專利名稱：一種耦聯(lián)蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位為載體結(jié) 合人胃泌素片段的耦聯(lián)蛋白的設計與制備方法，涉及該耦聯(lián)蛋白在胃泌素分泌過多所致疾 病中的應用。
背景技術：
胃泌素(gastrin)作為胃腸道內(nèi)的營養(yǎng)因子可促進胃腸道癌生長。它主要由胃 竇及小腸粘膜的G細胞分泌，另外人胰島的D細胞也分泌。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、延髓的迷走 神經(jīng)背核也含有gastrin。按其所含氨基酸殘基數(shù)目的多少，gastrin可分為多種形式，主 要有gaStrin-34(G34)、gaStrin-17(G17) 二種，二者同時存在于同一種細胞，也能同時釋 放入血，并均有生物活性，G17的生物活性比G34大。有人認為gastrin分子大小不同的原 因，可能是由于神經(jīng)及內(nèi)分泌細胞的不同，或者雖然細胞相同，但它們在體內(nèi)的位置不同。 Gastrin的作用有很多通過其5個羧基端氨基酸高親和度地結(jié)合于胃泌素(gastrin)/膽囊 收縮素(CCK-B)受體上。Gastrin/CCK-B受體是一個胞質(zhì)膜蛋白，屬于G蛋白耦聯(lián)受體家 族，含447個氨基酸，具有七個跨膜結(jié)構域，第一跨膜結(jié)構域和第四跨膜結(jié)構域為其主要抗 原表位，對胃泌素及膽囊收縮素(CCK)具有很高的親和力該蛋白通過G蛋白耦聯(lián)于跨膜信 號轉(zhuǎn)導途徑然后控制不同基因的表達。Gastrin最基本的作用是刺激壁細胞分泌鹽酸；刺 激胃和胰分泌酶；刺激胃、胰、肝和十二指腸腺分泌水和電解質(zhì)；刺激胃(底、體)、小腸、結(jié) 腸粘膜的生長；刺激胃、小腸、胰的血流；刺激下食道括約肌、胃、小腸和膽囊收縮；抑制幽 門括約肌的收縮；抑制小腸對水和電解質(zhì)的吸收。胃泌素通過與Gastrin/CCK-B受體結(jié)合，增加胃酸分泌，以致破壞胃粘膜層，導致 胃潰瘍，此為胃潰瘍的根本原因。對大腸癌組織、癌旁粘膜及正常粘膜中gastrin含量進行 測定，結(jié)果癌組織及癌旁粘膜中gastrin含量明顯高于正常大腸粘膜，提示大腸癌細胞具 有自分泌gastrin促生長作用，gastrin在癌組織周圍具更高的敏感性，從而導致癌腫的蔓 延擴大，說明gastrin同樣促進腫瘤細胞的生長。這一結(jié)果提示gastrin對某些癌癥診斷
眉、ο胃潰瘍及消化系統(tǒng)癌癥與gastrin及其受體相互作用明顯的相關性為這些病癥 提供了一條治療路線，即阻止gastrin與其受體的相互作用。從目前情況看，研究主要側(cè)重 于用高親和性拮抗劑封閉gastrin/CCK-B受體。一些高親和性gastrin/CCK-B受體拮抗劑 在一些實驗性胃腸癌上進行了體內(nèi)及體外的治療學評價。然而這些拮抗劑有嚴重的毒副作 用并且缺少特異性，它們阻斷所有受體的配體如在正常細胞中的G34和CCK。由于gastrin 拮抗劑對于gastrin/CCKB受體的低特異性，它們對腫瘤生長不能有效控制。因而，假如在 自分泌生長過程中gastrin與受體的結(jié)合不能完全抑制，則gastrin受體拮抗劑不可能阻 斷腫瘤生長促進機制。因此，如果能得到抗胃泌素抗體，用該抗體去治療因gastrin分泌過 多引起的胃潰瘍或消化道癌癥，無疑是一個不錯的方案。但與消化道疾病有關的胃泌素為 G17，單獨使用幾乎不能誘使動物產(chǎn)生特異抗體。
大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)為一同源五聚體，它與廣泛存在于真核細 胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl)受體有特異的結(jié)合能力，能誘使機體產(chǎn)生較強的免疫反應，并 且LTB無毒，因而被廣泛用于免疫佐劑。本發(fā)明利用LTB作為載體，將胃泌素片段通過化學 方法將它們耦聯(lián)形成一新型蛋白，該蛋白具有很強的免疫原性，能使動物產(chǎn)生很高滴度的 抗胃泌素受體的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于提供具有五個分支的，很強免疫原性的耦聯(lián)蛋白 (NH2-LTB-CGGGSQGPWLE)5 及(NH2-LTB-CGGGSQRPPLE)5。本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)該耦聯(lián)蛋白的方法.本發(fā)明的另一目的在于提供該融合蛋白在作為治療消化道疾病藥物中的應用。技術方案1、從野生型產(chǎn)毒大腸桿菌中分離并擴增LTB基因，并將該基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌以得 到分泌表達的LTB五聚體。純化LTB。2、人工全合成N端帶有Cys的人及大鼠胃泌素片段CGGGSQGPWLE及CGGGSQRPPLE。3、用活化劑和耦聯(lián)劑將LTB與CGGGSQGPWLE及CGGGSQRPPLE分別連接起來，形成 具有五個分支的耦聯(lián)蛋白(NH2-LTB-CGGGSQGPWLE) 5及(NH2-LTB-CGGGSQRPPLE) 5。純化該蛋白。4、用Elisa法將該疫苗免疫大鼠，測定抗體滴度。5、測定免疫后的大鼠對鼠胃泌素17胃酸分泌的抑制作用。


附圖1大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位及耦聯(lián)蛋白的SDS-PAGE圖M 蛋白質(zhì)中分量標準1:LTB (不煮)2:LTB(煮)3:耦聯(lián)蛋白(不煮)4:耦聯(lián)蛋白(煮)由圖看出耦聯(lián)蛋白分子量稍高，二者都在煮沸的情況下解聚成單體。附圖2不同免疫組動物的累積泌酸量由圖看出免疫耦聯(lián)蛋白組的胃酸分泌量顯著減少P <0.01。說明免疫耦聯(lián)蛋白 后，大鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗胃泌素抗體，中和了胃泌素的泌酸作用。附圖3耦聯(lián)蛋白四次免疫大鼠后(每次100 μ g，間隔3周免疫一次)，血清稀釋至 100倍時的抗體滴度。由圖看出免疫了耦聯(lián)蛋白的大鼠產(chǎn)生了特異抗G17抗體。
具體實施例方式實施例1，表達LTB的工程菌的構建。從野生型產(chǎn)毒大腸桿菌H44815中用PCR法擴增LTB基因，將該基因通過NcoI位點和BamHI位點重組入pET22b質(zhì)粒，篩選并純化重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami DE3，挑取鑒定。實施例2，LTB的表達重組工程菌pET22b-LTB/0rigami DE3進行IOL發(fā)酵表達，加入IPTG至終濃度為 0. lmmol/L，在18°C誘導表達過夜。實施例3，LTB的純化離心收取發(fā)酵細菌，用TEAN(20mmol/L Tris,2mmol/L EDTA,3mmol Na3N, 300mmol/LNaCl, pH 8.0)重懸，高壓均質(zhì)破菌，離心收取上清。將上清上經(jīng)TEAN平衡的固 相化半乳糖柱(Immobilised D-glactose)，用TEAN復平衡，用含0. 3mmol/L半乳糖的TEAN 洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。實施例4，CGGGSQGPffLE 及 CGGGSQRPPLE 多肽的制備委托合成HPLC純度的多肽。實施例5，LTB 與 CGGGSQGPWLE 及 CGGGSQRPPLE 多肽的耦聯(lián)(I)LTB 與 N-(gamma-maleimido-butyryl-oxy) succinimide (GMBS)以 1 4 摩爾 比在室溫下反應Ih.(2)多余的 GMBS 用 S印hadex G-25 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)凝膠過濾層析 除去。(3)收集LTB-GMBS并與多肽以1 2的摩爾比在室溫下反應2h。肽N端的Cys 直接與GMBS分子的馬來酰亞胺基團(maleimide group)反應。(4)交聯(lián)反應后，未反應的GMBS基團用終濃度為50mmol/L的2_巰基乙醇在室溫 下粹滅30min。(5) LTB交聯(lián)分子通過用S印hadex G_50column (Pharmacia)分離。近似摩爾比為 1 5的LTB五聚體/肽通過Superdex 200純化。(6)交聯(lián)物通過煮沸或未煮沸進行SDS-PAGE進行驗證。 實施例6，耦聯(lián)蛋白(NH2-LTB-CGGGSQRPPLE) 5的免疫原性與生物活性測定(1)動物免疫8_10周齡雌性Wistar大鼠皮下免疫兩組(6只/組)分別用含 LTB100 μ g 的 200 μ L PBS (ρΗ7. 4)，含耦聯(lián)蛋白 100 μ g 的 200 μ LPBS (ρΗ7. 4)進行皮下多點 免疫。間隔三3周免疫一次，總共免疫4次。第四次免疫后10天進行胃泌酸實驗。(2)急性胃瘺泌酸實驗動物實驗前禁食不禁水24小時；戊巴比妥鈉麻醉；分離 胃，結(jié)扎幽門端；胃上插入導管；用35°C生理鹽水洗去胃內(nèi)容物。動物保溫半小時后尾靜脈 注射50 μ L/只(200ng/mL)的大鼠胃泌素(IOOng/只)；注射后結(jié)扎賁門端；收集導管流出 的胃液，45分鐘后取胃，0.9% NaCl溶液0. 5mL沖洗胃內(nèi)分泌物，堿滴定測定計算胃酸總量。 結(jié)果見附圖2。(3)Elisa法測定特異抗體用大鼠胃泌素G17包被96孔板，將進行胃泌酸實驗 當天采集的耦聯(lián)蛋白免疫組與PBS對照組動物血清均稀釋至100倍作一抗，山羊抗大鼠 IgG-HRP作二抗，OPD作底物顯示，讀取492nm處光吸收值，用耦聯(lián)蛋白免疫組讀數(shù)減去對照 組讀數(shù)作圖見附圖3。序列表SEQUENCE LISTING
5
<110>重慶教育學院<120>—種耦聯(lián)蛋白<130>a<140>a<141>2009-05-31<160>2<170>PatentIn version 3. 3<2IOM<211>11<212>PRT<213>人工合成<400>1Cys Gly Gly Gly Ser Gln Gly Pro Trp Leu Glu1510<210>2
<211>11<212>PRT<213>人工合成<400>2Cys Gly Gly Gly Ser Gln Arg Pro Pro Leu Glu1510
權利要求
一種耦聯(lián)蛋白，其特征在于該蛋白以一個載體連接五個相同的短肽。
2.權利要求1所述的載體為大腸桿菌不耐熱腸毒素，大腸桿菌不耐熱腸毒素無毒突變 體，大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位之一。
3.權利要求1所述的載體，優(yōu)選為大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位。
4.權利要求1所述的短肽為連接肽連接的人或大鼠胃泌素片段。
5.權利要求4所述的連接肽連接的人胃泌素片段，其序列為Seql=CysGly Gly Gly Ser GlnGly Pro Trp Leu Glu0
6.權利要求4所述的連接肽連接的大鼠胃泌素片段，其序列為Seq2:CySGly Gly Gly Ser GlnArg Pro Pro Leu Glu0
7.權利要求1所述的的耦聯(lián)蛋白在制備疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耦聯(lián)疫苗的設計技術及制備純化技術，涉及該耦聯(lián)疫苗在作為抑制胃酸過多的藥物中的應用。本發(fā)明的特征在于將大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)通過化學方法與通過連接肽連接的胃泌素片段耦聯(lián)，形成五聚體的新型蛋白。將這種耦聯(lián)蛋白皮下免疫大鼠，通過胃造瘺法測定胃泌素對胃酸分泌的影響。實驗表明，本發(fā)明的耦聯(lián)蛋白能顯著減少胃泌素所致的大鼠胃酸分泌，這提示所發(fā)明的耦聯(lián)蛋白可以作為疫苗抵抗人體因胃泌素分泌增加所致疾病。
文檔編號A61K39/39GK101906164SQ200910104020
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月4日 優(yōu)先權日2009年6月4日
發(fā)明者馮強 申請人:重慶教育學院