專利名稱：：禽流感h5n1病毒的ctl表位多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人禽流感H5N1病毒是一種來源于禽類的高致病性、高致死率的流感病毒亞型。1997年在香港首先爆發(fā)了人禽流感的感染，18人感染，其中6人死亡。到2003年，世界范圍內(nèi)又重新出現(xiàn)了人禽流感病例。從2003年底至今，已有408例感染，其中205例死亡。人禽流感的傳播方式一般是從禽類傳染給人，人和人之間的直接傳染只是偶發(fā)現(xiàn)象。但是，一旦病毒通過突變或者與人流感病毒基因發(fā)生重排，就可能產(chǎn)生適應(yīng)在人體復(fù)制和人與人直接傳播的新毒株，導(dǎo)致流感大流行。雖然目前沒有觀察到H5N1病毒持續(xù)的人到人的傳播，但是20世紀(jì)的3次流感大流行都起源于鳥類的流感病毒，其中1918-1919年流感大流行奪去了四千萬人口的生命。據(jù)估計，下一次流感大流行造成的死亡數(shù)字將遠高于此。因此，為應(yīng)對流感大流行做準(zhǔn)備是十分緊迫的任務(wù)。機體的免疫系統(tǒng)是抵御病毒入侵的重要紡線，研制高效的疫苗，激發(fā)人體的保護性免疫反應(yīng)是防治高致病性禽流感最重要的手段。機體的免疫系統(tǒng)有體液免疫和細(xì)胞免疫兩個分支。體液免疫是由抗體介導(dǎo)的。流感病毒通過其血凝素(HA)糖蛋白結(jié)合細(xì)胞表面的唾液酸殘基而粘附在宿主細(xì)胞表面，再通過內(nèi)吞作用以及隨后的病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜的融合而進入細(xì)胞。病毒HA對于流感病毒致病力和病毒感染的宿主范圍起著關(guān)鍵的作用，同時HA也是體液免疫的主要靶抗原。HA特異性抗體起著阻斷病毒粘附的作用，從而抑制病毒感染細(xì)胞。與體液免疫不同，細(xì)胞免疫是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)所介導(dǎo)的。病毒感染細(xì)胞后，病毒蛋白質(zhì)被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶分解成多肽，被轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，再被裝載到主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類分子上。然后多肽-細(xì)C復(fù)合物通過高爾基體被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面，再被CTL(CD8+T細(xì)胞)識別。CTL識別MHC分子提呈的病毒多肽后，分泌具有抗病毒活性的細(xì)胞因子，如IFN-Y和TNF-a，以及具有裂解細(xì)胞作用的穿孔素，從而殺傷被病毒感染的細(xì)胞，限制病毒的復(fù)制和傳播，進而清除病毒。這些被CTL識別的病毒多肽就是相應(yīng)的MHC限制性的CTL表位。細(xì)胞免疫雖然可能不能預(yù)防病毒感染細(xì)胞，但是可以通過清除被病毒感染的細(xì)胞防止流感病毒導(dǎo)致的嚴(yán)重疾病和死亡。目前禽流感H5N1的檢測方法包括病原學(xué)方法、血清學(xué)方法和核酸檢測方法。通過病毒的分離鑒定是禽流感的經(jīng)典病原學(xué)方法。該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈敏(極少量病毒也可檢出)，但操作程序繁雜、費用高、實驗室要求高(國家規(guī)定必須在P3級實驗室進行)、耗時費力、周期長(檢測時間需l-3周)，大面積應(yīng)用推廣受到較大限制。目前共有6種血清學(xué)檢測技術(shù)，分別是血凝抑制試驗(HI)、微量中和試驗(MNT)、免疫熒光技術(shù)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金免疫層析分析(GICA)和蛋白免疫印跡(westernblot)。這些方法都是利用抗原抗體之間的特異性反應(yīng)，來確定病毒亞型或者某種亞型特異性抗體的滴度。血凝抑制試驗和瓊脂擴散實驗操作簡便快速，但靈敏度較低。微量中和試驗雖然靈敏度高，但操作繁瑣耗時。免疫熒光技術(shù)靈敏度高，但需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備，應(yīng)用受到限制。酶聯(lián)免疫吸附試驗一般被認(rèn)為是既簡便快捷，又靈敏的方法，但是用于檢測抗體時，對抗原制備的要求較高。在這6種檢測技術(shù)中，血凝抑制試驗和微量中和試驗是實驗室常規(guī)方法，其余4種對于常規(guī)流感甲1和甲3亞型已有完善的方法，但是用于H5抗原的檢測還需改進和優(yōu)化。對于膠體金免疫層析分析，日本、美國和我國有區(qū)別甲型流感、乙型流感和H5亞型的試劑盒，敏感度不夠高。禽流感病毒的核酸檢測技術(shù)包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和實時定量PCR(RTQ-PCR)。該方法不但可鑒定樣品中病毒的型及亞型，還可結(jié)合基因序列分析推測病毒的致病力高低。其靈敏度高，較病毒分離法快速、特異性也高，是公認(rèn)的能夠在較短時間做出準(zhǔn)確診斷的方法。但其成本較高，試驗過程復(fù)雜，對實驗環(huán)境、儀器設(shè)備、操作人員等要求高，同時干擾因素多，會出現(xiàn)假陰性或假陽性現(xiàn)象，診斷時不能作為唯一的判定依據(jù)。除了病原學(xué)和血清學(xué)等指標(biāo)對禽流感進行檢測和監(jiān)測外，特異性的T細(xì)胞也可以作為一項監(jiān)測指標(biāo)。監(jiān)測禽流感病毒特異性的T細(xì)胞，可以了解人群免疫狀態(tài)，評價疫苗的免疫效果，也為制定合理的免疫規(guī)劃提供依據(jù)。近年來T細(xì)胞檢測技術(shù)有了很大發(fā)展。首先，酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)是可以從單細(xì)胞水平檢測分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞的一種細(xì)胞免疫學(xué)檢測技術(shù)。利用ELISPOT檢測分泌IFN-y的CTL是常用的評價細(xì)胞免疫水平的方法，其原理是將IFN-y的單抗包被在貼有PVDF膜的96孔板上，再將經(jīng)過免疫原性表位多肽剌激過的T細(xì)胞加入微孔內(nèi)培養(yǎng)，其分泌的IFN-y與包被抗體結(jié)合。將細(xì)胞和未結(jié)合成分洗去后，加入酶標(biāo)記IFN-y檢測單抗，與被捕獲的IFN-y結(jié)合。加入底物后，可在有IFN-y的位置產(chǎn)生有色斑點，每個斑點代表一個分泌IFN-Y的細(xì)胞。用計算機成像分析系統(tǒng)記數(shù)斑點數(shù)，就可以確定樣品中分泌IFN-Y的CTL的數(shù)量。ELISPOT技術(shù)敏感性高，由于細(xì)胞附近的細(xì)胞因子濃度高，分泌100個細(xì)胞因子的細(xì)胞也能被發(fā)現(xiàn)，足以檢測到1/105個IFN-Y分泌細(xì)胞。并且因為使用了識別細(xì)胞因子或抗體的兩個不同表位的兩種單克隆抗體，ELISPOT技術(shù)有著高度的特異性。其次，MHCI類分子四聚體(Tetramer)技術(shù)是另一種近年來發(fā)展起來的CTL檢測技術(shù)。該技術(shù)是一種可直接對抗原特異性CTL進行標(biāo)記和檢測的新方法。該技術(shù)利用1個分子的熒光素標(biāo)記的鏈霉親合素與4個分子的生物素化的MHC-表位多肽連接成四聚體復(fù)合物，顯著增加了其與T細(xì)胞受體(Tcellrec印tor，TCR)的親和力，因而使CTL的測定敏感性大為提高。Tetramer技術(shù)不僅可定性檢測T細(xì)胞群中MHC-肽特異性T細(xì)胞，還可定量測定其百分率。該技術(shù)的特點是快速、敏感和結(jié)果特異，較ELISPOT技術(shù)更為精確。利用ELISPOT和Tetramer技術(shù)檢測特異性CTL的基礎(chǔ)，是已知相應(yīng)的CTL表位多肽。對于禽流感H5N1病毒來說，如果確定了其不同于其他流感病毒亞型的特異性的CTL表位，就可以對其相應(yīng)的特異性的CTL進行定性定量分析。但是由于沒有H5N1病毒特異性的T細(xì)胞表位，針對H5N1禽流感病毒的T細(xì)胞檢測技術(shù)至今沒有建立。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽，為如下(a)或(b):(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與禽流感H5N1病毒的CTL表位相關(guān)的由序列1衍生的多肽。為了使(a)中的多肽便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的多肽的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的多肽可人工合成，也可先合成其編碼DNA，再進行生物表達得到。上述(b)中的多肽的DNA可通過將序列表中序列3自5'端第1至30位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述多肽具體可如序列表的序列1所示(RI-10)(GENBANKACCESSIONGNO.AAZ16277中自氮末端第205-214位氨基酸殘基)或序列表的序列2所示(KI-10)(GENBANKACCESSIONGNO.ABD28180中自氮末端第205-214位氨基酸殘基)。編碼所述多肽的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述DNA分子可為如下1)或2)或3):1)其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5MSDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。所述DNA分子具體可如序列表的序列3所示(RI-10)或序列表的序列4所示(KI-10)。含有所述DNA分子的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還保護如下物質(zhì)中的至少一種在制備禽流感病毒疫苗中的應(yīng)用所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。所述禽流感病毒具體可為H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。本發(fā)明還保護一種禽流感病毒疫苗，它的活性成份為如下物質(zhì)中的至少一種所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。所述禽流感病毒具體可為H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。本發(fā)明同時保護如下物質(zhì)中的至少一種在制備禽流感病毒特異性T細(xì)胞檢測試劑盒中的應(yīng)用所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。所述禽流感病毒具體可為H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。本發(fā)明同時保護一種禽流感病毒特異性T細(xì)胞檢測試劑盒，它含有如下物質(zhì)中的至少一種所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。所述禽流感病毒具體可為H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。6本專利的保護范圍也包括對RI-IO，KI-10的氨基酸序列以及相應(yīng)的基因序?qū)M行增刪或突變所得到的用于相同目的的序列。人類白細(xì)胞抗原(HLA)是人類的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子。HLA-A*0201是世界人口表達最廣泛的一個HLA的等位基因，HLA-A的201陽性的個體占世界人口的50%。經(jīng)過refolding結(jié)合實驗和T2細(xì)胞結(jié)合實驗，證實了所述的表位多肽(RI-10和KI-10)與HLA-AW201分子具有較高親和力，并且在HLA-A^K)201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠中具有很強的免疫原性，能誘導(dǎo)很強的CTL反應(yīng)。RI-10和KI-IO還被證實能在康復(fù)期的禽流感患者外周血單個核細(xì)胞中誘導(dǎo)CTL反應(yīng)。H5N1特異性T細(xì)胞表位的鑒定，使得H5N1病毒特異性T檢測能夠以高度的特異性和靈敏度進行，這樣就可以作為一項診斷指標(biāo)，也可以為檢測人群對特定病原體免疫狀態(tài)、制定合理的免疫規(guī)劃提供依據(jù)。本發(fā)明所提供的表位多肽一方面，可以用作在HLA-A的201陽性個體中激發(fā)對禽流感H5N1病毒具有保護作用的細(xì)胞免疫的疫苗；另一方面，可以用作在HLA-AM201陽性個體中檢測禽流感H5N1病毒特異性CTL反應(yīng)的診斷試劑。本發(fā)明提供表位多肽為開發(fā)相應(yīng)的疫苗、相應(yīng)的檢測試劑和診斷方法奠定了基礎(chǔ)。圖1為多肽與HLA-AHO201分子以及P2m分子構(gòu)成復(fù)合物的refolding實驗結(jié)果。圖2為多肽與T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子結(jié)合能力的實驗結(jié)果。圖3為經(jīng)帶有H5HA基因的痘苗病毒載體免疫的HLA-AW201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞中的多肽的特異性CTL反應(yīng)的實驗結(jié)果。圖4為多肽免疫HLA-A的201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠后用ELISP0T方法檢測CTL反應(yīng)的實驗結(jié)果。圖5為多肽免疫HLA-AW201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠后用tetramer染色的方法檢測CTL反應(yīng)的實驗結(jié)果。圖6為檢測RI-10和KI-10禽流感病毒感染病人康復(fù)期血樣的PBMC中的CTL反應(yīng)的實驗結(jié)果。圖7為RI-10/KI-10與HLA-A*0201分子以及P2m分子復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)；A:RI-10-HLA-A*0201;B:KI-10-HLA-A*0201;C:A和B的疊加圖。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。RI-10多肽如序列表的序列1所示。KI-10多肽如序列表的序列2所示。以下實施例中的多肽均委托北京中科亞光生物科技有限公司合成，經(jīng)過HPLC和質(zhì)譜分析進行鑒定，純度〉95%。實施例l、用refolding實驗檢測多肽與HLA-AW201分子的結(jié)合能力在refolding實驗中，如果多肽能與HLA-A*0201分子結(jié)合，那么多肽、HLA-A的201和P2m就能形成穩(wěn)定的多肽-MHC-e2m三元復(fù)合物，在分子篩層析圖譜中出現(xiàn)多肽-重鏈-輕鏈復(fù)合物峰。一、HLA-AW201重鏈胞外區(qū)包涵體的制備1、重組質(zhì)粒I的構(gòu)建將編碼HLA-A氺0201重鏈胞外區(qū)的DNA(GENBANKACCESSIONNO.AY365426自5'末端第73-897位核苷酸)導(dǎo)入pET-28(a)，得到重組質(zhì)粒I。2、HLA-A的201重鏈胞外區(qū)包涵體的制備將轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒I的大腸桿菌BL21(NEB公司，Cat.No.C2566H)的單克隆菌種接種于少量培養(yǎng)基中，在37"C搖床上過夜。再將過夜培養(yǎng)物接種于2L培養(yǎng)基中，在37'C搖至0D600為0.6-0.8時，加入lmMIPTG(終濃度為lmM)，誘導(dǎo)4h后收獲細(xì)菌。用PBS重懸菌體，加入lraMDTT，超聲破碎后離心，沉淀為包涵體。將包涵體用含有Triton的洗滌緩沖液(50mMTrisHC1，0.5%TritonX-100，lOOmMNaCl，lmMNaEDTA,lmMDTT)洗兩次，用不含有Triton的洗滌緩沖液洗一次，再加入尿素緩沖液(25mMMES[SIGMAM-3023]，8Murea[Baker4204-05]，10mMNaEDTA，0.1mMDTT)溶解，分裝后在-8(TC保存。二、人e2微球蛋白輕鏈包涵體的制備1、重組質(zhì)粒II的構(gòu)建將編碼人P2微球蛋白的DNA(GENBANKACCESSIONNO.NM—004048自5'末端第121-417位核苷酸)導(dǎo)入pET-28(a)，得到重組質(zhì)粒II。2、人e2微球蛋白輕鏈包涵體的制備用重組質(zhì)粒II代替重組質(zhì)粒I，其它同步驟一的2。三、refolding實驗1、多肽RI-IORefolding體系向Refolding緩沖液(100mMTris-HC1,400mML-arginine-HCL，2mMNaEDTA,0.5mMoxidizedglutathione,5mMreducedglutathione)中按l:1:3的摩爾比加入HLA-A利201重鏈胞外區(qū)包涵體、RI-10和人P2微球蛋白輕鏈包涵體。HLA-A的201重鏈胞外區(qū)包涵體和人e2微球蛋白輕鏈包涵體配成注入緩沖液，逐滴加入，RI-10溶解在100-200iil二甲亞砜中之后再加入。將Refolding體系放置在4T:攪拌48-36h后濃縮，進行分子篩層析。RI-10的分子篩圖譜見圖1。在洗脫體積為15ml處出現(xiàn)的峰代表RI-10-MHC-P2m三元復(fù)合物，結(jié)果表明，RI-10與HLA-AHO201分子有較好的親和力。2、多肽KI-10用多肽KI-10多肽代替RI-10，實驗方法同步驟l。KI-IO的分子篩圖譜與RI-10的分子篩圖譜一致，KI-10與HLA-A*0201分子有較好的親和力。實施例2、用T2細(xì)胞結(jié)合實驗檢測多肽與T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子的結(jié)合能力T2細(xì)胞是HLA-A的201陽性，TAP分子缺陷的細(xì)胞株。該細(xì)胞不能加工內(nèi)源性的抗原，但是可以遞呈外源性的抗原肽。在無抗原肽存在的情況下，其細(xì)胞表面HLA-A2分子的表達處于低水平，一旦有合適的外源性抗原肽與T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子結(jié)合，其細(xì)胞表面HLA-A2的表達強度將大大提高。一、多肽RI-10T2細(xì)胞(ATCC，Cat.No.CRL-1992)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS,Gibico)的RPMI-1640(補加5.9%HEPES，0.307%谷氨酸，0.11%丙酮酸鈉，2%碳酸氫鈉，50u/ml青霉素，50u/ml鏈霉素)中，培養(yǎng)箱溫度為37X:，含5%C02。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用無血清的培養(yǎng)基洗2次后，將細(xì)胞調(diào)至2X105/ml，接種于24孔板中，加入RI-10(終濃度為50uM)。在37匸和5%C02的條件下培養(yǎng)18h后，收獲細(xì)胞，用PBS洗2次，加入FITC標(biāo)記的anti-HLA-A2單克隆抗體BB7.2(Serotech，Cat.No.P10892)，在冰上孵育20min后，用含O.5%BSA的PBS洗2次，流式細(xì)胞儀測定樣品的熒光強度。用相同體積無菌水代替RI-IO，作為陰性對照。RI-10的結(jié)果見圖2。結(jié)果表明RI-10能使T2細(xì)胞表面的HLA-A2分子表達水平提高，進一步在細(xì)胞水平證實了RI-10可以與HLA-A2分子結(jié)合。二、多肽KI-10用多肽KI-10多肽代替RI-10，實驗方法同步驟一。結(jié)果表明KI-10與RI-IO具有同樣的效果。實施例3、用ELISP0T分析檢測多肽誘導(dǎo)經(jīng)帶有H5HA基因的pcDNA3.1(+)載體免疫的HLA-A承0201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)的能力HLA-A的201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠購自上海第二軍醫(yī)大學(xué)。9重組質(zhì)粒III(插入青海湖H5N1病毒H5HA的pcDNA3.1(+)載體)的制備設(shè)計上游引物(5'-GCTAGCCATGGAGAAAATAGTGCTT-3')和下游引物(5'-MTGCAAATTCTGCATTGTAAAAGCTT-3')擴增H5HA的基因(GENBANKACCESSIONGNO.AAZ16277)，用NheI和HindIII雙酶切，同時將pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen，Catalognos.V790-20)用NheI和HindIII雙酶切，將酶切產(chǎn)物置于18"C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(TAKARA，Cat.No.D9057)。經(jīng)克隆篩選、測序鑒定后備用。一、多肽RI-10取雌性的HLA-A的201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，用重組質(zhì)粒m進行免疫。免疫的途徑為肌肉注射，免疫的劑量為每次3.0Xl(fpfu。免疫分三次進行，兩次免疫之間的間隔為4周。用PBS代替重組質(zhì)粒III，采用相同方法免疫雌性的HLA-AW201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，作為對照。在最后一次免疫后的第10天，分離小鼠脾細(xì)胞，用ELISPOT(UCTech產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄編號CT317-PB5)分析檢測多肽特異性的CTL反應(yīng)。ELISPOT分析中，脾細(xì)胞的培養(yǎng)孔中加入終濃度為20uM的RI-10(或相同體積的無菌水)和終濃度為20u/ml的rmIL-2。ELISPOT分析的具體步驟用70%的乙醇潤濕96孔板底部的PVDF膜。然后用100u1/孔的去離子水洗滌2次，再加入50u1/孔用PBS稀釋好的anti-IFN-Y包被抗體，4"C包被過夜。次日傾倒包被液，用無菌PBS洗滌3次。最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。加入200u1/孔稀釋好的封閉液，37"C封閉lh。傾倒封閉液，加入2XK)5/孔的細(xì)胞和終濃度為20uM的RI-10(或相同體積的無菌水)，在37。C和5%C02的條件下培養(yǎng)24小時。傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基，加入200"l/孔冰冷的去離子水，4t:冰浴10min。每孔加入200ulPBST，浸泡3-5min后扣出洗滌液，重復(fù)5次。最后一次，在吸水紙上扣干。每孔加入100uL稀釋好的生物素標(biāo)記anti-IFN-Y檢測抗體，37t;孵育lh。每孔加入200u1PBST，浸泡3-5mins后扣出洗滌液，重復(fù)5次。最后一次，在吸水紙上扣干。每孔加入100ul稀釋好的酶標(biāo)親和素，37'C孵育1小時。每孔加入200ulPBST，浸泡3-5mins后扣出洗滌液，重復(fù)5次。最后一次，在吸水紙上扣干。每孔加入100iiL的顯色液，室溫靜置15-45min(在20-25°C)，避光。待斑點生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。將ELISP0T板置于BiosysBioreader自動讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，計數(shù)斑點。結(jié)果見圖3。結(jié)果表明用編碼H5HA的痘苗病毒載體免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生了顯著的CTL反應(yīng)，而用PBS免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細(xì)胞未產(chǎn)生CTL反應(yīng)。在RI-10的刺激下，CTL的數(shù)目與無多肽刺激時相比顯著增加，這表明RI-10有明顯的免疫原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL反應(yīng)。二、多肽KI-10用多肽KI-IO多肽代替RI-IO，實驗方法同步驟一。結(jié)果表明KI-10與RI-10具有同樣的效果。實施例4、用ELISPOT和tetramer染色的方法檢測多肽免疫HLA-A承0201/Kb轉(zhuǎn)基囟小鼠后脾細(xì)胞中產(chǎn)生的CTL反應(yīng)一、多肽RI-IO取雌性的HLA-AW201/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠，用50iigRI-IO進行免疫，用小鼠gp96的N末端片段N333(22-355)(GENBANKACCESSIONNO.NM—011631中自氮末端第22-355位氨基酸殘基)50ixg作為佐劑，與氟式不完全佐劑(IFA)乳化后皮下多點注射。免疫分三次進行，兩次之間的時間間隔為2周。在最后一次免疫后的第10天，分離小鼠脾細(xì)胞,在體外培養(yǎng)2周，細(xì)胞密度為2X107ml,培養(yǎng)孔加入多肽RI-10使其終濃度10uM，和終濃度為20u/ml的重組小鼠白介素-2(rmIL-2)，然后用IFN-yELISPOT法和tetramer染色檢測多肽特異性CTLs反應(yīng)。用流感病毒的優(yōu)勢表位GL-9(序列為GILGFVFTL)代替RI-10，作為陽性對照，1、ELISPOT法實驗方法同實施例3。結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，RI-10誘導(dǎo)了明顯的CTL反應(yīng)。與陽性對照比較，RI-IO誘導(dǎo)了比GL-9更強的CTL反應(yīng)。這些結(jié)果表明，RI-10是具有強免疫原性的CTLs表位多肽。2、tetraraer染色①tetramer的制備HLA-AHO201/Kb分子是HLA-A*0201分子和小鼠1^分子的雜合分子，編碼DNA由HLA-A*0201分子的編碼DNA(GENBANKACCESSIONNO.AY365426中自5，端第73-615位核苷酸)和Kb分子的編碼DNA(GENBANKACCESSIONNo.J00400中自5，端第349-630位核苷酸)拼合。HLA-AW201/Kb分子的包涵體的制備方法與實施例1中所述的"HLA-A*0201重鏈胞外區(qū)包涵體的制備"方法相同。P2M分子的編碼DNA是GENBANKACCESSIONNO.NM—004048自5'末端第121-417位核苷酸。p2M分子的包涵體的制備方法與實施例i中所述"人e2微球蛋白輕鏈包涵體的制備"方法相同。將C-末端帶有生物素化位點標(biāo)簽(GSGGGLNDIFEAQKIEWHE)的HLA-AnO201/Kb分子的包涵體、P2M分子的包涵體與RI-IO按I:1:3的摩爾比復(fù)性，得到RI-10-HLA-A2-e2M復(fù)合體。RI-10-HLA-A2-P2M復(fù)合體經(jīng)分子篩和離子交換柱純化，加入BirA酶(Avidity，Denver,Co)和生物素，在室溫反應(yīng)過夜，進行生物素化。其后，再用分子篩純化，收集復(fù)合體蛋白并測定蛋白濃度。加入取適量復(fù)合物蛋白，按1:4的摩爾比在4。C分次加入PE標(biāo)記的鏈霉親和素，制得RI-10-HLA-A2tetramer。11濃縮后用PBS洗3次，再濃縮至適當(dāng)?shù)捏w積備用。用同樣的方法制備GL-9-HLA-A2tetramer。②tetramer染色脾細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)體系中加入RI-10(10uM)和IL-2(20u/ml)。2周后收獲細(xì)胞用RI-10-HLA-A2tetramer和FITC標(biāo)記的anti-小鼠CD8單克隆抗體(BD，Cat.No.560469)對細(xì)胞進行雙染色，或者用GL-9-HLA-A2tetramer或再用流式細(xì)胞儀檢測多肽特異性的CTL反應(yīng)。結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，RI-10誘導(dǎo)了強大的CTL反應(yīng)，其特異性的CTL占脾細(xì)胞中CD8+細(xì)胞的20.6%。與陽性對照比較，RI-10誘導(dǎo)了比GL-9更強的CTL反應(yīng)。這些結(jié)果提示，RI-10是具有強大免疫原性的CTLs表位多肽。二、多肽KI-IO用多肽KI-IO多肽代替RI-IO，實驗方法同步驟一。結(jié)果表明KI-IO與RI-IO具有同樣的效果。實施例5、用tetramer染色的方法檢測多肽和禽流感病毒感染病人康復(fù)期血樣的PBMC中的CTL反應(yīng)從HLA-A2病人分離到的H5N1病毒的HA序列(GENB認(rèn)KACCESSIONGNO.AAZ16277)的205位氨基酸(即相當(dāng)于RI-IO的第一位殘基)，有的毒株是Arg(R)，有的毒株是Lys(K)。試驗樣本來源如下兩名HLA-A2陽性患者志愿者，編號分別為LXC(感染毒株HA序列的205位氨基酸為R)和HJR(感染毒株HA序列的205位氨基酸為K)。一名健康志愿者。一名HLA-A2—康復(fù)者志愿者。設(shè)置以下幾組對四名志愿者的外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)進行了CTL反應(yīng)檢測。用RI-IO(或KI-10，或GL-9)在體外刺激刺激PBMCs兩周后，收獲細(xì)胞進行tetramer染色(方法同實施例4)。結(jié)果見圖6。在LXC的PBMCs中，RI-lO特異性CTLs(即用RI-10-HLA-A2tetramer染色時CD8+tetramer+的雙陽性細(xì)胞)在CD8+細(xì)胞中的比例為1.5%，而用KI-10-HLA-A2的tetramer染色時CD8+tetramer+的雙陽性細(xì)胞的比例為0.5%。在HJR的PBMCs中KI-10特異性CTLs(即用KI-10-HLA-A2tetramer染色時CD8+tetramer+的雙陽性細(xì)胞)在〔08+細(xì)胞中的比例為2.7%，而用RI-10-HLA-A2tetramer染色時CD8+tetramer+的雙陽性細(xì)胞的比例為1.8%。在健康志愿者的PBMCs中檢測不到RI-10或KI-lO特異性CTLs。而作為陽性對照的GL-9特異性CTLs在HLA-A2+的健康志愿者的PBMCs以及LXC、HJR和HLA-A2—12的CD8+細(xì)胞中的比例分別為1.1%、1.2%和0.2%?？祻?fù)者志愿者血樣的PBMCs中檢測不到RI-10、KI-10和GL-9特異性CTLs。結(jié)果表明，RI-10/KI-10是H5特異性的HLA-A2限制性的CTL表位。而且，RI-10和KI-IO兩個多肽有交叉反應(yīng)，也就是說RI-10特異性CTLs能識別KI-10，而KI-lO特異性CTLs也能識別RI-lO，只不過交叉識別比特異性識別弱一些。此外，RI-10和KI-10特異性CTLs反應(yīng)均比在作為陽性對照的GL-9要強一些。實施例6、多肽-HLA-A2m復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)研究RI-10-HLA-A2-e2M復(fù)合體和KI-10-HLA-A2-P2M復(fù)合體的制備方法同實施例4。晶體結(jié)構(gòu)研究可以了解RI-10/KI-10被HLA-AW201分子提呈機制的微觀細(xì)節(jié)。晶體在16%PEG6000，25mMMES，pH6.5的條件下生長。X-射線衍射數(shù)據(jù)經(jīng)用HLA-A2復(fù)合體結(jié)構(gòu)(PDB:1JF1)為搜索模板,經(jīng)過分子置換法得到解析，RI-10-HLA-A2-32m和KI-10-HLA-A2-e2m的分辨率分別為2.3A和2.2A。經(jīng)過結(jié)構(gòu)精化，RI-10-HLA-A2-P2m復(fù)合物晶體的R"和Rf^分別達到20.2%和24.7%，而RI-10-HLA-A2-P2m復(fù)合物晶體的R"和Rf^分別達到19.2%和23.7%。兩個晶體結(jié)構(gòu)的空間群均為P1，每個不對稱單元中含有4個分子。晶體結(jié)構(gòu)包括HLA-A2重鏈的l-275位殘基，P2M的1-99位殘基，和RI-10/KI-10多肽。整體結(jié)構(gòu)與以前報道的多肽-HLA-A2復(fù)合物非常相似(Madden,D.R.，Garboczi,D.N.，Wiley，D.C.(1993)Theantigenicidentityofpeptide-MHCcomplexes:acomparisonoftheconformationsoffiveviralpeptidespresentedbyHLA—A2.75:柳-柳入RI-10/KI-10多肽主鏈的構(gòu)象符合典型的HLA-I類分子限制性多肽的特征其第2位和第10位殘基是錨定殘基，其側(cè)鏈向下插入HLA-A2的結(jié)合口袋。中間部分的殘基側(cè)鏈多向上指，是T細(xì)胞受體(TCR)識別的位點。在兩個結(jié)構(gòu)中，RI-10/KI-10多肽的N-端3個殘基和C-端2個殘基電子云密度很清晰，但兩個多肽的中間部分，即第4到第8個殘基，電子密度明顯比多肽兩端稀薄(圖7A，7B)，這顯示了這一部分具有柔性或靈活性。將兩個結(jié)構(gòu)疊加起來可以看出，兩個多肽的N-端3個殘基和C-端2個殘基重疊的很好，而中間部分主鏈和側(cè)鏈都表現(xiàn)出較明顯差異(見圖7C)。兩個多肽中間部分構(gòu)想的差異可能就是柔性的反映,也是兩個多肽誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)相互交叉而又有一定差別的原因。序列表〈110>中國科學(xué)院微生物研究所〈120>禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應(yīng)用<130〉CGGNARY92292<160>4<210>1<211>10<212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>1ArgLeuTyrGinAsnProThrThrTyrlie1510〈210>2<211>10〈212>PRT<213>人工序列〈220><223>〈400〉2LysLeuTyrGinAsnProThrThrTyrlie1510〈210〉3<211>30〈212〉靈〈213〉人工序列<220>〈223〉<400〉3aggctctatcaaaacccaaccacctatatt30<210>4<211〉30<212〉DNA〈213〉人工序列<220><223>〈400〉4aagctctatcaaaacccaaccacctatatt301權(quán)利要求1、一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽，為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與禽流感H5N1病毒的CTL表位相關(guān)的由序列1衍生的多肽。2、如權(quán)利要求l所述的多肽，其特征在于所述多肽如序列表的序列2所示。3、編碼權(quán)利要求1或2所述多肽的DNA分子。4、如權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為如下1)或2)或3):1)其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有9(m以上同源性，且編碼相同功能多肽的DNA分子。5、如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子如序列表的序列4所示。6、含有權(quán)利要求3或4或5所述DNA分子的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。7、如下物質(zhì)中的至少一種在制備禽流感病毒疫苗中的應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述的多肽，權(quán)利要求2或4或5所述的DNA分子，權(quán)利要求6所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。8、一種禽流感病毒疫苗，它的活性成份為如下物質(zhì)中的至少一種權(quán)利要求l或2所述的多肽，權(quán)利要求2或4或5所述的DNA分子，權(quán)利要求6所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。9、如下物質(zhì)中的至少一種在制備禽流感病毒特異性T細(xì)胞檢測試劑盒中的應(yīng)用-權(quán)利要求1或2所述的多肽，權(quán)利要求2或4或5所述的DNA分子，權(quán)利要求6所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。10、一種禽流感病毒特異性T細(xì)胞檢測試劑盒，它含有如下物質(zhì)中的至少一種權(quán)利要求1或2所述的多肽，權(quán)利要求2或4或5所述的DNA分子，權(quán)利要求6所述的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。全文摘要本發(fā)明公開了一種禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽，為如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與禽流感H5N1病毒的CTL表位相關(guān)的由序列1衍生的多肽。本發(fā)明還保護編碼所述多肽的DNA。本發(fā)明所述的表位多肽可用于制備針對禽流感H5N1病毒的疫苗，也可用于制備檢測H5N1病毒特異性T細(xì)胞的試劑盒。本發(fā)明具有重大價值。文檔編號A61K48/00GK101565455SQ200910085529公開日2009年10月28日申請日期2009年5月25日優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日發(fā)明者孫業(yè)平,福高申請人:中國科學(xué)院微生物研究所