專(zhuān)利名稱(chēng)：用于多發(fā)性骨髓瘤的治療的aplidine的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及aplidine和類(lèi)似物的在癌癥治療中、特別是在多發(fā)性 骨髓瘤的治療中的用途。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤表現(xiàn)為從單一無(wú)性系得到的漿細(xì)胞的惡性增殖。術(shù) 語(yǔ)多發(fā)性骨髓瘤和骨髓瘤可以互換使用。
漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體，即通過(guò)血、液移動(dòng)以幫助身體去除有害物質(zhì)的蛋 白質(zhì)。每種類(lèi)型的漿細(xì)胞通過(guò)制造大量的一個(gè)類(lèi)型的抗體而僅對(duì)一種 特定物質(zhì)作出反應(yīng)。這些抗體發(fā)現(xiàn)并且抵抗那一種物質(zhì)。因?yàn)樯眢w有 許多類(lèi)型的漿細(xì)胞，可以與許多種物質(zhì)反應(yīng)。當(dāng)癌癥牽涉到漿細(xì)胞的 時(shí)候，身體繼續(xù)產(chǎn)生越來(lái)越多的這些細(xì)胞。所有異常和所有完全相同 的不需要的漿細(xì)胞被稱(chēng)作骨髓瘤細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞傾向于在骨髓中和 骨的堅(jiān)硬的外側(cè)部分中集中。有時(shí)它們僅聚集在一塊骨中而且形成單 個(gè)塊(mass)或腫瘤，被稱(chēng)作漿細(xì)胞瘤。然而，在大多數(shù)情況下，骨 髓瘤細(xì)胞聚集在許多骨中，常常形成許多胂瘤而且引起其它問(wèn)題。當(dāng) 這發(fā)生的時(shí)候，疾病被稱(chēng)作多發(fā)性骨髓瘤(MM)。
因?yàn)榛加蠱M的人有大量異常的相同漿細(xì)胞，同樣，他們有太多 的一個(gè)類(lèi)型的抗體。它的產(chǎn)物胂瘤和宿主對(duì)它作出反應(yīng)造成多種器官 功能障礙和骨痛或骨折的癥狀、腎衰竭、易感性感染、貧血、高血釣， 而且有時(shí)有凝固異常情況、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和高粘度的血管表現(xiàn)。
MM是在西方世界中診斷出的列第二位的最普遍的血液學(xué)惡性腫 瘤，僅在美國(guó)每年就有約15,000個(gè)新病例的發(fā)病率。不幸地，盡管在 過(guò)去的約30年中非常努力地致力于對(duì)基于細(xì)胞毒性的化學(xué)治療的治療 活性進(jìn)行改進(jìn)，MM目前仍祐:i人為是不治之癥，而且MM病人的總存
3活數(shù)基本上在3-4年中依然沒(méi)有變化。重要地，MM診斷的中值年齡 <65歲，而且在診斷上超過(guò)1/3的MM病人<55歲對(duì)于相對(duì)年輕的 MM病人的這個(gè)實(shí)際的比例，MM的i會(huì)斷表明，在'給好沒(méi)有其它的并 存病的情況下，高度的可能性是，他們的總幸存者的壽命將比與其年 齡匹配的非MM病人的平均預(yù)期壽命更顯著地短。
最近，在MM的治療處理中已經(jīng)有一連串重要的進(jìn)步，就是2類(lèi) 新抗癌劑的抗-MM活性載入文獻(xiàn)，所述的2類(lèi)新抗癌劑是沙利度胺 (和它的免疫調(diào)節(jié)的衍生物)和蛋白酶體抑制劑。雖然這兩類(lèi)試劑已 經(jīng)顯示，在對(duì)常規(guī)的或以高劑量細(xì)胞毒素化學(xué)療法為基礎(chǔ)的用藥法的 復(fù)發(fā)/頑固性的MM病人的處理中是有效的，但是顯著比例的MM病 人新形成對(duì)那些新試劑的耐藥性，同時(shí)起始的反應(yīng)者(甚至那些實(shí)現(xiàn) 了可耐受的完全緩解)可以最終復(fù)發(fā)。因此，為了進(jìn)一步改善MM病 人的結(jié)局和有希望去取得對(duì)這個(gè)目前不能治愈的瘤形成的高治愈率， 迫切需要研制新類(lèi)型的抗MM藥劑。

發(fā)明內(nèi)容
我們已經(jīng)首次確定了 aplidine具有非常有效的抗多發(fā)性骨髓瘤活
性
Aplidine ( Dehydrodidemnin B)是從地中海海革肖 Aplidium albicans中分離的環(huán)狀縮肽。<formula>formula see original document page 4</formula>Aplidine
作為在此處使用的術(shù)語(yǔ)aplidine也涵蓋任何藥學(xué)可接受的鹽、酉;溶劑合物、水合物或前體藥物化合物，在施用它們后能給接受者提供
(直接或間接地)化合物aplidine。鹽和其它衍生物以及前體藥物的制 備，可以采用本領(lǐng)域已知的方法實(shí)施。
Aplidine類(lèi)似物包括在WO 02/2596中公開(kāi)的化合物。 關(guān)于aplidine、 Aplidine類(lèi)似物、它們的用途、組成和合成的更多 信息可以在專(zhuān)利申請(qǐng):WO 91/9485、 WO 98/1352、 WO 99/42125、 WO01 76616、 WO 01/35974、 WO02/30441和WO 02/2596中找到。我們通過(guò) 特別參考這些PCT文本各自的內(nèi)容來(lái)引入它們。
已顯示Aplidine在體外和I期和II期臨床試驗(yàn)中有與抗癌劑一樣 有用的可能性。Aplidine具有幾種作用方式，包括阻斷VEGF分泌、 抑制蛋白質(zhì)的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及誘導(dǎo)Gl細(xì)胞周期停滯。在mi期試 驗(yàn)中的劑量限制性毒性是肌肉毒性，伴隨值得注意的缺乏嚴(yán)重的骨髓 抑制。
Aplidine顯示有效的抗人腫瘤固體細(xì)胞系，特別是抗ICso值分別 在0.18 nM和0.45 nM上的非小細(xì)胞肺腫瘤和結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的體外活 性(Faircloth等，1995， Proceedings 8th ECCO Congress,Paris, Abstract no。 122， 529 ; Lobo等，1997, Anticancer Res, 17， 333-336 )。國(guó) 立癌癥研究所(NCI)的人體外小組已證實(shí)對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC )、 黑色素瘤、卵巢癌和結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的選擇性(Faircloth等，1996， Ann Oncol. ， 7， 34)。
對(duì)這種海洋生物縮肽的初期研究提出抗鼠腫瘤(例如B16黑色素 瘤)的體內(nèi)活性(Faircloth等，1995， Proceedings 8th ECCO Congress, Paris, Abstract no。 122， 529)。而且，在生產(chǎn)人異種移植腫瘤的老鼠 中進(jìn)行的附加的活體內(nèi)研究，證實(shí)了抗乳房MX-1和結(jié)腸CX-1的活性 (Faircloth等,1996， Ann Oncol,， 7， 34)。兒科的白血球過(guò)多癥的I 期試驗(yàn)已經(jīng)完成了 (JimenoJ。 etal., 2002， Ann Oncol. ， 13 ( suppl。 5 )， Abst. 65P )。最后顯示還證明了 aplidine抵抗皮下植入的胃、前列 腺和中空纖維的伯基特淋巴瘤人異種移植和膀胱癌的體內(nèi)抗腫瘤活性 (Faircloth等，1999， Proc.Am.Assoc。 CancerFees.， 40， Abstract2612 ; Faircloth等，1998， Proc.Am.Assoc。 Cancer Res.， 39， Abstract 227 )。 本發(fā)明涉及aplidine和類(lèi)似物在治療多發(fā)性骨髓瘤中的應(yīng)用。 本發(fā)明還涉及在治療多發(fā)性骨髓瘤中使用的包含aplidine或類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受的載體、運(yùn)載體或稀釋劑的藥物組合物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供治療任何受多發(fā)性骨髓瘤侵襲的哺乳動(dòng)物，特
別是人類(lèi)的方法，該方法包含施用治療上有效量的aplidine或類(lèi)似物 到患病個(gè)體。
另一方面本發(fā)明涉及aplidine或類(lèi)似物在制備治療多發(fā)性骨髓瘤 的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供包含分離的容器的試劑盒，該分離的容器包含含有 aplidine或類(lèi)似物的藥物組合物和重建試劑。還提供了重建的方法。


圖1.經(jīng)aplidine治療的MM細(xì)胞系小組的MTT比色法存活率試 驗(yàn)的結(jié)果
圖2. Aplidine (20nM, 48 hrs )抵抗從多重耐藥的MM病人得 到的原發(fā)MM腫瘤細(xì)胞樣品的體外活性
圖3.原發(fā)MM肺瘤細(xì)胞(從多重耐藥的MM病人分離)與骨髓 基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)的共培養(yǎng)不顯著減弱MM細(xì)胞對(duì)Aplidin的反應(yīng)
性
圖4. A)來(lái)自多重耐藥MM病人的原發(fā)MM肺瘤細(xì)胞的Aplidine 治療(20nM, 0-12 hrs)阻止VEGF的分泌
圖4. B) Aplidine ( 20 nM， 12 hrs )通過(guò)原發(fā)MM腫瘤細(xì)胞、 BMSCs，還通過(guò)共培養(yǎng)的MM細(xì)胞和BMSCs阻止VEGF分泌
圖5. Aplidine使原發(fā)MM肺瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素敏感
圖6. Aplidine抑制培養(yǎng)中的抗多發(fā)性骨髓瘤的地塞米*>( MM1.R) 細(xì)胞的生長(zhǎng)，與腸胃外路線一樣有效(MM1.S)
圖7. Aplidine抑制Bcl-2過(guò)分表達(dá)的MM細(xì)胞的生長(zhǎng)
發(fā)明詳述
盡管多發(fā)性骨髓瘤(MM)的治療處理近來(lái)有進(jìn)展，但是當(dāng)前不存 在對(duì)于這種疾病的治愈性治療，該疾病是在西方世界中診斷出的列笫 二位的最普遍的血液學(xué)惡性腫瘤。筌定具有抗MM活性的新治療劑， 特別在復(fù)發(fā)或?qū)ΤＲ?guī)方法新療法和/或沒(méi)有最佳反應(yīng)的病人中仍然是迫 切需要優(yōu)先考慮的。我們發(fā)現(xiàn)了 Aplidine (APL)， 一種新的來(lái)源于海洋生物的縮肽， 其在體外非常有效地對(duì)抗MM細(xì)月包。特別地，我們觀察到與臨床有關(guān) 的APL濃度有對(duì)抗一大組人MM細(xì)胞系的活性，包括抗傳統(tǒng)的抗MM 試劑(例如地塞米松、烷化劑、蒽環(huán)類(lèi)抗生素)或新型抗MM試劑(例 如沙利度胺、調(diào)節(jié)免疫的沙利度胺衍生物、蛋白酶抑制劑PS-341 [bortezomib、Apo2L/TRAIL )，或針對(duì)MM細(xì)胞的細(xì)胞過(guò)度表達(dá)的主 要抗細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑的MM細(xì)3包系。MTT比色法存活率試驗(yàn)顯示 aplidine是普遍有效地對(duì)抗我們小組的細(xì)胞系，其ICso用量范圍為 10nM或更少(對(duì)于壓倒性多數(shù)的這些MM細(xì)月包系)。重要地，通過(guò) APL的濃度觸發(fā)這有效的體外抗MM活性，所迷APL的濃度是在這 種試劑的I期臨床試驗(yàn)在實(shí)體瘤中臨床上達(dá)到的。而且這些ICsn值比 得上這種試劑在大多數(shù)APL敏感的實(shí)體瘤模型中的體外活性。
進(jìn)一步證實(shí)APL的在體外抗MM活性不是僅局限于一種細(xì)胞系模
抑制耐藥的病人新分離的原發(fā)MM腫瘤細(xì)胞的影響。在來(lái)自MM病人 (對(duì)于€0138+ CD38+ MM腫瘤細(xì)胞的純度>卯％ )的10個(gè)原發(fā)肺瘤 樣品的預(yù)試驗(yàn)中，我們觀察到的aplidine的體外抗MM活性與從我們 的細(xì)胞系小組的試驗(yàn)獲得的結(jié)果一致?？偟膩?lái)說(shuō)，aplidine對(duì)抗原發(fā) MM腫瘤樣品和MM細(xì)胞系的體外研究結(jié)果顯示，這種試劑可以有效 地對(duì)抗寬廣范圍的MM細(xì)胞，包括那些直接生成或后天性的抵抗常規(guī) 治療或其它有效抗MM活性的新試劑的MM細(xì)月包。
雖然細(xì)胞因子或細(xì)胞粘附介導(dǎo)的局部骨髓(BM)微環(huán)境(例如 BM基質(zhì)細(xì)胞)的相互作用保護(hù)來(lái)自常規(guī)治療(例如地塞米松或細(xì)胞毒 素化學(xué)療法)(refs)的MM細(xì)胞，但是APL能夠克服在MM細(xì)胞與 BM基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)模型中的這種保護(hù)效應(yīng) 。
除此之外，通過(guò)在離體的共培養(yǎng)模型中的MM細(xì)胞或BM基質(zhì)細(xì) 胞，APL使MM細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒素化學(xué)療法誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和促血管生 成細(xì)胞活素(例如VEGF)的取消分泌敏感。這提示aplidine可以與 常規(guī)的以細(xì)胞毒素化學(xué)療法為基礎(chǔ)的方案結(jié)合以達(dá)到增強(qiáng)的抗MM活 性。對(duì)MM細(xì)胞與其它抗癌藥對(duì)APL的靈敏度模式的比較分析，顯示 用APL處理的MM的劑量-反應(yīng)關(guān)系不同于那些與藥物給藥相關(guān)的劑 量-反應(yīng)關(guān)系。這進(jìn)一步支持通過(guò)與來(lái)自那些當(dāng)前可以得到的抗MM藥
7物不同的分子機(jī)制介導(dǎo)APL的抗MM性質(zhì)的理念，而且還提示APL 甚至可以有效地抗MM的亞型，戶(hù)斤述亞型能對(duì)其它現(xiàn)在臨床研制中的 新療法有抵抗力。這些發(fā)現(xiàn)與實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)中APL的有利的安全 圖譜相匹配。
對(duì)于本發(fā)明，aplidine的類(lèi)似物可以用來(lái)代替APL， aplidine本身。 典型的所述化合物是如WO0202596詳細(xì)i兌明的。本發(fā)明的化合物的例 子包括在WO0202596中給出的優(yōu)選的化合物，而且我們特別引入該專(zhuān) 利說(shuō)明書(shū)優(yōu)選化合物的詳述和在WO0202596中給出的有關(guān)方面。更優(yōu) 選地，類(lèi)似物在結(jié)構(gòu)上接近aplidine，而且通常與aplidine在在一個(gè)氨 基酸或末端側(cè)鏈方面不同。不同的氨基酸可以在分子的循環(huán)部分中或 在側(cè)鏈中。所述化合物的許多例子在WO0202596中給出，而且它們是 本發(fā)明使用的候選方案。
aplidine或類(lèi)似物的藥物制劑可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)耐緩嚼缤ㄟ^(guò) 口腔(包括含服或舌下)、直腸、鼻、局部(包括含服、舌下或經(jīng)皮膚)、 陰道或腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈注射或皮內(nèi))途徑以適合于施 用。所述成分可以通過(guò)任何藥學(xué)領(lǐng)域已知的方法制備，例如通過(guò)采用 將有效成分與載體或運(yùn)載體(輔藥)締和而帶入。
包含aplidine或類(lèi)似物的藥物組合物的例子，包括適合于靜脈內(nèi) 施用組分的液體(溶液，混懸液或乳劑)，而且它們可能含有純粹的化 合物或與其組合的任何載體或其它藥理學(xué)活性物質(zhì)。溶解的aplidine 在熱應(yīng)激試驗(yàn)和光應(yīng)激試驗(yàn)條件下顯現(xiàn)實(shí)質(zhì)性降解，并且發(fā)展了凍干 劑型，見(jiàn)W099/42125引入此處作為參考。
可以通過(guò)靜脈輸注施用aplidine和類(lèi)似物或本發(fā)明的組合物。可 以使用最高達(dá)72小時(shí)的輸液時(shí)間，更優(yōu)選1-24小時(shí)，最優(yōu)選約1小時(shí)， 約3小時(shí)或約24小時(shí)中的任意一個(gè)。允許實(shí)現(xiàn)治療而不用在醫(yī)院過(guò)夜 的短的輸液時(shí)間是特別需要的。然而，如果需要，輸液可能是大約24 小時(shí)或甚至更長(zhǎng)。輸液可以用變化的模式在適合的間隔實(shí)現(xiàn)，比如一 周一次，每周兩次，或每周更多次數(shù)，任選地以典型一周的間隙重復(fù) 每周。
在優(yōu)選的應(yīng)用方法中，在多個(gè)周期中完成給藥。在每個(gè)周期的第 一周，給病人靜脈輸注本發(fā)明化合物，允許病人在剩余的周期瘙愈。 每個(gè)周期的優(yōu)選持續(xù)時(shí)間是l、 3或4周中的任意一個(gè)；作為需要可以
8給出多個(gè)周期。在備選的給藥實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，比方說(shuō)本發(fā)明的化合物每3 周連續(xù)5天施用約1小時(shí)。其它方案可以;波設(shè)計(jì)為可變的。
根據(jù)被治療病人個(gè)體的耐受性，實(shí)施劑量延遲和/或劑量減少對(duì)治 療方案的調(diào)整。
雖然在上文中給出了對(duì)劑量的指導(dǎo)，但是化合物的適當(dāng)劑量可以 根據(jù)特定的組成、用法、和特定的部位、；故治療的宿主和腫瘤而變化。 其它因素像年齡、體重、性別、日常飲食、給藥的時(shí)間、排泄率、宿 主的狀態(tài)、聯(lián)合用藥、反應(yīng)靈敏度和疾病的嚴(yán)重性將被考慮。給藥可 以在最大耐受劑量之內(nèi)連續(xù)地或周期性地實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步的關(guān)于施用 apUdine的指導(dǎo)在WO 01/35974中給出，其全文引入此處作為參考。
在多發(fā)性骨髓瘤的治療中，Aplidine和類(lèi)似物可以與其它藥物一 起使用，以提供聯(lián)合治療。其它藥物可能構(gòu)成相同組合物的一部分， 或作為分離的組合物提供，在同一時(shí)間或不同時(shí)間施用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例 統(tǒng)計(jì)分析
通過(guò)雙向方差分析的檢驗(yàn)，然后通過(guò)Dimcan post hoc檢驗(yàn)，來(lái)檢 測(cè)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。在全部分析中，考慮P〈0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)上 顯著的。
實(shí)施例1:
MTT比色法存活率測(cè)定
使用3- U，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鐠淡化物(MTT; Sigma Chemical, St Louis, MO)比色測(cè)定，如前所述檢測(cè)細(xì)胞存活 率(Mitsiades C.S.等Blood 。 2001， 98， 795-804 ; Mitsiades N.等Proc Natl Acad Sci USA 2002， 99， 14374-14379; Mitsiades N.等Blood. 2003， 101， 2377-2380)。簡(jiǎn)要地，在2.5%胎牛血清(FBS )和在終濃 度為0-100 nM的Aplidine或DMSO運(yùn)載體對(duì)照的存在下，將70°/o-80% 融合度的細(xì)胞鋪于48孔培養(yǎng)板上。在各處理結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞用1 mg/mL MTT在37。C培養(yǎng)4小時(shí)；然后在有力的移液管沖洗下加入異丙醇和1NHC1的混合物(23: 2， vol/vol)以溶解甲臘結(jié)晶。用630nm作為對(duì) 照波長(zhǎng)，在570nm測(cè)量有活力的細(xì)胞的染色吸光度(A)。將細(xì)胞的成 活力估算成占未處理對(duì)照的值的百分?jǐn)?shù)。全部的實(shí)驗(yàn)至少被重復(fù)3次， 而且在各個(gè)實(shí)驗(yàn)中，各試驗(yàn)條件至少在三份孔中被重復(fù)。記錄的數(shù)據(jù) 是代表性實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。
耐受藥物的MM細(xì)胞系和原發(fā)性MM腫瘤細(xì)月包的小組 我們?cè)u(píng)估了藥物敏感的人MM細(xì)胞系和藥物耐受的人MM細(xì)胞系 的小組中aplidine的活性，包括下列細(xì)胞系地塞米松(Dex)-敏感 的MM-IS和Dex-抵抗的MM-1R細(xì)胞系(作為學(xué)術(shù)禮物由Dr Steven Rosen惠贈(zèng)，Northwestern University, Chicago, IL);化學(xué)敏感的 RPMI-8226/S細(xì)胞系和它們的阿霉素-(Dox6， Dox40 )、美法侖(LR5) -和鹽酸米托蒽醌(MR20)-抵抗的亞系(作為學(xué)術(shù)禮物由Dr William Dalton惠贈(zèng)，Lee Mo, Cancer Center, Tampa, FL ); Dr H.A.Messner 的OCl-My-5細(xì)月包(Ontario Cancer Institute, ON， Canada); Dr T.Kishimoto的S6B45細(xì)月包(Osaka University, Osaka, Japan ); ARD， ARK和ARP-l細(xì)胞(Dr Nikhil Munshi惠贈(zèng)，Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA); OPM-1 ， OPM-6, K620和LP-1細(xì)胞(作 為學(xué)術(shù)禮物由Dr Leif Bergsagel惠贈(zèng)，Cornell University, New York, NY);與從美國(guó)典型菌種收藏所(Rockville, MD )獲得的U266和 NC1-H929細(xì)胞一樣。
從10名病人的骨髓(BM)抽吸物中分離原發(fā)性MM腫瘤細(xì)胞， 上述病人對(duì)常規(guī)治療(以類(lèi)固醇-和細(xì)胞毒素化學(xué)療法-為基礎(chǔ)的)和更 多最近發(fā)展的抗MM試劑(例如沙利度胺或蛋白酶體抑制劑)有抵抗 力。通過(guò)Ficoll密度離心開(kāi)始處理BM抽吸物，通過(guò)CD138+選擇純化 (通過(guò)流式細(xì)胞4義活化細(xì)胞分選(FACS )，或通過(guò)CD138+正向選擇使 用免疫磁性分離)，采用如前所述的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Mitsiades C. S.等 Blood。 2001, 98, 795-804)。在CD38+CD138+或CD38+CD45RA陽(yáng)細(xì) 胞中，所有分選的腫瘤細(xì)胞樣品具有> 90%的純度。就在Aplidine治 療之前，通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除法測(cè)定，所有原發(fā)腫瘤樣品被證實(shí)具有超過(guò) 95%的成活力。將所有MM細(xì)胞系和病人MM細(xì)胞在RPM1 1640培 養(yǎng)基中培養(yǎng)(Gibco Laboratories, Grandlsland, NY),培養(yǎng)基中添加了 10%活性炭葡聚糖處理過(guò)的月臺(tái)牛血清(FBS; Hyclone， Logan, UT)以及L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素(Gibco Laboratories )。
結(jié)果Aplidine抵抗藥物耐受性MM細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤樣品的活
我們?cè)囼?yàn)了一大組人MM細(xì)月包系的體外活性，該MM細(xì)胞系包括 對(duì)常規(guī)(例如地塞米松、烷化劑、蒽環(huán)類(lèi)抗生素)或新型(例如沙利 度胺、調(diào)節(jié)免疫的沙利度胺衍生物、Apo2L/TRAIL)抗MM試劑敏感 或耐受的MM細(xì)胞。MTT比色法存活率測(cè)定(圖1 )顯示，Aplidine普 遍地有效對(duì)抗我們小組的細(xì)胞系，ICso用量(對(duì)于絕大多數(shù)這些MM 細(xì)胞系)在10nM或更少的范圍(它對(duì)應(yīng)于臨床上可達(dá)到的aplidine 的濃度，基于這種藥劑的I期試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn))。重要地，aplidine的這種體 外活性比得上它在大多數(shù)aplidine敏感的實(shí)體瘤模型中的體外活性。 使用分級(jí)蔟分析和關(guān)聯(lián)性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)算法(relevance network algorithms),我們比較了 MM細(xì)J包對(duì)aplidine的敏感度與其它抗癌藥 的比較的圖像，發(fā)現(xiàn)aplidine的劑量-反應(yīng)關(guān)系的圖像是清楚地與那些 其它藥物不同的。
這個(gè)發(fā)現(xiàn)不但進(jìn)一步支持通過(guò)與那些其它藥物不同的分子機(jī)制介 導(dǎo)aplidine抗MM性質(zhì)的理念，而且提示APL甚至可以有效抵抗這 種疾病的不同分子的亞型。
結(jié)果Aplidine的抵抗藥物耐受的原發(fā)MM腫瘤細(xì)胞的活性 為了進(jìn)一步證實(shí)APL的體外抗MM活性不只限于細(xì)胞系模型，我 們也測(cè)試了 APL對(duì)從耐沙利度胺或它的類(lèi)似物和/或蛋白酶體抑制劑 的病人新分離的原發(fā)MM肺瘤細(xì)月包的影響。在對(duì)來(lái)自MM病人的10 個(gè)原發(fā)腫瘤樣品的初步試驗(yàn)中(對(duì)于CD138+CD38+MM腫瘤細(xì)胞，純 度>90% )，我們獲得的Aplidine的體外抗MM活性與從我們的細(xì)胞系 小組的試驗(yàn)獲得的結(jié)果一致(圖2 )。
總的來(lái)i兌，對(duì)aplidine抵抗原發(fā)MM腫瘤樣品和MM細(xì)胞系體外 研究的結(jié)杲表明，這種試劑可以有效地抗廣譜的MM細(xì)胞，包括那些 新形成的或?qū)ΤＲ?guī)治療或其它具有有效抗MM活性的研究藥物獲得 抗性的MM細(xì)月包。
ii實(shí)施例2:
對(duì)Bcl-2和組成型活化的Akt的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
用編碼十四烷?；?組成型活化的)Akt或Bcl-2 (Upstate Biotechnologies, Lake Placid, NY)的質(zhì)粒載體或用空(neo )載體穩(wěn) 定地轉(zhuǎn)染MM-1S細(xì)胞，然后使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies )操作，接著如前所迷(Mitsiades C.S.等Oncogen" 2002， 21， 5673-5683; Mitsiades N.等ProcNatlAcad Sci USA. 2002， 99， 14374-14379)在包含G418的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
結(jié)果Aplidine克服Bcl-2或組成型活化的Akt抗細(xì)胞凋亡的影響 因?yàn)锽d-2和PI-3K/Akt級(jí)連反應(yīng)在MM和其它的瘤形成中藥物 造成的細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中的作用，我們還表征了 aplidine在用Bcl-2或 十四烷酰化的Akt構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MM-IS人MM細(xì)胞中的活性，與 空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照MM-1S細(xì)胞進(jìn)行比較。我們7見(jiàn)察到Bcl-2-或myrAkt-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)aplidine的靈敏度4氐于空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(圖1)，提示 Bcl-2
aplidine的抗MM作用
實(shí)施例3:
MM細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)的共培養(yǎng)測(cè)定 在粘附到BMSCs的時(shí)候，MM細(xì)胞具有減少的對(duì)傳統(tǒng)的抗MM 治療，例如地塞米爭(zhēng)>或細(xì)胞毒素化學(xué)療法(Chauhan D.等Blood.1996， 87， 1104-1112)的敏感性。這種形式的耐藥性祐:i人為是在MM病人接 受基于施用糖皮質(zhì)激素類(lèi)和/或細(xì)胞毒素化學(xué)療法治療的時(shí)候，最后復(fù) 發(fā)的主要原因。相比之下，在最近發(fā)展的MM的療法中，在化學(xué)抵抗 型或激素抵抗型MM的病例中的抗腫瘤活性已經(jīng)藉由幾類(lèi)藥品達(dá)到， 例如蛋白酶體抑制劑(HideshimaT.等Cancer Res.2001 ， 61, 3071-3076),其可以克月l BMSCs對(duì)MM細(xì)胞的保護(hù)作用。所以我們 研究了是否aplidine也可以克J!l BMSCs與MM細(xì)胞相互作用的分子 的后遺癥，并且達(dá)到本文上下文中的抗MM活性。因此我們用如前所 述的BMSCs進(jìn)行了 MM細(xì)胞的體外共培養(yǎng)測(cè)定將BMSCs在24孔培養(yǎng)板上生長(zhǎng)融合。隨后用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌，將從3名MM病人分 離的原發(fā)腫瘤細(xì)胞(在CD138+細(xì)胞中〉95o/o純度)加入到涂鋪了 BMSCs 的孔或如前所述的對(duì)照孔 (Uchiyama H.等Blood.1993 ， 82， 3712-3720 ; Mitsiades N.等Blood。 2003， 101, 4055-4062)，然后在 存在或不存在aplidine的環(huán)境下培養(yǎng)48小時(shí)。進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)分析 以檢測(cè)有活力的MM細(xì)胞的CD138+群體并且將aplidine對(duì)MM細(xì)胞 成活力的影響表示成存活的細(xì)胞數(shù)相對(duì)于各自的經(jīng)運(yùn)載體處理的培養(yǎng) 物的百分比表示。
結(jié)果Aplidine克服骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)對(duì)MM細(xì)胞的保護(hù)
效應(yīng)
來(lái)自我們的小組和其它研究者的先前的研究已經(jīng)顯示，細(xì)胞因子-或細(xì)胞粘附介導(dǎo)的局部骨髓(BM)微環(huán)境(例如BM基質(zhì)細(xì)胞)的相 互作用可以保護(hù)MM細(xì)胞免受常規(guī)治療(例如地塞米+>或細(xì)胞毒素化 學(xué)療法)的影響(ChauhanD.等Blood, 1996， 87， 1104-1112)。我們 因此評(píng)價(jià)了 Aplidine在MM細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)的環(huán)境中的抗MM 作用，而且使用流式細(xì)胞儀測(cè)定在MM細(xì)胞區(qū)域中的細(xì)胞死亡(圖3 )， 觀察到MM-BMSCs相互作用不顯著減弱aplidine的體外抗MM活性 (aplidine劑量不顯著地影響B(tài)MSCs的存活率)。
實(shí)施例4:
VEGF分泌的定量
BMSCs粘附到MM細(xì)胞誘導(dǎo)增強(qiáng)血管原細(xì)胞活素，例如血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子(VEGF)的分泌，該事件#^人為對(duì)于在BM環(huán)境中在MM 細(xì)胞的位置上的新血管的補(bǔ)充具有重大意義。因此我們使用如前所述 的MM細(xì)胞與BMSCs的體外共培養(yǎng)測(cè)定將BMSCs在24孔培養(yǎng)板 上生長(zhǎng)到鋪滿(mǎn)評(píng)價(jià)了是否aplidine可以通過(guò)MM和/或BMSCs來(lái)阻止 VEGF的分泌。在用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌后，將從3名MM病人分離的 原發(fā)腫瘤細(xì)胞(在CD138+細(xì)胞中〉95。/D純度)加入到涂鋪了 BMSCs 的孔或如前所述的對(duì)照孔(Uchiyama H.等Blood.1993， 82， 3712-3720; Mitsiades N.等Blood.2003, 101， 4055-4062)，然后在存在或不存在 Aplidine的環(huán)境下培養(yǎng)12小時(shí)。收集上清液，然后使用商業(yè)上可得到
13的試劑盒(VEGF ELISA kit; R&D Systems),依照制造廠商的技術(shù)說(shuō) 明書(shū)，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定VEGF的濃度。
結(jié)果Aplidine減少M(fèi)M/BMSCs分泌VEGF
已經(jīng)提出將VEGF作為在BM微環(huán)境中MM細(xì)胞增殖反應(yīng)推定的 介質(zhì)。VEGF也是在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域中腫瘤誘導(dǎo)的新血管補(bǔ)充的 關(guān)鍵介質(zhì)。因?yàn)樵谙鹊膱?bào)告提出對(duì)急性白血病細(xì)胞的aplidine治療導(dǎo) 致VEGF分泌受到抑制，我們研究了是否Aplidine也可以通過(guò)MM細(xì) 胞和/或通過(guò)BMSCs阻止VEGF的分泌。確實(shí)，使用aplidine ( 20 nM ) 治療12小時(shí)能夠通過(guò)MM細(xì)胞阻止VEGF的分泌，以及抵消在MM 細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)時(shí)發(fā)生的VEGF分泌的增加(圖4A和4B )。
實(shí)施例5:
結(jié)果Aplidine使MM細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒素化學(xué)療法敏感 使用MTT比色法存活率測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)這個(gè)治療與Aplidine 聯(lián)合的時(shí)候，MM細(xì)胞增強(qiáng)了對(duì)阿霉素的反應(yīng)性。圖5顯示通過(guò)用 aplidine ( 2 nM )進(jìn)行治療，原發(fā)MM腫瘤樣品對(duì)阿霉素(10ng/mL) 敏感的例子。
實(shí)施例6:
測(cè)試了 Aplidine對(duì)抗在培養(yǎng)中建立的不同的細(xì)胞。 所使用的細(xì)胞是
-多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞(MM1.S) ' -抗地塞米;^的多發(fā)性骨髓瘤系(MM1.R) -過(guò)度表達(dá)Bcl-2的多發(fā)性骨髓瘤系
對(duì)于已建立的細(xì)胞系，將細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板中而且允許在生長(zhǎng) 前24小時(shí)加入藥品。將細(xì)胞與藥物一起培養(yǎng)指定的時(shí)間，然后通過(guò) XTT或MTS試驗(yàn)，使用自動(dòng)平板讀數(shù)器測(cè)定細(xì)胞成活力。
這些研究的結(jié)果表示在圖6-7中。
權(quán)利要求
1.aplidine和aplidine類(lèi)似物在制備治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的用途。
2. 4艮據(jù)權(quán)利要求1的aplidine或aplidine類(lèi)似物的用途， 其中所述的aplidine或aplidine類(lèi)似物是aplidine。
3. 根據(jù)前面任何權(quán)利要求的aplidine或aplidine類(lèi)似物的 用途，其中將aplidine或aplidine類(lèi)似物與其它的藥或藥品或治 療組合使用以提供聯(lián)合治療。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中所述的aplidine或 aplidine類(lèi)似物用于治療具有新形成的抗性或獲得的抗性的多發(fā) 性骨髓瘤。
5. 被用于治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物組合物，它包含 aplidine或aplidine類(lèi)似物和藥學(xué)上可接受的載體、運(yùn)載體或稀 釋劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述的aplidine或 aplidine類(lèi)似物是aplidine,
7. 用于施用aplidine或aplidine類(lèi)似物以治療多發(fā)性骨髓 瘤的醫(yī)療試劑盒，其包括在分離的容器中包含aplidine或 aplidine類(lèi)似物的藥物組合物和重建劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的醫(yī)療試劑盒，其中所述的aplidine或 aplidine類(lèi)似物是aplidine。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于多發(fā)性骨髓瘤的治療的Aplidine。本發(fā)明涉及Aplidine和aplidine類(lèi)似物在制備治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P19/08GK101579520SQ200910003999
公開(kāi)日2009年11月18日 申請(qǐng)日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者C·S·米特斯亞德斯, D·梅蒂納, G·T·費(fèi)爾克洛思, J·R·伯蒂諾, K·安德森, N·米特斯亞德斯 申請(qǐng)人:達(dá)納-法伯癌癥協(xié)會(huì)有限公司;法馬馬有限公司