專利名稱：一種抗豬流感轉(zhuǎn)移因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥領(lǐng)域，具體地說，是涉及一種抗豬流感轉(zhuǎn)移因子的制備工藝。
背景技術(shù)：
豬流感病毒(Swine influenza virus, SIV) 一年四季可感染不同日齡、性別和品 種的豬，引起豬流感。豬流感是一種急性、熱性、高度接觸性的呼吸道傳染病。其臨床上以突 發(fā)、高熱、流淚、咳嗽、呼吸困難衰竭和死亡為特征。雖然SIV引起的死亡率很低，病豬也可 迅速康復(fù)，但會(huì)導(dǎo)致豬只增重受阻，肉料比降低，生產(chǎn)性能下降，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成極大的危害。1918年美國首次報(bào)道了本病的發(fā)生，1930年Shope從患病豬中分離到該病毒。迄 今為止，歐、美、亞、非、澳等世界各大洲均有本病的發(fā)生和流行。SI能引起豬的高發(fā)病率 (幾乎100% )和低病死率(病死率< )。此病的發(fā)生可使患病豬生產(chǎn)性能下降，推遲上 市；還可引起呼吸道細(xì)菌和病毒繼發(fā)或混合感染，使疫情更為嚴(yán)重，造成豬只死亡。豬流感 除了經(jīng)典的Hmi和H3N2亞型外，其它亞型的病毒在北美豬群中也有流行和爆發(fā)，并且H4N6 和Hmi的禽流感病毒突破了種間障礙，傳染給了豬；而豬流感感染人并導(dǎo)致人死亡的報(bào)道 也時(shí)有發(fā)生。豬在禽-豬-人的流感種間傳播過程中，起著中間宿主及多重宿主的作用。豬 是人源、禽源和豬源流感病毒的惟一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人或鳥類。通過 監(jiān)測SI的動(dòng)態(tài)變化可以預(yù)測人流感的發(fā)展趨勢(shì)。因此，研究SI具有更加深遠(yuǎn)的公共衛(wèi)生 學(xué)意義。由于本病的流行和危害日益嚴(yán)重，因此對(duì)SIV的研究已成為國內(nèi)外獸醫(yī)界、醫(yī)學(xué)界 和微生物學(xué)界的熱點(diǎn)之一。盡管目前已經(jīng)有一些抗豬流感的藥品或制劑，但是由于現(xiàn)有藥品制劑的針對(duì)性不 強(qiáng)，療效有限，而且，治療性制劑多是在發(fā)病后才應(yīng)用的，不能起預(yù)防作用。首先對(duì)于豬流感 的易感豬群，每年定期對(duì)豬接種疫苗也是控制豬流感的有效措施，美國和歐洲都有Hmi亞 型和H3N2亞型的商品疫苗；其次應(yīng)增強(qiáng)營養(yǎng)或藥物干預(yù)，提高自身免疫力；再者通過藥物 提高機(jī)體抵抗力或調(diào)節(jié)免疫力也是一種預(yù)防豬流感的有效方法，轉(zhuǎn)移因子可起到此作用。轉(zhuǎn)移因子(TF，Transfer Factor)是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的 低分子量多肽-核苷酸復(fù)合物，它能將供體的某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體 正常的淋巴細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，提高受體機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，抵抗真菌、病毒等 非細(xì)菌性感染；同時(shí)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的抗體分泌作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞釋放干擾素和白介素， 從而增強(qiáng)受體的免疫功能。目前已報(bào)道的轉(zhuǎn)移因子的提取方法有關(guān)于非特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法也有關(guān) 于特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。例如，中國發(fā)明專利申請(qǐng)“制備轉(zhuǎn)移因子的工藝方法-全 濾法”(專利申請(qǐng)?zhí)?200310118439. 6)則公開了采用壓濾、超濾、納濾幾種方法連續(xù)過濾的 制備工藝。另一份中國發(fā)明專利申請(qǐng)“制備轉(zhuǎn)移因子的工藝方法-加熱法”(專利申請(qǐng)?zhí)?200410039444. 2)是由同一申請(qǐng)人在前一份申請(qǐng)的基礎(chǔ)上加上加熱處理的步驟，仍然是連 續(xù)采用多種過濾法的制備工藝。關(guān)于特異性轉(zhuǎn)移因子的專利如“一種抗雞新城疫病毒轉(zhuǎn)移 因子的制備方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?200810053541. 5)則公開了用雞新城疫病毒免疫豬，用組織搗碎機(jī)、凍融、離心、超濾法的制備工藝。還有一份專利“抗流感病毒轉(zhuǎn)移因子的制備”(專 利申請(qǐng)?zhí)?00610035059. X)則公開了用流感疫苗免疫豬，組織搗碎機(jī)搗碎、低溫凍融、離 心、中空纖維管超過濾的制備工藝。上述專利申請(qǐng)的內(nèi)容是對(duì)破碎后的組織經(jīng)冷凍離心后 直接進(jìn)行過濾提取，組織搗碎機(jī)存在細(xì)胞破碎不完全的缺陷，有些工藝繁瑣，時(shí)間較長，對(duì) 產(chǎn)物的活性損失也較大，因此得率很難提高。因此，為了在最大限度保持活性、提高得率的基礎(chǔ)上提取轉(zhuǎn)移因子，同時(shí)為了適用 于工業(yè)化生產(chǎn)的需求，需要一種簡單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、高效的轉(zhuǎn)移因子的提取方法。因此，我們 采用高壓均質(zhì)機(jī)快速破碎細(xì)胞，能更有效的保持轉(zhuǎn)移因子活性在破碎期間不降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種天然高效 純生物活性物質(zhì)抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。本發(fā)明抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行(1)制備病毒抗原將豬流感病毒接種于MDBK細(xì)胞，加入的胰蛋白酶，37°C培 養(yǎng)24 72h。消化細(xì)胞，-20°C反復(fù)凍融3次，超聲波破壁，IOOOOrpm離心5min，棄去沉淀 收集上清液，甲醛滅活4°C，過濾除菌，分裝，-70°C保存。(2)純化病毒抗原新鮮收獲的病毒液5000rpm離心30min后，上清經(jīng)40000rpm 離心2h，病毒沉淀用TEN懸??；病毒懸液再經(jīng)蔗糖密度梯度(20%，30%，40%，50%， 60%)20000rpm離心2h，收集各區(qū)帶；然后加入適量的TEN，經(jīng)20000rpm離心lh，沉淀用TEN 溶解，即得到純化的病毒。(3)病毒抗原免疫豬挑選健康免疫豬，將上述無菌收獲的病毒液做1 10稀釋， 氣管接種，l.OmL/頭。逐日觀察豬只的食欲、精神等癥狀，并每日測其體溫2次。采集攻毒 后4d、7d和14d試驗(yàn)豬的血清，以血凝法或ELISA法檢測上述病毒的特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn) 病毒特異性免疫效價(jià)后，宰殺豬，取脾臟于-20°C保存，備用。(4)從免疫豬中提取抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子①先用注射用水洗凈用豬流感病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面的筋膜、脂肪 和大的血管等組織，再用生理鹽水沖洗；②將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1 2倍體積4°C預(yù)冷的IOMmol PBS緩沖液，用高壓 勻質(zhì)機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，同時(shí)加入殼聚糖溶液作為絮凝劑，混勻后制成勻漿；③置-20°C冷凍和室溫融化，反復(fù)凍融8次；④將步驟③中得到的勻漿液用HCl調(diào)pH5. 0 6. 0，然后在4°C，以6000rpm離心 20min,收集上清液，反復(fù)3次后，將上清置于透析袋中并將透析袋放入盛有無菌生理鹽水 的容器內(nèi)，置于0-4°C透析72h ；⑤用4% NaHCO3調(diào)整透析液pH值至中性，并加入0. 3%的氯仿作防腐劑；⑥將透析液用0. 2 μ m中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的 中空纖維柱超濾，收集濾出液；⑦在濾出液中加入濃度為1. 5%的硬脂酸鋅的2ml穩(wěn)定劑后，通過0. 22μπι微孔濾 膜除菌過濾，然后加入5ml甘油的耐熱保護(hù)劑，4°C保存，直接分裝，即得到轉(zhuǎn)移因子溶液。本發(fā)明所述的抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子的制備工藝，具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)原材料來源容易，無污染，價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)。豬脾臟和胸腺屬于屠宰后豬的下腳料， 以前多是丟棄的廢物。(2)本工藝采用先攻毒后提取的方法，攻毒豬后在抗體水平最高期宰殺，取脾臟、 胸腺等，最終得到特異性抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子。(3)在提取轉(zhuǎn)移因子過程中用低溫凍融處理，不使小分子物質(zhì)活性喪失，并能夠使 豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子得以充分的提取。(4)離心前調(diào)pH，使大部分蛋白絮凝，使得離心后的上清液的澄清度明顯好于以 前不調(diào)PH的方法；而且有利后續(xù)的微濾、超濾等操作。(5)在勻漿液中加入殼聚糖也起到蛋白絮凝的作用，簡化后面的離心處理。(6)本發(fā)明既可基于前期的常規(guī)病毒抗原免疫步驟，又可優(yōu)選本發(fā)明的免疫步驟， 具有靈活高效的優(yōu)點(diǎn)。(7)轉(zhuǎn)移因子提取物經(jīng)體外生物活性試驗(yàn)及藥理、毒性試驗(yàn)等證明，具有純度高、 免疫活性起效快而維持時(shí)間長、易吸收、無不良反應(yīng)等特點(diǎn)。本產(chǎn)品是一種不含蛋白質(zhì)、只 含可溶性的小分子物質(zhì)，分子量在6000道爾頓以下。該提取物可做成各種劑型，口服劑型、 糖漿劑型等，還可通過常規(guī)凍干工藝進(jìn)一步可得到抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子的粉末，結(jié)合常 規(guī)輔料，可制成膠囊、片劑等劑型。本發(fā)明的抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子可以全面或部分抑制豬流感病毒，能保護(hù)正常機(jī) 體細(xì)胞免受病毒感染。因此使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防豬流感病毒感染、能夠保 護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受豬流感病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時(shí)對(duì)于遭到豬流感病毒 感染的豬使用轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行治療，可有效的改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子的制備(1)制備病毒抗原將豬流感病毒接種于MDBK細(xì)胞，加入的胰蛋白酶，37°C培 養(yǎng)24 72h。消化細(xì)胞，-20°C反復(fù)凍融3次，超聲波破壁，IOOOOrpm離心5min，棄去沉淀 收集上清液，甲醛滅活4°C，過濾除菌，分裝，_70°C保存。(2)純化病毒抗原新鮮收獲的冰毒液5000rpm離心30min后，上清經(jīng)40000rpm 離心2h，病毒沉淀用TEN懸?。徊《緫乙涸俳?jīng)蔗糖密度梯度(20%，30%，40%，50%， 60%)20000rpm離心2h，收集各區(qū)帶；然后加入適量的TEN，經(jīng)20000rpm離心lh，沉淀用TEN 溶解，即得到純化的病毒。(3)病毒抗原免疫豬挑選健康免疫豬，將上述無菌收獲的病毒液做1 10倍稀 釋，以氣管接種的途徑接種，l.OmL/頭。逐日觀察豬只的食欲、精神等癥狀，并每日測其體 溫2次。采集攻毒后4d、7d和14d試驗(yàn)豬的血清，以血凝法或ELISA法檢測上述病毒的特 異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價(jià)后，宰殺豬，取脾臟于-20°C保存，備用。(4)從免疫豬中提取抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子①先用注射用水洗凈用豬流感病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面的筋膜、脂肪 和大的血管等組織，再用生理鹽水沖洗；②將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1 2倍體積4°C預(yù)冷的IOMmol PBS緩沖液，用高壓 勻制機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，同時(shí)加入殼聚糖溶液作為絮凝劑，混勻后制成勻漿；
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③置-20°C冷凍和室溫融化，反復(fù)凍融8次；④將步驟③中得到的勻漿液用HCl調(diào)pH5. 0 6. 0，然后在4°C，以6000rpm離心 20min,收集上清液，反復(fù)3次后，將上清置于透析袋中并將透析袋放入盛有無菌生理鹽水 的容器內(nèi)，置于0-4°C透析72h ；⑤用4% NaHCO3調(diào)整透析液pH值至中性，并加入0. 3%的氯仿作防腐劑；⑥將透析液用0. 2 μ m中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的 中空纖維柱超濾，收集濾出液；⑦在濾出液中加入濃度為1. 5%的硬脂酸鋅的2ml穩(wěn)定劑后，通過0. 22μπι微孔濾 膜除菌過濾，然后加入5ml甘油的耐熱保護(hù)劑，4°C保存，直接分裝，即得到轉(zhuǎn)移因子溶液。實(shí)施例2 對(duì)本發(fā)明所述工藝制備的抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子的檢測對(duì)實(shí)施例1所示工藝制備的抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行以下檢測(1)紫外線分光光度測定上述所得樣品在252士2nm處有一吸收峰，且ABS260/ ABS280 > 2. 0.(2)標(biāo)準(zhǔn)液為淡黃色，pH值在6. 0 6. 5之間。(3) 20%磺基水楊酸檢測上述所得樣品無渾濁及沉淀現(xiàn)象，說明蛋白反應(yīng)均為陰 性，其不含大分子蛋白質(zhì)。(4)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)上述所得樣品中無需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。(5)核酸含量測定上述所得樣品經(jīng)地衣酚法測定核酸含量為589. 52 μ g/mL。(6)多肽含量測定上述所得樣品經(jīng)Lowry法測定多肽含量為3. 12mg/mL。(7)轉(zhuǎn)移因子活性檢測根據(jù)轉(zhuǎn)移因子可使脫E受體后的胸腺T細(xì)胞恢復(fù)其受體 功能，從而反應(yīng)轉(zhuǎn)移因子的生物活性。上述所得樣品形成E玫瑰花結(jié)的百分率為30. 5%，比 對(duì)照組增加21. 2% (P ^ 0. 01)。(8)取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品濃縮液，相當(dāng)于正?？诜┝康?0 倍，觀察小白鼠的生存能力的變化，結(jié)果無任何過敏、毒性反應(yīng)，也無任何死亡出現(xiàn)，說明 本品是安全的，無毒性和副作用。(9)用PPD做家兔皮試實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本品具有轉(zhuǎn)移免疫活性的功能。(10)用豬流感病毒抗原做皮試檢測，有微弱的陽性反應(yīng)，說明本品具有良好的轉(zhuǎn) 移活性和特異性。本發(fā)明可以做成各種劑型，口服劑型、糖漿劑型等，還可通過常規(guī)凍干工藝進(jìn)一步 可得到抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子的粉末，結(jié)合常規(guī)輔料，可制成膠囊、片劑等劑型。
權(quán)利要求
一種抗豬流感病毒的轉(zhuǎn)移因子，其制備方法包括(1)先用注射用水洗凈用豬流感病毒抗原免疫過的豬脾臟，去其表面的筋膜、脂肪和大的血管等組織，再用生理鹽水沖洗；(2)將洗凈的豬脾臟剪碎，加入1～2倍體積4℃預(yù)冷的10Mmol PBS緩沖液，用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，同時(shí)加入1％殼聚糖溶液作為絮凝劑，混勻后制成勻漿；(3)置 20℃冷凍和室溫融化，反復(fù)凍融8次；(4)將步驟(3)中得到的勻漿液用HCl調(diào)pH5.0～6.0，4℃6000rpm離心20min，收集上清液，反復(fù)3次后，將上清置于透析袋中并將透析袋放入盛有無菌生理鹽水的容器內(nèi)，置于0 4℃透析72h；(5)用4％NaHCO3調(diào)整透析液pH值至中性，并加入0.3％的氯仿作防腐劑；(6)將透析液用0.2μm中空纖維柱微濾，濾出液再用截留分子量為6000道爾頓的中空纖維柱超濾，收集濾出液；(7)在濾出液中加入濃度為1.5％的硬脂酸鋅2ml穩(wěn)定劑后，通過0.22μm微孔濾膜除菌過濾，然后加入5ml甘油的耐熱保護(hù)劑，4℃保存，直接分裝，即得到轉(zhuǎn)移因子溶液。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)移因子，其中在實(shí)施上述步驟之前，還包括制備病毒抗原、提取病毒 抗原、病毒抗原免疫豬等步驟。
3.權(quán)利要求2所述的制備病毒抗原步驟，包括將豬流感病毒接種于MDBK細(xì)胞，加入 1 %的胰蛋白酶，37°C培養(yǎng)24 72h。消化細(xì)胞，_20°C反復(fù)凍融3次，超聲波破壁，IOOOOrpm 離心5min，棄去沉淀，收集上清液，甲醛滅活4°C，過濾除菌，分裝，-70°C保存。
4.權(quán)利要求2所述的提取病毒抗原步驟，包括新鮮收獲的病毒液5000rpm離心30min 后，上清經(jīng)40000rpm離心2h，病毒沉淀用TEN懸?。徊《緫乙涸俳?jīng)蔗糖密度梯度(20%， 30%，40%，50%，60% )20000rpm離心2h，收集各區(qū)帶；然后加入適量的TEN，經(jīng)20000rpm 離心lh，沉淀用TEN溶解，即得到純化的病毒。
5.權(quán)利要求2所述的病毒抗原免疫豬步驟，包括挑選健康免疫豬，將上述無菌收獲的 病毒液做1 10稀釋，氣管接種，LOmL/頭。逐日觀察豬的食欲、精神等癥狀，并每日測其 體溫2次。采集攻毒后4d、7d和14d試驗(yàn)豬的血清，以血凝法或ELISA法檢測上述病毒的 特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價(jià)后，宰殺豬，取脾臟于-20°C保存，備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗豬流感病毒的轉(zhuǎn)移因子的制備工藝。使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防豬流感、保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受豬流感病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時(shí)對(duì)于遭受到豬流感病毒感染的豬使用該轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行治療，可以有效改善臨床癥狀，提高治愈率、降低死亡率。其制備工藝包括制備病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫豬、從免疫豬的脾臟中提取抗豬流感病毒轉(zhuǎn)移因子等步驟。
文檔編號(hào)A61P31/16GK101904870SQ200910069139
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者王小娥 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司