專利名稱：靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原sea基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤的基因治療，具體涉及一種靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原SEA基 因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建，屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤是危害人類健康的頑癥之一，盡管除了手術(shù)、放療和化療，還有導(dǎo)向治療、腫 瘤疫苗和基因治療等多種新的療法，但目前效果仍不盡人意。眾所周知，人體的免疫反應(yīng)具 有抗腫瘤作用，它通過細(xì)胞免疫機(jī)能捕獲和消滅機(jī)體內(nèi)新生的腫瘤細(xì)胞。而引起腫瘤發(fā)生 的最終因素都可以歸結(jié)為機(jī)體免疫效應(yīng)細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上不足以激發(fā)起有效的抗腫瘤 免疫應(yīng)答。因此，從治療上講，有效的抗腫瘤策略(1)增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，主要是提 高腫瘤局部活化的免疫效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，其中主要組織相容性復(fù)合物(MHC)限制性的細(xì)胞 毒T細(xì)胞(CTL/Tc，即殺傷性T細(xì)胞)是最重要的免疫監(jiān)視和效應(yīng)細(xì)胞。(2)采取有效手段 直接殺死腫瘤細(xì)胞。超抗原(Superantigen，SAg)是一組細(xì)菌或病毒編碼的蛋白質(zhì)分子，可不需要 抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell, APC)提呈作用，以完整的蛋白質(zhì)分子形式直 接與APC膜的MHC-II類分子抗原結(jié)合槽外側(cè)結(jié)合并且提呈給T細(xì)胞。SAg-MHC-II類分 子復(fù)合物僅與TCR(T細(xì)胞抗原受體)0鏈的V區(qū)相結(jié)合，由于人類Ve基因有20余種， 故SAg激活的T細(xì)胞克隆數(shù)可達(dá)普通抗原的數(shù)千倍乃至數(shù)萬倍。超抗原的抗腫瘤作用主 要是由SAg依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用來完成(Superantigen-d印endented cellular totoxicity, SDCC)，這是超抗原抗腫瘤的主要作用。再者，SAg激活的⑶4+T細(xì)胞還可以分 泌多種足量的細(xì)胞因子如TNF- a、TNF- ^和INF- y、IL_2、IL_6等，直接或間接地殺傷腫 瘤細(xì)胞。超抗原作為一種新型的抗腫瘤治療模式，近年來研究進(jìn)展很快，主要集中在超抗原 直接抗腫瘤作用、超抗原靶向抗腫瘤作用、以及超抗原的基因治療等方面；目前最有效的是 已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)用于晚期腎癌的5T4Fab-SEA靶向超抗原。金黃色葡萄球菌腸毒素 A(Staphyloccollal enterotoxin, SEA)是目前研究最多的超抗原。但是無論是單用超抗原 進(jìn)行抗腫瘤治療還是目前抗體靶向的超抗原抗腫瘤治療，都還有很多需要克服的困難單 用SAg治療的缺陷也是非常明顯的，即SAg介導(dǎo)的CTL主要?dú)鸐HC-II陽性的腫瘤細(xì)胞， 對MHC-II陰性的腫瘤細(xì)胞殺傷作用較弱，但腫瘤細(xì)胞MHC-II陽性率一般都很低，并具有明 顯的異質(zhì)性，因此，單純的SAg抗腫瘤的效果不理想，且難以避免對機(jī)體MHC-II陽性的正常 細(xì)胞造成的毒副作用。而單抗與超抗原的融合蛋白活化的T細(xì)胞是SEA反應(yīng)性的，并不是 腫瘤特異性的T細(xì)胞。故此類超抗原-單克隆抗體的融合蛋白尚缺乏抗瘤的廣譜性和特異 性，其誘導(dǎo)的靶向抗腫瘤免疫應(yīng)答并不盡如人意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建，它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶 瘤腺病毒部分分為溶瘤腺病毒穿梭質(zhì)粒PSG218與病毒骨架質(zhì)粒pPE3-ccdB，通過脂質(zhì)體共 轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，超抗原部分為金黃色葡萄球菌腸毒素A (SEA)基因片段，該技術(shù)能夠利 用病毒自身的裂解能力殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)病毒的復(fù)制產(chǎn)生子代病毒導(dǎo)致級連放大效應(yīng)， 在腫瘤間自行擴(kuò)散，達(dá)到最終消活全部腫瘤的效果。更關(guān)鍵的是，它能選擇性在腫瘤細(xì)胞內(nèi) 增殖、裂解腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞幾乎沒有影響，這使其在保證治療率的同時(shí)保證了安全 性。因此，腫瘤特異性增殖病毒是一種具有抗腫瘤作用的特殊病毒性基因治療載體。我們 以腫瘤特異性增殖腺病毒質(zhì)粒為載體，攜帶超抗原SEA基因片段，并進(jìn)一步與病毒骨架質(zhì) 粒重組包裝成溶瘤腺病毒_超抗原復(fù)合物，該復(fù)合物將既具有在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖能 力又具有強(qiáng)大細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞刺激能力，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的靶向治療效。本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原SEA基因的溶瘤 腺病毒載體的構(gòu)建，其特征是它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部 分分為溶瘤腺病毒穿梭質(zhì)粒PSG218與病毒骨架質(zhì)粒pPE3-ccdB，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，超抗原部分為金黃色葡萄球菌腸毒素A (SEA)基因片段。所述的金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)基因片段，且SEA基因片段的長度為771bp。所述的靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建方法，其特征 是按如下步驟進(jìn)行(1)超抗原SEA基因的克??；(2)溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建；(3)溶瘤腺病毒的包裝、純化、滴度測定。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該技術(shù)能夠利用病毒自身的裂解能力殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)病毒 的復(fù)制產(chǎn)生子代病毒導(dǎo)致級連放大效應(yīng)，在腫瘤間自行擴(kuò)散，達(dá)到最終消活全部腫瘤的效 果。它能選擇性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖、裂解腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞幾乎沒有影響，這使其在 保證治療率的同時(shí)保證了安全性。因此，腫瘤特異性增殖病毒是一種具有抗腫瘤作用的特 殊病毒性基因治療載體。我們以腫瘤特異性增殖腺病毒質(zhì)粒為載體，攜帶超抗原SEA基因 片段，并進(jìn)一步與病毒骨架質(zhì)粒重組包裝成溶瘤腺病毒_超抗原復(fù)合物，該復(fù)合物將既具 有在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖能力又具有強(qiáng)大細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞刺激能力，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞 產(chǎn)生強(qiáng)大的靶向治療效。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明圖1是SEA基因的PCR電泳結(jié)果；圖2是DNA序列分析結(jié)果；圖3是pDC318-SEA經(jīng)SEA引物PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果；圖4是pDC318-SEA經(jīng)Spel和Sail雙酶切后電泳結(jié)果；圖5為已構(gòu)建的攜帶超抗原SEA基因的非增殖腺病毒DC318-SEA結(jié)構(gòu)圖；圖6為DC318-SEA的PCR鑒定結(jié)果；
具體實(shí)施例方式實(shí)施例(1)實(shí)驗(yàn)所需試劑病毒載體pSG218、PPE3-ccdB、HEK293細(xì)胞均購自上海肝膽外科醫(yī)院病毒與基因 治療中心。Taq酶申能博彩公司
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LipofectAmine2000 試劑盒GIBC0 BRL 公司(2)超抗原SEA基因克隆與鑒定1、超抗原SEA基因的PCR擴(kuò)增以產(chǎn)SEA金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13565為模板，根據(jù)GenBank已知的SEA基因序 列設(shè)計(jì) 1 對引物(P1 5' -CCAATATGAAAAAAACAGCAT-3‘,P2 5' -ATTGGACTTGTATATAAATATATA-3‘)， 行PCR擴(kuò)增后。循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，56°C退火lmin，72°C延伸lmin， 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到771bpDNA 片段，見圖1。2、PCR產(chǎn)物連接入克隆載體PUC57 用EcoRV酶切pUC57質(zhì)粒，將目的基因的PCR產(chǎn)物與pUC57載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連 接，16°C反應(yīng)過夜。轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂氨芐抗性平板，37°C過夜培養(yǎng)，篩選克隆，提 取質(zhì)粒電泳及KpnI、HindIII雙酶切鑒定，并測序確認(rèn)插入產(chǎn)物，見圖2。(3)攜帶超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒載體PDC318-SEA的構(gòu)建及鑒定1、攜帶SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒載體PDC318-SEA的構(gòu)建應(yīng)用PCR技術(shù)將引 入Spel和Sail酶切位點(diǎn)的超抗原SEA基因片段連接到經(jīng)Spel和Sail雙酶切后的非增殖 溶瘤腺病毒穿梭質(zhì)粒PSG218中，將鑒定正確的非增殖溶瘤腺病毒載體命名為PDC318-SEA。 見圖3和圖4。1. 1PDC318載體的酶切PDC3183. OulSpel3. Oul10*BSA7. Oul2Buffer7. OulH2050. Oul_
總體系70. Oul37°C水浴6h后，加入Sail3. Oul10*BSA3. Oul3Buffer10. OulH2O14. Oul_總體系100. Oul37 V水浴6h后，1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(QIAquick GelExtraction)回收PDC318線性化條帶3926bp。1. 2PCR獲得目的基因SEA (圖2)Puc1. Oul2mM dNTP5. OulKOD plus Buffer5. Oul25mM MgS042. Oul上游引物l.Oul下游引物l.OulKOD plus1. OulH2O34. Oul_總體系20. OulPCR 參數(shù)puc57_SEA 質(zhì)粒l.Oul 94 °C 3min
GT310 引物Iul94°C 40sec 一~
GT311 引物Iul490C 40secLscycle
KoD 酶Iul68 0C 90sec __JKoD 酶 Buffer5. Oul2mM dNTP5ul
25mM MgS042ul94°C 40sec ~
55°C 40sec — 27cycle 68 0C 90sec __H2O14. Oul_68 °C 10min總體系50. OulPCR后，用膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction)直接回收SEA基因771bp。1. 3 連接
PDC318/Spe I Sal I2ulSEA/Spe I Sal I8ulSolution IIOul_總體系20. Oul12°C連接12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪瓊脂板(含AMP) 后，37°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-12h。挑取生長的細(xì)菌單克隆，在含氨芐青霉素的LB溶液 中，37°C搖床擴(kuò)增12h。抽提陽性克隆的質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后命名為PDC318-SEA(需 要正向克隆)。1. 4PDC318-SEA 載體的鑒定(圖 3、4、5)PDC318-SEA3. Oul PDC318-SEA3. OulEcoR I0. 5ul Aat II0. 5ulXho I0. 5ul Cla I0. 5ulEcoR I Buffer2. Oul Buffer 42. Oul10XBSA2. Oul 10XBSA2. OulH2O12. Oul H2O12. Oul__總體系20. Oul 總體系20. Oul切出條帶大小3787bp+887bp切條帶大小2730bp+1240bp+704bpPDC318-SEA3.Oul PDC318-SEA 3. OulSpe I0. 5ul Cla I0. 5ulSal I0. 5ul Hinc II0. 5ulBuffer 32. Oul Buffer 42. Oul10XBSA2. Oul 10XBSA2. OulH2O12. Oul H2O12. Oul__總體系20. Oul 總體系20. Oul37 °C水浴Ih后，1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳.切出條帶大小748+3888bp 切出條帶大小2325bp+1995bp+354b2、攜帶SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA的重組將非增殖溶瘤腺病毒載體PDC318-SEA與病毒骨架質(zhì)粒pPE3共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞(是轉(zhuǎn)染腺病毒ElA基因的人腎上皮細(xì)胞系，比較容易轉(zhuǎn)染，是常用的表達(dá)研究外源基因的 細(xì)胞株)，共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，提取腺病毒DNA，應(yīng)用 PCR進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為DC318-SEA。見圖5和圖6。PDC318-SEA 載體的酶切PDC3183. OulSpeI3. Oul10*BSA7. Oul2Buffer7. Oul
H2O50. Oul_總體系70. Oul總體系70. Oul37°C水浴6h后，加入SalI3. Oul10*BSA3. Oul3Buffer10. OulH2O14. Oul_總體系100. Oul37 V水浴8h后，1. 2 %瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(QIAquick GelExtraction)回收 SEA 片段大小 771bp。(4)攜帶超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒PDC318-SEA的擴(kuò)增和滴度測定20ml 10% FBS/DMEM 培養(yǎng)75cm2 培養(yǎng)瓶中長至 80% -90% 293 細(xì)胞，換成 15ml2% FBS/DMEM。取 0. 5ul 首次擴(kuò)增的病毒保存液(病毒空斑感染24孔獲得)，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃動(dòng) 3次，37°C 5% C02孵箱中培養(yǎng)48小時(shí)后收集病毒上清或細(xì)胞沉淀，沉淀細(xì)胞加AD buffer 保存液，-80°C至37°C凍融3次，600g離心20分鐘后去沉淀取上清，收上清和細(xì)胞的混合 液，-80°C至37°C凍融3次，600Xg離心20分鐘去除細(xì)胞碎片，收集上清。反復(fù)擴(kuò)增至需要 病毒量，50 %組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度。
權(quán)利要求
一種靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建，其特征是它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分分為溶瘤腺病毒穿梭質(zhì)粒pSG218與病毒骨架質(zhì)粒pPE3-ccdB，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，超抗原部分為金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)基因片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu) 建，其特征是所述的金黃色葡萄球菌腸毒素A (SEA)基因片段，且SEA基因片段的長度為 771bp。
3.—種權(quán)利要求1所述的靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建 方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行(1)超抗原SEA基因的克隆；(2)溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建；(3)溶瘤腺病毒的包裝、純化、滴度測定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腫瘤的基因治療，具體涉及一種靶向抗腫瘤的表達(dá)超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒載體的構(gòu)建，屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分分為溶瘤腺病毒穿梭質(zhì)粒pSG218與病毒骨架質(zhì)粒pPE3-ccdB，通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，超抗原部分為金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)基因片段，它以腫瘤特異性增殖腺病毒質(zhì)粒為載體，攜帶超抗原SEA基因片段，并進(jìn)一步與病毒骨架質(zhì)粒重組包裝成溶瘤腺病毒-超抗原復(fù)合物，該復(fù)合物將既具有在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖能力又具有強(qiáng)大細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞刺激能力，進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的靶向治療效。
文檔編號A61P35/00GK101812477SQ200910031699
公開日2010年8月25日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者郝林, 韓從輝 申請人:韓從輝;郝林