松脂素-8-0-P-D-葡萄吡喃糖苷、(+ )松月旨 素一4-0-P-D-葡萄吡喃糖苷、(+ ) 8-羥基-松脂素、(+ )8, 9'-二羥基-松脂素-4'-0-P-D-葡萄吡喃糖苦、(+ ) 8-羥基-松脂素-4， 4'-0-(3-D-雙葡萄吡喃糖苷、 橄欖樹脂素-4，-0-P-D-葡萄糖苷、落葉松脂醇-4, 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷、 橄欖樹脂素-4-0-P-D-葡萄吡喃糖苷、8-羥基-落葉松脂醇-4'-0-p-D-葡萄吡喃 糖香、落葉松脂醇-4-0-(3-D-葡萄吡喃糖苷對照品各5.0mg,用甲醇定容至 2ml，濾過，即得；② 分別精密吸取對照品溶液溶液各10^1，注入液相色譜4義，照高效液相 色鐠法測定，測定對照品色語圖，建立峰面積與含量間的關(guān)系；③ 將對照品溶液各取10^1混合，定容至lml;取lOjxl,注入液相色譜 儀，照高效液相色譜法測定，測定混合對照品色譜圖；第二步，建立黑水纈草有效部位指紋圖譜共有模式圖譜 ①供試品溶液的制備取經(jīng)鑒定的為黑水纈草有效部位的粉末5.0g,用甲醇定容至2ml，濾過，即得；② 黑水纈草有效部位指紋圖譜測定分別精密吸取黑水纈草有效部位供 試品溶液溶液10^1,注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，即得黑水纈 草有效部位供試品指紋圖譜；③ 取(+ )松脂素-4， 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苦對照品lOpl,再取供試 品溶液40^d中，混勻定容至0.5ml,精密吸取混合溶液10|il，注入液相色譜 儀，進(jìn)行加樣回收測定；④ 對所收集并經(jīng)鑒定為黑水纈草有效部位的10批樣品按供試品溶液的 制備方法制備供試品溶液，并逐一按上述方法檢測，分別得到各批黑水纈草 有效部位相應(yīng)的指紋圖譜；經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助相似性評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算，得出黑水纈草有效部位共有模式圖譜；⑤ 色譜圖中應(yīng)檢出與對照指紋圖譜相同的13個共有特征峰；其中5號 峰為(+ )松脂素-4, 4'-0-(3-D-雙葡萄吡喃糖苷，應(yīng)與對照品指紋圖語一致； 供試品指紋圖i普與相應(yīng)的共有模式圖語經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助相似性評價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行計(jì) 算，相關(guān)系數(shù)大于0.9000。
7、 一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物組合物，其特征在于由 有效量的權(quán)利要求1或2所述的黑水纈草有效部位提取物與藥學(xué)上可接受的 載體或輔料組成。
8、 按照權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于將所述藥物組合 物制備成膠嚢劑、片劑、顆粒劑、滴丸劑、口服液或注射液。
9、 權(quán)利要求8所述膠嚢劑的質(zhì)量控制方法，包括含量測定(+ )松脂素-4, 4'-Op-D-雙葡萄吡喃糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱取在60。C減壓干燥至恒重的(+ )松脂素-4, 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷對照 品加曱醇制成每lml含0.1mg的溶液，搖勻；精密量取0.5ml， l.OmI, 1.5ml， 2.5ml與3.5ml，分別置50ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；照 分光光度法，在280nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)、濃度為橫 坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定法取待檢測內(nèi)容物，研細(xì)，取15mg,精密稱定，置25ml量瓶 中，加曱醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液l ml,置25ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；照分光光度法，在280nm的波長處分別 測定吸收度，分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中(+ )松脂素-4， 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷的重量，計(jì)算，即得，本品每粒含總木脂素以(+ )松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷計(jì)，不得少于150.0mg;(+ )松脂素-4， 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷對照高效液相色譜法測定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；25-35: 75-65的曱醇-水為流動相檢測波長為280nm,理論板數(shù)按(+)松脂素-4, 4'-O-卩-D-雙葡萄吡喃糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000;對照品溶液的制備稱取在60。C減壓干燥至恒重的(+ )松脂素-4, 4'-0-P-D-雙葡萄吡喃糖苷對照品加曱醇制成每lml含5嗎的溶液，即得；供試品溶液的制備取待檢測內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱定，加曱醇溶解并 稀釋至刻度，搖勻，濾過，用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即 得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各20pl，注入液相色諳儀， 測定，即得；本品每粒含(+ )松脂素-4, 4'-0-p-D-雙葡萄吡喃糖苷不得少于 1.50mg。
10、權(quán)利要求1或2所述的黑水纈草有效部位提取物在制備治療中樞神經(jīng) 系統(tǒng)退^f亍性疾病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了黑水纈草有效部位提取物及其質(zhì)量控制方法和醫(yī)藥用途。本發(fā)明提取物中總木脂素類物質(zhì)的含量占提取物總重量的50％以上；其中，以(+)松脂素-4，4′-O-β-D-雙葡萄吡喃糖苷和(+)松脂素-8-O-β-D-葡萄吡喃糖苷為有效部位提取物中的主要有效成分，二者的含量之和占提取物總重量的13％以上。本發(fā)明還公開該有效部位提取物的制備方法及其質(zhì)量控制方法。本發(fā)明有效部位提取物含有1個總木脂素類成分的有效部位群，能夠有效治療老年癡呆癥、抑郁癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。本發(fā)明黑水纈草抗老年癡呆有效部位提取物的制備工藝能適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，為應(yīng)用黑水纈草治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供了一種新方法。
文檔編號A61P25/24GK101601700SQ20091015913
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者匡海學(xué), 左月明, 張忠立, 王秋紅 申請人:匡海學(xué)