專利名稱：保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥組合物領(lǐng)域，特別是涉及一種保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合 物、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中醫(yī)中藥為中華民族的繁衍昌盛作出了巨大的貢獻(xiàn)。近年來，中藥作為“綠色’"天 然”藥物越來越受到國際醫(yī)藥學(xué)界的重視。隨著國際交流的頻繁，中藥在海外保健品市場 及治療領(lǐng)域逐漸占有一席之地。然而“綠色” “天然”并非是“安全”的，隨著中藥的廣泛應(yīng) 用，某些中藥的毒副作用也日益受到關(guān)注。前幾年受到廣泛關(guān)注的龍膽瀉肝湯中的關(guān)木通被檢測出對人體腎臟有損傷，繼而 青木香、馬兜鈴等藥也被檢查出對人體有副作用，引起人們對中藥用藥的重視。據(jù)報道對肝 臟有損傷的中藥除了雷公藤、千里光、川楝子、黃藥子之外，還有一些中藥也被認(rèn)為有肝毒 性，譬如生首烏、桅子、蒼耳子、蒼術(shù)、薄荷、艾葉、石榴皮、貫眾等，但是這些毒性多是從臨床 醫(yī)生的印象中得來，缺少可靠的臨床資料和毒理實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。在上述中藥中，有些屬常用 中藥，臨床應(yīng)用廣泛，甚至還是治療肝病的常用藥。例如，桅子從古至今在臨床上運(yùn)用廣泛 并具有卓越療效，在醫(yī)圣-張仲景所著的《傷寒論》中，相當(dāng)多的方劑中都有桅子的配伍使 用，尤以在《傷寒論·太陽病中篇》的應(yīng)用最為廣泛。由于桅子清熱解毒功效顯著，有較好 的降低轉(zhuǎn)氨酶活性和膽紅素的作用，現(xiàn)代肝病醫(yī)生在臨診治療急慢性肝炎時常喜將其作為 要藥應(yīng)用。因近年來有不少文獻(xiàn)報道，桅子具有肝毒性，大劑量使用，會造成肝臟損害。由此 給臨床醫(yī)生帶來困惑，遣方用藥不敢使用桅子，從而影響臨床療效。然而，有關(guān)桅子肝毒性 的實(shí)驗(yàn)研究的桅子用量超出臨床常用量的數(shù)十倍，與臨床應(yīng)用劑量相去甚遠(yuǎn)。常用量的桅 子是否會損傷肝臟，目前尚無研究報道。能否通過中藥配伍，既發(fā)揮桅子的臨床療效，又避 免其損傷肝臟的毒副作用，現(xiàn)有的文獻(xiàn)也缺乏報道。因此，需通過動物實(shí)驗(yàn)，來觀察臨床常 用劑量的桅子對正常小鼠和急性肝損傷小鼠的肝毒性，并以健脾保肝中藥相配伍，觀察用 桅子治療急性肝損傷模型小鼠的同時，藥物的肝毒性是否能夠避免。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物、其制 備方法及應(yīng)用。通過“知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”的中醫(yī)治法理論指導(dǎo)，按照《金匱要略》中肝病 補(bǔ)用酸，助用焦苦，益以甘味之藥調(diào)之的原理，選用黃芪、白術(shù)、茯苓、甘草、五味子等5味藥 食兩用的中藥組成復(fù)方，取名健脾保肝方。經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)肝臟病理學(xué)研究證實(shí)，該方本身沒有 肝毒性，且有一定的預(yù)防CCl4所致的小鼠急性肝損傷的作用。該方既能減輕桅子對正常小 鼠的肝損害，又能協(xié)助常規(guī)劑量的桅子預(yù)防治療CCl4所致的小鼠急性肝損傷，因此，本發(fā)明 具有安全、有效、價廉等特點(diǎn)，適合化學(xué)性和藥物性肝損傷患者服用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物，包括以下重量份的原料藥制成炙黃芪20份 30份、白術(shù)10份 15份、茯苓10份 15份、甘草 10份 15份、五味子10份 15份。優(yōu)選的中藥組合物重量份的原料藥為炙黃芪20份、白術(shù)10份、茯苓10份、甘草 10份、五味子15份，該中藥組合物稱為“健脾保肝方”。另外，本發(fā)明的中藥組合物還可與桅子組合，即本發(fā)明的中藥組合物還可以由以 下重量份的原料藥制成炙黃芪20份 30份、白術(shù)10份 15份、茯苓10份 15份、甘草 10份 15份、五味子10份 15份、桅子9份 18份。 優(yōu)選的中藥組合物重量份的原料藥為炙黃芪20份、白術(shù)10份、茯苓10份、甘草 10份、五味子15份，桅子18份。本發(fā)明的保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物的制備方法，包括將所述重量份的原料藥加水煎煮，濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 55 0. 75g · πιΓ1。本發(fā)明的中藥組合物可用于治療的主要適應(yīng)癥是預(yù)防肝損傷，因此，該組合物可 用于制備預(yù)防肝損傷藥物。本發(fā)明的中藥組合物可以采用中藥制劑的常規(guī)方法制備成不同劑型的內(nèi)服制劑 (如顆粒劑、片劑、膠囊劑或口服液)，其用量和療程可根據(jù)劑型、患者的年齡、疾病的輕重 程度作適當(dāng)調(diào)整，一般為每日劑量相當(dāng)于該方生藥60g，可分3次口服，以1個月為一個療 程，可連續(xù)使用6個療程或更長時間。本發(fā)明應(yīng)用中醫(yī)基礎(chǔ)理論結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及科學(xué)技術(shù)手段，并依據(jù)《金匱要略》云
“夫肝之病，補(bǔ)用酸，助用焦苦，益用甘味之藥以調(diào)之......”，肝為剛臟，五行屬木，以疏為
用。肝之為病，易克土傳變侮脾?；凇拔床》纻鳎巡》雷儭钡挠^念，治肝病當(dāng)先實(shí)脾，安 其未受邪之脾臟，使肝木不侵犯脾土。脾為后天之本，健脾也可以養(yǎng)木。本發(fā)明選用黃芪、白術(shù)、茯苓、甘草、五味子等5味中藥組成復(fù)方，取名健脾保肝 方。黃芪性味甘溫，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，具有補(bǔ)氣升陽、健脾益氣、解毒、護(hù)肝 作用，在健脾保肝方中為君藥。黃芪的主要成分為甙類、多糖及微量元素，臨床及現(xiàn)代藥理 方面，并具有保肝，利尿、抗衰老、降壓、強(qiáng)心、擴(kuò)張冠狀血管、及全身末梢血管、抗菌、增強(qiáng)機(jī) 體免疫力等作用；炙用偏于走里，能補(bǔ)中益氣、補(bǔ)氣生血。在動物實(shí)驗(yàn)方面，黃芪可提高小鼠 的血清IgG(免疫球蛋白G)含量及體液免疫的作用，并對正常機(jī)體的抗體生成功能有明顯 促進(jìn)作用。在臨床應(yīng)用方面，以黃芪為主的復(fù)方，可使脾虛患者的IgG水平升高、慢性肝炎 患者IgG由治療前水平下降上升到正常范圍，并使免疫球蛋白含量升高。以黃芪口服液治 療慢性肝炎可以有改善臨床癥狀及降低血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALP)并有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的 功能；另一方面，可以使慢性乙型病毒性肝炎NK細(xì)胞活性及LTR(淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率)的下降 和SIL22R(可溶性白細(xì)胞介素22受體)的升高，隨病情加重而明顯；黃芪對慢性乙型病毒 性肝炎輕度患者，有提高NK細(xì)胞活性、LTR和降低SIL22R的作用。提示黃芪能增強(qiáng)NK細(xì) 胞清除乙肝病毒的能力。白術(shù)性味甘苦微溫，具有補(bǔ)脾、益胃、燥濕、和中的功效，并具有保肝作用，在健脾 保肝方中為臣藥。臨床上用以治療脾胃氣弱、泄瀉、汗出、胎動不安等。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)， 白術(shù)含揮發(fā)油、維生素等成分，其揮發(fā)油中含蒼術(shù)醇、蒼術(shù)酮，能增加胃腸的分泌和蠕動，有 利腸胃的消化，因而能保護(hù)肝臟，促進(jìn)血液循環(huán)和降低血糖；并能能調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)，常食能補(bǔ)益人體，增強(qiáng)正氣。白術(shù)尚且明顯提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。在動物實(shí)驗(yàn)方 面，白術(shù)多糖PAM作用于體內(nèi)及體外對小鼠脾淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示白術(shù)多糖PAM 在一定濃度范國內(nèi)能單獨(dú)激活或協(xié)同ConA (刀豆素A) /PHA (植物血球凝集素)促進(jìn)正常小 鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化并能明顯提高IL_2(白介素-2)分泌的水平。PAM對氫化可的松造成的免 疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞的增殖功能有恢復(fù)作用。同時還發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖PAM對淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié) 與腎上腺素受體激動劑異丙腎上腺素相關(guān)。在機(jī)體防御方面，白術(shù)含有大量T淋巴細(xì) 胞、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。因免疫功能低下而產(chǎn)生致敏淋巴細(xì)胞和抗體，白術(shù)能清除衰老 細(xì)胞和微生物等物質(zhì)。白術(shù)揮發(fā)油能增強(qiáng)小鼠DNCB(2，4-二硝基氯苯)所致遲發(fā)型超敏反 應(yīng)，顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞EA花環(huán)率并可提高巨噬細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免 疫功能，抑制癌細(xì)胞的生長。茯苓自古作為食品當(dāng)藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其收載，列為“上品”。性味甘淡平，入 心、脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)脾健胃、滲濕利水、保肝作用，并且有激素樣作用和降酶作用，在健脾保 肝方中為佐藥。茯苓藥性平緩，補(bǔ)而不峻，利而不猛，既能扶正，又能祛邪，為較佳的補(bǔ)虛防 病要藥?，F(xiàn)代藥理方面，茯苓聚糖可增強(qiáng)人體免疫功能；茯苓多糖具有抗寒和抗疲勞作用。 在大鼠試驗(yàn)證明，茯苓能提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，有防癌抑癌作用，并且有抗菌、降血糖 和降低胃酸、預(yù)防胃潰瘍等作用。茯苓素在小鼠體內(nèi)外能增強(qiáng)經(jīng)BCG(卡介苗)預(yù)先激活巨 噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF(腫瘤壞死因子)能力，且有顯著的劑量依賴性關(guān)系其在小鼠體內(nèi)對移植 性腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制性作用，其抑制作用與TNF的水平呈正相關(guān)。甘草也被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品。其性味甘平，具有補(bǔ)中益氣、清熱解毒、止咳潤 肺。本品藥性平和通行十二經(jīng)脈，調(diào)和諸藥，故又名國老，在健脾保肝方中為使藥。現(xiàn)代藥理 研究發(fā)現(xiàn)，甘草及甘草甜素對CCI4及化學(xué)致癌劑甲基-氨偶氮苯所致的肝損傷和肝癌有明 顯的保護(hù)作用。甘草酸具有抑制肝臟損傷的作用，其對慢性肝炎的降酶效果已被確認(rèn)，甘草 酸的降解酶作用在給藥后即可出現(xiàn)，于8hr后轉(zhuǎn)氨酶達(dá)到最低值；推測其作用機(jī)制是對肝 細(xì)胞膜的直接保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究證明，甘草酸保護(hù)肝細(xì)胞膜的機(jī)制是通過抑制磷脂 酶的活性發(fā)揮抗炎作用實(shí)現(xiàn)的。對肝炎病毒的作用，研究證實(shí)，甘草酸具有抑制肝臟損傷的 作用。臨床運(yùn)用方面，甘草酸二胺經(jīng)隨機(jī)配對治療研究顯示，其降低慢性病毒性肝炎病人的 ALT (谷丙轉(zhuǎn)氨酶)效果顯著，靜脈給藥Iw之內(nèi)即可見效，經(jīng)2m治療，85 %以上的病人ALT 可恢復(fù)正常，明顯優(yōu)于單胺制劑，用藥后血清SB(間接膽紅素)也同步恢復(fù)正常，且在療程 后期可明顯降低Y球蛋白。經(jīng)肝活檢對照實(shí)驗(yàn)研究表明，用藥后慢性乙型、慢性丙型肝炎 患者均有80%左右的病人肝組織學(xué)得到改善，主要是炎癥細(xì)胞浸潤減少、肝細(xì)胞變性、壞死 減少。五味子在《神農(nóng)本草經(jīng)》也名忝上品，為著名的滋補(bǔ)性中藥。因其果實(shí)甘、酸、辛、 苦、咸五味俱全，故名五味子。具有斂肺滋陰、生津澀精、益氣強(qiáng)陰、養(yǎng)五臟、降酶作用，為健 脾保肝方中的引經(jīng)藥?，F(xiàn)代藥理提示，五味子對動物和人的神經(jīng)系統(tǒng)功能有調(diào)節(jié)作用，可促 進(jìn)蛋白質(zhì)和肝糖原的生成，并對化學(xué)毒物的肝損害起保護(hù)作用，其制劑能促進(jìn)肝糖原異生， 并能促進(jìn)肝糖原分解，使腦、肝、肌肉中果糖和葡萄糖的磷酸化過程加強(qiáng)。在動物實(shí)驗(yàn)方面， 小鼠口服五味子乙醇提取物，每日1次，連續(xù)3d后，由腹腔注射苯丙氨酸，發(fā)現(xiàn)其滲入肝臟 蛋白質(zhì)速率顯著增加，表明蛋白質(zhì)合成增加。大鼠注射CCl4后產(chǎn)生肝小葉壞死，嗜堿質(zhì)、線 粒體DNA、糖原、酸性磷酸酶、ATP酶、5-核苷酸酶、琥珀酸脫氫酶的活性均降低，經(jīng)五味子制
5劑治療后，肝小葉壞死區(qū)縮小，嗜堿性、線粒體和糖原增多，各種組織化學(xué)酶活性增高，顯示五味子乙醇提取液對大鼠由014引起的高SGPT(ALT，谷丙轉(zhuǎn)氨酶)有明顯的降低作用。預(yù) 先給家兔五味子乙醇提取液，可預(yù)防CCl4引起的小鼠SGPT升高。五味子多糖對荷瘤小鼠 的免疫器官有較好的保護(hù)作用，并能抑制腫瘤的生長，具有預(yù)防和治療癌癥的潛在價值，其 在抑瘤作用的同時，還對脾臟、胸腺有刺激增生作用，由此提高其機(jī)體的免疫功能。在臨床 運(yùn)用方面，患慢性肝病時，尤其是肝硬化時常有不同程度的腸道菌群失調(diào)，失調(diào)程度往往與 肝功能損害程度有關(guān)。中藥五味子能有效地調(diào)整腸道菌群，預(yù)防慢性肝損傷，對肝臟起保護(hù) 作用，是一理想的微生態(tài)調(diào)節(jié)劑和肝臟保護(hù)劑。在提高藥物療效方面，古代醫(yī)家認(rèn)為只有將 五味子打碎后使用，才能取得五味子內(nèi)含的五種滋味，而五種滋味是保證五味子能夠充分 發(fā)揮療效的根本。明代陳嘉謨在其《本草蒙筌》中曰“五味子，宜預(yù)搗碎(則五味俱)方投 煎。，，清代楊士泰在其《本草述鉤元》中對此論述更詳，認(rèn)為“五味子皮肉甘酸，核中辛苦，五 味皆具，味全者真。入藥必打碎核，方五味備...”。由此可見，使用五味子時必須打碎其核 (種子)，才能夠確保五味子的療效。李時珍在其《本草綱目》中云“五味子，酸咸入肺而補(bǔ) 腎，辛苦入心而補(bǔ)肺，甘入中宮而益脾胃”。不難看出，五味子的療效是通過所含的五種滋味 相互結(jié)合協(xié)同作用而體現(xiàn)出來的，五味皆有其用，缺少其一即可能使五味子的療效受到影 響。若不將其打碎則難以煎出其味，故必須搗碎入煎。綜觀健脾保肝方，含有四君子湯方之意，體現(xiàn)肝病容易傳變，因此先安未受邪之脾 臟，使脾不受木邪來乘。健脾保肝全方具有補(bǔ)氣升陽、益氣健脾、保肝降酶等作用。該方單 獨(dú)用于正常小鼠，都未顯示其有升高轉(zhuǎn)氨酶的活性和膽紅素含量作用，該組小鼠肝臟結(jié)構(gòu) 正常，肝細(xì)胞形態(tài)無明顯異常。該方與高劑量桅子水提液同用，有效地防止了高劑量桅子造 成的肝細(xì)胞變性，降低了桅子導(dǎo)致的轉(zhuǎn)氨酶活性和膽紅素含量的升高，顯示健脾保肝方作 為桅子減毒配伍方劑的價值。本發(fā)明的中藥組合物經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有減輕肝損傷的作用，具有如下優(yōu)點(diǎn)1)健脾保肝方性味酸、苦、甘具備，合于《金匱要略》肝病補(bǔ)用酸，助用焦苦，益以甘 味之藥調(diào)之的原理；2)通過培土濡養(yǎng)后天之本以保肝，體現(xiàn)了中醫(yī)“知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”和“治病必 求于本”的治則，先安未受邪之地的“治未病”思想；3)健脾保肝方既能減輕桅子對正常小鼠的肝損害，又能協(xié)助桅子預(yù)防治療014所 致的小鼠急性肝損傷；4)健脾保肝方的組方中藥均為藥食兩用之品，甚至桅子也被列入“既是食品又是 藥品的物品名單”，可以按常規(guī)劑量放心使用。


下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明圖1是實(shí)施例7中的各組小鼠肝臟的病理改變圖(HE染色，X400)，其中，Ι-a為 正常組，Ι-b高劑量組，1-c高劑健脾組，Ι-d健脾保肝組；圖2是實(shí)施例7中的連續(xù)造模6w各組生化指標(biāo)的變化圖，其中，2-a中，與同期正 常組比較，** =P < 0.01，與同期高劑量桅子水提液模型組比較，# :P < 0. 05 ；2-b中，與同 期正常組比較，* =P < 0. 05 ；2-c中，與同期正常組比較，* =P < 0. 05 ；2-d中，與同期正常組比較，** :P < 0. 01，* :P < 0. 05 ；圖3是實(shí)施例8中的各組小鼠肝臟的病理改變及健脾保肝方對CCl4肝損傷的預(yù) 防結(jié)果圖(HE染色，X200)，3-a為正常組，3-b為模型組，3-c為中劑量組，3-d為健脾保肝 組，3-e為桅子保肝組；圖4是實(shí)施例8中的各組生化指標(biāo)的變化圖，其中，4-a中，與正常組比較，** :P < 0. 01，與模型組比較，#:P<0. 05, ## :P<0. 01 ；4-b中，與正常組比較，** :P < 0. 01，與 模型組比較，# =P < 0. 05, ## =P < 0. 01 ；4-c 中，與正常組比較，* =P < 0. 05，** =P < 0.01,
與模型組比較，沒有差異性；4-d中，與正常組及同期模型組比較，沒有差異性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1稱取原料藥炙黃芪20g、白術(shù)10g、茯苓10g、甘草10g、五味子10g，加水煎煮2次， 可濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 55g · Hir10實(shí)施例2稱取原料藥炙黃芪25g、白術(shù)12. 5g、茯苓12. 5g、甘草12. 5g、五味子12. 5g，加水 煎煮2次，可濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 65g · HiF10實(shí)施例3稱取原料藥炙黃芪30g、白術(shù)15g、茯苓15g、甘草15g、五味子15g，加水煎煮2次， 可濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 75g · Hir10實(shí)施例4稱取原料藥炙黃芪20g、白術(shù)10g、茯苓10g、甘草10g、五味子10g、桅子9g，加水 煎煮2次，可濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 55g · HiF10實(shí)施例5稱取原料藥炙黃芪25g、白術(shù)12. 5g、茯苓12. 5g、甘草12. 5g、五味子12. 5g、桅子 13. 5g，加水煎煮2次，可濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 65g · HiF10實(shí)施例6稱取原料藥炙黃芪30g、白術(shù)15g、茯苓15g、甘草15g、五味子15g、桅子18g，加水 煎煮2次，可濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 75g · HiF10實(shí)施例7對桅子肝毒性的預(yù)防作用1.材料1. 1實(shí)驗(yàn)動物c57bl雄性小鼠60只，體重20 士 2g，SPF級，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供， 動物合格證號SCKK (滬)2007-0009。1. 2實(shí)驗(yàn)藥物的制備高劑量桅子水提液取桅子200g，加入適量清水，煎煮2次，將2次煎煮的藥液濃 縮成高濃度水提液，濃度0. 298g · mr1.0. 65g -πιΓ1健脾保肝方制法取甘草42g，白術(shù)42g，茯苓42g，炙黃芪84g，五味子 63g，加適量水煎煮2次，濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 65g · πιΓ1.高劑量桅子合健脾保肝方取炙黃芪60g、白術(shù)30g、茯苓30g、甘草30g、五味子
745g，桅子108g，加適量水煎煮2次，濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 606g · πιΓ1。中藥提取液的制備由上海中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心協(xié)助完成。1. 3主要儀器和設(shè)備自動脫水機(jī)(ASP300)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2035)、包埋機(jī)(EGl 160)、浸蠟機(jī)(HI 1210)、烤片機(jī)(HI 1220)均為德國Leica公司。低溫冰箱(_70°C )，F(xiàn)orma scientific產(chǎn)品。層 析柜，Revco公司。臺式離心機(jī)(microfuge lite)，Beckman公司產(chǎn)品。AA-200分析天平， Densere儀器公司產(chǎn)品。Olympus BX40光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司。煮藥設(shè)備由?？?技實(shí)驗(yàn)中心提供。2.方法2. 1動物實(shí)驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為正常組、高劑量桅子水提液組(以下簡稱高劑量組)、高劑量桅子 合健脾保肝方組(以下簡稱高劑健脾組)、健脾保肝方組(簡稱健脾保肝組)，每組均為15 只。正常組小鼠灌胃飲用水，其余各組小鼠每天灌胃相應(yīng)藥物，灌胃量為0. 2ml ·10Ρ，連續(xù) 6w(M )，6w后處死各組小鼠。每只小鼠予2% (2g/100ml)戊巴比妥鈉按照0. 02ml · lOg-1 腹腔注射麻醉，眼球取血。將血液滴入1. 5ml EP管，室溫靜置2hr，以3000rpm，15min離 心。取血清，置于-70°C冰箱備用。將小鼠脊椎脫白處死，打開腹腔，取肝臟右葉，切取 0.6X0. 6X0. 2mm3組織2塊，分別放入10% (體積百分?jǐn)?shù))甲醛固定液內(nèi)。剩余肝臟組織 放入1. 5ml EP管，置于_70°C冰箱備用。2. 2觀察指標(biāo)2. 2. 1肝臟組織病理學(xué)觀察將已固定的肝臟組織標(biāo)本分別脫水、浸蠟、包埋、切片厚4μ m，作HE染色(蘇木 精_伊紅染色)，光鏡下觀察肝臟病理變化。 2. 2.2血清生化學(xué)指標(biāo)檢測ALT (谷丙轉(zhuǎn)氨酶)活性采用賴氏法；AST (谷草轉(zhuǎn)氨酶)活性采用賴氏法；Alb (白 蛋白)含量采用溴甲酚綠法；TBiL(總膽紅素)含量采用苯甲酸鈉-咖啡因比色法，由曙光 醫(yī)院檢驗(yàn)科自動生化分析儀檢測。2. 3 統(tǒng)計利用SPSS12. 0軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD程序進(jìn)行兩兩 比較。3.結(jié)果3. 1各組小鼠肝臟顯微觀察正常組小鼠和健脾保肝方組小鼠的肝臟肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝板呈放射狀排列，肝 細(xì)胞形態(tài)正常。以高劑量桅子水提液造模6w后，模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞普遍 腫脹變性，多為嚴(yán)重的水樣變甚至氣球樣變，少數(shù)樣本以脂肪變?yōu)橹鳎瑐€別樣本肝細(xì)胞變性 較輕，肝竇狹窄，枯否氏組細(xì)胞增生，淋巴細(xì)胞浸潤。同時用健脾保肝方干預(yù)的高劑量桅子 合健脾保肝方組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)破壞較輕，15個樣本中有8個肝小葉結(jié)構(gòu)正常，其余小 鼠肝細(xì)胞變性較輕，多為胞漿疏松的水樣變，僅1例以脂肪變?yōu)橹鳎芾鄹渭?xì)胞在半數(shù)以 下，多位于I帶，肝竇狹窄少見多為擴(kuò)張(見圖1)。3. 2各組小鼠生化指標(biāo)的變化
高劑量組小鼠的ALT和AST活性以及TBiL含量均明顯比正常組升高，2組相比有 顯著性差異(P < 0. 01，P < 0. 05)。健脾保肝組這些指標(biāo)的變化不大，與正常組無明顯差 異。高劑健脾組這些指標(biāo)升高的幅度比高劑量組低，與正常組相比，無顯著性差異(見表 1)。表16w各組小鼠ALT和AST活性、和TBiL和Alb含量的變化(mean士S) 注與正常組比較，*:P < 0. 05，** =P < 0. 01 ；與模型組比較，#:P<0. 05。由表1和圖2可知，以高劑量桅子水提液連續(xù)灌胃小鼠6w后，高劑量組有明顯的 肝損傷，損傷以水樣變?yōu)橹?，少?shù)樣本以脂肪變?yōu)橹?，肝竇狹窄。高劑健脾組肝組織結(jié)構(gòu)破 壞較輕，15個樣本中有8個肝小葉結(jié)構(gòu)正常，其余小鼠肝細(xì)胞變性較輕，多為胞漿疏松的水 樣變，提示健脾保肝方可預(yù)防高劑量桅子水提液造成的肝傷害。健脾保肝方連續(xù)灌胃小鼠 6w后，小鼠肝臟病理與正常組無異，說明健脾保肝不會加重肝臟的負(fù)擔(dān)，可以放心使用。實(shí)施例8對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的預(yù)防作用1.材料1. 1實(shí)驗(yàn)動物健康SPF級c57bl雄性小鼠48只，體重20士2g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 提供。動物合格證號SCKK (滬)2007-0011。1. 2實(shí)驗(yàn)藥物四氯化碳溶液(Carbon tetrachloride, CCl4)，分析純，分子量153. 82，上海國藥 集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號T20070323。橄欖油(Oliveoil)，化學(xué)純，上海國藥集團(tuán)化學(xué) 試劑有限公司，批號F20070307。1. 2. 1中劑量桅子水提液及自擬方健脾保肝方的制備中劑量桅子水提液取250ml高劑量桅子水提液(參見實(shí)施例7)，加等量蒸餾水 稀釋，制備成中濃度桅子水提液0. 149g · Hir10健脾保肝方取甘草42g，白術(shù)42g，茯苓42g，炙黃芪84g，五味子63g，加適量水煎 煮2次，濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 65g · HiF101. 2. 2桅子合健脾保肝方的制備取炙黃芪20g、白術(shù)10g、茯苓10g、甘草10g、五味子15g，桅子18g，加適量水煎煮 2次，濃縮至濃度0. 55g · ml—1。中藥提取由上海中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心協(xié)助完成。1. 3主要儀器和設(shè)備
自動脫水機(jī)(ASP300)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2035)、包埋機(jī)(EGl 160)、浸蠟機(jī)(HI 1210)、 烤片機(jī)(HI 1220)均為德國Leica公司。低溫冰箱(_70°C )，F(xiàn)orma scientific產(chǎn)品。層 析柜，Revco公司。臺式離心機(jī)(microfuge lite)，Beckman公司產(chǎn)品。AA-200分析天平， Densere儀器公司產(chǎn)品。Olympus BX40光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司。煮藥設(shè)備由?？?技實(shí)驗(yàn)中心提供。2.方法2. ICCl4模型的建立將小鼠隨機(jī)分為正常組，CCl4組(以下簡稱模型組)、中劑量桅子水提液組( 以下 簡稱中劑量組)、健脾保肝組、桅子合健脾保肝方組(以下簡稱桅子保肝組)。除正常組為 8只小鼠外，其余每組均為10只。正常組小鼠灌胃飲用水，其余小鼠均以相應(yīng)藥物灌胃，灌 胃量均為0. 2ml · lOg—1，連續(xù)5d。第6d，除正常組小鼠，其余各組小鼠給予0. 5% (體積百 分?jǐn)?shù))CCl4/橄欖油溶液，0. Iml · log—1腹腔注射，腹腔注射后，所有小鼠禁食17hr，但仍給 予飲用水。17hr后，按照0.02ml · lOg—1劑量，小鼠予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，眼球 取血。將血液滴入1. 5ml EP管，室溫靜置2hr，將裝有血液的EP管，以3000rpm，15min離 心。抽取血清，置于-70°C冰箱備用。將小鼠脊椎脫臼處死，打開腹腔，取肝臟右葉，切取 0.6X0.6X0. 2mm3組織2塊，分別放入10%甲醛固定液內(nèi)。余肝臟組織放入1. 5ml EP管， 置于-70°C冰箱備用。2. 2觀察指標(biāo)2. 2. 1肝臟組織病理學(xué)觀察將已固定的肝臟組織標(biāo)本分別脫水、浸蠟、包埋、切片厚4 μ m，HE染色，光鏡下觀 察肝臟病理變化，自擬肝細(xì)胞變性分級標(biāo)準(zhǔn)(見表2)。表2肝細(xì)胞變性分級標(biāo)準(zhǔn)
^m\urn ^
m.無變性肝細(xì)胞
I級變性肝細(xì)胞占視野1/4以下II級變性肝細(xì)胞占視野1/4 1/2
III級變性肝細(xì)胞占視野1/2 3/4
IV級變性肝細(xì)胞占視野3/4以上2. 2. 2生化檢測ALT活性采用賴氏法；AST活性采用賴氏法；Alb含量采用溴甲酚綠法；TBiL含量 采用苯甲酸鈉_咖啡因比色法，由曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科自動生化分析儀檢測。2. 3 統(tǒng)計利用SPSS12. 0軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD程序進(jìn)行兩兩 比較。半定量分析采用Ridit方法統(tǒng)計。3.結(jié)果3. 1桅子水提液和健脾保肝方對急性肝損傷小鼠的治療作用的病理觀察3. 1. 1各組小鼠大體觀察
注射CCl4前各組小鼠外觀和活動度均無明顯不同。第5d腹腔注射CCl4后，除正 常組外，各組小鼠的活動力降低。第6d模型組的小鼠活動力明顯低于其他各組。3. 1. 2各組小鼠肝臟肉眼觀察正常組小鼠肝臟肉眼觀察色澤鮮紅、質(zhì)軟、邊緣銳利，模型組小鼠肝臟邊緣稍鈍， 肝臟稍有腫脹。其余各組肝臟大體變化不明顯。3. 1. 3各組小鼠肝臟顯微觀察結(jié)果如圖3所示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝板呈放射狀排列，肝細(xì)胞形態(tài)正 常。模型組肝板排列紊亂，肝細(xì)胞普遍變性，水樣變和以小泡性為主的脂肪變均明顯，部分 肝細(xì)胞氣球樣變，變性肝細(xì)胞多位于肝腺泡I帶和III帶，嚴(yán)重者II帶肝細(xì)胞也有變性。有散 在的點(diǎn)狀或灶狀壞死及炎細(xì)胞浸潤。中劑量組肝細(xì)胞損傷情況較模型組輕，為在I帶的小 泡性脂肪變或II帶的水樣變，氣球樣變和細(xì)胞壞死少見，肝竇狹窄。健脾保肝組肝損情況 是肝細(xì)胞脂肪變者多在I帶，在II帶內(nèi)觀察到的氣球樣變肝細(xì)胞很少。桅子保肝組肝細(xì)胞 的脂肪變性及肝細(xì)胞的氣球樣變性很少，肝細(xì)胞壞死情況未見，為4組中病理改變最輕者。3. 1. 4各組小鼠肝細(xì)胞變性半定量分析表3顯示正常組小鼠肝細(xì)胞沒有變性。模型組小鼠肝細(xì)胞變性嚴(yán)重，多為IV級，與 正常組比較差異顯著(P <0.001)。中劑量的桅子水提液和健脾保肝方可以減輕CCl4造成 的肝細(xì)胞變性，這2組的肝細(xì)胞變形程度較模型組低，但是統(tǒng)計學(xué)差異不明顯。桅子保肝組 的肝細(xì)胞變性明顯較模型組輕(P < 0.01)，肝細(xì)胞I、II級變性的例數(shù)占多數(shù)，沒有IV級變 性的樣本。表3各組肝細(xì)胞變性程度
肝細(xì)胞變性程度
組別Π _
0IIIIIIW正常組880000模型組***1000127中劑量組1000343健脾保肝組1000235梔子保肝組##1003340注與正常組比較，***:Ρ< 0.001;與模型組比較，##:Ρ<0. 01。3. 2桅子水提液和健脾保肝方對急性肝損傷小鼠的治療作用和肝毒性的生化指標(biāo) 的觀察由表4和圖4所示，CCl4注射后，模型組小鼠ALT和AST活性及TBiL含量顯著升 高，與正常組相比有顯著性差異(均P<0.01)。中劑量組的ALT和AST活性也升高，但比 模型組低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P < 0. 05, P < 0. 01)，TBiL含量升高與模型組相似。健脾保肝組 ALT活性和TBiL含量升高明顯，與正常組有顯著性差異(均P < 0. 01)，AST活性的升高幅
11度則較模型組明顯低(P < 0. 05)桅子保肝組小鼠ALT和AST活性及TBiL含量也升高，但 比模型組明顯低，其中轉(zhuǎn)氨酶活性與模型組相比有顯著性差異(均P<0.01)。Alb含量在 4組間無明顯差異。表4各組小鼠ALT和AST活性、和TBiL和Alb含量的變化(mean士S) 注與正常組比較，*:P < 0. 05，** =P < 0. 01 ；與模型組比較# :P < 0. 05，## =P < 0. 01CCl4 一次注射后造成小鼠急性肝損傷，ALT和AST活性以及TBiL含量明顯升高， 肝細(xì)胞變性嚴(yán)重，模型組與正常組相比差異顯著(均P <0.01)。中劑量的桅子水提液能有 效地抑制CCl4導(dǎo)致的轉(zhuǎn)氨酶活性升高，中劑量組ALT和AST活性均較模型組組明顯低下(P < 0. 05，P < 0. 01)，病理觀察也顯示該組肝細(xì)胞變性輕于模型組，但統(tǒng)計學(xué)差異不明顯，顯 示桅子預(yù)防小鼠急性肝損傷具有一定的藥效。健脾保肝方有降低急性肝損傷小鼠轉(zhuǎn)氨酶活 性的作用，該組AST活性與模型組的相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P < 0.05)，但是降酶幅度稍遜于 桅子，病理變化與中劑量組相似。該方與中劑量的桅子同用，降酶的幅度在3個用藥組中最 大，與模型組統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P < 0. 01)，該組肝細(xì)胞變性在3個用藥組中最輕，與模型組 同樣有顯著性差異(P <0.01)。健脾保肝方的作用可能體現(xiàn)在二個方面，與桅子的協(xié)同作 用或減少桅子的肝毒性。雖然本實(shí)施例無法對這二個作用加以鑒別，但可以提示中劑量的 桅子可有效地預(yù)防CCl4所致的小鼠急性肝損傷，健脾保肝方與桅子配伍可以使預(yù)防作用更 佳。
權(quán)利要求
一種保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物，其特征在于包括以下重量份的原料藥制成炙黃芪20份～30份、白術(shù)10份～15份、茯苓10份～15份、甘草10份～15份、五味子10份～15份。
2.如權(quán)利要求1所述的保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物，其特征在于所述的中藥 組合物重量份的原料藥為炙黃芪20份、白術(shù)10份、茯苓10份、甘草10份、五味子15份。
3.如權(quán)利要求1所述的保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物，其特征在于所述的中藥 組合物原料藥還包括重量份為9份 18份的桅子。
4.如權(quán)利要求3所述的保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物，其特征在于所述的中藥 組合物重量份的原料藥為炙黃芪20份、白術(shù)10份、茯苓10份、甘草10份、五味子15份， 桅子18份。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物的制備方法，包括將所述重量份的原料藥加水煎煮，濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0. 55 0. 75g · HiF10
6.如權(quán)利要求1-4任一項所述的保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物在制備預(yù)防肝損 傷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種保護(hù)肝臟、預(yù)防肝損傷的中藥組合物、其制備方法及應(yīng)用，該組合物包括以下重量份的原料藥制成炙黃芪20份～30份、白術(shù)10份～15份、茯苓10份～15份、甘草10份～15份、五味子10份～15份；其制備將所述重量份的原料藥加水煎煮，濃縮至濃度相當(dāng)于生藥0.55～0.75g·ml-1。經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)肝臟病理學(xué)研究證實(shí)，本發(fā)明的健脾保肝方本身沒有肝毒性，且有一定的預(yù)防CCl4所致的小鼠急性肝損傷的作用。該方既能減輕梔子對正常小鼠的肝損害，又能協(xié)助常規(guī)劑量的梔子預(yù)防治療CCl4所致的小鼠急性肝損傷。本發(fā)明安全、有效、價廉，適合化學(xué)性和藥物性肝損傷患者服用。
文檔編號A61K36/744GK101869603SQ20091005713
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者徐列明, 林慶勛 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院