專利名稱：：一株兼性厭氧海洋施氏假單胞菌的活性提取物及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及來源于細(xì)菌的醫(yī)藥配制品，特別是來源于一株兼性厭氧海洋反硝化細(xì)菌培養(yǎng)物的活性提取物及其制法。
背景技術(shù)：
：海洋微生物來源的新藥開發(fā)是二十一世紀(jì)世界范圍的研究熱點(diǎn)問題，以其新菌種來源、產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)活性物質(zhì)、克服傳統(tǒng)抗生素耐藥性以及實(shí)現(xiàn)資源可持續(xù)等特點(diǎn)而為人們所普遍關(guān)注。目前己經(jīng)從各類海洋微生物中分離到許多結(jié)構(gòu)新穎的抗細(xì)菌抗生素、抗真菌抗生素、抗病毒抗生素、抗腫瘤抗生素以及一些抗炎癥和鎮(zhèn)痛的活性物質(zhì)、酶抑制劑等。但目前新型生命活性物質(zhì)的研發(fā)對(duì)象主要集中于易于研究的海洋好氧微生物，有大量報(bào)道從海洋好氧微生物中分離到新的藥理活性成分。由于海水的物理阻隔作用，中下層海水中存在大量的兼性厭氧細(xì)菌和嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，至今稀見有從這些類型細(xì)菌中分離到活性成分的報(bào)道。海水中的反硝化細(xì)菌屬于兼性厭氧的細(xì)菌類群，這類微生物在好氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行有氧呼吸，在缺氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行硝酸鹽呼吸，在其硝酸鹽呼吸代謝途徑中產(chǎn)生了許多不同于有氧呼吸的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但迄今尚未見有報(bào)道從海洋反硝化細(xì)菌類群在缺氧培養(yǎng)物中分離提取到具有藥理活性的組分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種反硝化細(xì)菌海洋菌株培養(yǎng)液的活性提取物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了該活性提取物的分離方法。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了該活性提取物在制備抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的一株兼性厭氧海洋細(xì)菌DN7是從中國渤海海域的海洋底泥中分離獲得。該菌株合適的生長鹽濃度范圍為2.0%~5.0%;對(duì)銅綠假單胞菌和禾古草芽抱桿菌有抗性。依據(jù)《Bergy，smanualofsystematicalbacteriology》(vol.1.TheWilliamsandwilkinsCo.Baltimore.1984)，經(jīng)鑒定為施氏假單胞菌尸化i^/omw2osWwweW，已于2008年10月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(其簡(jiǎn)稱為CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào)為CGMCCNo.2732。海洋菌株DN7具有下述性質(zhì)革蘭染色為陰性菌。短桿狀，寬0.3pm0.5^im，長1.0^im1.5^im，無鞭毛。在有氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行氧呼吸，菌落為褐色，表面光滑，較粘稠，邊緣規(guī)則；在缺氧培養(yǎng)條件下進(jìn)行硝酸鹽呼吸，產(chǎn)氣，每一菌落將包圍的營養(yǎng)瓊脂脹裂，液體培養(yǎng)基中則產(chǎn)生連續(xù)而均勻的細(xì)小氣泡。最佳生長溫度范圍3537。C，最佳生長pH為7.27.4。對(duì)有機(jī)碳源的利用情況如下在(1)乙酸鹽，(2)酒石酸鉀鈉，(3)淀粉等條件下生長良好。海洋菌株DN7在缺氧培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，而在有氧培養(yǎng)條件下則檢測(cè)不到抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。海洋菌株DN7的16SrDNA序列(1451bp)己向美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank基因序列數(shù)據(jù)庫提交，登陸號(hào)為EU873348。其全序列如下ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGAGCCACGGAGTGATTCATGACTGGG這種海洋菌株DN7可以利用常規(guī)的液體培養(yǎng)方式，可使培養(yǎng)基中含有用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其它營養(yǎng)源。對(duì)光照、時(shí)間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)格的限制，以適宜于海洋菌株DN7生長為準(zhǔn)，并以選擇使培養(yǎng)物的活性提取物的收率最高的條件為好。當(dāng)然這些培養(yǎng)基的組分、氫離子的濃度、培養(yǎng)溫度、攪拌條件等均應(yīng)根據(jù)所使用的菌株種類及外部條件等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，并獲得最好的效果。由以上所得的培養(yǎng)物出發(fā)，通過一些適當(dāng)?shù)姆椒ň湍芴崛∑渲械幕钚越M分，這些方法是常用于提取代謝物的方法，例如可利用活性提取物與其它雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力及分子量等方面的差別進(jìn)行提取，這些方法可以單獨(dú)使用，也可以適當(dāng)配合或反復(fù)使用。其中，以如下培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和提取方法來培養(yǎng)海洋菌株DN7產(chǎn)生抗生素最佳液體培養(yǎng)基為乙酸鈉20.0g;認(rèn)032.0g;K2HP040.5g;MgS040.2g;NaCl25.0g;MgS047H203.0g;CaCl22H200.05g;蒸餾水1000ml;用濃度為0.10.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.2±0.2。本發(fā)明的液體培養(yǎng)基還可以用如下配方為酒石酸鉀鈉20.0g;KN032.0g;K2HP040.5g;MgS040.2g;人工海水(或陳海水)1000ml;用濃度為0.10.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.27.5。人工海水配方NaCl25.0g;Na2S04KC10.7g;NaHC030.20g;KBr0.10g;H3B03O.(Bg;NaF0.003g;1.0mol/LMgCl2溶液53mL;1.0mol/1CaCl2溶液10mL;0.1mol/LSr02溶液0.90ml;蒸餾水1000ml用濃度為0.10.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.27.5。A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中12rC、0.105Mpa滅菌20min;冷卻后接種海洋菌株DN7，并用無菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中3537"C下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為10~15天；B.擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比510%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DN7菌液，于恒溫培養(yǎng)箱中35~37"C下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為1520天；C.提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液依次分別用等體積的乙酸乙酯、正丁醇連續(xù)抽提3次(即乙酸乙酯提取時(shí)分出乙酸乙酯提取液，剩余物用正丁醇提取)，7將正丁醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50。C減壓蒸干，得一份干固體；D.提純將上述干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠薄層板上，選用體積比為二氯甲烷甲醇三乙胺=3:1:0.02的展開劑展開，采用薄層層析生物自顯影活性測(cè)試法和紙片法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，用甲醇洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用Cw反相柱，用體積濃度為5~100%的甲醇水作為流動(dòng)相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再用100%甲醇洗脫20分鐘，檢測(cè)254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰組分，將含活性組zvw、vfr—hm瑜m仏扭茲厶v、/pBnr黃工伯twt/八r^ra析古力口、jvyu"兀Y儀ra/!M:符然/)c'i人v9V上^i，口d形j木。本發(fā)明中從海洋菌株DN7中提取得到的活性提取物，通過抗菌模型篩選，采用瓊脂稀釋法(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.2000.Approvedstandard:M2A7，7thed.NCCLS，Wayne,Pa.)測(cè)定對(duì)銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的MIC值，證實(shí)其培養(yǎng)液的正丁醇提取相具有抗菌活性制備出的活性組分抗銅綠假單胞菌的MIC值為0.64ng/mL，抗枯草芽孢桿菌的MIC值為1.28|ag/mL。利用本發(fā)明的活性提取物中的有效組分，可以用于制備抗菌的藥物。以下用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l.液體培養(yǎng)基為用濃度為O.lmol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.2±0.2。A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121'C、0.105Mpa滅菌20min;冷乙酸鈉20.0g;2,0g;0.5g;0.2g;25.0g;3.0g;0.05g;KN03K2HPQMgS04NaClMgS047H20CaCl22H20蒸餾水1000ml;卻后接種海洋菌株DN7，并用無菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中3537"C下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為10~15天；B.擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5~10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DN7菌液，于恒溫培養(yǎng)箱中3537'C下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為1520天；C.提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液依次分別用等體積的乙酸乙酯、正丁醇連續(xù)抽提3次，將正丁醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓蒸干，得一份干固體；rj廬企Ttr爭(zhēng)收"去工ra/7irzv幼1始"hn,K縣m崎被在sr^烊工zv太p;開U7::t始、強(qiáng)曰促^t::^nr丄^cui問rf乂j刀'jyi。j/jh:^里t白T^倉;a卞，at、1卞j乂jDi^t^'n土"人f守/石板上，選用體積比為二氯甲垸甲醇三乙胺=3:1:0.02的展開劑展開，采用薄層層析生物自顯影活性測(cè)試法和紙片法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，用甲醇洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用C,8反相柱，用體積濃度為5100%的甲醇水作為流動(dòng)相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再用1,00%甲醇洗脫20分鐘，檢測(cè)254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份白色粉末。實(shí)施例2.液體培養(yǎng)基為酒石酸鉀鈉20.0g認(rèn)032,0gK2HP040.5gMgS040.2g人工海水(或陳海水)1000ml用濃度為0.3mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.2~7.5。人工海水配方NaCl25.0gNa2S044.0gKC10.7gNaHC030.20gKBr0.10gH3B030.03g9NaF0.003g1.0mol/LMgCl2溶液53mL1.0mol/1CaCl2溶液10mL0.1mol/LSr02溶液0.90ml蒸餾水1000ml用濃度為0.2mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.2~7.5。A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中12rC、0.105Mpa滅菌20min;冷土n1=古玄宋出、)^、、,關(guān)齒嫂ry\T，卄m工齒+立羊"^^U茲ite"圭tfei區(qū)^rT4宏^".i|々rfn、)垂ifer盟"h乂口J女l卞74f"Y卞四'PFd丄、/，7Trn乂Li四+口開巫TrYra，"Wi皿wc爾'i、A6i、；dT皿iR力a且于恒溫培養(yǎng)箱中3537'C下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為1015天；B.擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5~10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DN7菌液，于恒溫培養(yǎng)箱中35~37"C下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為1520天；C.提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液依次分別用等體積的乙酸乙酯、正丁醇連續(xù)抽提3次，將正丁醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓蒸干，得一份干固體；D.提純將上述干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠薄層板上，選用體積比為二氯甲垸甲醇三乙胺=3:1:0.02的展開劑展開，采用薄層層析生物自顯影活性測(cè)試法和紙片法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，用甲醇洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用ds反相柱，用體積濃度為5100%的甲醇水作為流動(dòng)相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再用100%甲醇洗脫20分鐘，檢測(cè)254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份白色粉末。實(shí)施例3.活性組分活性測(cè)定結(jié)果采用瓊月旨稀釋》去(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.2000.Approvedstandard:M2A7，7thed.NCCLS，Wayne,Pa.)測(cè)定對(duì)銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的MIC值，證實(shí)其培養(yǎng)液的乙酸乙酯提取相具有抗菌活性制備出的活性組分抗銅綠假單胞菌的MIC值分別為0.64pg/mL,抗枯草芽孢桿菌的MIC值為1.28嗎/mL。序列表SEQUENCELISTING〈110〉大連交通大學(xué)〈120〉一株兼性厭氧海洋施氏假單胞菌的活性提取物及其制法和用途<160>1<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1451〈213〉海洋菌株DN7的16SrDNA序列〈400〉1acgctggcggcaggcctaacacatgc犯gtcgagcggatgaagagagcttgctctttgat60tcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtsgtgggggacaacgtttc,120gEm3gg認(rèn)gctaataccgcatacgtcctacggg卿卿caggggaccttcgggccttg180cgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgsggt33tggCtcaccaaggct240acgatccgta3ctggtctgag鄉(xiāng)atgatcagtcacactgg已a(bǔ)ctgagacacggtccaga300ctcctacggg已ggcagcagtggggaatattggscaatgggcgaaagcctgatccagccat360gccgcgtgtgtga卿aggtcttcggattgtaaagcqctttaagttgggaggaagggcat420taacctaatacgttagtgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaacttcgtgc■cagcagccgcggtaatacgaagggtgc朋gcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgc540gcgtaggtggtttgttaagttgaatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatcc600aaaactggcaagctagagtatggc卿gggtggtggaatttcctgtgtagcggtg^atg660gga3ggaacaccagtggcgaaggcgaccacctgggctaatactgacactg720gcgtggggagt已gataccctggtagtccax;gccgtaaacg780atgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcatt已a(bǔ)gtcga840ccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaa■gcggtggagcatgtggtttaattcga已gca已cgcgaag33ccttaccaggccttgacatg960cagagaactttCCagELg已tggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatgg1020ctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagtcccgt犯cgagcgcaacccttgt1080ccttagttaccagcacgtta郷tgggcactct^ggagactgccggtgacaaaccggag114011<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1.一株兼性厭氧海洋施氏假單胞菌DN7CGMCCNo.2732培養(yǎng)液的活性提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋菌株DN7培養(yǎng)液的活性提取物，其特征在于為缺氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)物的正丁醇提取物，對(duì)銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌有抗性。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的海洋菌株DN7培養(yǎng)液的活性提取物的制備方法，其特征在于包括下列步驟'A.種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中12rC、0.105Mpa滅菌20min;冷卻后接種海洋菌株DN7，并用無菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中3537。C下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為1015天；B.擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比510%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器，采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株DN7菌液，于恒溫培養(yǎng)箱中35~37"C下培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為1520天；所述種子培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)基組成為乙酸鈉雄g認(rèn)032.0gK2HP040.5gMgS040.2gNaCl25.0gMgS047H203.0gCaCl22H200.05g蒸餾水1000ml用濃度為0.10.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)使其pH為7.2±0.2;C.提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液依次分別用等體積的乙酸乙酯、正丁醇連續(xù)抽提3次，將正丁醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓蒸干，得一份干固體;D.提純將上述干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠薄層板上，選用體積比為二氯甲垸甲醇三乙胺=3:1:0.02的展開劑展開，采用薄層層析生物自顯影活性測(cè)試法和紙片法追蹤活性斑點(diǎn)；再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，用甲醇洗脫；洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用ds反相柱，用體積濃度為5100%的甲醇水作為流動(dòng)相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再用100%甲醇洗脫20分鐘，檢測(cè)254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份白色粉末。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的海洋菌株DN7培養(yǎng)液的活性提取物的制備方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)基組成為酒石酸鉀鈉20.0gKN032.0gK2HP040.5gMgS040.2g人工海水或陳海水1000ml用濃度為0.10.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.27.5;所述人工海水組成為NaCl25.0gNa2S044,0gKC10.7gNaHC030.20gKBr0.10gH3B030.03gNaF0.003g1.0mol/LMgCl2溶液53mL1.0mol/lCaCl2溶液10mL0.1mol/LSrO溶液0.90ml蒸餾水1000ml用濃度為0.10.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.2~7.5。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的海洋菌株DN7培養(yǎng)液的活性提取物的制備方法，其特征在于所述人工海水用陳海水代替。6.權(quán)利要求1或2所述的海洋菌株DN7培養(yǎng)液的活性提取物在制備抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。全文摘要一株兼性厭氧海洋施氏假單胞菌的活性提取物及其制法和用途，從中國渤海分離獲得的海洋菌株DN7，鑒定為施氏假單胞菌Pseudomonasstuszeri。DN7缺氧條件下擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，其正丁醇提取相經(jīng)硅膠薄層層析和反相高效液相色譜分離，得到兩個(gè)有效部分的白色粉末，對(duì)銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌有抗菌活性，具有作為抗菌藥物的潛在用途。文檔編號(hào)A61P31/04GK101496820SQ200910010499公開日2009年8月5日申請(qǐng)日期2009年2月26日優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日發(fā)明者付步飛,翼張,軍穆,董學(xué)偉,顧曉潔申請(qǐng)人:大連交通大學(xué)