專利名稱：活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法，屬于發(fā)育生物 學(xué)和海水養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)80年代以來,經(jīng)濟(jì)蟹類(中華絨螯蟹、鋸緣青蟹、遠(yuǎn)海梭子蟹和 三疣梭子蟹等)養(yǎng)殖在我國迅速發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計(jì)2007年全國蟹類養(yǎng)殖總產(chǎn)量近 70萬噸，我國的蟹類養(yǎng)殖已經(jīng)取得舉世矚目的成就。蟹的主要可食部分為肌 肉、卵巢和肝胰腺，其中卵巢具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。因此在蟹類養(yǎng)殖生產(chǎn)中， 卵巢發(fā)育良好的雌蟹，俗稱紅膏蟹，經(jīng)濟(jì)價(jià)值比卵巢發(fā)育差的雌蟹要高很多。 另一方面，雌蟹卵巢發(fā)育的好壞直接影響著雌蟹的生殖能力，在蟹類育苗中 需要挑選卵巢發(fā)育良好的雌蟹作為親本，這對(duì)于蟹類育苗生產(chǎn)顯得十分重要。 此外，研究蟹類卵巢發(fā)育一直是甲殼動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)上的一個(gè)重要的研究?jī)?nèi) 容。因此，判斷蟹類卵巢發(fā)育情況對(duì)于了解其發(fā)育生物學(xué)、育苗、養(yǎng)殖和商 品蟹流通均具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。
對(duì)蝦類的卵巢位于半透明的頭胸甲內(nèi)，通常通過肉眼即可觀察甲殼內(nèi)的 卵巢發(fā)育情況，蟹類的卵巢位于不透明的頭胸甲內(nèi)，故肉眼難以觀察。經(jīng)驗(yàn) 的判斷方法是，在一定光照條件下觀察蟹的卵巢是否充滿頭胸甲，如果卵巢 充滿頭胸甲，則說明卵巢發(fā)育較成熟，但是這種方法的準(zhǔn)確性較差，且不可 對(duì)卵巢組織取樣進(jìn)行深入的研究。
判斷卵巢發(fā)育情況較為可靠的方法是解剖雌蟹，取出卵巢觀察發(fā)育情況， 但這樣就必須殺死雌蟹，故這種方法在育苗生產(chǎn)和商品蟹銷售過程中并不可 取。我們先前的技術(shù)"采用微型電鉆鉆孔，然后用鑷子活體直接取出少量組織, 最后密封穿剌孔"，那種取樣方法對(duì)主要適用于卵巢發(fā)育成熟(五期)的蟹， 而且對(duì)蟹的傷害較大,容易產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，例如停食和躁動(dòng)等，從而導(dǎo)致蟹體內(nèi)發(fā)生一系列生理變化(如血糖和雌二醇等含量升高)，甚至造成蟹的應(yīng)激 死亡。由于那種采樣方法會(huì)導(dǎo)致卵巢發(fā)育至三期的雌蟹卵巢停止發(fā)育，因此那 種方法僅適合于檢査卵巢發(fā)育成熟或者接近成熟的雌蟹，了解其卵巢發(fā)育情 況，從而預(yù)報(bào)其產(chǎn)卵期，不適合于研究卵巢發(fā)育早期(四期之前)的蟹。本發(fā)明 通過使用穿剌技術(shù)較好的解決了這一問題，能夠精確取樣卵巢發(fā)育早期(三 期)的卵巢組織，而且對(duì)蟹的傷害小,不會(huì)影響蟹的卵巢進(jìn)一步發(fā)育，所取的卵 巢組織可以用于多種生物學(xué)研究，如組織學(xué)、激素測(cè)定、生物化學(xué)和分子生 物學(xué)等。
此外,在以往的科研工作中，為了計(jì)算蟹的卵巢指數(shù)，首先需要稱重蟹的 體重,然后處死蟹,再解剖取出所有卵巢組織，最后稱重卵巢，根據(jù)這些來計(jì)算
卵巢指數(shù)(％)=100><卵巢重量/雌蟹體重。由于親本蟹價(jià)格昂貴，顯然處死親本
蟹的方法不僅增加了科研成本，而且也無法滿足對(duì)同一個(gè)體不同卵巢發(fā)育階 段進(jìn)行連續(xù)采樣的需要，同時(shí)還不利于動(dòng)物福利的開展。
以往解剖蟹對(duì)卵巢組織進(jìn)行取樣步驟繁瑣，操作過程耗時(shí)較長，對(duì)于提
取RNA等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)不利，稍有不慎便會(huì)使RNA降解，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。 同時(shí)解剖過程中，蟹的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蟹體內(nèi)生理指標(biāo)的產(chǎn)生變化，對(duì)于激 素測(cè)定結(jié)果會(huì)造成較大不良影響。而采用穿刺技術(shù)對(duì)蟹卵巢組織進(jìn)行采樣， 不僅操作簡(jiǎn)便和迅速，而且對(duì)蟹傷害小，能避免這些不良影響。
遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunus pelagicus)又稱遠(yuǎn)洋梭子蟹，屬于暖水性蟹類，主要 分布在我國福建、臺(tái)灣、廣東和廣西海域，該蟹最大個(gè)體達(dá)187mm，可食用 部分大、營養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質(zhì)的經(jīng)濟(jì)蟹類；另一方面，該蟹生長迅速、繁殖 能力強(qiáng)、抗病能力強(qiáng)、卵巢發(fā)育周期短、在適宜條件下可以全年連續(xù)產(chǎn)卵， 所以該蟹具有廣闊的養(yǎng)殖前景，同時(shí)又可以作為研究蟹類卵巢發(fā)育的模式動(dòng) 物。因此，本實(shí)驗(yàn)室利用遠(yuǎn)海梭子蟹作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立了活體穿刺技術(shù)檢 査蟹類卵巢發(fā)育的方法，且通過實(shí)踐驗(yàn)證了其可行性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用活體穿剌技術(shù)在活蟹體內(nèi)取出少量卵巢組織，然后用小塑料 板和502膠迅速封住穿刺留下的穿刺孔，這樣極大減少了采樣對(duì)于蟹造成的傷害，能保證采樣后蟹卵巢正常發(fā)育。本方法克服了 "采用微型電鉆鉆孔，然 后用鑷子活體直接取樣"容易造成"對(duì)蟹的的傷害大，造成較強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)，僅 是適合于研究卵巢發(fā)育晚期的蟹"等缺陷?；铙w穿刺技術(shù)取樣不僅對(duì)蟹的傷 害小，而且可以取樣發(fā)育早期的卵巢組織，也可以對(duì)同一個(gè)體進(jìn)行連續(xù)采樣 等。該方法簡(jiǎn)單易行，適合于科研和生產(chǎn)單位使用，在活體條件下了解親本
的卵巢發(fā)育情況，以及分析卵巢發(fā)育不同時(shí)期激素含量，抽提DNA和RNA 等對(duì)樣品進(jìn)行分子生物學(xué)研究。該技術(shù)適用于遠(yuǎn)海梭子蟹、三疣梭子蟹、中 華絨螯蟹和鋸緣青蟹等蟹類。
穿刺技術(shù)是利用穿刺針刺入動(dòng)物機(jī)體的臟器、體腔，用于獲取組織和器 官樣品進(jìn)行診斷，也可對(duì)器官中的積氣、積液進(jìn)行排瀉，或者注入藥物，在 醫(yī)學(xué)被廣泛應(yīng)用，穿刺技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可以在體外對(duì)活體進(jìn)行組織取樣，不 需要手術(shù)，對(duì)正常組織的破壞少。
將穿刺技術(shù)用于蟹類卵巢取樣基于以下幾點(diǎn)考慮。
一、 蟹類的卵巢位于其頭胸甲內(nèi)，頭胸甲不透明，很難用肉眼直接觀察 頭胸甲內(nèi)的卵巢發(fā)育情況，經(jīng)驗(yàn)的方法在一定光照條件下觀察卵巢是否充滿 頭胸甲的判斷方法準(zhǔn)確性差，無法了解卵巢發(fā)育的準(zhǔn)確狀況。
二、 蟹類卵巢在體內(nèi)所處區(qū)域相對(duì)固定，位于甲殼中軸兩側(cè)呈Y型分布， 用穿刺針采樣時(shí)的可以準(zhǔn)確定位。
三、 傳統(tǒng)的蟹類卵巢組織取樣方法必需先處死蟹，然后打開頭胸甲取樣 卵巢組織，這種方法不僅需要處死蟹，增加成本，而且無法對(duì)同一個(gè)體不同 卵巢發(fā)育階段進(jìn)行連續(xù)跟蹤采樣。
四、 "采用微型電鉆鉆孔，然后用鑷子活體直接取樣"的辦法容易傷害蟹的 真皮層，造成對(duì)蟹的應(yīng)激反應(yīng)，甚至導(dǎo)致早期卵巢停止發(fā)育，甚至死亡，因此僅 適合于研究卵巢發(fā)育晚期(五期)的蟹。利用穿刺技術(shù)采樣，穿刺針直接刺 過真皮層，創(chuàng)口小，對(duì)蟹造成的傷害少，能夠滿足對(duì)同一個(gè)體連續(xù)采樣的需 要，極大提高了采樣精確度和可靠性。
五、 穿刺針采樣迅速，能保證分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)取樣的速度要求，因?yàn)?RNA極容易降解。
六、 穿剌技術(shù)造成蟹的應(yīng)激反應(yīng)小，能減少因?yàn)閼?yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的蟹體內(nèi)激素水平的變化,從而提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
七、 在科研中利用穿刺技術(shù)取樣卵巢判斷其發(fā)育情況，不僅對(duì)蟹的傷害 小，而且可以減少科研工作中需要處死和解剖蟹的數(shù)量，從而有利于開展動(dòng) 物福利的工作。
八、 在生產(chǎn)上利用穿刺技術(shù)判斷卵巢發(fā)育情況，可以指導(dǎo)膏蟹培育和親 本選擇等，從而提高養(yǎng)殖生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。
一種活體穿剌技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法，包括以下步驟
(1) 穿刺部位為蟹頭胸甲前緣、靠近眼睛后的區(qū)域，所述穿刺部位打磨 平整，以便于取樣后密封穿刺孔；同時(shí)將穿剌部位打磨變薄，以便于采用穿 刺針扎入卵巢組織取樣；
(2) 穿刺針穿透穿剌部位,迅速取樣后密封穿刺孔；
(3) 取樣的卵巢組織直接用肉眼觀察卵巢外觀，初步判斷其發(fā)育情況或 用于組織學(xué)、激素和分子生物學(xué)研究。
步驟(1)中所述穿剌部位必須嚴(yán)格遵守圖版說明中的區(qū)域，控制在頭胸 甲前緣，靠近眼睛后的區(qū)域，在卵巢發(fā)育早期(三期)時(shí)也能采到樣品，而 且不會(huì)對(duì)心臟、胃造成損傷，所述穿刺部位的甲殼比較平整，取樣后容易密 封穿刺孔。
步驟(1)中用砂紙或者微型拋光機(jī)將穿刺部位拋光平整，以便取樣后密 封穿剌孔，防止海水進(jìn)入；打磨過程使穿刺部位變薄，便于穿刺針扎入蟹體 內(nèi)進(jìn)行取樣。
所述穿刺部位必須打磨平整，有條件可使用微型拋光機(jī)；無條件的單位 或者農(nóng)戶可以用砂紙打磨，打磨時(shí)需要注意不能傷及真皮層，因?yàn)檎嫫又?有感覺神經(jīng)末梢，易引起蟹的應(yīng)激反應(yīng)，取樣后容易密封穿刺孔，需要保證 穿剌孔密封完全,以防止海水進(jìn)入蟹體內(nèi)。打磨時(shí)不得傷及真皮層，只能在角 質(zhì)化的外層進(jìn)行，以免對(duì)蟹造成傷害。
所述穿刺部位、微型拋光機(jī)、穿刺針經(jīng)過消毒，防止細(xì)菌感染造成蟹的 死亡。
步驟(2)中穿刺針進(jìn)入蟹體內(nèi)后嚴(yán)禁攪動(dòng)，接上無菌注射器抽取少量樣品后應(yīng)迅速筆直抽出，以免對(duì)卵巢造成較大損傷。
步驟(2)所述穿剌孔的孔徑為0.46-1.31mm。
步驟(2)取樣完畢后用502膠和塑料片密封，等膠水固化后將蟹放回海 水中。
所述塑料片柔軟、完全貼合蟹甲殼表面，且不透水。 所述502膠選用凝固性佳，在5分鐘內(nèi)完全凝固。
步驟(3)肉眼觀察卵巢樣品，卵巢的不同顏色代表不同的卵巢成熟階段， 以遠(yuǎn)海梭子蟹為例，顏色達(dá)到黃色代表卵巢發(fā)育達(dá)到三期或者三期以后，卵 巢桔紅色通常為四期或者五期。若需更加精確的了解卵巢發(fā)育情況，則需通 過石蠟切片和HE染色技術(shù)對(duì)卵巢進(jìn)行組織學(xué)觀察，如果卵巢中以外源性卵黃 合成期細(xì)胞為主說明卵巢發(fā)育處于三期，卵巢中以近成熟細(xì)胞為主說明卵巢 發(fā)育處于四期，卵巢中以成熟細(xì)胞為主說明卵巢發(fā)育達(dá)到五期。
步驟(3)中利用組織學(xué)統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞直徑，所述卵母細(xì)胞的直徑是指長 徑，然后推算卵巢指數(shù)，是指利用卵母細(xì)胞細(xì)胞直徑與卵巢指數(shù)的回歸方程 來計(jì)算卵巢指數(shù)。
計(jì)算卵巢指數(shù)，需要從組織切片中統(tǒng)計(jì)卵巢中卵母細(xì)胞直徑(長徑)，然 后將平均細(xì)胞直徑(長徑)代入回歸方程(參見圖9)，即可算出卵巢指數(shù)。 根據(jù)卵母細(xì)胞直徑推算卵巢指數(shù)的方法源于本實(shí)驗(yàn)室建立的遠(yuǎn)海梭子蟹卵母 細(xì)胞直徑和卵巢指數(shù)的回歸方程y = 0.3464eQQ114x。
用于預(yù)測(cè)雌體卵巢指數(shù)的回歸方程的回歸曲線統(tǒng)計(jì)卵巢發(fā)育三期的雌體 30個(gè)以上，統(tǒng)計(jì)優(yōu)勢(shì)卵母細(xì)胞的長徑，所述卵巢發(fā)育三期主要為外源性卵黃 合成期的卵母細(xì)胞。
所述優(yōu)勢(shì)卵母細(xì)胞是指同一個(gè)體的切片中，該類型的細(xì)胞必需占細(xì)胞總 數(shù)的70%以上。
若所取樣品用于孕酮和雌二醇含量測(cè)定，需要事先準(zhǔn)備好抽提激素的1.5 毫升離心管中(離心管中裝有1毫升乙酸乙酯)參見圖5，步驟(3)取樣后 的卵巢組織需要迅速放入離心管中。
若所取樣品用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，需事先準(zhǔn)備好液氮及相關(guān)保存容器， 步驟(3)取樣后的卵巢組織需要迅速放入液氮中，防止RNA降解。具體結(jié)果-
采用本方法取樣卵巢組織，蟹的成活率可達(dá)到90%以上，科研上可以節(jié)
約采樣成本60%以上，本試驗(yàn)室的實(shí)踐證明本方法切實(shí)可行；利用本方法建
立的遠(yuǎn)海梭子蟹卵巢指數(shù)預(yù)報(bào)方程(y = 0.3464e,14x)，卵巢指數(shù)預(yù)報(bào)的準(zhǔn)確 率在85%以上，預(yù)報(bào)值和實(shí)際解剖測(cè)定數(shù)值相差僅18.85%左右。 本發(fā)明的原理
本發(fā)明通過穿刺技術(shù)準(zhǔn)確取樣卵巢組織，取樣后迅速密封穿刺孔，這樣 種方法對(duì)蟹的傷害極小，而且可以連續(xù)跟蹤研究同一個(gè)體的卵巢發(fā)育情況。 這種方法克服了傳統(tǒng)辦法"取樣卵巢樣品必須處死蟹"的問題，而且克服了 "采用微型電鉆鉆孔，然后用鑷子活體直接取樣"的辦法容易"傷害蟹的真 皮層，造成對(duì)蟹的應(yīng)激反應(yīng)，甚至造成卵巢停止發(fā)育和死亡"的缺點(diǎn)，可以在 科研和生產(chǎn)單位進(jìn)行廣泛使用。
由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果
1、 此方法在不殺死蟹的情況下即能取得卵巢組織用于組織學(xué)、激素測(cè)定、 分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)，不僅可以節(jié)約采樣成本，而且可以對(duì)同一個(gè)體不同卵巢 發(fā)育階段進(jìn)行連續(xù)采樣；
2、 穿剌技術(shù)可以準(zhǔn)確取樣蟹卵巢發(fā)育三期及三期以后的卵巢組織，對(duì)蟹 的傷害極小，有利于實(shí)現(xiàn)動(dòng)物福利，減輕人類科研和生產(chǎn)活動(dòng)對(duì)蟹造成的痛 苦和傷害；
3、 在養(yǎng)殖生產(chǎn)中利用此方法可以取少量卵巢組織，從而判斷膏蟹的等級(jí)， 有利于提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益；
4、 方法簡(jiǎn)單，容易掌握。僅需要砂紙、穿刺針和502膠等簡(jiǎn)單用具，就 可以取樣蟹的卵巢組織。
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明。

圖1成體遠(yuǎn)海梭子蟹卵巢的位置，紅線內(nèi)為成熟卵巢的位置，黃色區(qū)域?yàn)?可以鉆孔的區(qū)域。
圖2所用微型拋光機(jī)的打磨頭圖3采樣用穿刺針。
圖4取樣后封孔的遠(yuǎn)海梭子蟹背甲。
圖5將穿刺獲得的卵巢樣品放入乙酸乙酯后，可以用于激素提取和測(cè)定。 圖6將穿刺獲得的卵巢樣品轉(zhuǎn)移至液氮中保存，可以用于RNA提取等分 子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
圖7將穿剌獲得的卵巢樣品用改良的Bouin氏液固定，以便進(jìn)行組織學(xué) 研究。
圖8遠(yuǎn)海梭子蟹成熟卵巢組織學(xué)照片
圖9遠(yuǎn)海梭子蟹卵母細(xì)胞直徑與卵巢指數(shù)的回歸曲線。
具體實(shí)施例方式
為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解， 下面結(jié)合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。 實(shí)施例l科研單位使用
工具和試劑的準(zhǔn)備微型拋光機(jī)(施力特P-600A，寧波高橋施力特工具 廠)參見圖2;穿刺針7弁0.46mm， 9# 0.71mm, 12#1.31mm,(棱牌，腰椎穿 剌針，上海埃斯埃醫(yī)械塑料制品有限公司)參見圖3; 502膠(廣東愛必達(dá)膠 粘劑公司)；1.5毫升離心管若干(預(yù)先裝有1毫升乙酸乙酯)，參見圖5;液 氮罐；—80。C超低溫冰箱；電光源解剖鏡(LeicaZoom-2000， Meyer Instruments, Inc, Houston, TX 77084);電光源顯微鏡(江南XS-212-201，南京江南永新光 學(xué)有限公司)；Cl型目測(cè)微尺(Cl型，上海越磁電子科技有限公司)；75%酒 精(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；組織切片機(jī)(Leica RM 2016, Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL, USA);改良的Bouin氏固定液(2.4毫升 飽和苦味酸溶液、64.5毫升福爾馬林、12.5毫升冰醋酸溶液和190毫升蒸餾 水)；干毛巾和棉球。
活體取樣取出實(shí)驗(yàn)用的遠(yuǎn)海梭子蟹，用干毛巾擦干甲殼上的水分，用 酒精棉球?qū)Υ┐滩课贿M(jìn)行消毒，穿剌部位為圖中紅色區(qū)域，參見圖l;然后用 微型拋光機(jī)在甲殼上打磨，參見圖2;然后用酒精棉球消毒過的穿刺針進(jìn)行穿 刺，插入蟹體內(nèi)lcm即可，參見圖3，穿剌孔的孔徑為0.46-1.31mm。拔出穿刺針襯芯，接上無菌注射器，略微旋轉(zhuǎn)穿刺針，拉動(dòng)注射器，抽出少許卵巢
組織。取出穿刺針后，迅速用502膠和0.5mm厚的塑料板密封采樣后的穿刺 孔，參見圖4，防止海水進(jìn)入或者細(xì)菌感染導(dǎo)致蟹的死亡。
激素測(cè)定的樣品保存抽出的少許卵巢組織置于含有離心管中(離心管 中裝有1毫升乙酸乙酯，用于抽提激素)參見圖5，離心后取上清夜立即可以 用于測(cè)定孕酮和雌二醇含量，或者放入一2(TC冰箱保存待測(cè)定。
用于提取RNA和卵黃蛋白純化等的樣品保存取出少量卵巢組織置于離 心管中，迅速放入液氮罐中，參見圖6，也可以直接置于一8(TC超低溫冰箱中 保存。
組織學(xué)樣品固定和切片將取出的卵巢組織用改良的Bouin氏液進(jìn)行固 定，參見圖7;常規(guī)石蠟切片、HE染色，在顯微鏡下觀察卵巢發(fā)育的組織學(xué) 情況，參見圖8，組織學(xué)觀察的內(nèi)容主要為卵巢中卵母細(xì)胞的組成、直徑、卵 黃物質(zhì)積累情況。根據(jù)卵巢中優(yōu)勢(shì)卵母細(xì)胞的組成可以確定卵巢發(fā)育分期， 如果卵巢中以外源性卵黃合成期細(xì)胞為主說明卵巢發(fā)育處于三期，卵巢中以 近成熟細(xì)胞為主說明卵巢發(fā)育處于四期，卵巢中以成熟細(xì)胞為主說明卵巢發(fā) 育達(dá)到五期。所述優(yōu)勢(shì)卵母細(xì)胞是指同一個(gè)體的切片中，該類型的細(xì)胞必需 占細(xì)胞總數(shù)的70%以上。
卵巢指數(shù)的推算每個(gè)蟹通常需要統(tǒng)計(jì)30-50個(gè)優(yōu)勢(shì)卵母細(xì)胞的直徑(長 徑)，然后計(jì)算平均值，將平均值帶入回歸曲線方程(圖9， y = 0.3464eQQ114x)， 即可推算出卵巢指數(shù)。建立"雌體卵巢指數(shù)和卵母細(xì)胞直徑的回歸曲線"時(shí)， 必需隨機(jī)統(tǒng)計(jì)卵巢發(fā)育三期的雌體30個(gè)以上，根據(jù)他們的卵巢指數(shù)和卵母細(xì) 胞直徑(長徑)建立回歸曲線和回歸方程，所述卵巢發(fā)育三期的雌體主要指 卵巢中70%以上為外源性卵黃合成期的卵母細(xì)胞。
實(shí)施例2生產(chǎn)單位使用
蟹類卵巢發(fā)育情況的確定對(duì)于成蟹養(yǎng)殖(評(píng)估蟹的食用價(jià)值，卵巢發(fā)育越 好，價(jià)格越高)和育苗(卵巢發(fā)育好的蟹才能用于育苗)都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 在生產(chǎn)中采用穿刺技術(shù)對(duì)卵巢取樣，不僅可以評(píng)定膏蟹等級(jí)，而且可以輔助 進(jìn)行育苗親本的選擇。工具和試劑準(zhǔn)備砂紙；穿刺針7# 0.46mm, 9# 0.71 mm, 12#1.31mm， (棱牌腰椎穿刺針，規(guī)格9,上海埃斯埃醫(yī)械塑料制品有限公司)，參見圖3; 電光源解剖鏡(Leica Zoom-2000, Meyer Instruments, Inc， Houston, TX 77084); 75%酒精(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；502膠(廣東愛必達(dá)膠粘劑有限公 司)；干毛巾和棉球。
活體取樣取出待檢查的遠(yuǎn)海梭子蟹，用干毛巾擦干甲殼上的水分，用 酒精棉球?qū)Υ┐滩课贿M(jìn)行消毒，參見圖h砂紙?jiān)诩讱ど洗蚰?；然后用酒精?球消毒過的穿刺針進(jìn)行穿刺，插入蟹體內(nèi)lcm即可，參見圖3，穿刺孔的孔 徑為0.46-1.31mm。拔出穿刺針襯芯，接上無菌注射器，略微旋轉(zhuǎn)穿刺針，拉 動(dòng)注射器，抽出少許卵巢組織，用502膠和0.5mm厚的塑料板密封采樣用的 小孔，參見圖4，防止海水進(jìn)入或者細(xì)菌感染導(dǎo)致蟹的死亡。
膏蟹等級(jí)判斷將穿刺取得的卵巢樣品用肉眼觀察后，然后置于電光源解 剖鏡下觀察，根據(jù)卵巢顏色、卵母細(xì)胞直徑等可以判斷蟹卵巢發(fā)育情況，用 圖9的方程推算卵巢指數(shù)，如果卵巢為桔紅色，卵母細(xì)胞直徑(長徑)大于 300微米，卵巢指數(shù)大于10%為一級(jí)膏蟹；如果卵巢為桔紅色或者深黃色， 卵母細(xì)胞直徑(長徑)在250—300微米，卵巢指數(shù)在7-10%為二級(jí)膏蟹；如 果卵巢為深黃色或者黃色，卵母細(xì)胞直徑(長徑)在200—250微米，卵巢指 數(shù)在4-7%為三級(jí)膏蟹；如果卵巢為黃色或者淡黃色，卵母細(xì)胞直徑(長徑) 在100—200微米，卵巢指數(shù)在1-4。％，為四級(jí)膏蟹。
育苗中的親本選擇將穿刺取得的樣品采用肉眼和電光源解剖鏡觀察顏 色，卵母細(xì)胞大小，卵黃顆粒的分布情況，然后統(tǒng)計(jì)30-50個(gè)卵母細(xì)胞的平均 直徑(長徑)，用圖9的方程推算卵巢指數(shù)，如果卵巢為桔紅色，卵母細(xì)胞直 徑(長徑)大于280微米，卵黃顆粒分布比較均勻，卵巢指數(shù)大于8%雌蟹，通 ?？梢宰鳛槿斯び视H本，這些雌體的生殖產(chǎn)卵量大，生殖性能比較穩(wěn)定。
本發(fā)明通過穿刺技術(shù)取出少量卵巢組織可用于各種生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，還 可根據(jù)卵巢的細(xì)胞學(xué)參數(shù)推算卵巢指數(shù)。該技術(shù)取樣的主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)蟹的傷 害較小，不會(huì)影響蟹卵巢的正常生長發(fā)育，可以對(duì)同一個(gè)體進(jìn)行連續(xù)采樣。該 方法的關(guān)鍵在于用穿刺針取出少量卵巢組織，然后可以用于多種生物學(xué)研究 (激素測(cè)定、分子生物學(xué)和組織學(xué)研究等)。蟹類卵巢發(fā)育情況的確定對(duì)于成蟹養(yǎng)殖(評(píng)估蟹的食用價(jià)值，卵巢發(fā)育越好,價(jià)格越高)、育苗(卵巢發(fā)育好的 蟹才能用于育苗)和資源評(píng)估(了解卵巢發(fā)育情況才能評(píng)估生殖群體的情況) 都有重要意義，同時(shí)蟹類發(fā)育狀況及卵巢指數(shù)對(duì)于科學(xué)研究上是十分重要的 指標(biāo)。本方法適合于科研和生產(chǎn)單位使用，在活體條件下對(duì)卵巢組織進(jìn)行采 樣，并可以進(jìn)一步了解親本的卵巢發(fā)育情況。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行 業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明 書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本 發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍 內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。
權(quán)利要求
1、一種活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法，包括以下步驟(1)穿刺部位為蟹頭胸甲前緣、靠近眼睛后的區(qū)域，所述穿刺部位打磨平整，以便于取樣后密封穿刺孔；同時(shí)將穿刺部位打磨變薄，以便于采用穿刺針扎入卵巢組織取樣；(2)穿刺針穿透穿刺部位，迅速取樣后密封穿刺孔；(3)取樣的卵巢組織直接用肉眼觀察卵巢外觀，初步判斷其發(fā)育情況或用于組織學(xué)、激素和分子生物學(xué)研究。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活體穿刺技術(shù)檢査蟹類卵巢發(fā)育的方法， 其特征在于步驟(1)中用砂紙或者微型拋光機(jī)將穿剌部位拋光平整，以便 取樣后密封穿刺孔，防止海水進(jìn)入；打磨過程使穿刺部位變薄，便于穿刺針 扎入蟹體內(nèi)進(jìn)行取樣。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種活體穿刺技術(shù)檢査蟹類卵巢發(fā)育的方法， 其特征在于所述穿刺部位、微型拋光機(jī)、穿刺針經(jīng)過消毒，防止細(xì)菌感染 造成蟹的死亡。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活體穿刺技術(shù)檢査蟹類卵巢發(fā)育的方法， 其特征在于步驟(2)所述穿刺孔的孔徑為0.46-1.31 mm。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活體穿刺技術(shù)檢査蟹類卵巢發(fā)育的方法， 其特征在于步驟(2)取樣完畢后用502膠和塑料片密封，等膠水固化后將 蟹放回海水中。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法， 其特征在于所述塑料片柔軟、完全貼合蟹甲殼表面，且不透水。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種活體穿剌技術(shù)檢査蟹類卵巢發(fā)育的方法， 其特征在于所述502膠選用凝固性佳，在5分鐘內(nèi)完全凝固。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法， 其特征在于步驟(3)中利用組織學(xué)統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞直徑，所述卵母細(xì)胞的直 徑是指長徑，然后推算卵巢指數(shù)，是指利用卵母細(xì)胞細(xì)胞直徑與卵巢指數(shù)的 回歸方程來計(jì)算卵巢指數(shù)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種活體穿刺技術(shù)檢査蟹類卵巢發(fā)育的方法，其特征在于用于預(yù)測(cè)雌體卵巢指數(shù)的回歸方程的回歸曲線統(tǒng)計(jì)卵巢發(fā)育三 期的雌體30個(gè)以上，統(tǒng)計(jì)優(yōu)勢(shì)卵母細(xì)胞的長徑，所述卵巢發(fā)育三期主要為外 源性卵黃合成期的卵母細(xì)胞。
10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種活體穿刺技術(shù)檢査蟹類卵巢發(fā)育的方法， 其特征在于所述優(yōu)勢(shì)卵母細(xì)胞是指同一個(gè)體的切片中，該類型的細(xì)胞必需 占細(xì)胞總數(shù)的70%以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法，包括穿刺部位為蟹頭胸甲前緣、靠近眼睛后的區(qū)域，所述穿刺部位打磨平整，以便于取樣后密封穿刺孔；同時(shí)將穿刺部位打磨變薄，以便于采用穿刺針扎入卵巢組織取樣；穿刺針穿透穿刺部位取樣后密封穿刺孔；取樣的卵巢組織直接用肉眼觀察卵巢外觀，初步判斷其發(fā)育情況或用于組織學(xué)、激素和分子生物學(xué)研究。本發(fā)明通過穿刺技術(shù)用穿刺針取出少量卵巢組織可用于各種生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)，還可根據(jù)卵巢的細(xì)胞學(xué)參數(shù)推算卵巢指數(shù)。本方法適合于科研和生產(chǎn)單位使用，在活體條件下對(duì)了解親本的卵巢發(fā)育情況。
文檔編號(hào)A61B10/00GK101612051SQ200910054769
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者浪 豐, 劉智俊, 吳旭干, 成永旭, 李光霞, 楊筱珍 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)