專利名稱：2,4-二甲氧基反式茋的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及2，4_ 二甲氧基反式芪的新用途，特別是2，4_ 二甲氧基反式芪在降脂 及抗老年癡呆中的用途。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是威脅全人類健康與生命的頭號殺手。在中國，每年大約有260 萬人死于心腦血管疾病，且發(fā)病率仍不斷上升。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)可 以引起冠心病、腦卒中、心肌梗死等病癥。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理中，高脂血癥是一 個(gè)主要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。高脂血癥是指血液中的總膽固醇(total cholesterol, TC), 低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholestero，LDL-C)及甘油三酯水平 (triglyceride,TG)高于正常范圍及/或高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平低下1_2，脂質(zhì)代謝紊亂尤其是低密度脂蛋白水平增高可引起血粘 稠度增高，血流緩慢，血液中過多的脂質(zhì)沉積于血管壁，形成粥樣斑塊，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化 的發(fā)生。腦部動(dòng)脈硬化可引起腦血栓或腦溢血；心臟冠狀動(dòng)脈硬化可引起心慌、胸悶，嚴(yán)重 者可導(dǎo)致心肌梗塞。所以控制高脂血癥的發(fā)生對于預(yù)防心腦血管疾病有著重要意義3_4。阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)是一種最常見的癡呆癥，影響到全球 1500萬人口生活質(zhì)量。隨著生命周期的延長，到2050年，大約25%的西半球人年齡超過65 周歲，而其中1/3的人口將會(huì)發(fā)展為老年癡呆5。在中國，人口老齡化問題也日益突出，所以 面臨同樣的挑戰(zhàn)。老年癡呆發(fā)病期長，護(hù)理費(fèi)用高，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前臨床 用于治療AD的藥物主要為膽堿酯酶抑制劑，此類藥物雖然能改善癥狀，但不能改變AD的發(fā) 病進(jìn)程，因此，開發(fā)抗AD藥物迫在眉睫。此外，越來越多的證據(jù)證實(shí)，老年癡呆(AD)與高膽固醇血癥有著密切的關(guān)系6_8， 流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，血清中膽固醇的水平升高會(huì)增加神經(jīng)退行性癡呆的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)9_1(1。例 如，載脂蛋白E的ε 4表型是AD的重要危險(xiǎn)因子，載脂蛋白E ε 4表型與血清中膽固醇高低 密切相關(guān)“。另外，早老癡呆患者腦脊液中24s-羥基膽固醇水平明顯比同年齡段的正常人 高12_13，24s-羥基膽固醇是一種只可能在腦組織中由膽固醇代謝生成的產(chǎn)物14，提示早老癡 呆患者腦中膽固醇可能比同年齡段的正常人高。2，4-二甲氧基反式芪最早合成于1956年15?，F(xiàn)有技術(shù)中僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)過2， 4-二甲氧基反式芪類似物的一些活性，例如美國專利申請公開號US2007/0249647 Al公開 通式I的反式芪化合物參與抑制癌癥和癌前病變、炎癥、中風(fēng)、局部缺血，且這些化合物都 有抗氧化活性。Heynekamp J. J.等人16報(bào)導(dǎo)反式芪(包括天然產(chǎn)物白藜蘆醇及其衍生物) 具有抑制腫瘤壞死因子α (TNFa)對NF-κΒ的激活作用。Ali MA.等人17報(bào)導(dǎo)羥基芪類 具有殺線蟲活性。經(jīng)查現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，未見2，4-二甲氧基反式芪關(guān)于降脂和抗老年癡呆活性的報(bào) 導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是尋找并開發(fā)2，4_ 二甲氧基反式芪(以下簡稱S3)的醫(yī)藥新用途。本發(fā)明首次采用在高脂大鼠側(cè)腦室注射A β建立AD模型，驗(yàn)證S3的抗AD作用，復(fù) 制了老年癡呆患者同時(shí)伴有高膽固醇血癥的自然發(fā)病環(huán)境。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，2，4-二 甲氧基反式芪具有降脂和抗老年癡呆的良好前景。本發(fā)明第一方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在制備治療高脂血癥的藥物中的用 途。本發(fā)明第二方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在制備治療老年癡呆的藥物中的用 途。本發(fā)明第三方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在制備治療老年癡呆同時(shí)伴有高脂血 癥的藥物中的用途。本發(fā)明第四方面提供2，4_ 二甲氧基反式芪在制備預(yù)防由高脂血癥導(dǎo)致的老年癡 呆的藥物中的用途。進(jìn)一步，本發(fā)明提供含有2，4_ 二甲氧基反式芪以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物 組合物在制備治療高脂血癥的藥物中的用途、治療老年癡呆的藥物中的用途、在制備治療 老年癡呆同時(shí)伴有高脂血癥的藥物中的用途和在制備預(yù)防由高脂血癥導(dǎo)致的老年癡呆的 藥物中的用途。本發(fā)明藥物組合物中的載體包括稀釋劑、吸收劑、濕潤劑、粘合劑、崩解劑、崩解抑 制齊 、吸收促進(jìn)劑、潤滑劑、分散劑、助溶劑、緩沖劑、表面活化劑。本發(fā)明所述的藥物或藥物組合物是以片劑、注射劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉 劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑的形式使用。本發(fā)明所述的藥物或藥物組合物經(jīng)靜脈、口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、 腹腔、直腸給予。2，4_ 二甲氧基反式芪可依據(jù)本發(fā)明的方法制備，也可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所述的方法制 備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將2，4-二甲氧基反式芪與一種或多種固體或液體藥物賦 形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人用藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?，4_ 二甲氧基反式芪或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可 為腸道或非腸道，如靜脈、口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒 劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其它劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混 懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑等。2，4_ 二甲氧基反式芪可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑 及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體 的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄 糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、 乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、 紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、 褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基
4纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收 促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂 酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。其它載體如聚丙稀酸樹脂類、脂質(zhì)體，水溶性載體如 PEG4000和PEG6000、PVP等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、 腸溶包衣片，或雙層片和多層片。例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體 的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷 酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等； 崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分2，4-二甲氧基反式芪與上述的各種 載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將2，4_ 二甲氧基反 式芪制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中應(yīng)用。例如，將2，4_ 二甲氧基反式芪制成液體制劑，如溶液劑、混懸劑、溶液劑、乳劑，這 種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合 劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二 醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。此外，還可以添 加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、PH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。此外，如果還需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味 劑或其它材料。為達(dá)到用藥目的，增強(qiáng)治療效果，2，4-二甲氧基反式芪制成的藥物或藥物組合物 可用任何公知的給藥方法給藥。2，4_ 二甲氧基反式芪、含有它的藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所 要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給 藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā) 明中化學(xué)成分的使用劑量可以根據(jù)2，4_ 二甲氧基反式芪組合物中最后的制劑中所含有的 化合物實(shí)際數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的治療目的。 通常人用每天的劑量不超過lg。


圖1 :S3對側(cè)腦室注射Αβ25_35$導(dǎo)神經(jīng)損傷模型小鼠海馬細(xì)胞凋亡的影響(圖中 箭頭所示)。a 對照組；b 模型組；c :S3 (50) ；d :S3 (25)。圖2 :S3對高脂+側(cè)腦室注射Αβ25_35神經(jīng)損傷大鼠跳臺實(shí)驗(yàn)潛伏期的影響。均數(shù) 士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 10) ;，<0.01化對照齊<0.05化高脂+側(cè)腦室注射六325_35神經(jīng)損傷 模型組。圖3 :S3對高脂+側(cè)腦室注射Αβ25_35神經(jīng)損傷大鼠跳臺實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)的影響。均 數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 10) ；##Ρ < 0. Olvs對照；*P < 0. 05vs高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損 傷模型組。 圖4 :S3對高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬細(xì)胞凋亡的影響(圖 中褐色團(tuán)塊)。A 對照組；B 高脂組；C 高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型組；D :S350mg/kg；E :S3 25mg/kg；F :S3 12.5mg/kg。圖5 :S3對高脂+側(cè)腦室注射々025_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬SOD酶活性的影響。 均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 6)卞<0.05^對照組，乍<0.05^高脂+側(cè)腦室注射4 025_35神經(jīng) 損傷模型組。圖6 :S3對高脂+側(cè)腦室注射Αβ 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬GSH-PX酶活性的影 響。均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 6) ；##P<0.01vs對照組廣P<0.01vs高脂+側(cè)腦室注射Αβ25_35 神經(jīng)損傷模型組。圖7 :S3對高脂+側(cè)腦室注射Αβ 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬丙二醛(MDA)含量 的影響。均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 6) ；##Ρ < 0. Olvs對照組，**Ρ < 0. Olvs高脂+側(cè)腦室注射 Αβ25_35神經(jīng)損傷模型組。圖8 :S3對高脂+側(cè)腦室注射Aβ 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶 (ChaT)活性影響。均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 6) ’##Ρ < 0. Olvs對照組，**Ρ < 0. Olvs高脂+側(cè) 腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型組。圖9 :S3對高脂+側(cè)腦室注射々025_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬乙酰膽堿酯酶(AchE) 活性影響。均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 6) ；-P < 0. Olvs對照組,P < 0. 05vs高脂對照；*P < 0. 05vs 高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型組。圖10 :S3對高脂+側(cè)腦室注射々025_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬乙酰膽水平的影響。 均值均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 6) ；##Ρ < 0. Olvs對照組·，Ρ < 0. 05vs高脂對照；*P < 0. 05vs高 脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型組。圖11 :S3對細(xì)胞色素C(Cyto-C)釋放的影響。分離線粒體和胞漿后，胞漿部分采 用WB檢測細(xì)胞色素C的釋放。均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 3) ；##Ρ < 0.01, _Ρ < 0. Olvs對照； ■P < 0. Olvs高脂對照，**Ρ < 0. Olvs模型組。圖12 :S3對高脂大鼠血清總膽固醇(TC)的影響。均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差；##P < 0. Olvs 對照組；*P < 0. 05vs高脂模型組。圖13 :S3對高脂模型大鼠血清中高密度脂蛋白(HDL-C)的影響。均值士標(biāo)準(zhǔn)差； flflP < 0. Olvs對照組廣P < 0. Olvs模型組。圖14 :S3對高脂模型大鼠血清低密度脂蛋白(LDL-C)的影響。均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差；##P < 0. Olvs對照組；*P < 0. 05vs模型組。圖15 :S3對A β 25_35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響。將細(xì)胞與不同濃度的A β 25_35 共同孵育48小時(shí)，MTT方法檢測細(xì)胞活力。< 0. Olvs對照組。圖16 S3對A β 25_35損傷SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。細(xì)胞加入S3 IOmin后， 再加入 Αβ 25_35 共同孵育 48h。##P < 0. Olvs 對照組；*P < 0. 05vs Αβ 25_35 組。圖17 :S3對Αβ25_35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響。細(xì)胞在50 μ mo 1/L Αβ25_35 作用下加入S3 48h后。圖18 :S3對A β 25_35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)的影響。細(xì)胞中加入S3， IOmin后，再加入A β 25_35共同孵育48h，經(jīng)H2DCF-DA探針染色后，通過熒光比色法檢測ROS 的產(chǎn)生。##P < 0. Olvs 對照組廣P < 0. 01ν8Αβ25_35 組。圖19 :S3對A β 25_35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷細(xì)胞線粒體膜電位變化。細(xì)胞中加入 S3 IOmin后，加入A β 25_35共同孵育48h，JC-1探針染色。
具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合實(shí)施例與附圖用于進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例并非限制著本發(fā) 明的范圍和精神實(shí)質(zhì)。實(shí)施例12，4-二甲氧基反式芪(以下簡稱S3)的制備化合物1 (芐化溴，0. Imol)與稍過量的亞磷酸三乙酯(0. 125mol)反應(yīng)，油浴加熱 到120°C，反應(yīng)至無氣體逸出，約需3小時(shí)，得化合物2 (淺黃色油狀液體)。在IOOml圓底瓶中置上步反應(yīng)制得的化合物2 (0. 02mol)，將反應(yīng)瓶置于冰水浴 中，加入無水四氫呋喃，攪拌下加入NaH(0. 02mol)，反應(yīng)2小時(shí)，加入化合物3 (0. 0126mol)， 攪拌2小時(shí)后，室溫?cái)嚢柽^夜。將反應(yīng)液過濾，濾液濃縮至無四氫呋喃蒸出，固體以水甲醇為2 1的溶液做重 結(jié)晶，得白色針狀結(jié)晶，為化合物4，即2，4- 二甲氧基芪(S3)，此步收率為80. 1 %。EI-MS240(M+,100)，197，182，165，153，121，91。1H-WR(CDCl3) 3. 82 (3H, s)，3. 86 (3H，s) ,6. 46 (1H, d, J = 2. 4Hz)，6. 51 (1H，dd, Jl = 2. 4Hz, J2 = 6. 0Hz)，7. 01 (1H, d, J = 16. 2Hz)，7. 21 (1H, t, J = 7. 8Hz)，7. 32 (1H, t, J = 7. 8Hz)，7. 39 (1H, d, J = 16. 2Hz)，7. 51 (3H, m)。實(shí)施例2S3對Αβ 25_35腦室注射誘導(dǎo)記憶缺陷小鼠的保護(hù)作用(一 )實(shí)驗(yàn)方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c小鼠，雌性，6周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所。2.藥物用量及分組分4組對照組、模型組、采用本發(fā)明實(shí)施例1得到的S3高劑 量組(50mg/kg/day)、S3低劑量組(25mg/kg/day)。每組動(dòng)物15只。給藥方式以0. 5wt% 羧甲基纖維素鈉作為溶媒制作S3的藥物混懸液，自手術(shù)當(dāng)天開始灌胃給藥，0. 2ml/只/天。 對照組和模型組以等量的溶媒灌胃。3. Αβ 25_35腦室注射動(dòng)物飼養(yǎng)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所清潔級動(dòng)物房， 飼料和飲水均經(jīng)過消毒。所有動(dòng)物適應(yīng)行喂養(yǎng)一周，采用戊巴比妥鈉3%，0. lml/100g腹腔 注射麻醉小鼠。酒精擦拭小鼠頭部皮膚，剪毛。碘酒擦拭消毒，酒精再擦去碘。鑷子提起頭 部皮膚，沿兩耳中線中部剪開口后再向前剪開約1cm，在前鹵后2mm中隔左邊1.5mm，進(jìn)針 2. 5mm的部位注射lmg/ml的A β 25_35 5 μ 1，接著縫合皮膚。用棉球蘸酒精，擦去皮膚傷口處
P(OC2Hs):
Λ /-CH2PO(OC2H5)1
7血漬。4.檢測指標(biāo)(1)小鼠空間記憶測定造模后，第5天開始做動(dòng)物水迷宮實(shí)驗(yàn)(water-maze test)，將小鼠頭朝池壁放入黑色圓形水池中(直徑100cm，高50cm，水深25cm，)，水池中有 一平臺(直徑5cm)，平臺位于水面下lcm。池水用墨水染成黑色，記錄動(dòng)物找到平臺的時(shí)間， 第一次實(shí)驗(yàn)中，如果動(dòng)物找到平臺的時(shí)間超過120s，則引導(dǎo)動(dòng)物到平臺，讓動(dòng)物在平臺停留 10s。(2)細(xì)胞凋亡測定采用免疫組化實(shí)驗(yàn)方法檢測，試劑盒購置Roche molecular biochemicals，USA0(3)小鼠海馬、皮質(zhì)ChAT、AchE及SOD活性測定購置南京建成生物工程研究所的 乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，采用紫外分 光光度計(jì)測定。( 二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. S3對A β 25_35腦室注射誘導(dǎo)記憶缺陷小鼠空間記憶的影響由表1可見，與對照組比較，模型組在造模后第7天和第8天，小鼠找到平臺的時(shí) 間明顯延長(Ρ<0.01)；與模型組比較，S3 (50)和S3(25)組小鼠在造模后第7天和第8天 找到平臺的時(shí)間明顯縮短，顯示S3可以明顯改善Αβ25_35腦室注射小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能 力。表1 S3對側(cè)腦室注射A β 25_35誘導(dǎo)AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
5th天6th天7th天8th天對照104.6 土 2675.2±30.144.4±31.543.3 土 15.2模型107.6 土 23.672.9 土 33.381.4±37.7##83.4 土 34.4.7##S3 (50mg/kg)105.5 土 15.668.2±27.248.0 士 23.廣46.9士21.4"S3 (25mg/kg)108.2 土 23.769.5 土 20.8556.1±25.8*53.4 土 22 廣均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 12)。數(shù)據(jù)顯示小鼠找到水底平臺需要的時(shí)間(潛伏期)。##Ρ < 0. Olvs 對照，*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs 模型組2. S3對A β 25_35腦室注射誘導(dǎo)神經(jīng)凋亡的保護(hù)作用由圖1可以看出，空白對照組無凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，模型組，海馬區(qū)有大量凋亡細(xì)胞出 現(xiàn)(箭頭所指褐色團(tuán)塊)；S3 (50)組海馬區(qū)無凋亡細(xì)胞出現(xiàn)；S3 (25)組海馬區(qū)有凋亡細(xì)胞， 但明顯少于模型組。提示S3對々025_35腦室注射誘導(dǎo)神經(jīng)凋亡的保護(hù)作用。3. S3對腦室內(nèi)注射Αβ 25_35誘導(dǎo)神經(jīng)損傷模型小鼠海馬、皮質(zhì)SOD活性的影響與對照組比較(表2)，模型組海馬和皮質(zhì)的超氧化物歧化酶(SOD)活性分別下降 20.6% (P < 0.01) ^P 35.4% (P < 0.01), S3 (50)與模型組比較，海馬和皮質(zhì)的SOD活性 分別提高40. 2% (P <0.01)和45.0% (P < 0. 01)。提示S3能改善A β 25_35腦室注射誘導(dǎo) 的SOD活性的降低。表2 S3對海馬和皮質(zhì)SOD酶活性的影響
8SOD 活性(IU/g)組別海馬皮質(zhì)對照組116.7±15.8162.3±23.8模型組92.7士 11.6#105.0 士 20.0##S3 (50)130.0 士 18.4**152.3 士 19.1S3 (25)106.8±15.295.8±24.2均數(shù)士 標(biāo)準(zhǔn)差(η = 10) /P < 0. 05，##Ρ < 0. Olvs 對照組；*P < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs
模型組4. S3對腦室內(nèi)注射Αβ 25_35小鼠海馬、皮質(zhì)ChAT活性的影響與對照組比較(表3)，模型組海馬和皮質(zhì)的乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性分別下降 20. 6% (P < 0. 01)和61. 2% (P < 0. 01) ；S3 (50)與模型組比較，海馬和皮質(zhì)的ChAT活性 分別提高39. 5% (Ρ<0. 05)和55. 3% (P < 0. 05)。提示S3能改善Αβ 25_35腦室注射誘導(dǎo) 的ChAT活性的降低。表3 S3對海馬和皮質(zhì)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶酶(ChAT)活性的影響
乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性(IU/mg)組別海馬皮質(zhì)對照組1.02 士 0.190.98 士 0,20模型組0.81±0.14#0.38 士 0.13##S3 (50)1.13±0.13"0.59±0.12*S3 (25)0.87 士 0.130.42 士 0.14均數(shù)士 標(biāo)準(zhǔn)差(η = 7) /P < 0. 05、##Ρ < 0. Olvs 對照組；*P < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs
模型組5. S3對腦室內(nèi)注射Αβ 25_35小鼠海馬、皮質(zhì)AchE活性的影響與對照組比較(表4)，模型組海馬和皮質(zhì)的乙酰膽堿酯酶(AchE)活性分別提高 36. 2% (P < 0.01)和 45. 8% (P < 0.01) ；S3 (50), S3 (25)與模型組比較，海馬和皮質(zhì)的 AchE 活性分別下降 59. 0% (P < 0. 01) ,29. 2% (P < 0. 01)和 40. 0% (P < 0. 01) ,28. 6% (P < 0. 05)，提示S3能改善A β 25_35腦室注射誘導(dǎo)的AchE活性的升高。表4 S3對海馬和皮質(zhì)乙酰膽堿酯酶(AchE)酶活性的影響
AchE 活性(IU/g) 組別海馬皮質(zhì)
對照組0.138 士0.0240.048±0.014
模型組0.188±0.037##0.070士 0.017##
9S3 (50)0.077±0.016**0.042±0.009**
S3 (25)0.133士0.026**0.050±0.015*均數(shù)士 標(biāo)準(zhǔn)差(η = 7)，flflP < 0. Olvs 對照組；**Ρ < 0. Olvs 模型組實(shí)施例3S3對高脂+Αβ 25_35腦室注射誘導(dǎo)記憶缺陷大鼠的保護(hù)作用(一 )實(shí)驗(yàn)方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物wistar大鼠，雌性，180g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所，許可證 編號SCXK (京)2005-0013。2.藥物用量及分組動(dòng)物分6組，分別為正常對照組，高脂對照組，模型組，采用市 售的 S3 高劑量組(50mg/kg/day)，S3 中劑量組(25mg/kg/day)，S3 低劑量組(12. 5mg/kg/ day)。每組動(dòng)物10只。3. Αβ 25_35腦室注射動(dòng)物飼養(yǎng)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所清潔級動(dòng)物房， 飼料和飲水均經(jīng)過消毒。所有動(dòng)物適應(yīng)行喂養(yǎng)普通飼料一周后，除正常對照組外，其他所有 組給予高脂飼料喂養(yǎng)兩個(gè)月。隨后腦室注射Aβ 25_35 戊巴比妥鈉1%，0. 5ml/100g腹腔注射 麻醉大鼠。腦室定位儀固定大鼠，酒精擦拭大鼠頭部皮膚，剪毛。碘酒擦拭消毒，酒精再擦 去碘。手術(shù)刀切開頭部皮膚，在前鹵后Imm中隔左邊2mm的部位用牙科鉆在顱骨鉆一小孔， 用微量注射器進(jìn)針3.8!11111注射11^/1111的六025_35 10μ1，接著縫合皮膚。用棉球蘸酒精，擦 去皮膚傷口處血漬。腹腔注射8萬IU的青霉素。4.給藥方式以0. 5%羧甲基纖維素鈉作為溶媒制作S3的藥物混懸液，自手術(shù)當(dāng) 天開始灌胃給藥，2ml/只/天。對照組和模型組以等量的溶媒灌胃。5.檢測指標(biāo)(1)S3對模型大鼠空間記憶的影響動(dòng)物造模后，第3天開始做動(dòng)物水迷宮實(shí) 驗(yàn)(water-maze test)，將大鼠頭朝池壁放入黑色圓形水池中(直徑120cm，高60cm，水深 30cm，)，水池中有一平臺(直徑8cm)，平臺位于水面下2cm。池水用墨水染成黑色，記錄動(dòng) 物找到平臺的時(shí)間，第一次實(shí)驗(yàn)中，如果動(dòng)物找到平臺的時(shí)間超過60S，則引導(dǎo)動(dòng)物到平臺， 讓動(dòng)物在平臺停留10s。(2)跳臺實(shí)驗(yàn)跳臺裝置為一 25CmX20CmX75Cm的被動(dòng)回避反應(yīng)箱，箱底鋪直徑 為Imm銅柵，通36V交流電，銅柵的一角固定一 8cmX 8cmX 5cm大小的塑料泡沫塊作為動(dòng)物 回避電擊反應(yīng)的安全區(qū)。先將大鼠放入箱中自由活動(dòng)3min，熟悉環(huán)境，然后接通銅柵電源， 大鼠受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回泡沫塊以躲避傷害性刺激，多數(shù)動(dòng)物可能再次或多次跳 至銅柵上，受到電擊(雙足同時(shí)接觸銅柵)又跳回安全區(qū)，如此訓(xùn)練5min。24h后重復(fù)上述 試驗(yàn)，記錄每只大鼠第一次跳下安全區(qū)的時(shí)間(潛伏期)和錯(cuò)誤次數(shù)，作為記憶測試成績。(3)細(xì)胞凋亡測定采用免疫組化實(shí)驗(yàn)方法檢測，試劑盒購置Roche molecular biochemicals, USA。(4)大鼠海馬ChAT、AchE、GSH-PX、MDA及SOD活性測定購置南京建成生物工程研究 所的乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、GSH-PX 試劑盒、MDA試劑盒，采用紫外分光光度計(jì)測定。(5)大鼠海馬Ach水平的測定大鼠酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒[ELISA Kit for Rat]。試劑購自ADL公司。
10
(6)細(xì)胞色素C的釋放采用West Blot方法檢測?？贵w購自R&D公司。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. S3對高脂+側(cè)腦室注射Aβ 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠空間記憶的影響與對照組 比較(表5)，高脂對照組在第7天找到平臺的時(shí)間明顯延長(P <0.01)；高脂+Αβ25_35 造模后第6天和第7天，找到平臺的時(shí)間明顯延長(P <0.01)；與高脂+Αβ 25_35組比較， S3 (50)和S3(25)組小鼠在造模后第6天和第7天找到平臺的時(shí)間明顯縮短。顯示S3可以 明顯改善Αβ 25_35腦室注射小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。表5 S3對高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響
5th天6th天7th天對照組38.22士23.5839.99±16.5410.61±6.32高脂對照組57.1 土 9.1744.72±17.0940.49土 19.78#高脂+Αβ25_3549.26±15.9856.61±6.9#52.09±6.9##S3 (50)39.2 土 20.1933.8 士 17.5"34.75士 19.07*S3 (25)52.78±11.9935.34±23.31*37.10±21.16S3 (12.5)40.2 土 25.6044.93土 21.5738.80±18.49
均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(η= 10).表中數(shù)據(jù)顯示大鼠找到水底平臺需要的時(shí)間(潛伏期) flP < 0. 05、flflP < 0. Olvs 對照組；*Ρ < 0. 05、**Ρ < 0. Olvs 高月旨 +A β 25_35
2. S3對高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠記憶的影響 從圖2和圖3可以看出，與空白對照組比較，模型組大鼠首次跳下平臺需要的時(shí)間 (潛伏期)明顯縮短(P < 0. 05)，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P < 0. 05)。高脂組與正常對照組比 較潛伏期與錯(cuò)誤次數(shù)無差異。與模型組比較，S3 (50)組潛伏期明顯延長，錯(cuò)誤次數(shù)明顯減 少，提示S3可改善大鼠記憶。3. S3對高脂+側(cè)腦室注射Αβ 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響從圖4可以看出，空白對照組海馬區(qū)域無凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，高脂組有海馬區(qū)域零星 的凋亡細(xì)胞(褐色團(tuán)塊)；而高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型組海馬區(qū)有大量凋亡 細(xì)胞出現(xiàn)(褐色團(tuán)塊)；S3 (25)和S3 (50)組海馬區(qū)仍有凋亡細(xì)胞；S3 (50)組海馬區(qū)則僅有 零星凋亡細(xì)胞，明顯少于高脂+側(cè)腦室注射Αβ 25_35神經(jīng)損傷模型組。4. S3對模型大鼠皮質(zhì)、海馬SOD活性的影響從圖5可以看出，高血脂對大鼠腦海馬SOD活性并無影響，而高脂+腦室注射 Αβ 25_35則能明顯降低海馬SOD活性(與對照組比，P < 0. 05) ；S3(50/mg/kg)能明顯升高 SOD 的活性(P < 0. 05，P < 0. 05)。5. S3對A β 25-35腦室注射誘大鼠海馬GSH-PX活性的影響從圖6可以看出，高脂大鼠海馬GSH-PX活性與正常組比較無顯著性差異；腦室注 射Αβ25_35后，大鼠海馬GSH-PX活性與正常組比較明顯降低(P <0.01)。S3(50/mg/kg)則 能明顯升高GSH-PX的活性(P < 0. 01)。6. S3對A β 25_35腦室注射誘大鼠海馬MDA水平的影響從圖7可以看出，高脂大鼠海馬中MDA含量比正常組稍有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 模型組大鼠海馬MDA含量比正常組明顯升高(P < 0. 05)。給予S3能劑量依賴性的降低海
11馬中MDA含量，但只有在S3高劑量時(shí)才有顯著性差異(P < 0. 01)。7. S3對A β 25_35腦室注射誘大鼠海馬ChAT活性的影響由圖8可以看出，高脂大鼠海馬中ChAT活性比正常組升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模 型組大鼠海馬中ChAT活性與正常組比較明顯降低；給予高劑量的S3能升高ChAT活性，與 模型組比價(jià)有顯著性差異(P < 0. 01)。8. S3對高脂+側(cè)腦室注射ΑΒ25-35神經(jīng)損傷模型海馬AchE活性的影響由圖9可以看出，高脂組和高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型組大鼠海馬 中AchE活性比正常組升高(P < 0. 05，P < 0. 01)。高劑量S3能明顯降低AchE活性(P < 0. 05)。9. S3對高脂+側(cè)腦室注射ΑΒ25-35神經(jīng)損傷模型海馬Ach水平的影響由圖10可以看出，高脂對照組大鼠海馬中Ach水平比對照組稍有降低，但無統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義；模型組大鼠海馬Ach水平比正常對照組和高脂對照組明顯降低(均P < 0. 01)。給 予高劑量的S3和中劑量的S3后，海馬中Ach水平較模型組明顯升高(P < 0. 01，P < 0. 05)。10. S3對高脂+側(cè)腦室注射A β 25_35神經(jīng)損傷模型大鼠海馬細(xì)胞色素C(Cyto-C)釋 放的影響由圖11可以看出，與對照組相比，高脂組與模型組腦組織胞漿中cyto-c水平升高 (均 P < 0. 01) ；S3 (50)和 S3 (25)能顯著降低 cyto-c 的釋放(均 P < 0. 01)。實(shí)施例4、S3對高脂模型大鼠血脂的影響(一)實(shí)驗(yàn)方法1.動(dòng)物來源及飼料雌性Wistar大鼠(二級)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究 所繁育場，動(dòng)物合格證號SCXK (京)2005-001372只，體重180g。飼養(yǎng)于本所清潔動(dòng)物房，動(dòng) 物房編號SYXK (京)2005-0036。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食 和飲水，所有飼料和飲用水均進(jìn)過消毒處理。大鼠高脂飼料配方如下10%豬油，1.5%的膽 固醇，0. 2%的膽酸鹽，5%的蛋黃粉，0. 2%的甲基硫氧嘧啶，83. 的基礎(chǔ)飼料。2.藥物辛伐他汀片由默沙東公司生產(chǎn)。3.動(dòng)物分組將動(dòng)物隨機(jī)分成6組①正常組；②高脂模型組；③辛伐他汀組；④本 發(fā)明實(shí)施例1得到的S3低劑量組；⑤S3中劑量組；⑥S3高劑量組。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. S3對高脂大鼠TC的影響由圖12可以看出，與對照組比較，高脂模型組大鼠TC水平提高508% (P <0.01)； 與模型組比較，辛伐他汀組TC水平降低30. 0% (P < 0. 05)，S3 (50)、S3 (25)組TC水平分 別降低30. 0%和27. 9%。2. S3對高脂模型大鼠HDL-C的影響由圖13可以看出，與對照組比較，模型組HDL-C的水平升高79. 94% (P < 0. 01)。 與模型組比較，S3 (50)組升高26. 9% (P < 0. 01)。辛伐他汀與S3 (25)及S3 (12. 5)分別 與模型組比較無顯著性差異。3. S3對高脂模型大鼠LDL-C的影響由圖14可以看出，與對照組比較，模型組LDL-C的水平升高24. 2倍(P < 0. 01)。
12與模型組比較，辛伐他汀組和S3 (50)組LDL-C的水平降低20. 72% (P < 0. 05)和20. 47% (P < 0. 05)。S3 (25)組S3 (12. 5)與模型組比較LDL-C的水平無顯著性差異。實(shí)施例5S3對A β 25_35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用(一)實(shí)驗(yàn)方法1.藥物來源S3由本發(fā)明實(shí)施例1得到。2.試劑 RPMI 1640粉末GIBCO公司產(chǎn)品；青霉素鈉，80萬U/瓶；硫酸鏈霉素， 100萬U/瓶，華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS) ,Hyclone公司產(chǎn)品；MTT粉 末Amresco公司產(chǎn)品；Αβ 25_35，sigma公司產(chǎn)品；DCFH-DA探針，sigma公司產(chǎn)品。3.儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱SANY0 MCO175, Japan 超凈工作臺蘇州艾可林凈化設(shè)備 有限公司；SpectraMax M5酶標(biāo)儀。4. Αβ 25_35損傷SH-SY5Y細(xì)胞模型的建立SH-SY5Y細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物 研究所，以低糖RPM1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100 U/ml)，于 37°C,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用含有EDTA的胰蛋白酶消化傳代。SH-SY5Y細(xì)胞采用 含有EDTA的胰蛋白酶消化傳代，以0. 5X IO5個(gè)/孔接種于96孔板。培養(yǎng)12h后，加入終 濃度為 12. 5ymol/L、25ymol/L、50ymol/L、100ymol/L 的 Αβ25_35，培養(yǎng) 48h 后，進(jìn)行細(xì)胞 活力測定。A β 25_35處理結(jié)束后，棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗兩次，每孔加入100 μ 1 MTT液(采用 RPM1640培養(yǎng)基配制，MTT終濃度為0. 5mg/ml)，于37°C，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。吸棄上 清，每孔加入100 μ 1的DMS0，充分振蕩10分鐘，觀察每孔中甲贜顆粒均已溶解后于570nm 處測定OD值。5. S3對A β 25_35誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)S3用DMSO溶解，然后用無血清RPM1640培 養(yǎng)基倍比稀釋至所需濃度，-20°C保存，DMSO使用最高終濃度< 0. 1%。細(xì)胞共分為五個(gè) 組另I」，分別為正常組、々325_35組、雌二醇(10_7M)組，S3 (HD)組(10_6M)、S3 (MD)組(10_7M)， S3 (LD)組(I(T8M)和 S3 (I(T7M)+ICI (I(T6M)組。細(xì)胞采用含有EDTA的胰蛋白酶消化傳代，以0. 5X IO5個(gè)/孔接種于96孔板。12h 后，加入 S3 (終濃度分另Ij lXl(T6mol/L、lXl(T7mol/L、lXl(r8mol/L)，雌二醇 ICT6M 及 ICI 10_6M，隨后加入終濃度為50ymol/L的A β 25_35 (Α β 25_35的使用終濃度根據(jù)損傷模型結(jié)果來 確定)，培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞活力檢測。不加A β 25_35的作為正常對照組，只加A β 25_35為 A β 25_35組。正常組和A β 25_35組加入與S3藥液等體積的無血清RM1640培養(yǎng)基。棄去原培養(yǎng)液，用PBS洗兩次，每孔加入100 μ 1 MTT液(采用無血清RM1640培 養(yǎng)基配制，MTT終濃度為0. 5mg/ml)，于37°C，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸棄上清，每孔加入 100 μ 1的DMS0，充分振蕩10分鐘，觀察每孔中甲贜顆粒均已溶解后于570nm處測定OD值。6.細(xì)胞凋亡(Hoechst 33342染色)A β 25_35作用48小時(shí)后，吸盡培養(yǎng)液，用無 酚紅的培養(yǎng)基洗滌兩次，加入50μ 1的Hoechst 33342染色液(10 μ g/ml)，37°C染色20分 鐘。用無酚紅的培養(yǎng)基洗滌兩次，加入ΙΟΟμΙ無酚紅培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下檢測。激發(fā) 波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右。7. S3對Αβ 25_35誘導(dǎo)細(xì)胞ROS水平的影響吸出細(xì)胞上層培養(yǎng)液，加入100 μ 1的 DCFH-DA(5 μ Μ)探針，37°C孵育45min，吸出上清，用PBS(Ph = 7. 3)洗滌3次，加入100 μ 1
13PBS (Ph = 7. 3)上機(jī)檢測，激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為525nm。8. S3對細(xì)胞線粒體膜電位的影響細(xì)胞線粒體膜電位的測定吸取mitolight Apoptosis Detection Kit (LOT :PS01450307 Exp 2009/06)染色液 2 μ 1 加入到 0. 9ml 的 雙蒸水中，加入0. Iml的IOX buffer，加入Iml的無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基，超聲助溶。吸出 細(xì)胞上清，加入配好的染色液，每孔0. 25ml。37°C孵育20min，吸出上清液，用無酚紅的DMEM 培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次，上熒光顯微鏡觀察(激發(fā)光為藍(lán)光和綠光)。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. Αβ 25_35誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的建立由圖15可以看出，細(xì)胞活力與△日25_35成濃度依賴性的降低。下面實(shí)驗(yàn)中，Αβ25_35 濃度均取50(ymol/L)。2. S3對A β 25_35誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)由圖16可以看出，Αβ25_35的細(xì)胞活率比對照組降低27. (P < 0. 01)，S3在 10_6Μ濃度時(shí)，與模型組比較細(xì)胞活率提高30. 8% (P < 0. 05)。3. S3對Αβ 25_35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響由圖17可以看出，Hoechst 33342染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對照組細(xì)胞核多數(shù)為大小 較一致、染色均勻的圓形核，偶見固縮濃染核；Αβ25_35處理組細(xì)胞數(shù)減少，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞核， 染色質(zhì)發(fā)生固縮，細(xì)胞核致密濃染，形狀不規(guī)則，為顆粒、小塊狀。給予S3后能顯著減少細(xì) 胞凋亡。4. S3對A β 25_35誘導(dǎo)損傷細(xì)胞ROS的影響由圖18可以看出，與對照組比較，模型組(Αβ25_35)的ROS水平顯著提高(增 加了 124.2%，P <0.01)；與模型組比較，S3能劑量依賴的降低細(xì)胞ROS水平，分別降低 50. 98%,40. 22%,24. 95% (P < 0. 01)。5. S3對A β 25_35誘導(dǎo)損傷細(xì)胞線粒體的影響由圖19可以看出，與正常組比較，模型組細(xì)胞突觸變短，細(xì)胞變圓，細(xì)胞膜電位降 低(染色變綠)。S3 (50)，S3 (25)組與模型組比較，細(xì)胞膜電位明顯升高(顯示橙色細(xì)胞變 多)。實(shí)施例6S3對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響1.實(shí)驗(yàn)方法藥品與試劑S3由本發(fā)明實(shí)施例1得到；MTT購自Sigma ；DMEM高糖培養(yǎng)基和血清 購自Hyclone ；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。MCF-7細(xì)胞購自本所細(xì)胞中心。實(shí)驗(yàn)方法MCF-7細(xì)胞以0.5X IO5密度接種于96孔板中，每孔180 μ L細(xì)胞液培 養(yǎng)24小時(shí)后，每孔分別加入各濃度的藥物20μ L，使S3終濃度分別為10_4、10_5、10_6、10_7、 10_8mOl/L，雌二醇的終濃度為lO—W/L。48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20ul, 37°C，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150ul 二甲基亞砜 DMSO (分析純)，振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測 定各孔光吸收(OD)值，記錄結(jié)果。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表6可見，S3能抑制MCF-7細(xì)胞的增殖作用，在10_4、10_5、10_6、liTmol/L濃度時(shí)
14與正常組比較有顯著性差異，分別抑制細(xì)胞增殖達(dá)到46. 3 %，11 %，9. 4 %，9. 4 %。表6 S3對MCF-7細(xì)胞增殖作用
組別濃度(mol/L)OD值對照組0.529士 0.051雌二醇組10"0.534士0.04710"7+ICI0.526士 0.048ICIIO"60.458士0.076*10·40.284士 0.041*IO"50.471±0.093*IO"60.479±0.061*ΙΟ·70.479士 0.075S3IO"80.498士 0.061
10'7+ICI0.547士 0.036MCF-7與S3共同孵育48h。MTT方法檢細(xì)胞增殖情況，*P < 0. 05vs對照組結(jié)論S3結(jié)構(gòu)上類似于植物雌激素，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知體內(nèi)雌激素高容易誘發(fā) 乳腺癌，而本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S3能抑制MCF-7細(xì)胞的增殖作用，克服了雌激素的副作用。實(shí)施例7小鼠單次給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明小鼠，雌雄各半。體重18_20g。S3由本發(fā)明實(shí)施例1得到。實(shí)驗(yàn) 分組分3組，每組5只小鼠，5g/kg組，10g/kg組，15g/kg組。動(dòng)物灌胃量為0. 2ml/只。實(shí)驗(yàn)方法小鼠按5g/kg給藥，5只，觀察2天，如果無死亡；按10g/kg給藥，5只； 觀察2天，如無死亡；按15g/kg給藥，5只，觀察2天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)小鼠按5g/kg給藥，觀察14天，無死亡。(2)小鼠按10g/kg給藥，觀察14天，無死亡。結(jié)論S3安全性較高。參考文獻(xiàn)1. “中國膽固醇教育計(jì)劃(CCEP) ”暨衛(wèi)生部“十年百項(xiàng)”冠心病血脂干預(yù)推廣項(xiàng) 目年度工作總結(jié)會(huì)議簡介.中國臨床醫(yī)生，2005 ;33 (2) 27.2.葉平.積極降脂，有效防治冠心病.老年醫(yī)學(xué)與保健，2005; 11(1) 11 13.3. Prasad K，Kalra J. Oxygen free radicals and hypercholesterolemic atherosclerosis :effect of vitamin E.Am Heart J,1993 ；125(4) :958 973·4.Deepa PR， Varalakshmi P.Atheroprotective effect of exogenous heparin-derivative treatment on the aortic disturbances and lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic diet fed rats. Clin Chim Acta,2005 ；355 (1-2) 119 130.5. Luigi Puglielli，Rudolph E，Tanzi, et al. Alzheimer' s disease :the
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1權(quán)利要求
2，4 二甲氧基反式芪在制備治療高脂血癥的藥物中的用途。
2.2，4-二甲氧基反式芪在制備治療老年癡呆的藥物中的用途。
3.2，4_ 二甲氧基反式芪在制備治療老年癡呆同時(shí)伴有高脂血癥的藥物中的用途。
4.2，4_ 二甲氧基反式芪在制備預(yù)防由高脂血癥導(dǎo)致的老年癡呆的藥物中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的用途，其中2，4-二甲氧基反式芪進(jìn)一步與藥學(xué)上 可接受的載體組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述的載體包括稀釋劑、吸收劑、濕潤劑、粘合劑、 崩解劑、崩解抑制劑、吸收促進(jìn)劑、潤滑齊 、分散劑、助溶齊 、緩沖齊 、表面活化劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的藥物是以片劑、注射劑、膠囊、 滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑的形式使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的用途，其中所述的藥物經(jīng)靜脈、口服、肌肉、皮下、 鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹腔、直腸給予。
全文摘要
本發(fā)明涉及2，4-二甲氧基反式芪的新用途，特別是2，4-二甲氧基反式芪在降脂及抗老年癡呆中的用途。
文檔編號A61P3/06GK101919830SQ20091008598
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者孫蘭, 斯建勇, 李展, 阮燦軍, 陳迪華, 駱慶峰 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所