專利名稱：姜黃素的一種新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及姜黃素的一種新用途。
背景技術(shù)
一、姜黃素的特性和藥理作用
1、姜黃素的一般特性
姜黃素(curcumte，Cur)是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中提 取到的一種天然多酚類化合物(其化學結(jié)構(gòu)如圖1所示)。姜黃素易溶于甲醇、乙醇、 堿、醋酸、丙酮、二甲基亞砜等有機溶劑，幾乎不溶于水，分子式為C21H2tlO6,分子量 為368.38，其主鏈為不飽和脂族及芳香族基團。姜黃素具有抗氧化、抗纖維化、抗腫 瘤、抗抑郁、抗炎、抗病毒、抗血栓、抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，且毒性 很低。但口服姜黃素的血藥濃度低，生物利用率不高。
2、姜黃素的抗氧化作用
近年來，許多研究證實了姜黃素可以上調(diào)各種抗氧化因子、減少丙二醛(MDA) 產(chǎn)生，而發(fā)揮抗氧化作用。在各種氧化應激中，由于促氧化與抗氧化平衡失調(diào)，導致傾 向于前者的損害，如自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應，終產(chǎn)物為MDA，后者會引起蛋 白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，并且具有細胞毒性?？寡趸蜃佑羞^氧化氫酶 (catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)等，具有非 常重要的生理作用。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是一種重要的過氧化物分解酶，能 催化GSH變?yōu)镚SSG，使過氧化物還原成羥基化合物，并促進H2O2的分解，發(fā)揮抗氧化 作用。過氧化氫酶同樣可以催化H2O2的分解，從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。
在黃曲霉毒素誘導的雄性Swiss小鼠肝腎脂質(zhì)過氧化作用實驗中，給予姜黃 素(50mg/kg)45日能夠上調(diào)酶和非酶的抗氧化因子而發(fā)揮抗氧化作用(Verma R J， Mathuria N.Curcumin ameliorates aflatoxin—induced lipid-peroxidation in liver andkidney of mice.Acta Pol Pharm, 2008，65(2) 195-202.)，并能減輕肝腎 DNA、RNA、蛋白質(zhì)的 損害(Mathuria N， Verma R J.Ameliorative effect of curcumin onaflatoxin—induced toxicity in DNA, RNA and protein in liver and kidney of mice.ActaPol Pharm, 2007, 64(6) 497-502.)。姜黃素還能減輕環(huán)孢菌素誘導的大鼠腎臟的氧化損傷(TirkeyN，KaurG, Vy G， et al.Curcumin, a diferuloylmethane, attenuatescyclosporine-induced renal dysfunction and oxidative stress in rat kidneys.BMCPharmacol, 2005, 5 15.)。預先給予姜黃素也 能減輕氧化應激損傷。如預先給予姜黃素O00mg/kg)2周，能夠改善慶大霉素誘導 的雄 t生大鼠 lIf 氧化損傷(Farombi E O, Ekor M.Curcumin attenuates gentamicin—induced renal oxidative damage in rats.FoodChem Toxicol, 2006，44(9) 1443-8.)。預先給予姜 黃素(50mg/kg)3日，能夠減輕氮基三醋酸鐵誘導的雄性Wistar大鼠腎臟脂質(zhì)過氧化損 傷(Eybl V，Kotyzova D, Cerna P, et al.Effect of melatonin, curcumin, quercetin, and resveratrol on acute ferricnitrilotriacetate (Fe-NTA) -induced renal oxidative damage in rats.HumExp Toxicol, 2008，27(4) 347-53.)、氯化鎘誘導的雄性小鼠脂質(zhì)過氧化損傷(Eybl V, Kotyzova D, Koutensky J, et al.Comparative study of natural antioxidants-curcumin, resveratrol andmelatonin—in cadmium-induced oxidative damage in mice.Toxicology, 2006, 225(2-3) 150-6.)。預先給予姜黃素QOOmg/kg) 7日能夠通過上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)抗氧化，而減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用(Bayrak O，UzE, BayrakR, et al.Curcumin protects against ischemia/reperfusion injury in rat kidneys.World JUrol，2008, 26(3) 285-91.)。
3、姜黃素的抗纖維化作用
姜黃素具有抗纖維化的作用，如可用于抗肝、肺、腎、胰等器官的纖維化。其 作用機制主要與抑制成纖維細胞的增殖、減少細胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生、增加金屬蛋白酶 的活力以及調(diào)節(jié)各種信號因子有關(guān)。
姜黃素能夠誘導過氧化物酶體增殖體活化受體r(PPARr)基因表達、激活 PPARr,抑制肝星狀細胞的活化與增殖，從而使肝纖維化程度降低(Xu J，F(xiàn)uY, Chen A.Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma contributes to theinhibitory effects of curcumin on rat hepatic stellate cell growth.Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol, 2003，285(1) G20-30.),并且還能誘導硬皮病肺成纖維細胞6LF)的凋亡(Tourkina Ε, Gooz P, Oates J C, etal.Curcumin-induced apoptosis inscleroderma lung fibroblasts role of protein kinase cepsilon.Am J Respir Cell Mol Biol, 2004, 31 (1) 28—35.)。 姜黃 素(50mg/kg)能夠減少SD大鼠腎中毒血清腎炎模型中腎小球膠原蛋白IV、纖連蛋白 含量，發(fā)揮抗纖維化作用(Bao H Y, Chen R H, Huang SM, et al.[Effect of curcumin on extracellular matrix accumulation in the glomeruli innephrotoxic sera nephritis rats].Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2004，2(1) 30-2.)?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinase， MMPs)具有降解ECM成分、減緩纖維化病變的作用。姜黃素可以通過抑制基質(zhì)金屬 蛋白酶抑制劑(TIMPs)表達，提高局部基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性而發(fā)揮抗纖維化 的作用(Jiang Y, Li Z S, Jiang F S， et al.Effects of different ingredients of zedoary on gene expression of HSC-T6 cells.World JGastroenterol, 2005，11(43) 6780-6.)。姜黃素能 夠抑制TGF-β誘導的體外培養(yǎng)的肺成纖維細胞α-平滑肌動蛋白(α-SMA)的表達 (Hu Y, Peng J, Feng D, etal.Role ofextracellular signal-regulated kinase, p38 kinase, and activator protein-1 in transforminggrowth factor—betal-induced alpha smooth muscle actin expression in human fetal lungfibroblasts in vitro.Lu ng, 2006, 184(1) 33—42.)。在體夕卜培 養(yǎng)TGF-β誘導的腎成纖維細胞實驗中，姜黃素能夠下調(diào)TGF-β II型受體、減少Smad 的磷酸化、抑制c-jun活力，減少ECM的產(chǎn)生(Gaedeke J，NobleNA, BorderWA, et al.Curcumin blocks multiplesites of the TGF-beta signaling cascade in renal cells.Kidney Int, 2004，66(1) 112-20.)。在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻模型中，姜黃素能夠下調(diào)促纖維因子發(fā) 揮抗纖維化作用，而抑制核因子-κ B (NF- κ B)信號途徑可能起重要作用(Kuwabara N， Tamada S，Iwai T, etal .Attenuation of renal fibrosis by curcumin in rat obstructive nephropathy. Urology, 2006，67(2) 440-6.)。在腎小球腎炎大鼠模型中，姜黃素能夠通過上調(diào) 血紅素氧化酶-ICheme oxygenase 1，HO-1)而發(fā)揮抗纖維化作用，并呈劑量依賴性， 50-100mg/kg 時達到最大抑制作用(Gaedeke J，NobleNA, BorderWA, et al. Curcuminblocksfibrosis in anti-Thy 1 glomerulonephritis through up-regulation of heme oxygenase 1.Kidney Int, 2005，68(5) 2042-9.)。
近年來，有關(guān)姜黃素抗囊性纖維化的作用仍存在許多爭議(EganME， Pearson Μ, Weiner S A, et al.Curcumin, a major constituent of turmeric, corrects cystic fibrosisdefects.Science, 2004，304(5670) 600-2.Dragomir A，Bjorstad J, Hjelte L, et al.Curcumin does not stimulate cAMP-mediated chloride transport in cystic fibrosis airwayepithelial cells.Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322(2) 447-51.), 最 近 研究發(fā)現(xiàn)，盡管姜黃素不能增強囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子(deltaF508-CFTR)的表 達，但可通過下調(diào)鈣網(wǎng)質(zhì)蛋白(calreticulin，CRT)而改善倉鼠卵巢細胞deltaF508_CFTR 的 功 能(Harada K, Okiyoneda T, Hashimoto Y，etal.Curcumin enhances cystic fibrosistransmembrane regulator expression by down-regulating calreticulin.Biochem BiophysRes Commun，2007，353(2) 351-6.)。
4、姜黃素的抗腫瘤作用
姜黃素的抗腫瘤作用主要通過一系列信號途徑抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細 胞凋亡，同時姜黃素還具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抗血管生成、提高免疫力等作用。
姜黃素可使細胞分裂停滯G2和G2/S期，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。 Holy (Holy J Μ.Curcumin disrupts mitotic spindle structure and induces micronucleationin MCF-7breast cancer cells.Mutat Res, 2002，518(1) 71-84.)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素阻斷細胞 于 G2/M 期與細胞核異常裝配有關(guān)。Squires 等 Squires M S，HudsonEA, HowellsL, etal.Relevance of mitogen activated protein kinase (MAPK) andphosphotidylinositol-3-kinase /protein kinase B (PI3K/PKB) pathways to induction ofapoptosis by curcumin in breast cells. Biochem Pharmacol, 2003，65(3) 361-76.)證實姜黃素通過影響 S/G2/M 細胞周期 而抑制 HBL100 和 MDA-MB-468 人乳腺癌細胞的增殖。Choudhuri (Choudhuri T，Pal S，Agwarwal M L, etal.Curcumin inducesapoptosis in human breast cancer cells through p53-dependent Bax induction.FEBS Lett, 2002, 512(1-3) 334_40.)等發(fā)現(xiàn)姜黃素能誘導 MCF-7乳腺癌細胞的凋亡，其機制與上調(diào)野生型p53和Bax表達有關(guān)。
姜黃素能夠誘導人肺癌細胞的凋亡，其機制與下調(diào)p53、bcl-2、bcl-X、Bak和 caspase 的表達有關(guān)(Radhakrishna Pillai G， Srivastava A S， Hassanein T I, etal.nductionof apoptosis in human lung cancer cells by curcumin.Cancer Lett, 2004, 208(2) 163-70.)。
姜黃素能夠誘導K562白血病細胞的凋亡，其可能機制為抑制谷胱甘肽轉(zhuǎn)移 酶GSTP-I的表達，阻斷腫瘤壞死因子TNF-α的表達，抑制佛波酯誘導的轉(zhuǎn)錄因子活 化蛋白-I(AP-I)和NF-κ B結(jié)合形成的轉(zhuǎn)錄因子與GSTP-I基因的啟動子相結(jié)合，抑制 TNF-α 誘導的 GSTP-I 基因轉(zhuǎn)錄活性(Duvoix A，Morceau F，Delhalle S，etal.Induction of apoptosis by curcumin mediation by glutathione S-transferase Pl-Iinhibition.Biochem Pharmacol, 2003，66(8) 1475—83.)。
研究發(fā)現(xiàn)(SindhwaniP，Hampton J A, Baig M M，etal.Curcumin preventsintravesical tumor implantation of the MBT-2 tumor cell line in C3H mice.J Urol, 2001，166(4) 1498-501.)姜黃素與人UMUC及鼠MBT-2膀胱癌細胞共孵育，能夠抑制 兩種細胞的生長，并能觀察到凋亡細胞的存在，提示對膀胱癌細胞的生長和移植有顯著的抑制作用。另有研究發(fā)現(xiàn)(TongQ S，ZhengLD, Lu P，et al.Apoptosis-inducingeffects of curcumin derivatives in human bladder cancer cells.Anticancer Drags, 2006, 17(3) 279-87.)姜黃素能夠上調(diào)膀胱癌EJ細胞中凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)而促進EJ細胞的凋 亡，但不影響正常腎小管上皮細胞。
姜黃素可以阻止直腸癌細胞DNA的錯配修復，并通過抑制細胞色素P450酶的 活性和提高谷胱甘肽轉(zhuǎn)化酶的活性而發(fā)揮抗癌作用(Chauhan D P, etal.Chemotherapeutic potential of curcumin for colorectal cancer. Curr Pharm Des，2002, 8 (19) 1695-706.)。
姜黃素還可抑制肝癌QGY細胞生長，其抑瘤率具有劑量依賴性和時間依賴性， 流式細胞儀分析證實細胞停止在S期，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞有變性、壞死、凋亡(厲紅 元，車藝，等.姜黃素對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響.中華肝臟病雜志，2002，10(6) 449-451.)。
5、姜黃素的抗抑郁作用
近年來，研究發(fā)現(xiàn)(XuY，Ku B S, Yao HY, etal.Antidepressant effects of curcuminin the forced swim test and olfactory bulbectomy models of depression in rats. PharmacolBiochem Behav.2005, 82(1) 200-6.),姜黃素在大鼠強迫游泳實驗與雙側(cè)嗅球 損傷實驗中具有一定的抗抑郁作用。隨后研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠修復慢性應激大鼠抑郁模 型海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷，同時能夠上調(diào)5羥色胺1A(5-HT1a)受體和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)水平，從而發(fā)揮抗抑郁作用(Xu Y，Ku B，CuiL, et al.Curcuminreverses impaired hippocampal neurogenesis and increases serotonin receptor IA mRNAand brain-derived neurotrophic factor expression in chronically stressed rats.Brain Res, 2007, 1162 9-18.)。 進一步研究發(fā)現(xiàn)姜黃素抗抑郁通過5-羥色胺能系統(tǒng)介導，并證實至少與5-HT1A/1B受體和 5_1112(3受體有關(guān)(Wang R, XuY, WuHL, etal.Theantidepressant effects of curcumin in the forced swimming test involve 5-HTl and5_HT2 receptors.Eur J Pharmacol, 2008, 578(1) 43-50.)。
6、姜黃素的抗炎作用
腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白介素等炎癥因子，在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中具有重 要的作用。姜黃素能夠通過抑制TNF-α而改善順鉬誘導的大鼠腎臟炎癥損害，并呈劑 量依賴性(Kuhad A, Pilkhwal S，Sharma S，et al.Effect of curcumin oninflammation and oxidative stress in cisplatin—induced experimental nephrotoxicity.JAgric Food Chem, 2007, 55(25) 10150-5.)。Wistar大鼠急性胰腺炎模型末期，姜黃素能夠下調(diào)TNF-α與白 介素-6 (IL-6)而發(fā)揮抗炎作用(Gulcubuk A, Altunatmaz K, Sonmez K, et al.Effects of curcumin on tumour necrosis factor-alpha and interleukin-6in the late phase of experimental acute pancreatitis.J Vet Med A Physiol Pathol ClinMed, 2006, 53 (1) 49-54)。 最近研 究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以減少TNF-α誘導HaCaT細胞的IL-I β和IL-6產(chǎn)生，但不影響 IL-8 (Cho J W，Lee K S，Kim C W.Curcuminattenuates the expression of IL-I beta, IL-6, and TNF-alpha as well as cyclin E inTNF-alpha-treated HaCaT cells ； NF-kappaB and MAPKs as potential upstream targets.Int J Mol Med, 2007, 19(3) 469-74.)。
7、姜黃素的抗病毒作用
姜黃素具有抗人類免疫缺陷病毒(HIV)活性(Araujo C C，Leon L LBiologicalactivities of Curcuma longa L.Mem Inst Oswaldo Craz, 2001, 96(5) 723—8.), 其機制主要通過抑制長末端重復序列、病毒復制的相關(guān)酶(逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶和HIV-I 整合酶)以及細胞因子的活性，而發(fā)揮抗HIV作用。姜黃素還可通過抑制BZLFl 基因的轉(zhuǎn)錄而達到抑制EB病毒的作用(Hergenhahn M, Soto U, Weninger A, etal. Thechemopreventive compound curcumin is an efficient inhibitor of Epstein-Barr virusBZLFl transcription in Raji DR-LUC cells.Mol Carcinog，2002，33(3) 137—45.)。
8、姜黃素的抗血栓作用
1985 年研究已發(fā)現(xiàn) Nrivastava R, Dikshit Μ, Srimal R C, etal. Anti-thromboticeffect of curcumin.Thromb Res, 1985，40 (3) 413-7.)，姜黃素在體外和體內(nèi)均可抑制膠原和腎上腺素誘導的血小板聚集。近年來，研究證實(ChenHW， Kuo H Τ, Chai CY, et al.Pretreatment of curcumin attenuates coagulopathy and renal injury inLPS-induced endotoxemia.J Endotoxin Res, 13(1) 15-23.),預先腹膜內(nèi)給予姜黃素能夠改善脂多糖誘導的大鼠彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)損害，其機制為姜黃素能夠減少血 小板、血漿纖維蛋白原的消耗，并能減少腎臟腎小球纖維素沉積。
9、姜黃素的抗血管生成作用
研究證明(Mohan R, Sivak J, Ashton P, et al.Curcuminoids inhibit the angiogenicresponse stimulated by fibroblast growth factor—2, including expression of matrixmetalloproteinase gelatinase B.J Bio Chem, 2000, 275(14) 10405-12.),姜黃素局部和口服給藥均具有抗血管生成的作用。姜黃素可通過抑制MMP活性而抑制血管的生成 (李劍明，楊和平.雙脫甲氧基姜黃素抗血管生成作用分子學機制研究.中國臨床康復， 2004，8(27) 5830-1.)。姜黃素還能抑制牛血清及腫瘤細胞條件培養(yǎng)液促進的牛內(nèi)皮細 胞遷移，從而抗血管生成(高承賢，丁志山，梁冰冰，等.姜黃素對血管生成影響的實驗 研究.中藥材，2003，26(7) 499-502.)。姜黃素能抑制人肝癌細胞BEL-7402中VEGF 蛋白和mRNA的表達(孫軍，王賀玲，李巖.姜黃素對人肝癌細胞中血管內(nèi)皮生長因子表 達的影響.中華消化雜志，2006，26(12) 843-4.)。
10、姜黃素的免疫調(diào)節(jié)作用
有研究證實(VaralakshmiCh，AliAM，Pardhasaradhi，B V, et al.Immunomodulatory effects of curcumin in-vivo.Int Immunopharmacol，2008, 8(5) 688-700.)，長期的腹腔注射姜黃素，并不削弱天然殺傷細胞、巨噬細胞、T細胞的免疫 功能，相反能夠促進T細胞的增殖，因此是一種安全有效的免疫調(diào)節(jié)劑。姜黃素可以 抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞的活化和增生，以及抑制抗體的產(chǎn)生及淋巴因 子的分泌，機制與下調(diào)CD^、CD80的表達并且上調(diào)細胞溶解性T淋巴細胞相關(guān)抗原 相關(guān)(Sharma S，Chopra K, Kulkarni S K, et al.Resveratrol and curcuminsuppress immune response through CD28/CTLA-4and CD80 co-stimulatory pathway.Clin Exp immunol， 2007，147(1) : 155-63.)。姜黃素還可抑制變異淋巴細胞的增殖(Ranjan D，Chen C， Johnston T D, et al.Curcumin inhibits mitogen stimulatedlymphocyte proliferation, NFkappaB activation, and IL-2 signaling.J Surg Res, 2004，121(2) 171-7.)，抑制分裂素 ConA、 PHA、PMA 誘導的人脾淋巴細胞的增殖(GururajanM，Dasu Τ, Shahidain S, et al.Spleen tyrosine kinase (Syk), a novel target ofcurcumin, is required for B lymphoma growth.JImmunol, 2007，178(1) 111-21.)，并能影響正常自然殺傷細胞(NK細胞)的免疫功 能，增加 NK細胞的細胞毒性(YadavV S，Mishra K P，SinghDP, etal.Immunomodulatory effects of curcumin.Immunopharmacol Immunotoxicol.2005, 27(3) 485—97.)。 姜黃素可 以抑制脂多糖或分裂素誘導的巨噬細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞和骨髓細胞的腫瘤壞死因 子(TNF-2)表達(Kim G Y，Kim K H，Lee S H，etal.Curcumin inhibits immunostimulatory functionof dendritic cells MAPKs and translocation of NF-kappa B as potential targets. JImmunoL 2005，174(12) 8116—24.)。
11、姜黃素治療糖尿病的作用
姜黃素可以改善鏈脲霉素誘導的雄性SD糖尿病大鼠的腎功能，其機制為抑制 熱休克蛋白-27和MAP激酶p38的表達，抑制組蛋白H3的去磷酸和乙?；?TikooK， Meena R L， Kabra D G， et al.Change in post-translational modifications of histoneH3， heat-shock protein-27 and MAP kinase p38 expression by curcumin instreptozotocin-induced type I diabetic nephropathy.Br J Pharmacol.2008，153 (6) 1225-31.)。
12、姜黃素的降血脂作用
姜黃素可通過增加各種抗氧化酶如環(huán)氧化物水解酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、谷胱 甘肽過氧化物酶等的活性，改變脂肪酸的代謝如增加膽囊對LDL排泄、抑制脾對LDL 的攝取，而降低高脂模型大鼠血脂水平，起到降血脂和抗動脈粥樣硬化作用(Asai，A, Miyazawa T.Dietary curcuminoids prevent high fat diet-induced lipidaccumulation in rat liver and epididymal adipose tissue.J Nutr, 2001, 131(11) 2932-5.)。
13、姜黃素潛在毒性作用
姜黃素的血藥濃度低，生物利用度不高，口服的姜黃素有40% 75%未經(jīng)變化 通過胃腸道，被吸收的姜黃素主要在小腸黏膜與肝臟中代謝。急、慢性動物試驗證實 小鼠經(jīng)口服姜黃乙醇提取物(ETE)，未見顯著的死亡率差異；亞慢性體重處理的小鼠與 對照組相比未見明顯的體重改變，而心、肺等臟器的重量明顯改變，并且血中的RBC、 WBC水平顯著降低；未發(fā)現(xiàn)顯著的精子致畸毒性。
綜上所述，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)姜黃素具有許多藥理學作用，但目前尚未見任何其與 多囊腎病發(fā)生與治療的相關(guān)報道。
二、常染色體顯性遺傳多囊腎病發(fā)病機制和治療進展
常染色體顯性遺傳多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)是一種常見的單基因遺傳疾病，在國外的發(fā)病率高達1/1000-1/400，占我國終 末期腎衰竭病因的第4位。目前，已發(fā)現(xiàn)三個基因與ADPKD發(fā)病有關(guān)，其中PKDl基因 (polycystic kidney disease 1)定位于染色體16pl3.3，該基因的突變約占ADPKD的85% ； PKD2基因定位于甸21-23，該基因的突變約占ADPKD的15% ； PKD3基因的突變僅發(fā) 現(xiàn)數(shù)個家系，尚未定位。ADPKD病變以雙腎多發(fā)性進行性囊泡為主要特征，引起腎功能 改變，終末期導致腎衰，常伴有肝、脾、胰等器官囊性病變以及心腦血管病變。目前， 除應用腎移植和透析治療終末期腎衰，尚無特效療法阻止囊泡的發(fā)生和生長。因此，延 緩ADPKD發(fā)病、甚至逆轉(zhuǎn)ADPKD的病程是國內(nèi)外該領(lǐng)域的研究熱點。
PKDl基因與PKD2基因編碼的蛋白分別稱為多囊蛋白l(polycystin_l，PCl)禾口 多囊蛋白2(p0lyCyStin-2，PC2)。其中，PCl是腎小管上皮細胞膜受體，主要亞細胞定位于腎上皮細胞纖毛、緊密連接部、粘著連接、橋粒、粘著斑等；PC2具有鈣離子通道 的作用，主要亞細胞定位于纖毛、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、中心體等。在腎小管上皮細胞纖毛處，PCl 與PC2相互作用組成功能復合體，PCl可感知腎小管腔內(nèi)液體對纖毛的機械刺激，并將 信號傳遞給PC2，PC2介導Ca2+內(nèi)流，Ca2+內(nèi)流進一步引起細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放，維 持胞內(nèi)Ca2+濃度至正常水平。Ca2+水平正常的細胞內(nèi)，Ca2+能夠通過抑制腺苷酸環(huán)化酶 6來抑制cAMP的生成，同時還可以激活磷酸二酯酶(PDE)而降解cAMP，因此，細胞內(nèi) Ca2+能夠負向調(diào)節(jié)細胞內(nèi)cAMP的濃度。當PKDl基因或PKD2基因發(fā)生突變時，細胞內(nèi) Ca2+濃度降低，Ca2+負向調(diào)節(jié)cAMP的作用減弱，細胞內(nèi)cAMP濃度增高。增高的細胞 內(nèi)cAMP活化蛋白激酶A (PKA)，PKA可以激活Ras/Raf/MEK/ERK信號通路而促進囊 泡上皮細胞的增殖；PKA還可以激活囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子(CFTR)促進氯離子 分泌至囊腔，提高囊泡內(nèi)滲透壓，引起鈉和水繼發(fā)性向囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運而促進囊液的分泌， 最終導致多囊腎的病理學改變。另有研究表明，PCl在PC2的參與下可作用于蛋白質(zhì) 酪氨酸激酶(JAK2)，通過信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子KSTAT1)上調(diào)p21waf基因的表達， p21可抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)而使Gl期延長，從而抑制細胞增殖(Bhunia AK, Piontek K, BolettaA, et al.PKDl induces p21 (wafl) and regulation of thecell cycle via direct activation of the JAK-STAT signaling pathway in a process requiringPKD2.Cell, 2002, 109(2) 157-68.)。PCl還可以在PC2的參與下作用于JAK2，通過信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活 因子3 6TAT3)促進肝細胞生長因子(HGF)介導的腎小管分化。當PKDl基因或PKD2 基因發(fā)生突變時，p21waf基因的表達減少，細胞增殖增加，同時腎小管分化減少，促進 多囊腎的發(fā)生。PCl可通過與結(jié)節(jié)性硬化癥(TSC2)基因和mTOR形成復合物而抑制 mTOR的活性，從而調(diào)節(jié)mTOR信號通路。在ADPKD中，PCl的缺失會導致mTOR信 號通路的異常激活，使細胞過度增殖(MostovKE.mTOR is out of control in polycystic kidney disease.Proc Natl Acad Sci USA, 2006，103 (14) : 5247-8.)。在正常的腎小管上皮細胞 中，PCl參與β -連環(huán)素(β -catente)和E-鈣粘附分子(E_cadherin)形成復合物的過程， 維持細胞連接；PCl還可以上調(diào)糖原合成酶激酶3 β (GSK3 β )活性促進β -catenin的降 解，從而保持細胞質(zhì)內(nèi)3_cate:dn濃度的較低水平(BocaM，D' Amato L, Distefano G， et al.Polycystin-1 induces cellmigration by regulating phosphatidylinositol 3-kinase-dependent cytoskeletalrearrangements and GSK3beta-dependent cell cell mechanical adhesion.Mol Biol Cell, 2007，18(10) 4050-61.)。在ADPKD中，PCl的缺失可以使細胞連接損傷、胞 質(zhì)內(nèi)β-catente濃度升高，同時Wnt信號通路異常激活，Wnt通過Dishevelled蛋白拮抗 β-catenin降解復合物(APC/Ax:in)的形成而阻斷β-catenin降解也可使β-catente在細 胞質(zhì)內(nèi)聚集，經(jīng)轉(zhuǎn)錄入核促進細胞過度增殖。因此根據(jù)多囊腎的發(fā)病機制，可以通過抑 制囊泡上皮細胞增殖和囊液分泌等方法來篩選治療ADPKD的藥物(見圖2)。
目前，治療ADPKD的研究仍處于探索階段，治療策略主要是根據(jù)其發(fā)病機制集 中在抗細胞增殖、抑制囊液分泌、調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度和減輕繼發(fā)病變等方面。下面從這 幾個方面進行闡述
1、抗細胞增殖
ADPKD囊泡上皮細胞的增殖可能涉及多種生長因子，如表皮生長因子 (epidermal growth factor, EGF)能夠刺激囊泡上皮細胞的增殖，其機制與表皮生長因子受體 Erb B/EGFR(epidermal growth factor receptor)、Src> MEK 促分裂原活化蛋白激酶 激酶(mitogen-activated protein kinase kinase)等的酪氨酸激酶活性密切相關(guān)。因此，酪 氨酸激酶抑制劑在ADPKD的治療中具有很大的潛力。如Wilson等研究發(fā)現(xiàn)Erb B2抑 制劑可以恢復多囊腎囊泡細胞的正常結(jié)構(gòu)并改善其功能(Wilson SJ，Amsler K，Hyink DP, et al.Inhibition of HER-2 (neu/ErbB2) restores normalfunction and structure to polycystic kidney disease (PKD) epithelia.Biochim BiophysActa, 2006，1762 (7) : 647-55.)。 另 有研究發(fā)現(xiàn)，Src抑制劑可以修復多囊腎腎臟的異常上皮細胞Sweeney WE Jr，von Vigier RO, Frost P, Avner ED.Src inhibitionameliorates polycystic kidney disease.J Am Soc Nephrol, 2008，19(7) 1331-41.)。MEK抑制劑能夠抑制pcy多囊腎小鼠的囊泡細胞 增殖，延緩其腎功衰竭(Omori S，Hida M，F(xiàn)ujita H, et al.Extracellular signal-regulated kinase inhibition slows disease progressionin mice with polycystic kidney disease.J Am Soc Nephrol, 2006，17(6) 1604-14.)。其他如雷帕霉素(Berthier CC，Wahl PR, Le Hir Μ, et al.Sirolimus ameliorates the enhancedexpression of metalloproteinases in a rat model of autosomal dominant polycystic kidneydisease.Nephrol Dial Transplant, 2008, 23(3) 880-9.)、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑(Bukanov NO，Smith LA，Klinger KW, et al.Long-lasting arrest of murinepolycystic kidney disease with CDK inhibitor roscovitine. Nature, 2006，444 (7121) : 949-52.)、細胞凋亡蛋白酶抑制劑(Tao Y，Kim J, Faubel S， et al.Caspase inhibitionreduces tubular apoptosis and proliferation and slows disease progression in polycystickidney disease.PNAS, 2005，102(19) 6954-9.)等也可以通過影 響細胞增殖而起到治療ADPKD的作用。
2、抑制囊液分泌
囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator, CFTR)是一種cAMP激活的ATP門控性氯離子通道，在腎上皮細 胞頂膜表達。在ADPKD發(fā)病機制中，血管加壓素等可激活腺苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)cAMP 濃度增加、PKA被激活；PKA可激活位于囊泡上皮細胞頂膜的CFTR使氯離子分泌至囊 腔，提高囊泡內(nèi)滲透壓，引起鈉和水繼發(fā)性向囊泡內(nèi)轉(zhuǎn)運，并在囊泡內(nèi)蓄積，而囊液的 蓄積導致了囊泡上皮細胞代償性增生。因此，抑制CFTR可以有效地治療ADPKD。許 多研究表明，CFTR過度表達在多囊腎發(fā)病中起著非常重要的作用。犬腎細胞(MDCK 細胞)PKD模型、體外胚胎腎模型和PKD小鼠模型均證實CFTR抑制劑顯著抑制囊泡在 體外和體內(nèi)的形成和生長(Yang B，Sonawane ND, Zhao D，etal.Small-molecule CFTR inhibitors slow cyst growth in polycystic kidney disease.J AmSoc Nephrol, 2008, 19 (7) 1300-10.) ο 其他如血管加壓素1V2受體CV2R)拮抗劑(WangX，Wu Y, Ward C J, et al.Vasopressin directly regulates cyst growth in polycystic kidneydisease.J.Am Soc Nephrol, 2008，19(1) 102-8.)、生長抑素類似物(Ruggenenti P, Remuzzi A, Ondei P, et al.Safety and efficacy of long-acting somatostatin treatment inautosomal-dominant polycystic kidney disease.Kidney Int, 2005，68(1) 206-16.)等也可以通過調(diào)節(jié)囊液分泌而用來治 療 ADPKD。
3、調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度
ADPKD發(fā)病中，PKDl基因或PKD2基因發(fā)生突變，細胞內(nèi)Ca2+濃度降低，低水平細胞內(nèi)Ca2+通過影響細胞內(nèi)與細胞分化生長、基因表達和細胞膜蛋白功能調(diào)控相關(guān) 的信號傳導通路，引起囊泡形成、囊泡上皮細胞異常增殖和囊泡液體過度分泌，繼而導 致多囊腎病理學改變?？蛇\用Ca2+通道激動劑、Ca2+載體(Yamaguchi T，Hempson SJ, Reif GA, et al.Calcium restores a normal proliferation phenotype in humanpolycystic kidney disease epithelial cells.JAm SocNephrol, 2006，17(1) 178-87.)、PDE激動劑(Cheng J， Grande JP.Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) inhibitors novel therapeutic agents for progressive renal disease.Exp Biol Med, 2007，232(1) 38-51.)等通過上調(diào)胞內(nèi) Ca2+濃度 來治療ADPKD。另外，Crews小組發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯可以通過促進PC2介導的細胞內(nèi) Ca2+的釋放和促進P21的表達(P21是CDK的抑制物)從而發(fā)揮抑制細胞增殖的作用， 此過程不依賴PCl的表達，提示雷公藤內(nèi)酯可用于治療ADPKD (Leuenroth SJ, Okuhara D, Shotwell JD, et al.Triptolide is atraditional Chinese medicine-derived inhibitor of polycystic kidney disease.PNAS, 2007，104(11) 4389-94.)。
4、減輕繼發(fā)病變
ADPKD囊泡的生長與組織的重建需要基質(zhì)的降解與重組，由于金屬蛋白酶能 夠降解基質(zhì)，使囊泡容易在組織中增大，并使周圍組織重構(gòu)，因此可運用金屬蛋白酶抑 制齊U來治療 ADPKD (Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al.Elevation of seramlevels of metalloproteinase-1, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and type IVcollagen, and plasma levels of metalloproteinase-9 in polycystic kidney disease.Am JNephrol，2000, 20(1) 32-6.)。一些降糖降脂藥也可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)積聚而緩解ADPKD癥狀(Muto S，Aiba A, Saito Y，et al.Pioglitazone improves the phenotype and moleculardefects of a targeted Pkdl mutant.Hum Mol Genet, 2002，11(15) 1731_42.Yuan ZZ，XuCG, Gao CF, Mei CL.Effect of lovastatin on proliferation and extracellular matrixsecretion in cyst-lining epithelial cells of autosomal dominant polycystic kidney disease.Acad J Sec Mil Med Univ， 2006，27(1) 111-2.)。ADPKD發(fā)病過程往往伴隨著組織重構(gòu)和血管增生，而血管內(nèi) 皮生長因子(VEGF)是主要的促血管生成因子，研究發(fā)現(xiàn)，應用VEGF抑制劑可抑制 Han:SPRD 大鼠(Cy/+)囊泡的形成與生長(Tao Y，KimJ, Yin Y，et al.VEGF receptor inhibition slows the progression of polycystic kidneydisease.Kidney Int, 2007, 72(11) 1358-66.)。ADPKD患者腎囊泡的形成與擴大可激活腎素_血管緊張素-醛固酮系統(tǒng) (renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)，使血管硬化而導致高血壓、左心室月巴 厚。動物實驗已證實，應用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitors, ACEI)或血管緊張素受體阻斷劑(angiotensin receptor blocker, ARB)控制血 壓可能延緩多囊腎腎功能衰竭，但一些臨床研究未證實其作用(Van Dijk MA，Breuning ΜΗ, Duiser R, et al.No effect ofenalapril on progression in autosomal dominant polycystic kidney disease.Nephrol DialTransplant, 2003，18: 2314-20.)。
根據(jù)ADPKD的發(fā)病機制與治療策略，篩選囊泡形成和生長抑制劑，研發(fā)治療 ADPKD的新藥物是目前該領(lǐng)域的研究熱點。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供姜黃素的一種新用途。
本發(fā)明所提供的姜黃素的新用途具體為
1)以姜黃素為活性成分的預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物；
2)姜黃素在制備預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物中的應用；
3)以姜黃素為活性成分的抑制細胞形成囊泡和/或抑制囊泡生長的藥物；
4)姜黃素在制備抑制細胞形成囊泡和/或抑制囊泡生長的藥物中的應用。
上述新用途中，所述細胞為犬腎細胞或小鼠胚胎腎細胞。
上述預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物可通過注射或口服的方 式導入機體。
所述預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物的用量一般為 0.1-3mg/kg體重(注射)或低于1.2g/kg體重(口服)。
本發(fā)明應用MDCK囊泡模型篩選得到抑制囊泡形成和生長的姜黃素，通過MTT 法確定該化合物的毒性和對正常細胞生長分化的影響；用MDCK小管生成實驗研究姜黃 素對腎上皮細胞分化的影響；通過體外胚胎腎模型確定姜黃素的腎內(nèi)藥理活性。實驗結(jié) 果表明，姜黃素對MDCK囊泡形成和生長具有明顯的抑制作用，且其作用呈劑量效應關(guān) 系；在檢測的劑量范圍內(nèi)，姜黃素對MDCK細胞無細胞毒性作用，說明姜黃素抑制囊泡 的作用與其細胞毒性無關(guān)；姜黃素在抑制囊泡生成和生長的劑量水平不誘導MDCK細胞 凋亡，證實姜黃素抑制囊泡的作用與其促進細胞凋亡無關(guān)；姜黃素能夠促進MDCK細胞 或囊泡形成小管樣結(jié)構(gòu)，作用呈劑量效應關(guān)系；而且姜黃素對胚胎腎囊泡生長也具有抑 制作用。



下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物 材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1、姜黃素對MDCK囊泡形成和生長的抑制作用
1、姜黃素能夠抑制囊泡的形成
犬腎細胞(MDCK)在三維基質(zhì)膠中培養(yǎng)時受cAMP刺激形成囊泡，并可持續(xù) 生長。forskoHn是腺苷酸環(huán)化酶的激活劑，腺苷酸環(huán)化酶可介導cAMP的生成，因此 forskoKn可促進MDCK囊泡形成和生長，其囊泡特性與多囊腎囊泡的特性相似，是篩選 評價化合物治療多囊腎藥理活性的最佳體外模型。
將MDCK細胞(購自美國ATCC公司，商品目錄號CCL-34)分別培養(yǎng)于含 有10 μ M forskoKn (佛司可林，購自美國Sigma公司，商品目錄號F6886)和濃度分別 為0M、4X1(Tm、2Χ IO-6M和IXlO-5M的姜黃素(購自美國Fluka公司，商品目錄號 28260)的三維基質(zhì)膠(Purecol Collagen,購自 Inamed Biomaterials Fremont 公司，商品目 錄號M09)中，每孔大約400個細胞，培養(yǎng)4-5天后，在含有10 μ MforskoKn的培養(yǎng)孔中 形成MDCK細胞的囊泡。每個劑量設3個平行孔。培養(yǎng)第6天時計數(shù)圓形囊泡(直徑 大于50 μ m)和非囊泡細胞的集落，計算囊泡占總細胞集落(囊泡和非囊泡集落)的百分 率。實驗設三次重復，囊泡占總細胞集落的百分率為33.82士0.93%。囊泡與非囊泡細胞 的形態(tài)如圖3所示。其中，control表示該孔中加入不含forskoKn的培養(yǎng)液，forskoHn表 示該孔中加入含10 μ M forskolin的培養(yǎng)液。姜黃素對MDCK囊泡形成的抑制作用如圖4 所示。從圖4中可以看出，姜黃素可以明顯減少forskoKn誘導的MDCK囊泡數(shù)目，且抑 制作用呈劑量效應關(guān)系(圖中黑色部分)，但姜黃素不影響總集落數(shù)(包括囊泡和非囊泡 集落，圖中白色和黑色部分的總和)。以上結(jié)果說明，姜黃素對MDCK囊泡形成具有明 顯的抑制作用，但沒有細胞毒性。
2、姜黃素能夠抑制囊泡的生長
將MDCK細胞培養(yǎng)于含有10 μ M forskolin的三維基質(zhì)膠中，培養(yǎng)4_5天后即 可形成直徑為50-100 μ m的圓形囊泡；然后再在細胞培養(yǎng)板中加入終濃度分別為0M、 4X IO-7M, 2X10_6M和1X10_5M的姜黃素繼續(xù)培養(yǎng)。每日換新鮮的含有姜黃素和 forskolin的培養(yǎng)液，隔天跟蹤照相各個囊泡并測量囊泡直徑以評價姜黃素抑制囊泡生長的 效果，共觀察8-12天。每個劑量重復3個孔，每孔計數(shù)10個以上囊泡，作囊泡生長曲 線。實驗設三次重復，姜黃素對囊泡生長的抑制作用如圖5所示。其中，第一排表示第 4-12天用含forskolin的培養(yǎng)液培養(yǎng)，第二排表示第4-12天用含有姜黃素和forskolin的培 養(yǎng)液培養(yǎng)，第三排表示第4-7天用含有姜黃素和forskoKn的培養(yǎng)液培養(yǎng)，第8_12天只用 含forskoKn的培養(yǎng)液培養(yǎng)。姜黃素對囊泡生長的抑制作用曲線如圖6所示。結(jié)果表明， MDCK細胞在含有10 μ M forskolin的三維基質(zhì)膠中培養(yǎng)4天后即可形成圓形囊泡，且囊 泡呈進展性生長(見圖5第一排照片)，從圖6中可以看出，姜黃素能夠明顯抑制囊泡生 長。
3、姜黃素能夠可逆地抑制囊泡的生長
將MDCK細胞培養(yǎng)于含有10 μ M forskolin的三維基質(zhì)膠中，培養(yǎng)4天后即可形成圓形的囊泡；從第4天開始在細胞培養(yǎng)板中加入終濃度為4X IO-7M的姜黃素繼續(xù)培 養(yǎng)，每日換新鮮的含有姜黃素和forskoKn的培養(yǎng)液；到第8天時，在細胞培養(yǎng)板中只加入 終濃度為10 μ M的forskoKn，而不加入姜黃素，直至第12天。每天測量囊泡直徑，實 驗設三次重復，姜黃素可逆性抑制囊泡生長的情況如圖7所示。其中，實心球曲線表示 同時加入終濃度為10 μ M的forskoKn和姜黃素，空心球曲線表示只加入終濃度為10 μ M 的forskoKn而沒加入姜黃素。結(jié)果表明，去掉姜黃素后，囊泡可恢復生長，說明姜黃素 并未損傷囊泡上皮細胞，表明姜黃素對囊泡生長的抑制作用是可逆的。
實施例2、姜黃素的細胞毒性、對細胞生長與分化的影響
1、通過MTT法確定姜黃素的細胞毒性
將對數(shù)期的MDCK細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含有4X IO3個細胞，每 孔給予200 μ 1 MDCK細胞培養(yǎng)液(由DMEM培養(yǎng)基(購自美國Invitrogen公司，商品目 錄號12100-046)和F12培養(yǎng)基(購自美國Invitrogen公司，商品目錄號21700-075)等體 積混合而成)，置于37°C的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時。然后在細胞培養(yǎng)板中加入終 濃度分別為1 X 10_4M、1 X 10_5M、1 X IO-6M和1 X IO-7M的姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。 除去上清，加入200 μ 1 MDCK細胞培養(yǎng)液和20 μ 1濃度為5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培 養(yǎng)3小時。除去上清，每孔加入150μ1 二甲基亞砜，置搖床上100轉(zhuǎn)/分振蕩lOmin，使 結(jié)晶物充分溶解。酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長為492nm)，設置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、 MTT和二甲基亞砜)和對照孔(細胞、相同濃度的姜黃素的溶解介質(zhì)、培養(yǎng)基、MTT和 二甲基亞砜)，每組設定5個復孔。按照下述公式計算抑制率抑制率=[(對照孔-調(diào) 零孔)_(給藥孔-調(diào)零孔)]/(對照孔-調(diào)零孔)X100%。實驗設三次重復，加入姜黃素 后細胞的MTT結(jié)果如圖8所示。其中，control表示用不含姜黃素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。結(jié)果 表明，IXlO-5M以下濃度的姜黃素對MDCK細胞無細胞毒性作用，說明姜黃素抑制囊泡 的作用與其細胞毒性無關(guān)。
2、Tunel試劑盒(購自美國Roche公司，商品目錄號11684795910)確定姜黃素 對細胞凋亡的影響
將MDCK細胞培養(yǎng)至細胞密度30-50 %時分別加入濃度為4 X 10_7M、 2 X IO-6M, 1X10_5M的姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；倒去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞一次， 然后在15-25°C的條件下，用體積百分含量為4%的多聚甲醛(固定液)固定細胞60分 鐘。再用PBS洗滌一次，加入含有0.1%體積百分含量Triton X-100的0.1%質(zhì)量百分含 量的檸檬酸鈉劑(透化液)，冰上)孵育2分鐘。除去透化液，姜黃素處理的實 驗組、陽性對照組分別加入50 μ ITUNEL檢測液，陰性對照組加入50 μ 1熒光標記液， 在潮濕的環(huán)境中，37°C避光孵育60分鐘。用PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片液(購 自Beyotime，商品目錄號P0126)封片后熒光顯微鏡下觀察、計數(shù)、照相。在光學顯微鏡 下，凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色，可見細胞核形態(tài)呈碎點狀。在熒光顯微鏡下，選 擇450-500nm的激發(fā)波長和515-565nm的發(fā)射波長，凋亡細胞顯示綠色熒光。隨機選取 5個高倍視野，統(tǒng)計各組(實驗組、陽性對照組和陰性對照組)的凋亡細胞數(shù)并做統(tǒng)計分 析。實驗設三次重復，姜黃素對MDCK細胞凋亡的誘導作用如圖9和圖10所示。圖9 和圖10中，control表示陰性對照組細胞的凋亡情況，gentamycin表示陽性對照組細胞的 凋亡情況，姜黃素表示加入姜黃素的實驗組細胞的凋亡情況。結(jié)果表明，姜黃素不明顯誘導MDCK細胞凋亡，證實姜黃素抑制囊泡的作用與其促進細胞凋亡無關(guān)。
3、MDCK小管生成實驗證實姜黃素能夠促進MDCK形成小管樣結(jié)構(gòu)
將MDCK細胞在分別含有4Χ1(Γ7Μ、2Χ1(Γ6Μ、1 X 1(Γ5Μ的姜黃素和3Τ3成纖 維細胞培養(yǎng)液(用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，購自美國Invitrogen公司，商品目 錄號12100-046，培養(yǎng)3Τ3成纖維細胞3日，所得培養(yǎng)液即為3Τ3成纖維細胞培養(yǎng)液)的 三維基質(zhì)膠中培養(yǎng)15天，每日換新鮮的含有姜黃素和3Τ3成纖維細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)液并 照相，每孔跟蹤10個以上小管，通過小管計數(shù)來評價姜黃素對MDCK細胞分化的影響。 實驗設三次重復，姜黃素對MDCK小管生成的促進作用如圖11所示。其中，control表 示用不含姜黃素的3T3成纖維細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)MDCK細胞15天。結(jié)果表明，姜黃素能 夠促進MDCK細胞形成小管樣結(jié)構(gòu)。
4、MDCK囊泡小管生成實驗證實姜黃素能夠促進囊泡形成小管樣結(jié)構(gòu)
將MDCK細胞培養(yǎng)于含有10 μ M forskoKn的三維基質(zhì)膠中，培養(yǎng)4天后即 可形成直徑為50-100μιη的圓形囊泡；停止加forskoKn，換成分別含有4X 10_7M、2X IO-6M, IX IO-5M姜黃素的3T3成纖維細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每日換新鮮的含有姜黃 素的3T3成纖維細胞培養(yǎng)液。MDCK囊泡在3T3成纖維細胞培養(yǎng)液中出芽、突觸、成索 和成管，類似于腎臟上皮細胞小管生成過程。15天后，統(tǒng)計所形成的小管個數(shù)和小管的 長度。實驗設三次重復，姜黃素對囊泡形成小管樣結(jié)構(gòu)的促進作用如圖12和13所示。 圖13中，control表示用不含姜黃素的3T3成纖維細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)4天的MDCK囊泡15 天。結(jié)果表明，姜黃素能夠促進囊泡形成小管樣結(jié)構(gòu)。
實施例3、通過體外胚胎腎模型確定姜黃素對胚胎腎囊泡生長的抑制作用
第1天下午將6周齡ICR小鼠(購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心)按照1 1 的數(shù)量進行雌雄同籠交配，第2天早上觀察雌鼠是否有陰栓，若有陰栓澤表示雌鼠已懷 孕半日，將沒有陰栓的小鼠先分籠，下午再合籠，第二日再觀察；將懷孕雌鼠繼續(xù)單獨 喂養(yǎng)13天，第13天取胚胎腎用tnmswell板培養(yǎng)。
取上述13.5天的小鼠胚胎腎在ΙΟΟμΜ的8-Br-cAMP (購自美國Sigma公司，商 品目錄號B-1381)作用下，在腎組織中形成多發(fā)性、進行性生長的腎囊泡，可作為評價 姜黃素預防和/或治療ADPKD的體外整體器官模型。胚胎腎囊泡模型的示意圖如圖14 所示。小鼠胚胎腎的囊泡形成過程如圖15所示。其中，control表示沒有用8-Br-cAMP 處理的胚胎腎，8-Br-cAMP表示用100 μ M的8-Br-cAMP處理過的胚胎腎。
將上述形成囊泡的胚胎腎分別用濃度為4X10_7M、2X IO-6M, 1Χ1(Γ5Μ的姜 黃素處理，實驗設三次重復，姜黃素對胚胎腎囊泡生長的抑制作用如圖16和17所示。 圖16中，control表示未用8_Br_cAMP和姜黃素處理的胚胎腎；8_Br_cAMP表示只用 8-Br-cAMP處理，而未用姜黃素處理的胚胎腎；姜黃素4X10_7、姜黃素2X10_6、姜黃 素1 X ΙΟ"5分別表示用8-Br-cAMP處理后再用不同濃度的姜黃素處理的胚胎腎。
結(jié)果表明，姜黃素能夠抑制8-Br-cAMP誘導的13.5天的小鼠胚胎腎組織內(nèi)的囊 泡形成，作用呈劑量效應關(guān)系。
實施例4、姜黃素的作用靶點和機制
利用Western印跡技術(shù)，檢測姜黃素對囊泡上皮細胞信號轉(zhuǎn)導通路的影響。具體 實驗過程如下
將MDCK細胞培養(yǎng)至70%的細胞密度，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)M小時，然后加 入含10 μ Mforsk0Kn的培養(yǎng)液，同時分別給予姜黃素，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為 0Μ、4X IO-7M> 2Χ1(Γ6Μ*1Χ1(Γ5Μ，同時以不含有forskolin的培養(yǎng)液培養(yǎng)的MDCK細 胞作為control組，上述各組細胞均刺激ΜΟη ι。
提取上述各組細胞的總蛋白，用Bradford法作蛋白定量。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn) 膜，加相應一抗(p-ERK，sc7383、ERK2, sc-153、B_raf，sc-166、Raf-I, sc-227 和 β -actin, sc47778，上述各抗體均購自美國Santa Craz Biotechnology公司)和二抗(購 自美國Amersham公司，商品目錄號NA934VS)。用ECL PLUS (購自美國GEHealthcare 公司，商品目錄號ALSZR004-096412)化學發(fā)光，顯影、定影。通過檢測B_raf、Raf-I 和p-ERK蛋白水平發(fā)現(xiàn)姜黃素對Ras-B-Raf-MEK-ERK信號通路的影響。在ADPKD 中，B-raf表達增加、Raf-I表達減少，而姜黃素可以下調(diào)B_raf，上調(diào)Raf-I，并可抑制 p-ERK磷酸化，結(jié)果如圖18所示。
權(quán)利要求
1.以姜黃素為活性成分的預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物。
2.姜黃素在制備預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物中的應用。
3.以姜黃素為活性成分的抑制細胞形成囊泡和/或抑制囊泡生長的藥物。
4.姜黃素在制備抑制細胞形成囊泡和/或抑制囊泡生長的藥物中的應用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述細胞為犬腎細胞或小鼠胚胎腎細
全文摘要
本發(fā)明公開了姜黃素在制備預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的藥物中的應用。本發(fā)明應用MDCK囊泡模型篩選得到抑制囊泡形成和生長的姜黃素，實驗結(jié)果表明，姜黃素對MDCK囊泡形成和生長具有明顯的抑制作用，且其作用呈劑量效應關(guān)系；姜黃素對MDCK細胞無細胞毒性作用，說明姜黃素抑制囊泡的作用與其細胞毒性無關(guān)；姜黃素不明顯誘導MDCK細胞凋亡，證實姜黃素抑制囊泡的作用與其促進細胞凋亡無關(guān)；姜黃素能夠促進MDCK細胞或囊泡形成小管樣結(jié)構(gòu)，作用呈劑量效應關(guān)系；而且姜黃素對胚胎腎囊泡生長也具有抑制作用。姜黃素有可能研發(fā)成為預防和/或治療常染色體顯性遺傳多囊腎病的特效藥物。
文檔編號A61P13/12GK102018689SQ200910092749
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
發(fā)明者周虹, 楊寶學, 雷天落, 高晉生 申請人:北京大學