專利名稱：：石杉堿甲眼用制劑及其應(yīng)用的制作方法石杉堿甲眼用制劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及眼用制劑，尤其涉及石杉堿甲眼用制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：青光眼是臨床最常見的眼病之一，主要表現(xiàn)為眼內(nèi)壓增高導(dǎo)致眼底視神經(jīng)乳頭塌陷，視野變窄，視力下降，嚴(yán)重者可能失明，且一旦失明，就會永久喪失視力。近年大量研究表明視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞主要是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncells,RGCs)的進(jìn)行性死亡(凋亡為主)是青光眼視神經(jīng)病變的關(guān)鍵機制。因此選擇性阻抑視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞主要是RGCs死亡無疑成為防治青光眼的重要策略。不可否認(rèn)有效控制眼壓是目前視神經(jīng)保護的重要手段，但對非眼壓因素所致視神經(jīng)損害的防護仍不能忽視。因此，理想的抗青光眼藥物不僅僅具有改善機械壓力效應(yīng)還應(yīng)具有多靶點的視神經(jīng)保護作用(青光眼的神經(jīng)保護治療一般是指藥物直接作用于視網(wǎng)膜和視神經(jīng)而預(yù)防、阻止或延緩RGCs死亡)。石杉堿甲(HuperzineA，HupA)是我國從石杉屬植物蛇足石杉中成功開發(fā)的新一代可逆、高效、高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑，因具有獨特的藥理特征和低毒性，而引起了人們的廣泛注意。HupA通過與乙酰膽堿酯酶可逆性結(jié)合，使膽堿酯酶不能水解乙酰膽堿，從而乙酰膽堿水平升高，產(chǎn)生促膽堿能作用。石杉堿甲目前已被廣泛用于治療阿爾茨海默病、早老性癡呆、血管性癡呆以及改善學(xué)生的學(xué)習(xí)與記憶能力、腦外傷性記憶功能和認(rèn)知功能。作為治療老年癡呆的首選藥物，已上市或研究的石杉堿甲有片劑，膠囊劑，滴丸，緩釋微球，鼻腔給藥等劑型，石杉堿甲在治療眼科疾病方面的應(yīng)用及眼用制劑的制備均未見文獻(xiàn)報道。當(dāng)前臨床常用眼科用藥大多以滴眼液、藥膏等傳統(tǒng)劑型出現(xiàn)，滴眼液作為眼科最常用的局部給藥劑型，因使用方便，生產(chǎn)成本低而使患者及生產(chǎn)企業(yè)樂于接受，但普通滴眼液滴入眼內(nèi)后，易經(jīng)鼻淚管損失造成全身吸收，且數(shù)分鐘內(nèi)可被淚液稀釋至原來濃度的0.1%，因此需增加給藥次數(shù)才能達(dá)到有效治療濃度，給使用帶來很多不便。眼膏雖然釋藥緩慢，但油膩感強且使用后影響視力及美觀，夜間應(yīng)用又易污染衣被，因而不受患者歡迎。目前市場上也又眼用凝膠劑商品，但多為粘稠狀半固體，如果直接將凝膠滴入眼內(nèi)，凝膠在眼內(nèi)缺乏良好的鋪展性，藥物不易均勻分布，同時使用劑量也不能準(zhǔn)確控制，還可能影響美觀及視力，因此也非理想眼用制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種石杉堿甲眼用制劑在制備預(yù)防、治療眼科疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種石杉堿甲眼用原位凝膠劑。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種石杉堿甲滴眼液。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是石杉堿甲眼用制劑在制備預(yù)防、治療青光眼、眼壓升高或伴有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的眼科疾病藥物中的應(yīng)用，所述的眼用制劑是石杉堿甲滴眼液和石杉堿甲眼用原位凝膠劑。所述的石杉堿甲眼用原位凝膠劑是由下列組分組成組分含量(重量％)石杉堿甲0.001-10.INHCl0.002-0.2增稠劑0.05-20等滲調(diào)節(jié)劑0-40防腐劑0.01-0.5絡(luò)合劑0-0.1pH調(diào)節(jié)劑0-0.05水余量，所述的增稠劑含有溫度敏感型、pH敏感型或離子敏感型高分子材料中的一種或多種；所述的等滲調(diào)節(jié)劑是選自甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、甘油或丙二醇；所述的防腐劑選自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一種或多種；所述的pH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硼酸、枸櫞酸、硼酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、或三乙醇胺。所述的石杉堿甲滴眼液是由下列組分組成組分含量(重量％)石杉堿甲0.00110.INHCl0.002-0.02增稠劑015防腐劑0.01-0.5等滲調(diào)節(jié)劑0-40pH值調(diào)節(jié)劑0-0.05絡(luò)合劑0-0.1水余量，所述的增稠劑選自羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸鈉或聚乙烯醇；所述的防腐劑選自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一種或一種以上的混合物的一種或多種；所述的等滲調(diào)節(jié)劑是選自甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、甘油或丙二醇；所述的pH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硼酸、枸櫞酸、硼酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀或三乙醇胺；所述的絡(luò)合劑選自依地酸二鈉。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種石杉堿甲眼用原位凝膠劑，所述的眼用原位凝膠劑是由下列組分組成組分含量(重量％)石杉堿甲0.001-10.INHCl0.002-0.2增稠劑0·05-20等滲調(diào)節(jié)劑0-40防腐劑0.01-0.5絡(luò)合劑0-0.1pH調(diào)節(jié)劑0-0.05水余量。所述的增稠劑含有溫度敏感型、pH敏感型或離子敏感型高分子材料中的一種或多種。所述的等滲調(diào)節(jié)劑是選自甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、甘油或丙二醇。所述的防腐劑選自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一種或多種。所述的pH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硼酸、枸櫞酸、硼酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀或三乙醇胺。所述的增稠劑含有增稠劑可含有甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸鈉的一種或多種。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種石杉堿甲滴眼液，所述的石杉堿甲滴眼液是由下列組分組成組分含量(重量％)石杉堿甲0.00110.INHCl0.002-0·02增稠劑015防腐劑0.01-0.5等滲調(diào)節(jié)劑0-40pH值調(diào)節(jié)劑0-0.05絡(luò)合劑0-0.1水余量，所述的增稠劑選自羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸鈉或聚乙烯醇；所述的防腐劑選自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一種或一種以上的混合物的一種或多種；所述的等滲調(diào)節(jié)劑是選自甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、甘油或丙二醇；所述的pH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硼酸、枸櫞酸、硼酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀或三乙醇胺；所述的絡(luò)合劑選自依地酸二鈉。需要說明的是增稠劑必須含有溫度敏感型、PH敏感型或離子敏感型高分子材料中的一種或多種；溫度敏感型高分子材料包括泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、N_異丙基丙稀酰胺共聚物和/或聚乙二酸-PLGA嵌段共聚物；pH敏感型高分子材料包括醋酸纖維素酞酸酯，丙烯酸樹脂卡波姆或聚乙烯縮醛二乙胺醋酸；離子敏感型高分子材料包括去乙酰結(jié)冷膠、海藻酸鈉、黃原酸、卡拉膠/文萊膠。增稠劑可含有甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸鈉的一種和/或多種。本發(fā)明優(yōu)點在于1、本發(fā)明經(jīng)大量細(xì)胞、動物實驗研究證明，藥物石杉堿甲對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有良好的保護作用，口服及局部滴眼均有較好的降眼壓作用，可用于預(yù)防及治療青光眼。2、本發(fā)明成功開發(fā)了石杉堿甲滴眼液和石杉堿甲眼用原位凝膠劑，所述的兩個劑型方便眼科疾病患者使用。3、石杉堿甲眼用原位凝膠劑適用于治療各類青光眼及眼壓升高或伴有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的眼科疾病。石杉堿甲眼用原位凝膠劑在體外為流動性良好的液體，滴眼時，劑量容易準(zhǔn)確控制，使用方便，滴入眼內(nèi)后，能均勻鋪展，并形成凝膠，在眼內(nèi)停留時間較長，不易流失進(jìn)入全身而被吸收，能維持局部有效藥物濃度，提高生物利用度，且毒性低，刺激性效，生物相容性好，是一個有效的治療青光眼及高眼壓的藥物，能應(yīng)用于臨床，具有廣闊的開發(fā)前景。圖1石杉堿甲眼用制劑對家兔瞳孔直徑的影響，*p<0.05vs對照組，**p<0.Olvs對照組?！?N生理鹽水對照組，▲Drop石杉堿甲滴眼液組，Gel石杉堿甲眼用原位凝膠劑組圖2石杉堿眼用制劑對甲基纖維素(CMC)致高眼壓家兔眼壓的影響Zp<0.05vs模型組，**p<0.Olvs模型組?！?Model模型組，▲Drop石杉堿甲滴眼液組，Gel石杉堿甲眼用原位凝膠組圖3石杉堿甲對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC-5)活力的影響，**p<0.Olvs對照組，##p<0.Olvs谷氨酸(glutamicacid,Glu)損傷組。圖:N正常對照組，[]:glu谷氨酸損傷組，·:用藥(石杉堿甲)組圖4不同實驗條件下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，A正常組，B谷氨酸損傷組，C:用藥(石杉堿甲)組。圖5石杉堿甲對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的影響，A正常組，B谷氨酸損傷組，C用藥(石杉堿甲)組。圖6不同條件下HE染色后視網(wǎng)膜切片組織學(xué)特征圖，A正常組，B缺血再灌注損傷模型組，C用藥(石杉堿甲)組。圖7石杉堿甲眼用原位凝膠劑與人工淚液混合前后流變學(xué)特征。具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的石杉堿甲眼用制劑及其應(yīng)用具體實施方式作詳細(xì)說明。實施例一石杉堿甲滴眼液的制備(一)按下述配比取原料石杉堿甲0.Ig0.INHCl0.2gHPMC2g葡萄糖200g苯扎溴胺0.Ig去離子水余量至IOOOml(處方一般總量為1000ml)制備方法如下取石杉堿甲，用0.INHCl溶解，加注射用水稀釋后；攪拌狀態(tài)下加入HPMC直至溶解，放置12-24小時至完全溶脹溶解；攪拌條件下依次加入葡萄糖，苯扎溴胺，溶解并混勻，0.22μm微孔濾膜過濾，再自濾器上加水至總量混勻。所制備的石杉堿甲滴眼劑PH6，粘度20cps，滲透壓289m0sm，澄明度良好。實施例二石杉堿甲滴眼液的制備(二)按下述配比取取原料石杉堿甲IOg0.INHCl2g透明質(zhì)酸鈉Ig葡萄糖400g尼泊金乙酯0.IgEDTA0.Olg注射用水余量至IOOOml制備方法如下取石杉堿甲，用0.INHCl溶解，加注射用水稀釋后；攪拌狀態(tài)下加入透明質(zhì)酸鈉直至溶解，放置12-24小時至完全溶脹溶解；攪拌條件下依次加入葡萄糖，尼泊金乙酯，EDTA，溶解并混勻，0.22μm微孔濾膜過濾，再自濾器上加水至總量混勻。所制備的石杉堿甲滴眼劑pH6，粘度15cps，滲透壓290m0sm，澄明度良好。實施例三石杉堿甲滴眼液的制備(三)按下述配比取原料石杉堿甲0.Olg0.INHCl0.02g聚乙烯醇140gNaCl6g尼泊金乙酯0.IgEDTA0.Olg注射用水余量至IOOOml制備方法如下取石杉堿甲，用0.INHCl溶解，加注射用水稀釋后；攪拌狀態(tài)下加入聚乙烯醇直至溶解，放置12-24小時至完全溶脹溶解；攪拌條件下依次加入NaCl，尼泊金乙酯，EDTA，溶解并混勻，0.22μm微孔濾膜過濾，再自濾器上加水至總量混勻。所制備的石杉堿甲滴眼劑PH7，粘度3cps(25°C士0.1°C)，滲透壓290m0sm，澄明度良好。0121]實施例四石杉堿甲眼用原位凝膠劑的制備(一0122]按下述配比取原料0123]石杉堿甲0.lg0124]0.INHC10.02g0125]卡波姆9713g0126]泊洛沙姆130g0127]NaCl6.0g0128]尼泊金甲酯0.lg0129]EDTA0.Olg0130]硼酸0.2g0131]注射用水余量至1000ml0132]制備方法如下0133]將石杉堿甲溶于0INHC1中，注射用水稀釋后姆，至溶解，放置過夜，使高分子材料完全溶脹溶解；攪拌條件下依次將NaCl，尼泊金甲酯，EDTA至充分溶解，用硼酸調(diào)節(jié)pH為5.5，溶液通過微孔濾膜過濾，再自濾器上加水至總量混勻。實施例五石杉堿甲眼用原位凝膠劑的制備(二)按下述配比取原料0134]0135]0136]0137]0138]0139]0140]0141]0142]0143]0144]0145]石杉堿甲0.INHC1海藻酸鈉HPMC葡萄糖苯扎溴胺三乙醇胺注射用水制備方法如下將石杉堿甲溶于適量稀鹽酸中，注射用水稀釋后，攪拌狀態(tài)下加入海藻酸鈉、HPMC，至溶解，放置過夜，使高分子材料完全溶脹溶解；攪拌條件下依次將葡萄糖，苯扎溴胺，至充分溶解，用三乙醇胺調(diào)節(jié)PH為7，溶液通過微孔濾膜過濾，再自濾器上加水至總量混勻。實施例六石杉堿甲眼用原位凝膠劑的制備(三)按下述配比取原料10g2glglg400g0.05g0.Olg余量至1000ml石杉堿甲0.INHC1卡波姆HPMCNaCl尼泊金乙酯0.Olg0.02g2glg5g0.lgEDTA硼酸注射用水0.Olg0.5g余量至1000ml制備方法如下將石杉堿甲溶于0.INHC1中，注射用水稀釋后，攪拌狀態(tài)下加入卡波姆、HPMC，至溶解，放置過夜，使高分子材料完全溶脹溶解；攪拌條件下依次將NaCl，尼泊金乙酯，EDTA至充分溶解，用硼酸調(diào)節(jié)PH為5，溶液通過微孔濾膜過濾，再自濾器上加水至總量混勻。本發(fā)明的石杉堿甲原位凝膠劑為一種在體外呈流動性良好液體狀態(tài)，滴入眼內(nèi)成凝膠狀態(tài)的眼用制劑。其毒性低刺激性小，生物相容性好，可提高患者依從性和耐受性。石杉堿甲眼用原位凝膠劑與人工淚液混合前后流變學(xué)特征見圖7。本發(fā)明的石杉堿甲原位凝膠劑與滴眼液、眼膏等常用傳統(tǒng)劑型相比有如下優(yōu)點(1)非生理條件下為流動性較好的液體，即傳統(tǒng)的滴眼劑形式，進(jìn)入眼內(nèi)在生理條件下迅速發(fā)生相變成為粘彈性凝膠。具有使用方便，劑量準(zhǔn)確，且與眼角膜作用時間長，生物利用度高等優(yōu)點。(2)本發(fā)明的原位凝膠劑具有假塑性流變學(xué)特征，即隨眨眼次數(shù)的增加，粘度逐漸降低，使用感覺舒適。同時因其在眼內(nèi)停留時間長而具有緩釋作用，可減少使用次數(shù)，大大方便患者，因此本發(fā)明的石杉堿甲眼用原位凝膠劑能應(yīng)用于臨床，具有廣闊的開發(fā)前景。實施例七石杉堿甲眼用制劑對家兔瞳孔直徑的影響1實驗材料1.1藥物實施例一提供的石杉堿甲滴眼液，實施例四提供的石杉堿甲原位凝膠劑。1.2試驗動物新西蘭大白兔，體重2.2-2.8kg，雌雄兼用，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號SYXK2003-0026。2實驗方法2.1瞳孔的測定將兔固定于兔箱，在自然光線下用瞳孔尺(Castroviejocaliper)測量兔瞳孔直徑。2.2給藥方法選擇健康無眼疾白色家兔30只，隨機分成3組(每組十只兔20只眼)。分別為生理鹽水組每眼滴入生理鹽水50yl；石杉堿甲滴眼液組每眼滴入實施例一的石杉堿甲滴眼液50iU；石杉堿甲眼用原位凝膠劑組每眼滴入實施例四的石杉堿眼用甲原位凝膠劑50ill。分別與給藥前與給藥后的30，60，90，120，180，210，240，270，310，330min測量兔瞳孔直徑。3統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)均用mean士SEM表示，組間比較采用單因素方差分析(onewayanalysisofvariance,AN0VA)。p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。4實驗結(jié)果石杉堿甲滴眼液和石杉堿甲眼用原位凝膠劑均使兔虹膜括約肌收縮，瞳孔縮小，并顯時效關(guān)系，同時石杉堿甲眼用原位凝膠劑的縮瞳時間明顯長于石杉堿甲滴眼液(見圖1)。實施例八石杉堿甲眼用制劑對甲基纖維素(CMC)致高眼壓家兔眼壓(Intraocularpressure,IOP)的影口向1.1藥物實施例一提供的石杉堿甲滴眼液，實施例四提供的石杉堿甲原位凝膠劑。1.2試驗動物新西蘭兔，體重2.2-2.8kg，雌雄兼用，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號SYXK2003-0026。2實驗方法2.1眼壓測定將兔固定于兔箱，用0.丁卡因進(jìn)行眼球表面麻醉，用眼壓計測量眼壓，重復(fù)測量三次，取其平均值，記錄眼壓曲線。2.2兔高眼壓模型的建立選擇健康無眼疾白色家兔，每兔從耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(lmL/kg)全身麻醉。雙眼滴入1%丁卡因局部角膜麻醉，用眼壓計測量基礎(chǔ)眼壓，原發(fā)性高眼壓者棄之不用。然后用4號針頭沿角膜邊緣內(nèi)1mm處進(jìn)針象前房穿刺，抽取房水0.05ml，換針管注入2%CMCO.05ml，拔出針頭，即制成兔高眼壓模型。2.3給藥方法實驗大白兔30只，隨機分成3組(每組10只20只眼)。分別為生理鹽水空白對照組每眼滴入生理鹽水50yl；石杉堿甲滴眼組每眼滴入實施例一的石杉堿甲滴眼液50u1)，石杉堿甲眼用原位凝膠組(每眼滴入實施例四的石杉堿眼用甲原位凝膠劑50yl。分別與給藥前與給藥后的30，60，90，120，180，210，240，270，300，330min測量眼壓。3統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)均用mean士SEM表示，組間比較采用單因素方差分析(onewayanalysisofvariance,ANOVA)。p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。4實驗結(jié)果甲基纖維素(CMC)制作的高眼壓模型，方法簡單，重復(fù)性好，高眼壓作用可靠，維持時間長。在制備高眼壓模型前，各組家兔基礎(chǔ)眼壓無明顯差別。前房內(nèi)注射CMC后隨眼壓的整個觀察期間眼壓均明顯高于基礎(chǔ)值(P<0.01)。治療組眼壓也高于正常，但眼壓上升幅度明顯低于對照組，其中石杉堿甲眼用原位凝膠劑的降眼壓時間較石杉堿甲滴眼液明顯延長。(見圖2)。實施例九石杉堿甲對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC-5)的體外保護實驗1實驗材料1.1細(xì)胞株RGC-5視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株，購自ATCC。1.2實驗藥品及試劑石杉堿甲(上海中科院藥物研究所)，用DMS0溶解制成貯備液，-20°C貯存，臨用前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。谷氨酸(Glu)購自Sigma，用培養(yǎng)液溶解制成貯備液，_20°C貯存，臨用前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。2實驗方法取穩(wěn)定生長、復(fù)蘇后培養(yǎng)3-10代的RGC-5細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以3X103/孔接種于96孔板，每孔100ill。細(xì)胞生長至70%-80%融合時，將細(xì)胞分為對照組、谷氨酸(Glu)處理組和藥物預(yù)處理組，每組5復(fù)孔。藥物預(yù)處理組分別應(yīng)用0.1，LlOuMHupA預(yù)處理2h，然后加入5mMGlu。孵育24h后每孔加入MTT溶液10yl，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加入DMS0200u1/孔，振蕩lOmin充分溶解染料結(jié)晶，酶標(biāo)儀測定吸光度(測定波長490nm，參考波長655nm)。細(xì)胞存活率(％)=用藥組細(xì)胞存活率/對照組細(xì)胞存活率X100%3實驗結(jié)果HupA預(yù)處理能夠劑量依賴性地抑制Glu(5mM)的細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率的增加(見圖3)和細(xì)胞形態(tài)、密度的改善(見圖4)，表明HupA對谷氨酸引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷有明顯的保護效應(yīng)。4統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)均用mean士SEM表示，組間比較采用單因素方差分析(onewayanalysisofvariance,ANOVA)。p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。實施例十流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率1實驗材料見實施例九2實驗方法取穩(wěn)定生長、復(fù)蘇后培養(yǎng)3-10代的RGC-5細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，以lX105/ml接種于6孔板，每孔2ml。細(xì)胞生長至70%融合時，將培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)液，并將細(xì)胞分為對照組、Glu處理組和HupA預(yù)處理組，每組2復(fù)孔。藥物預(yù)處理組應(yīng)用1yMHupA預(yù)處理2h，然后加入5mMGlu。孵育24h后，參照凋亡試劑盒說明進(jìn)行凋亡檢測。3實驗結(jié)果與MTT實驗結(jié)果相似，5mMGlu誘發(fā)了明顯的細(xì)胞凋亡；HupA(lyM)預(yù)處理能夠抑制Glu的促凋亡作用(見圖5)。實施例十一石杉堿甲對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的體內(nèi)保護實驗1實驗材料1.1實驗動物Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體重在250_350g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)號為清潔級，所有大鼠經(jīng)一般檢查和眼部檢查均無異常后采用。全身情況要求毛發(fā)色澤光亮，無脫毛，四肢和尾部無疾缺，頸部無歪斜。眼部檢查要求雙側(cè)眼球等大，眼瞼完整，睫毛整齊，角膜透明，前房清晰，瞳孔對光反射靈敏。均取左眼做損傷模型。1.2主要試劑石杉堿甲，戊巴比妥鈉，鹽酸利多卡因注射液2實驗方法2.1動物模型的建立121)石杉堿甲預(yù)處理滴眼組組給予0.01%石杉堿甲滴眼，每天4次，連續(xù)3天。2)大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注模型的建立腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，用5號一次性輸液針頭做左眼前方穿刺，經(jīng)一次性消毒輸液器連接乳酸鈉林格氏液輸液瓶。將液面高度調(diào)整至距實驗眼水平面150cm，使之產(chǎn)生約llOmmHg靜水壓。在大鼠左眼前房內(nèi)持續(xù)加壓灌注，50min后拔除針頭，大鼠自行蘇醒。左眼前房注入生理鹽水加壓，此時可見動物左眼虹膜蒼白，角膜渾濁，外突，并維持此眼內(nèi)壓50min。然后將眼壓緩慢降至加壓前水平。視網(wǎng)膜缺血/再灌注的判定提升眼壓后以阿托品眼膏散瞳，直接檢眼鏡檢查眼底，以視網(wǎng)膜動脈血中斷，視網(wǎng)膜蒼白為視網(wǎng)膜缺血成功標(biāo)志；視網(wǎng)膜動脈學(xué)流恢復(fù)，視網(wǎng)膜充血微視網(wǎng)膜再灌注成功標(biāo)志。當(dāng)眼壓升高后，可以見到眼球在約2min內(nèi)變白(由于眼底血管被阻斷，導(dǎo)致眼底反光由紅色變?yōu)榘咨瑫r虹膜也因缺血而變白)。如果在前房穿刺中不慎損傷晶狀體，則去掉該動物的數(shù)據(jù)。對照組只滴加了消炎藥，但沒有做前房穿刺和眼壓升高。3)術(shù)后石杉堿甲繼續(xù)滴眼，每天4次，連續(xù)3天。4)組織制備實驗動物達(dá)存活時間點后，麻醉下急性取雙眼眼球，3.7%甲醛溶液固定，去角膜，晶狀體和玻璃體后，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，平行于眼球剖面通過視神經(jīng)作連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。5)數(shù)據(jù)收集和處理每只動物取2張切片，每張切片采用Laica數(shù)碼相機在Laica顯微鏡40倍物鏡下以視神經(jīng)為中心對稱取6個部位(3個部位/側(cè))攝片，用IPP圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。HE染色片測量內(nèi)核層(IPL)和內(nèi)網(wǎng)狀層(INL)厚度，及RGCs密度(1mm視網(wǎng)膜中RGCs個數(shù))。雙盲計數(shù)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)；數(shù)據(jù)對各組均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。3統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)均用mean士SEM表示，組間比較采用單因素方差分析(onewayanalysisofvariance,ANOVA)。p<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。4實驗結(jié)果HE及尼氏染色顯示正常對照組視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)清晰；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞呈圓形或卵圓形，胞漿豐富，染色均勻，核呈圓形，核仁清晰；RGCs間的Muller細(xì)胞纖維欄排列整齊；內(nèi)外網(wǎng)狀層節(jié)后清晰；內(nèi)外顆粒層結(jié)構(gòu)清楚，排列均勻(見圖6)。模型組內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度變薄，IPL和INL厚度變小，GCL細(xì)胞數(shù)目顯著減少，排列稀疏，RGCs固縮，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞周圍間隙擴大，核固縮，形態(tài)不一，染色不均；Muller西柏纖維欄排列紊亂，內(nèi)外網(wǎng)狀層變薄，結(jié)構(gòu)尚清晰；內(nèi)顆粒層細(xì)胞周圍間隙擴大；外顆粒層結(jié)構(gòu)尚清晰，排列均勻；視網(wǎng)膜各層輪廓清晰，未見炎性細(xì)胞浸潤。石杉堿甲組GCL細(xì)胞數(shù)目明顯多于模型組，IPL和INL厚度恢復(fù)，內(nèi)層視網(wǎng)膜變薄不明顯。統(tǒng)計結(jié)果表明急性高眼壓組節(jié)細(xì)胞數(shù)明顯低于正常對照組(P<0.01)，石杉堿甲組可顯著改善節(jié)細(xì)胞數(shù)目，明顯高于急性高眼壓組(P<0.01)。IPL和INL厚度在石杉堿甲組也較急性高眼壓組有明顯恢復(fù)(表1)。表1各組大鼠IPL、INL厚度及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)細(xì)胞數(shù)量比較(mean士s.e.m，13n=5)，##P<0.Olvs模型組<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補充，這些改進(jìn)和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求石杉堿甲眼用制劑在制備預(yù)防、治療青光眼、眼壓升高或伴有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的眼科疾病藥物中的應(yīng)用，所述的眼用制劑是石杉堿甲滴眼液和石杉堿甲眼用原位凝膠劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的石杉堿甲眼用原位凝膠劑是由下列組分組成組分含量(重量％)石杉堿甲0.001-10.INHCl0.002-0.2增稠劑0.05-20等滲調(diào)節(jié)劑0-40防腐劑0.01-0.5絡(luò)合劑0-0.1pH調(diào)節(jié)劑0-0.05水余量，所述的增稠劑含有溫度敏感型、PH敏感型或離子敏感型高分子材料中的一種或多種；所述的等滲調(diào)節(jié)劑是選自甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、甘油或丙二醇；所述的防腐劑選自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一種或多種；所述的PH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硼酸、枸櫞酸、硼酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、或三乙醇胺。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的石杉堿甲滴眼液是由下列組分組成組分含量(重量％)石杉堿甲0.00110.INHCl0.002-0.02增稠劑015防腐劑0.01-0.5等滲調(diào)節(jié)劑0-40PH值調(diào)節(jié)劑0-0.05絡(luò)合劑0-0.1水余量，所述的增稠劑選自羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸鈉或聚乙烯醇；所述的防腐劑選自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一種或一種以上的混合物的一種或多種；所述的等滲調(diào)節(jié)劑是選自甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、甘油或丙二醇；所述的PH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硼酸、枸櫞酸、硼酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀或三乙醇胺；所述的絡(luò)合劑選自依地酸二鈉。4.一種石杉堿甲眼用原位凝膠劑，其特征在于，眼用原位凝膠劑是由下列組分組成組分含量(重量％)石杉堿甲0.001-1，0.INHCl0.002-0.2增稠劑0.05-20等滲調(diào)節(jié)劑0-40防腐劑0.01-0.5絡(luò)合劑0-0.1pH調(diào)節(jié)劑0-0.05水余量。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的石杉堿甲眼用原位凝膠劑，其特征在于，所述的增稠劑含有溫度敏感型、PH敏感型或離子敏感型高分子材料中的一種或多種。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的石杉堿甲眼用原位凝膠劑，其特征在于，所述的等滲調(diào)節(jié)劑是選自甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、甘油或丙二醇。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的石杉堿甲眼用原位凝膠劑，其特征在于，所述的防腐劑選自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一種或多種。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的石杉堿甲眼用原位凝膠劑，其特征在于，所述的pH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硼酸、枸櫞酸、硼酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀或三乙醇胺。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的石杉堿甲眼用原位凝膠劑，其特征在于，所述的增稠劑含有增稠劑可含有甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸鈉的一種或多種。10.一種石杉堿甲滴眼液，其特征在于，石杉堿甲滴眼液是由下列組分組成組分含量(重量％)石杉堿甲0.0011，0.INHCl0.002-0.02增稠劑015防腐劑0.01-0.5等滲調(diào)節(jié)劑0-40PH值調(diào)節(jié)劑0-0.05絡(luò)合劑0-0.1水余量，所述的增稠劑選自羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸鈉或聚乙烯醇；所述的防腐劑選自苯扎氯胺、苯扎溴胺、尼泊金甲、乙、丙酯中的一種或一種以上的混合物的一種或多種；所述的等滲調(diào)節(jié)劑是選自甘露醇、葡萄糖、氯化鈉、甘油或丙二醇；所述的PH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硼酸、枸櫞酸、硼酸鈉、枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀或三乙醇胺；所述的絡(luò)合劑選自依地酸二鈉。全文摘要本發(fā)明涉及石杉堿甲眼用制劑及其應(yīng)用。所述的石杉堿甲眼用制劑在制備預(yù)防、治療青光眼、眼壓升高或伴有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的眼科疾病藥物中的應(yīng)用，所述的眼用制劑是石杉堿甲滴眼液和石杉堿甲眼用原位凝膠劑。本發(fā)明優(yōu)點在于成功開發(fā)了石杉堿甲滴眼液和石杉堿甲眼用原位凝膠劑，所述的兩個劑型方便眼科疾病患者使用。所述的石杉堿甲眼用原位凝膠劑在體外為流動性良好的液體；滴眼時，劑量容易準(zhǔn)確控制，使用方便；滴入眼內(nèi)后，能均勻鋪展，并形成凝膠，在眼內(nèi)停留時間較長，不易流失進(jìn)入全身而被吸收，能維持局部有效藥物濃度，提高生物利用度，且毒性低，刺激性效，生物相容性好，是一個有效的治療青光眼的藥物，具有廣闊的開發(fā)前景。文檔編號A61P27/06GK101797223SQ20091004602公開日2010年8月11日申請日期2009年2月6日優(yōu)先權(quán)日2009年2月6日發(fā)明者馮雪梅,周薇,容征星,崔永耀,朱亮,陳紅專申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院