專利名稱：適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法。
背景技術：
與傳統(tǒng)的給藥形式相比，生物粘附制劑具有作用部位廣泛、作用迅速、生物利用度高、 給藥方便，可隨時終止用藥及具有緩釋作用等特點。羧甲基殼聚糖分子中的氨基、羥基可與 粘液中的糖蛋白形成氫鍵而產生粘附作用，能延長藥物在體內特定區(qū)域的滯留時間，持續(xù)釋 放藥物，可打開粘膜細胞的緊密連接通道，并且對細胞膜無損傷。巰基化聚合物基于巰基與 二硫鍵的交換反應，二硫鍵在聚合物和半胱氨酸含量豐富的粘液蛋白之間形成，并生成粘液 凝膠層。羧甲基殼聚糖巰基化后可模仿自然機制中的糖蛋白分泌黏液(一種生物系統(tǒng)中最常 見的結構)，粘附性能可大幅度的提高。微凝膠的尺寸比較小，可滲透到粘膜凝膠層來延長 它們在粘膜上的停留時間。但目前常見的離子交聯(lián)微凝膠穩(wěn)定性不高。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，該 方法工藝簡單，該方法制備的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠具有良好的生物粘附性，對人體無副 作用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠 的制備方法，其特征在于它包括如下步驟-
1) 按羧甲基殼聚糖與L-半胱氨酸鹽酸鹽的質量比為1: l 1: 2，選取羧甲基殼聚糖 (不同分子參數的)和L-半胱氨酸鹽酸鹽，備用；將羧甲基殼聚糖在25 3(TC下溶于蒸餾
水中配成質量濃度為0. 02 0. 03g/mL的羧甲基殼聚糖水溶液；羧甲基殼聚糖水溶液用濃度 為lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH為2. 5 5. 0，得羧甲基殼聚糖混合溶液；將L-半胱氨酸鹽酸鹽 溶于蒸餾水中配成質量濃度為0. 1 0. 2g/mL的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液；
將L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液滴加到羧甲基殼聚糖混合溶液中，攪拌，恒溫震蕩3h，靜 置12 24h，于濃度為1 5mmol/L鹽酸溶液中透析48 96h，用無水乙醇洗滌，得到白色的 固體；白色的固體在50 8(TC下真空干燥，得到巰基化羧甲基殼聚糖，備用；
2) 按羧甲基殼聚糖:液體石蠟乳化劑Span80的配比4g: 150 mL 7. 0 mL ，選取液體 石蠟和乳化劑，將液體石蠟中加入乳化劑，攪拌20 40分鐘，使充分混合均勻，得液體石 蠟混合物，備用；
3) 將巰基化羧甲基殼聚糖溶于蒸餾水中配成質量濃度為0. 02 0. 03g/ml的巰基化羧 甲基殼聚糖水溶液，用lmol/L的HC1溶液調節(jié)pH值為5. 0 6. 5，得巰基化羧甲基殼聚糖混 合溶液；用帶7S針頭的針管將巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液緩慢滴加至液體石蠟混合物中， 高速攪拌反應20 40min，使乳化體系穩(wěn)定，得乳化體系；
34) 按羧甲基殼聚糖交聯(lián)劑的配比二lg: 5 mL,選取交聯(lián)劑，交聯(lián)劑是質量濃度為0. 05 2mg/ mL的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亞胺(EDC)鹽酸鹽溶液(EDC鹽酸鹽溶于蒸餾 水中成為EDC鹽酸鹽溶液)；再向乳化體系中緩慢加入交聯(lián)劑，高速攪拌2 3h (所述高速攪 拌是指轉速為800 1500轉/分鐘)，得到白色的乳液；
5) 將得到的乳液離心分離，得到白色產物；
6) 按羧甲基殼聚糖石油醚無水乙醇的配比^g: 150: 50 mL，選取石油醚和無水乙 醇；白色產物分別用石油醚和無水乙醇分別洗滌2 3次，得淡黃色粉末狀固體；淡黃色粉 末狀固體在25 4(TC下真空干燥，得到巰基羧甲基殼聚糖微凝膠。
步驟1)所述的羧甲基殼聚糖水溶液中加入濃度為5mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲胺基 丙基)-碳二亞胺(EDC)鹽酸鹽溶液，按羧甲基殼聚糖濃度為5匪ol/L的1-乙基-3-(3-二甲 胺基丙基)-碳二亞胺(EDC)鹽酸鹽溶液的配比4g: 5mL，選取5mmol/L的1-乙基-3_(3_二 甲胺基丙基)-碳二亞胺(EDC)鹽酸鹽溶液。
步驟l)所述的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液加入濃度為5mmol/L的N-羥基琥珀酰亞胺， 按羧甲基殼聚糖濃度為5mmol/L的N-羥基琥珀酰亞胺的配比4g: 5mL，選取濃度為 5mmol/L的N-羥基琥珀酰亞胺。
本發(fā)明的有益效果是
1、 釆用EDC鹽酸鹽作為催化劑催化自交聯(lián)反應，避免了傳統(tǒng)交聯(lián)劑如戊二醛等對人體 的副作用；本發(fā)明安全無毒(對人體無副作用)，而且用量微小，經濟快捷。
2、 從操作過程可知本發(fā)明提供的制備方法工藝安全、簡單有效、符合環(huán)保要求。
3、 羧甲基殼聚糖巰基化后可模仿自然機制中的糖蛋白分泌黏液——一種生物系統(tǒng)中最 常見的結構，粘附性能可大幅度的提高(具有良好的生物粘附性)。巰基化羧甲基殼聚糖經 EDC共價微凝膠不容易瓦解(穩(wěn)定性高)而又具有優(yōu)良的黏附性和滲透性。
4、 本發(fā)明適用于粘膜給藥系統(tǒng)。
具體實施例方式
下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，但本發(fā)明的內容不僅僅局限于下面的實施例。
實施例l:
適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，它包括如下步驟
1) 稱取脫乙酰度為42. 61%、羧甲基取代度為0. 154的羧甲基殼聚糖lg， 28。C下溶于40mL 蒸餾水中，得羧甲基殼聚糖水溶液(質量濃度為0.025g/ mL)，用lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH 為5，得羧甲基殼聚糖混合溶液；再稱取L-半胱氨酸鹽酸鹽lg，溶于10mL蒸餾水中，得L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液(質量濃度為0. lg/mL);將L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液滴加到羧甲基 殼聚糖混合溶液中，持續(xù)攪拌，恒溫震蕩3h，靜置過夜(12h)，于lmmol/L鹽酸溶液中透析， 用無水乙醇洗滌，得到白色的固體；白色的固體5(TC下真空干燥，得到巰基含量為 120.32Mmol/g的巰基化羧甲基殼聚糖(置磨口棕色瓶中于冰箱中4'C備用)；
2) 取液體石蠟150mL，加入7. OmL乳化劑Span80 (乳化劑司盤80)，攪拌20分鐘，使充分混合均勻，得液體石蠟混合物，備用；
3) 將巰基化羧甲基殼聚糖溶于蒸餾水中配成質量濃度為0. 03g/mL的巰基化羧甲基殼聚 糖水溶液，用濃度為lmol/L的HC1溶液調節(jié)pH值為5. 5，得巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液； 用帶7tt針頭的針管將此巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液緩慢滴加至液體石蠟混合物中，高速攪 拌反應20min，使乳化體系穩(wěn)定，得乳化體系；
4) 再向乳化體系中用帶7ft針頭的針管緩慢加入5mL質量濃度為0.05 mg/mL的 EDC. HC1 [即EDC鹽酸鹽]溶液作為交聯(lián)劑(EDC鹽酸鹽溶于蒸餾水中成為EDC鹽酸鹽溶液)， 高速攪拌2h，得到白色的乳液；
5) 將得到的乳液離心分離，得到白色產物；
6) 白色產物用石油醚150mL洗滌3次，用無水乙醇50mL洗滌2次，得淡黃色粉末狀固 體(4'C冷藏保存)；黃色粉末狀固體25"C下真空干燥，得到巰基羧甲基殼聚糖微凝膠。
所得巰基羧甲基殼聚糖微凝膠在體外模擬胃液環(huán)境(pH值為l.O)中，對豬胃粘蛋白的 粘附率達到68%;明顯高于pH1.0條件下，脫乙酰度為42.61%，羧甲基取代度為0. 154的羧 甲基殼聚糖對豬胃粘蛋白的粘附率(48%)。在模擬結腸環(huán)境(pH值為7.4)中對豬胃粘蛋 白的粘附率達到54%;明顯高于pH7.4條件下，脫乙酰度為42.61%，羧甲基取代度為0. 154 的羧甲基殼聚糖對豬胃粘蛋白的粘附率(32%)。在pH7.4條件下24h內對BSA (牛血清白蛋 白)的釋放達到61%。
實施例2:
適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，它包括如下步驟
1) 稱取脫乙酰度為77. 61%、羧甲基取代度為0. 154的羧甲基殼聚糖lg， 28'C下溶于40mL 蒸餾水中，用濃度為lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH為5，加入濃度為5咖ol/L的EDC. HC1溶液5mL， 得羧甲基殼聚糖混合溶液；再稱取L-半胱氨酸鹽酸鹽lg，溶于10mL蒸餾水中，然后滴加到 羧甲基殼聚糖混合溶液中，持續(xù)攪拌，恒溫震蕩3h，靜置過夜(12h)，于濃度為lmmol/L 鹽酸溶液中透析，用無水乙醇洗滌，得到白色的固體；白色的固體在5(TC下真空干燥，得到 巰基含量為340. 47Wnol/g的巰基化羧甲基殼聚糖；
2) 取液體石蠟150mL，加入7.0mL乳化劑Span80，攪拌20分鐘，使充分混合均勻，得 液體石蠟混合物，備用；
3) 將巰基化羧甲基殼聚糖溶于蒸餾水中配成質量濃度為0.025g/mL的巰基化羧甲基殼 聚糖水溶液，用濃度為lmol/L的HC1溶液調節(jié)pH值為6. 0，得巰基化羧甲基殼聚糖混合溶 液；用帶7ft針頭的針管將此巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液緩慢滴加至液體石蠟混合物中，高 速攪拌反應20rain，使乳化體系穩(wěn)定，得乳化體系；
4) 再向乳化體系中用帶7號針頭的針管緩慢加入5mL質量濃度為0. 05 mg/mL的EDC. HC1 溶液作為交聯(lián)劑，高速攪拌2h，得到白色的乳液；
5) 將得到的乳液離心分離，得到白色產物；
6) 白色產物用石油醚150mL洗滌3次，用無水乙醇50mL洗滌2次，得淡黃色粉末狀固 體；淡黃色粉末狀固體在25'C下真空干燥，得到巰基羧甲基殼聚糖微凝膠。所得巰基羧甲基殼聚糖微凝膠在體外模擬胃液環(huán)境(pH值為l.O)中，對豬胃粘蛋白的 粘附率達到85%;明顯高于pH1.0條件下，脫乙酰度為77.61°/。，羧甲基取代度為O. 154的羧 甲基殼聚糖對豬胃粘蛋白的粘附率(48%)。在模擬結腸環(huán)境(pH值為7.4)中對豬胃粘蛋 白的粘附率達到64%;明顯高于pH7.4條件下，脫乙酰度為77.61%，羧甲基取代度為0. 154 的羧甲基殼聚糖對豬胃粘蛋白的粘附率(32%)。在pH7.4條件下24h內對BSA的釋放達到 72%。
實施例3:
巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，它包括如下步驟
1) 稱取脫乙酰度為77. 61%，羧甲基取代度為0. 101的羧甲基殼聚糖lg， 28。C下溶于40mL 蒸餾水中，用濃度為lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH在4. 5，加入濃度為5mmol/L的EDC. HC1溶液 5mL，得羧甲基殼聚糖混合溶液；再稱取L-半胱氨酸鹽酸鹽2g，溶于lOmL蒸餾水中，加入 濃度為5mmol/L的N-羥基琥珀酰亞胺5mL，得L-半胱氨酸鹽酸鹽混合溶液；將L-半胱氨酸 鹽酸鹽混合溶液滴加到羧甲基殼聚糖混合溶液中，持續(xù)攪拌，恒溫震蕩3h，靜置過夜，于濃 度為lramol/L鹽酸溶液中透析，用無水乙醇洗滌，得到白色的固體；白色的固體在5(TC下真 空干燥，得到巰基含量為680. 12Mmol/g的巰基化羧甲基殼聚糖；
2) 取液體石蠟150mL，加入7.0mL乳化劑Span80，攪拌20分鐘，使充分混合均勻，得 液體石蠟混合物，備用；
3) 將巰基化羧甲基殼聚糖溶于蒸餾水中配成質量濃度為0. 03g/mL的巰基化羧甲基殼聚 糖水溶液，用濃度為lmol/L的HC1溶液調節(jié)pH值為6. 0，得巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液； 用帶7ft針頭的針管將巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液緩慢滴加至液體石蠟混合物中，高速攪拌 反應20min，使乳化體系穩(wěn)定，得乳化體系；
4) 再向乳化體系中用帶7號針頭的針管緩慢加入5mL質量濃度為0. 05 mg/mL的EDC. HC1 溶液作為交聯(lián)劑，高速攪拌2h，得到白色的乳液；
5) 將得到的乳液離心分離，得到白色產物；
6) 白色產物分別用石油醚150mL洗滌3次，用無水乙醇50mL別洗滌2次，得淡黃色粉 末狀固體；淡黃色粉末狀固體在25"C下真空干燥，得到巰基羧甲基殼聚糖微凝膠。
所得巰基羧甲基殼聚糖微凝膠在體外模擬胃液環(huán)境(pH值為l.O)中，對豬胃粘蛋白的 粘附率達到128. 34%;明顯高于pH1.0條件下，脫乙酰度為77.61%，羧甲基取代度為0. 101 的羧甲基殼聚糖對豬胃粘蛋白的粘附率(48%)。在模擬結腸環(huán)境(pH值為7.4)中對豬胃 粘蛋白的粘附率達到77%;明顯高于pH7. 4條件下，脫乙酰度為77. 61%，羧甲基取代度為0. 101 的羧甲基殼聚糖對豬胃粘蛋白的粘附率(32%)。在pH7.4條件下24h內對BSA的釋放達到 82% 。
實施例4:
適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，它包括如下步驟 1)按羧甲基殼聚糖與L-半胱氨酸鹽酸鹽的質量比為1: 1.5 (如羧甲基殼聚糖lg， L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5g)，選取羧甲基殼聚糖和L-半胱氨酸鹽酸鹽，備用；將羧甲基殼聚糖在
63(TC下溶于蒸餾水中配成質量濃度為0. 03g/mL的羧甲基殼聚糖水溶液；羧甲基殼聚糖水溶 液用濃度為lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH為2.5，得羧甲基殼聚糖混合溶液；將L-半胱氨酸鹽酸 鹽溶于蒸餾水中配成質量濃度為0. 2g/mL的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液；
將L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液滴加到羧甲基殼聚糖混合溶液中，攪拌，恒溫震蕩3h，靜 置24h，于濃度為5mraol/L鹽酸溶液中透析96h，用無水乙醇洗滌，得到白色的固體；白色 的固體在8(TC下真空干燥，得到巰基化羧甲基殼聚糖，備用(置磨口棕色瓶中于冰箱中4'C 備用)；
2) 按羧甲基殼聚糖:液體石蠟乳化劑Span80的配比4g: 150 mL 7 mL ，選取液體石 蠟和乳化劑，將液體石蠟中加入乳化劑，攪拌40分鐘，使充分混合均勻，得液體石蠟混合 物，備用；
3) 將巰基化羧甲基殼聚糖溶于蒸餾水中配成質量濃度為0. 03g/ml的巰基化羧甲基殼聚 糖水溶液，用lmol/L的HCl溶液調節(jié)pH值為6.5，得巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液；用帶 7tt針頭的針管將巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液緩慢滴加至液體石蠟混合物中，高速攪拌反應 40min，使乳化體系穩(wěn)定，得乳化體系；
4) 按羧甲基殼聚糖交聯(lián)劑的配比^g: 5mL，選取交聯(lián)劑，交聯(lián)劑是質量濃度為2mg/mL 的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亞胺(EDC)鹽酸鹽溶液(EDC鹽酸鹽溶于蒸餾水中成為 EDC鹽酸鹽溶液)；再向乳化體系中緩慢加入交聯(lián)劑，高速攪拌3h (所述高速攪拌是指轉速 為800 1500轉/分鐘)，得到白色的乳液；
5) 將得到的乳液離心分離，得到白色產物；
6) 按羧甲基殼聚糖石油醚無水乙醇的配比^lg: 150: 50 mL，選取石油醚和無水乙 醇；白色產物分別用石油醚和無水乙醇分別洗滌2次，得淡黃色粉末狀固體(4。C冷藏保存)； 淡黃色粉末狀固體在4(TC下真空干燥，得到巰基羧甲基殼聚糖微凝膠。
不同分子參數的羧甲基殼聚糖都能實現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明所列舉的各原料都能實現(xiàn)本發(fā) 明，以及各原料的上下限取值、區(qū)間值都能實現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明的工藝參數(如溫度、時間、 pH值等)的上下限取值以及區(qū)間值都能實現(xiàn)本發(fā)明，在此不一一列舉實施例。
權利要求
1.適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)按羧甲基殼聚糖與L-半胱氨酸鹽酸鹽的質量比為1∶1～1∶2，選取羧甲基殼聚糖和L-半胱氨酸鹽酸鹽，備用；將羧甲基殼聚糖在25～30℃下溶于蒸餾水中配成質量濃度為0.02～0.03g/mL的羧甲基殼聚糖水溶液；羧甲基殼聚糖水溶液用濃度為1mol/L鹽酸溶液調節(jié)pH為2.5～5.0，得羧甲基殼聚糖混合溶液；將L-半胱氨酸鹽酸鹽溶于蒸餾水中配成質量濃度為0.1～0.2g/mL的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液；將L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液滴加到羧甲基殼聚糖混合溶液中，攪拌，恒溫震蕩3h，靜置12～24h，于濃度為1～5mmol/L鹽酸溶液中透析48～96h，用無水乙醇洗滌，得到白色的固體；白色的固體在50～80℃下真空干燥，得到巰基化羧甲基殼聚糖，備用；2)按羧甲基殼聚糖∶液體石蠟∶乳化劑Span80的配比＝1g∶150mL 7.0mL，選取液體石蠟和乳化劑，將液體石蠟中加入乳化劑，攪拌20～40分鐘，使充分混合均勻，得液體石蠟混合物，備用；3)將巰基化羧甲基殼聚糖溶于蒸餾水中配成質量濃度為0.02～0.03g/ml的巰基化羧甲基殼聚糖水溶液，用1mol/L的HCl溶液調節(jié)pH值為5.0～6.5，得巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液；用帶7#針頭的針管將巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液緩慢滴加至液體石蠟混合物中，高速攪拌反應20～40min，使乳化體系穩(wěn)定，得乳化體系；4)按羧甲基殼聚糖∶交聯(lián)劑的配比＝1g∶5mL，選取交聯(lián)劑，交聯(lián)劑是質量濃度為0.05～2mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽溶液；再向乳化體系中緩慢加入交聯(lián)劑，高速攪拌2～3h，得到白色的乳液；5)將得到的乳液離心分離，得到白色產物；6)按羧甲基殼聚糖∶石油醚∶無水乙醇的配比＝1g∶150∶50mL，選取石油醚和無水乙醇；白色產物分別用石油醚和無水乙醇分別洗滌2～3次，得淡黃色粉末狀固體；淡黃色粉末狀固體在25～40℃下真空干燥，得到巰基羧甲基殼聚糖微凝膠。
2. 根據權利要求1所述的適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，其 特征在于步驟l)所述的羧甲基殼聚糖水溶液中加入濃度為5mmol/L的l-乙基-3-(3-二 甲胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽溶液，按羧甲基殼聚糖濃度為5mmol/L的1-乙基-3-(3-二 甲胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽溶液的配比^g: 5mL，選取5mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲胺 基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽溶液。
3. 根據權利要求1所述的適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，其 特征在于步驟1)所述的L-半胱氨酸鹽酸鹽水溶液加入濃度為5mmol/L的N-羥基琥珀 酰亞胺，按羧甲基殼聚糖:濃度為5腿ol/L的N-羥基琥珀酰亞胺的配比4g: 5mL，選取 濃度為5mmol/L的N-羥基琥珀酰亞胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法。適用于粘膜給藥的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)按羧甲基殼聚糖與L-半胱氨酸鹽酸鹽的質量比為1∶1～1∶2，選取羧甲基殼聚糖和L-半胱氨酸鹽酸鹽，分別配制成水溶液；混合，得到巰基化羧甲基殼聚糖，備用；2)制液體石蠟混合物；3)將巰基化羧甲基殼聚糖配成巰基化羧甲基殼聚糖混合溶液；用帶7#針頭的針管將此溶液緩慢滴加至液體石蠟混合物中，得乳化體系；4)再向乳化體系中緩慢加入交聯(lián)劑，得到白色的乳液；5)將得到的乳液離心分離，得到白色產物；6)白色產物洗滌、干燥，得到巰基羧甲基殼聚糖微凝膠。該方法工藝簡單，該方法制備的巰基羧甲基殼聚糖微凝膠具有良好的生物粘附性，對人體無副作用。
文檔編號A61K47/36GK101554367SQ200910062160
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月19日 優(yōu)先權日2009年5月19日
發(fā)明者徐詠梅 申請人:武漢理工大學