專利名稱：合成嗎啉代低聚物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過嗎啉代亞基單體的偶聯(lián)來合成連接磷酰二胺的嗎啉代低聚物的 方法，具體地涉及用于在每個(gè)偶聯(lián)步驟中使受保護(hù)的嗎啉代環(huán)氮脫保護(hù)的改進(jìn)的方法，并 涉及在鳥嘌呤堿基的N2和06/m基團(tuán)上均具有保護(hù)的鳥嘌呤嗎啉代(MoG)亞基的用途。與 使用單保護(hù)的鳥嘌呤亞基和/或常規(guī)的環(huán)氮脫保護(hù)方法合成的嗎啉代低聚物相比，使用這 些改良合成的嗎啉代低聚物的純度和收率更高。參考文獻(xiàn)Albert,A. ,Physical Methods in Heterocyclic Chemistry (l^i^Uf 巾白勺 ), Vol. I, A. R. Katritzky, Ed. , Academic Press, pp 44(1963).Fisher, A.，Galloway, W. J.，and Vaughan, J.，J. Chem. Soc. 3591 (1964).Garrison, A. W. and Boozer, C. E.，J. Am. Chem. Soc. 90 (13) :3486_3494 (1968) ·Gough et al. (1979) Nucleic Acids Research (核酸研究)7 :1955_1964.Hata et al. (1983)Tetrahedron Lett. 24 :2775_2778.Jones et al. (1982A)Tetrahedron Lett. 23 :2253_2256.Jones et al. (1982B)Tetrahedron Lett. 23 :2257_2260.Mitsunobu, 0. (1981) Synthesis ( ) 1 :1"28.Ravikumar, V. et al，第 5，510，476 號(hào)美國專利。Reese et al. (1981)Tetrahedron Lett. 22 :4755-4758.Reese et al. (1984) J. Chem. Soc. , Perkin Trans. 1 1263—1270.Rogne, 0.，J. Chem. Soc. 727 (1970).Summerton, J. E. and Weller, D. D. (1993)第 5，185，444 號(hào)美國專利。Summerton, J. Ε. and ffeller, D. D. , Antisense Nuc 1. Acid Drug Dev. 7 (3) 187-195(1997).Summerton, J. E. and ffeller, D. D.，第 5，185，444 號(hào)美國專利(1993)。SS連接磷酰二胺的嗎啉代低聚物或PMO是核酸類似物，其與互補(bǔ)RNA緊密結(jié)合并具 有特定的序列，并且用于調(diào)節(jié)蛋白合成并由此調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這些低聚物是由通過嗎啉代 主鏈體系支持的堿基配對(duì)識(shí)別部分(雜環(huán)堿基)組成的。能夠很容易地由相應(yīng)的核糖核苷 來制備用于合成這樣的低聚物的嗎啉代亞基，該核糖核苷容易購買并且是便宜的前體(參 見例如 Summerton and Weller，1993，1997)。在這樣的合成中，與常規(guī)的寡核苷酸合成相同，通常將雜環(huán)堿基上的官能團(tuán)掩蔽 以防止合成轉(zhuǎn)化中的干擾。例如，N-三苯甲基化嗎啉代單體(la-f ；

圖1)的活化需要使 5’_羥基與合適的二氯磷酰胺反應(yīng)以形成活化的亞基2a-f。在大型(50-100加侖反應(yīng)器) 中，粗活化亞基通常被高水平的副產(chǎn)物污染。色譜分離純化之后 ，將活化亞基以約50%的收 率分離成A、C、I、T、U和它們的受保護(hù)形式，而僅以5%的收率分離成活化的單獨(dú)保護(hù)的G 亞基，這被認(rèn)為是由于未受保護(hù)的06氧的存在。
06-未受保護(hù)的鳥嘌呤亞基在低聚物階段也發(fā)生副反應(yīng)。例如，在偶聯(lián)步驟中06 氧能夠與活化的亞基反應(yīng)形成06-磷酸化化合物或衍生化合物，并且在用氨最終裂解堿基 保護(hù)基的過程中，氨能夠在C6上反應(yīng)以取代這些化合物，得到二氨基嘌呤衍生物。這樣的 雜質(zhì)難以通過色譜法除去，并造成收率的大量損失。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)提出了各種保護(hù)方案以減少常規(guī)的寡核苷酸合成中的未受保護(hù) 的鳥嘌呤06位的副反應(yīng)(參見例如Gough et al. 1979 ；Reese et al. 1981，1984 Jones et al. 1982A，1982B)。然而，這些方案在應(yīng)用于PMO合成中時(shí)大多是不成功的。因此，在PMO 合成中，特別是在采用G嗎啉代亞基的PMO合成中尋求改進(jìn)的方法以增加收率和純度。在使用之前，通常還用三苯甲基或取代的三苯甲基化合物對(duì)嗎啉代亞基的嗎啉代氮進(jìn)行保護(hù)。在低聚物合成過程中，該基團(tuán)在每個(gè)周期中必須被除去以引入下一個(gè)亞基。無 法完全除去保護(hù)基團(tuán)造成污染期望的低聚物產(chǎn)物的N-I缺失序列的形成。通常用酸來除去三苯甲基，并且傳統(tǒng)上用于PMO合成的脫保護(hù)試劑為羧酸 (Summerton et al. 1993，1997)。然而，磷酰二胺基團(tuán)也易受到酸的影響，并且如圖1所示， 用于脫三苯甲基化的羧酸也能夠促進(jìn)與酰胺化合物鍵合的磷酰二胺鍵的水解，可能具有更 大量的主鏈降解。例如，包含氰基乙酸的20%乙腈/DCM是有效的脫保護(hù)試劑，但是發(fā)現(xiàn)其 導(dǎo)致PMO產(chǎn)物中磷酰二胺鍵的大量水解(5-10% )。在偶聯(lián)反應(yīng)之前，還必須將羧酸從合成載體樹脂中完全除去；否則，形成由含有 3’ _酰化化合物的截?cái)嗟牡途畚锝M成的副產(chǎn)物?；谶@些原因，在PMO合成中需要改進(jìn)的試劑用于嗎啉代氮脫保護(hù)。MM在一方面，本發(fā)明提供了包含結(jié)構(gòu)I的嗎啉代化合物 其中R1選自低級(jí)烷基、二(低級(jí)烷基)氨基和苯基；R2選自低級(jí)烷基、單環(huán)芳基甲基和單環(huán)(芳氧基)甲基；R3選自三芳基甲基和氫；并且Y選自受保護(hù)或未受保護(hù)的羥基或氨基、氯氨基磷酸酯基團(tuán)和與另外的嗎啉代化 合物或嗎啉代低聚物的環(huán)氮鍵合的磷酰二胺鍵。在所選擇的實(shí)施方案中，Y選自受保護(hù)或未受保護(hù)的羥基和氯氨基磷酸酯基團(tuán)，例 如-ο-Ρ( = ο)-N(CH3)2Cl形式的氯氨基磷酸酯基團(tuán)。當(dāng)Y為受保護(hù)的羥基時(shí)，其優(yōu)選為三烷基甲硅烷基保護(hù)的羥基。優(yōu)選地，基團(tuán)R3選自三苯甲基(三苯基甲基)、4_甲氧基三苯甲基、4-甲基三苯甲基、4，4’ - 二甲基三苯甲基和4，4’，4”_三甲基三苯甲基?；鶊F(tuán)R1優(yōu)選為低級(jí)烷基，特別 是C1-C4烷基，并且最特別為-C (CH3) 3 (叔丁基)?；鶊F(tuán)R2優(yōu)選選自芐基和-CH (CH3) 2 (異丙基)。在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供了合成嗎啉代低聚物的改進(jìn)方法，該方法包括(a)使具有未受保護(hù)的環(huán)氮的固相支持的嗎啉代亞基與堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單 體反應(yīng)，所述嗎啉代亞基單體具有三芳基甲基保護(hù)的環(huán)氮和5’ -環(huán)外碳上的活化的氨基磷
酸酯基團(tuán)，由此形成5’ -環(huán)外碳與未受保護(hù)的環(huán)氮之間的磷酰二胺鍵；(b)將受保護(hù)的環(huán)氮脫保護(hù)以形成未受保護(hù)的環(huán)氮；以及(c)用另外的堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體將步驟(a)和(b)重復(fù)一次或多次；其中至少一種的堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體為具有結(jié)構(gòu)I的雙重保護(hù)的鳥嘌呤 嗎啉代化合物 其中R1選自低級(jí)烷基、二(低級(jí)烷基)氨基和苯基；R2選自低級(jí)烷基、單環(huán)芳基甲基和單環(huán)(芳氧基)甲基；R3選自三芳基甲基和氫；并且Y為氯氨基磷酸酯基團(tuán)。上述結(jié)構(gòu)中表示的變量的所選擇的實(shí)施方案包括上文描述的那些實(shí)施方案。在另外的方面中，本發(fā)明提供了合成嗎啉代低聚物的改進(jìn)的方法，該方法包括(a)使具有未受保護(hù)的環(huán)氮的固相支持的嗎啉代亞基與堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單 體反應(yīng)，所述嗎啉代亞基單體具有三芳基甲基保護(hù)的環(huán)氮和5’ -環(huán)外碳上的活化的氨基磷 酸酯基團(tuán)，由此形成5’ -環(huán)外碳與未受保護(hù)的環(huán)氮之間的磷酰二胺鍵；(b)將受保護(hù)的環(huán)氮脫保護(hù)以形成未受保護(hù)的環(huán)氮；以及(c)用另外的堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體將步驟(a)和(b)重復(fù)一次或多次；其中所述脫保護(hù)包括在含有三氟乙醇的溶劑中，使三芳基甲基保護(hù)的環(huán)氮與包含 雜環(huán)胺鹽的試劑溶液接觸，所述鹽為雜環(huán)胺與選自磺酸、三氟乙酸和鹽酸的酸的鹽，所述雜環(huán)胺的質(zhì)子化形式的PKa為1-4。優(yōu)選地，雜環(huán)胺選自吸電子基取代的吡啶、噻唑、噠嗪、吡唑、三唑以及吸電子基取 代的這些化合物的取代衍生物。這樣的吸電子基(EWG)包括鹵素、氰基、醛、酮、羧酸酯和甲酰胺。優(yōu)選地，雜 環(huán)胺為吸電子基取代的吡唳，例如氯取代的吡啶或氰基取代的吡啶。優(yōu) 選地，胺鹽為諸如烷基磺酸鹽、(氟烷基)磺酸鹽或?qū)妆交撬猁}的磺酸的鹽或者三氟乙酸 鹽。在所選擇的實(shí)施方案中，該鹽選自3-氯吡啶鐺甲磺酸鹽(CPM)和4-氰基吡啶鐺三氟 乙酸鹽(CYTFA)。優(yōu)選地，含有TFE的溶劑包含體積比為約90 10至25 75的二氯甲烷和三氟 乙醇，并且更優(yōu)選地，其體積比為約80 20DCM TFE。三芳基甲基保護(hù)基團(tuán)選自三苯甲基(三苯基甲基)、4_甲氧基三苯甲基、4-甲基三 苯甲基、4，4，- 二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲基。可以將本文所描述的改良和改進(jìn)組合，從而進(jìn)行上述步驟(a)-(c)，其中(i)至少一種的堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體為具有如上文所述的結(jié)構(gòu)I的雙重保 護(hù)的鳥嘌呤嗎啉代化合物，以及(ii)受保護(hù)的環(huán)氮的脫保護(hù)包括在含有三氟乙醇的溶劑中，使三芳基甲基保護(hù)的 環(huán)氮與包含雜環(huán)胺鹽的試劑溶液接觸，所述鹽為雜環(huán)胺與選自磺酸、三氟乙酸和鹽酸的酸 的鹽，所述雜環(huán)胺的質(zhì)子化形式的PKa為1-4。通常，合成還包括按照標(biāo)準(zhǔn)方法將嗎啉代低聚物從固相中裂解并將堿基脫保護(hù)。當(dāng)結(jié)合附圖來閱讀下文的發(fā)明詳述時(shí)，本發(fā)明的這些和其它目的和特征將變得更 加完全明顯。附圖簡述圖1顯示活化的嗎啉代亞基的形成。圖2顯示雙重保護(hù)的嗎啉代G亞基(DPG)衍生物的形成路線，其中將N2位苯乙酰 化并用4-硝基苯乙基(NPE)來保護(hù)06位。圖3顯示雙重保護(hù)的嗎啉代G亞基(DPG)衍生物的可選的形成路線，其中將N2位 苯乙?；⒉捎?-硝基苯乙基(NPE)來保護(hù)06位。圖4顯示DPG衍生物的形成，其中將N2位苯乙?；⒉捎帽交酋；一?PSE) 或甲基磺?；一?MSE)來保護(hù)06位。圖5顯示DPG衍生物的形成，其中將N2位苯乙?；⒉捎萌谆坠柰榛一?(TMSE)來保護(hù)06位。圖6顯示DPG衍生物的形成，其中將N2位苯乙?；⒉捎靡幌盗蟹蓟苌飦肀?護(hù)06位。圖7顯示DPG衍生物的形成，其中將N2位苯乙?；⒉捎靡幌盗邪被柞；苌?物來保護(hù)06位。圖8顯示DPG衍生物的形成，其中將N2位苯乙?；⒉捎?_(新戊酰氧基)芐氧 基(POB)來保護(hù)06位。圖9顯示在用羧酸處理磷酰二胺鍵合的嗎啉代低聚物(PMO)時(shí)能夠發(fā)生的副反應(yīng) 中，磷酰二胺(PDA)鍵向氨基磷酸酯(酰胺化物)鍵的轉(zhuǎn)化。
圖10顯示二硫化物錨的制備，其用在合成樹脂的改性中，通過用硫醇處理使低聚 物輕易地釋放，該合成樹脂用于嗎啉代低聚物的逐步制備。圖11顯示含有三甘醇的部分(“尾部”)的制備，該部分增加合成的反義低聚物的 水溶性。圖12顯示用于固相合成嗎啉代低聚物的樹脂的制備。發(fā)明詳述I.定義除非另有說明，本文所用的以下術(shù)語具有下述含義“嗎啉代低聚物”是指具有主鏈的聚合物分子，所述主鏈支持能夠與通常的多核苷 酸形成氫鍵的堿基，其中該聚合物缺少戊糖主鏈部分，并且更具體地來說缺少通過磷酸二 酯鍵連接的核糖主鏈，該核糖主鏈為典型的核苷酸和核苷，但是相反地該聚合物含有環(huán)氮， 通過該環(huán)氮進(jìn)行偶聯(lián)。如以下所示，優(yōu)選的嗎啉代低聚物由“嗎啉代亞基”結(jié)構(gòu)組成，其中 優(yōu)選地，通過(硫代)磷酰二胺鍵將該低聚物連接在一起，將一個(gè)亞基的嗎啉代氮連接至相 鄰亞基的5’環(huán)外碳。每個(gè)亞基包括嘌呤或嘧啶堿基配對(duì)部分Pi，其通過堿基特異性氫鍵有 效地與多核苷酸中的堿基結(jié)合。 例如在共有的美國專利5, 698, 685,5, 217, 866,5, 142, 047,5, 034, 506, 5，166，315,5, 185，444,5, 521，063和5，506，337中詳細(xì)描述了嗎啉代低聚物，所有這些專 利通過引用明確地并入本文?！傲柞６贰被鶊F(tuán)包含具有兩個(gè)結(jié)合的氧原子和兩個(gè)結(jié)合的氮原子的磷，并且在本 文中還可以指具有一個(gè)結(jié)合的氧原子和三個(gè)結(jié)合的氮原子的磷。如以下通式II所示，在本 文所述的低聚物的亞基間的鍵中，一個(gè)氮通常懸掛在主鏈上，并且第二個(gè)氮為嗎啉代環(huán)結(jié) 構(gòu)中的環(huán)氮?；蛘呋虼送猓缫韵峦ㄊ絀II和IV所示，氮可以存在于5’ -環(huán)外碳上。 在硫代磷酰二胺鍵中，一個(gè)氧原子，通常為懸掛在本文所述低聚物的主鏈上的氧， 被硫代替?！肮滔嘀С值膯徇鷣喕蹦軌蚴堑谝粋€(gè)或任意隨后的嗎啉代亞基單體，其通過本 文所述的固相逐步合成被引入嗎啉代低聚物中。該亞基通過其5’環(huán)外碳結(jié)合至固體載體 或固體載體上的生長的低聚物鏈?！皦A基保護(hù)”是指采用保護(hù)基團(tuán)對(duì)嗎啉代亞基上的諸如嘌 呤或嘧啶堿基的堿基配對(duì)基團(tuán)進(jìn)行的保護(hù)，該保護(hù)基團(tuán)適于避免逐步低聚物合成過程中堿基配對(duì)基團(tuán)的反應(yīng)或干擾?！盎罨陌被姿狨セ鶊F(tuán)”通常為氯氨基磷酸酯基團(tuán)，其在低聚物中的最終的氨基 磷酸酯鍵中所期望的氮處具有取代。實(shí)例為(二甲基氨基)氯氨基磷酸酯，即-0-P( = 0) (NMe2) Cl。本文所使用的術(shù)語“帶電荷的”、“不帶電荷的”、“陽離子的”和“陰離子的”是指處 于諸如約6至8的接近中性pH值的化學(xué)部分的主導(dǎo)狀態(tài)。優(yōu)選地，該術(shù)語是指處于生理pH 值即約7. 4的化學(xué)部分的主導(dǎo)狀態(tài)。“低級(jí)烷基”是指1至6個(gè)碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、異丁基、叔丁基、 異戊基、正戊基和異戊基。在所選擇的實(shí)施方案中，“低級(jí)烷基”基團(tuán)具有1至4個(gè)碳原子， 或者1至2個(gè)碳原子；即甲基或乙基。類似地，“低級(jí)烯基”是指2至6個(gè)，優(yōu)選3或4個(gè)碳 原子的烯基，例如烯丙基和丁烯基?！安桓蓴_的”取代基為對(duì)本文所述的反義低聚物結(jié)合至其預(yù)期的靶的能力沒有不 利影響的取代基。這樣的取代基包括小的基團(tuán)并優(yōu)選為非極性基團(tuán)，例如甲基、乙基、甲氧 基、Zi氧基、輕基或氟。II. PMO合成中的堿基保護(hù)由于嗎啉代化學(xué)的具體挑戰(zhàn)，堿基保護(hù)基團(tuán)必須滿足若干要求。該保護(hù)基團(tuán)應(yīng)當(dāng) 容易被引至雜環(huán)部分上并且在此之后對(duì)亞基活化和純化條件以及固相合成是穩(wěn)定的。該保 護(hù)基團(tuán)應(yīng)當(dāng)不與生長鏈的嗎啉代胺部分反應(yīng)，而應(yīng)當(dāng)使活化的嗎啉代亞基與生長的低聚物 鏈完全偶聯(lián)。該保護(hù)基團(tuán)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選被氨裂解，而不引入新的雜質(zhì)。最后，為了避免在活化之 前色譜純化的需求，其應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致結(jié)晶亞基衍生物的生成。如下文和比較例中所描述的，如用于核酸合成的在雙重保護(hù)的鳥苷的文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo) 的保護(hù)基團(tuán)不夠滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)于嗎啉代G亞基需要新的保護(hù)策略。如下文所述， 發(fā)現(xiàn)06位的4-(新戊酰氧基)芐氧基的使用滿足所有上述標(biāo)準(zhǔn)。A. 06保護(hù)基團(tuán)比較數(shù)據(jù)Al. 4-硝基苯乙基醚(NPE)如圖2(Mitsunobu 1981)或圖 3 (Jones et al. 1982B)所示制備了該衍生物。雖 然能夠以合理的收率來制備粗06保護(hù)的亞基，但該化合物不容易結(jié)晶并且僅能夠通過硅 膠色譜來進(jìn)行足夠的純化，這對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)是不期望的。在對(duì)大范圍的重新打漿和/或 重結(jié)晶條件進(jìn)行測試之后，發(fā)現(xiàn)含有丁氧基乙醇的溶劑組合使材料結(jié)晶有一些困難。然而， 由于化合物可能作為溶劑合物結(jié)晶，因此不能將過量的丁氧基乙醇從最終產(chǎn)物中除去。在 活化反應(yīng)中，存在過多的醇溶劑會(huì)是不可接受的。通過β -消除機(jī)理用強(qiáng)堿將NPE基團(tuán)裂解。這些條件傾向于產(chǎn)生反應(yīng)性副產(chǎn)物 4-硝基苯乙烯，其能夠隨后與低聚物上的反應(yīng)活性部位反應(yīng)。雖然將各種清除劑(例如硫 醇和1，3_ 二羰基化合物)加入脫保護(hù)混合物中以試圖阻止低聚物對(duì)副產(chǎn)物的捕獲，但均沒 有完全成功地消除這個(gè)內(nèi)部回轉(zhuǎn)問題。甚至在純化之后，用這種亞基制備的低聚物仍具有 黃色的色調(diào)。Α2.苯基磺?；一?PSEI)和甲基磺?；一?MSE)
如圖4所示，通過相應(yīng)的2-硫代乙醇衍生物將這些基團(tuán)引入(Joneset al. 1982A， 1982B)。然而，對(duì)于最終的亞基，未能發(fā)現(xiàn)成功的結(jié)晶方法。
像以上的NPE基團(tuán)一樣，通過β-消除機(jī)理將這些基團(tuán)裂解。加入低聚物中之后， 這些衍生物產(chǎn)生了與采用NPE基團(tuán)出現(xiàn)的相同問題；即脫保護(hù)的過程中形成的反應(yīng)性烯烴 副產(chǎn)物的內(nèi)部回轉(zhuǎn)。
A3.三甲基甲硅烷基乙基醚如Jones (Jones et al. 1982B)所報(bào)導(dǎo)的，按照?qǐng)D5所示制備了 06-TMSE-改性的 嗎啉代鳥嘌呤亞基，但是其在低聚物合成中是不穩(wěn)定的。用這種亞基制備的低聚物顯示出 與由06-未受報(bào)護(hù)的G亞基制備的低聚物相似的一系列副產(chǎn)物。A4.苯基醚 按照Reese et al. (1981,1984)的方法制備了具有06-苯基取代的嗎啉代鳥嘌呤 亞基(圖6)。衍生物包括未取代的苯基、2，5-二氯苯基、五氟苯基和3-氟苯基。這樣的亞 基能夠被引入PMO中，但是不能使采用常見試劑的脫保護(hù)進(jìn)行完全而沒有低聚物的降解， 該常見的試劑例如2-硝基苯甲醛肟和強(qiáng)堿。A5.氨基甲酸酯按照Hata et al. 1983的方法合成了若干06-氨基甲酸酯衍生物(圖7)。取決于 所使用的衍生物，在低聚物合成中這些衍生物的使用給出了變化的結(jié)果。對(duì)于諸如二苯基 氨基甲?；愃莆锏妮^不穩(wěn)定的化合物來說，在固相合成的偶聯(lián)步驟中保護(hù)基團(tuán)向生長鏈 的3’ -氮的轉(zhuǎn)移是顯著的，結(jié)果生成含有3’ - 二苯基氨基甲酰基部分的截?cái)嗟牡途畚?。?夕卜，06-氨基甲酸酯具有兩個(gè)可能與氨反應(yīng)的部位。雖然諸如二苯基氨基甲?；母谢?性的部分在羰基上產(chǎn)生相對(duì)選擇性的攻擊，但更穩(wěn)定的二甲基氨基甲酸酯和吡咯烷基氨基 甲酸酯顯示出明顯的轉(zhuǎn)化成二氨基嘌呤的競爭的C6位的氨的反應(yīng)。B. 4-(新戊酰氧基)芐氧基保護(hù)基團(tuán)通過有效的、高收率的合成將4_(新戊酰氧基)芐氧基醇(4a，圖8)引入嗎啉代 鳥嘌呤亞基中?；罨澳軌虼笠?guī)模地合成并且可重現(xiàn)地分離該亞基(圖1和8中的化合 物If)而無需色譜純化，并且能夠使其從多種溶劑(例如THF/水、THF/庚烷、乙腈、各種酯 /烴混合物)中結(jié)晶。以50-200加侖的規(guī)模(批次大小8-27kg的化合物Ic)制備的十個(gè) 批次的這種亞基獲得了平均收率為65%的產(chǎn)物，其純度(通過HPLC)為97.6%至99.2%。與單保護(hù)的G相比，該亞基更完全地轉(zhuǎn)化成活化的亞基(即轉(zhuǎn)化成5’ _氯氨基磷 酸酯化合物)，并且其能夠更容易通過硅膠色譜法純化。在規(guī)模上，從化合物If至化合物 2f (圖1)的總體收率為約50%?？梢圆捎肞OB保護(hù)基團(tuán)以及用于N2和嗎啉代環(huán)氮的保護(hù)基團(tuán)的其它組合。合適 的N2保護(hù)基團(tuán)包括苯乙?；?如圖8所示)以及乙?；?、丙?；惗□；捅窖跻阴；?。 適合用于偶聯(lián)步驟之間的嗎啉代環(huán)氮保護(hù)的三苯甲基化合物包括未取代的三苯甲基、4-甲 基-三苯甲基、4，4’_ 二甲基-三苯甲基和4，4’，4”_三甲基三苯甲基，以及4-甲氧基三苯 甲基。還能夠使用其它?；Ｗo(hù)基團(tuán)來代替POB基團(tuán)的苯酚部分的新戊?；：线m的選 擇包括N，N-二甲基氨基甲?；捅郊柞；?。在PMO合成過程中，沒有看見其中新戊?；呀?jīng)變成結(jié)合至完全長度的PMO的較 小片段的3’ _末端的產(chǎn)物，即上文討論的06-氨基甲酸酯常見的副反應(yīng)。檢測到的唯一顯 著的副產(chǎn)物為含有酚殘余物的ΡΜ0，其由與脫保護(hù)副產(chǎn)物醌甲基化物的反應(yīng)產(chǎn)生。然而，通過含氨的脫保護(hù)溶液的足夠稀釋能夠使該副產(chǎn)物減少至痕量水平。此外，通過酚殘余物與 用于強(qiáng)陰離子交換色譜法的聚合物樹脂的牢固結(jié)合，很容易除去該副產(chǎn)物。通常，如表1所 示，純化的PMO的總體收率大幅提高。在PMO固相合成之后的純化中，其中除去二氨基嘌呤和相關(guān)副產(chǎn)物的困難能夠?qū)?致強(qiáng)的陰離子交換(SAX)色譜過程中的嚴(yán)重?fù)p耗，由POB保護(hù)的鳥嘌呤基團(tuán)促進(jìn)的PMO產(chǎn) 量的提高是最顯著的。例如， 用CPM和MPG(單保護(hù)的鳥嘌呤亞基，2c)制備的AVI-4126的 粗純度為68 %至73 %，其計(jì)算出的PMO的粗收率為約58 %。在結(jié)合三苯甲基和脫三苯甲基 的純化過程中，損耗大量的材料以獲得純凈產(chǎn)物，并且色譜法的總體回收率為52%。對(duì)于用 CYTFA和DPG(雙重保護(hù)的鳥嘌呤亞基)制備的AVI-4126來說，其粗純度為70%至75%，具 有通過質(zhì)譜法測量的相當(dāng)高的N-I水平(表明CYTFA和CPM試劑的脫三苯甲基化效率是大 約相等的)和約61%的粗收率。然而，應(yīng)用常見的純化方法從粗混合物中回收80%的ΡΜ0。表1 按照在共有的美國申請(qǐng)11/801，885中所描述的方法，使用該表中所示的改性進(jìn) 行了合成；參見以下的實(shí)施例3-6。所有的PMO具有5’- “尾部”并且在3’-末端是未取代的。1CAA =含11%氰基乙酸(w/w)的20 %的乙腈/DCM (ν/ν)混合物；CPM=含2% 3-氯吡啶鐺甲磺酸鹽(w/v)和0.9%乙醇(ν/ν)的20%三氟乙醇/DCM(ν/ν) ；CYTFA =含 2% 3-氰基吡啶鐺三氟乙酸鹽(w/v)和0.9%乙醇(ν/ν)的20%三氟乙醇/DCM (ν/ν)。2規(guī)模為起始樹脂的重量克數(shù)。樹脂的填充量為480-520微摩爾/克34X12g和lX8g運(yùn)行的組合產(chǎn)量。42X12g運(yùn)行的組合產(chǎn)量。54X12g運(yùn)行的組合產(chǎn)量。6用在嗎啉代氮上具有4-甲氧基三苯甲基保護(hù)的活化的嗎啉代C亞基進(jìn)行了最后 的C亞基的添加。因此，使用本發(fā)明的雙重保護(hù)的MoG單體提供了合成嗎啉代低聚物的方法，相對(duì) 于現(xiàn)有技術(shù)方法來說，特別是與當(dāng)采用單保護(hù)的MoG單體或其它非本發(fā)明的受保護(hù)的MoG 單體時(shí)所觀察到的純化收率相比，該方法提高了純化收率。尤其是，與使用非本發(fā)明的MoG 單體會(huì)獲得的二氨基嘌呤化合物相比，該方法優(yōu)選產(chǎn)生降低的二氨基嘌呤化合物水平。III.雙重保護(hù)的鳥嘌呤嗎啉代亞基本發(fā)明的雙重保護(hù)的鳥嘌呤(DPG)嗎啉代亞基具有以下結(jié)構(gòu) 其中R1選自低級(jí)烷基、二(低級(jí)烷基)氨基和苯基；R2選自低級(jí)烷基、單環(huán)芳基甲基和單環(huán)(芳氧基)甲基；R3選自三芳基甲基和氫；并且Y選自受保護(hù)的或未受保護(hù)的羥基或氨基、氯氨基磷酸酯基團(tuán)和與另外的嗎啉代 化合物或嗎啉代低聚物的環(huán)氮鍵合的磷酰二胺鍵。在所選擇的實(shí)施方案中，Y為受保護(hù)的或未受保護(hù)的羥基(如在預(yù)活化的單體中 的那樣)或者氯氨基磷酸酯基團(tuán)(如在活化的單體中的那樣)。羥基的優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)包括 三烷基甲硅烷基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)。其中Y為與另外的嗎啉代化合物的環(huán)氮鍵合的磷酰二胺鍵或者與另外的嗎啉代 低聚物的環(huán)氮鍵合的磷酰二胺鍵的實(shí)施方案是指堿基脫保護(hù)之前，在合成嗎啉代低聚物的 過程中形成的化合物。如下文討論的那樣，(活化的單體中的)氯氨基磷酸酯基團(tuán)上的取代基能夠根據(jù)所期望的具體的磷酰二胺鍵而變化。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了合成嗎啉代低聚物的方法，該方法包括(a)使具有未受保護(hù)的環(huán)氮的固相支持的嗎啉代亞基與堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單 體反應(yīng)，所述嗎啉代亞基單體具有三芳基甲基保護(hù)的環(huán)氮和5’ -環(huán)外碳上的活化的氨基磷
酸酯基團(tuán)，由此形成所述5’ -環(huán)外碳與所述未受保護(hù)的環(huán)氮之間的磷酰二胺鍵；(b)將所述受保護(hù)的環(huán)氮脫保護(hù)以形成未受保護(hù)的環(huán)氮；以及 (c)用另外的堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體將步驟(a)和(b)重復(fù)一次或多次；其中至少一種的所述堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體為具有以下結(jié)構(gòu)的雙重保護(hù)的 鳥嘌呤嗎啉代化合物 其中R1選自低級(jí)烷基、二(低級(jí)烷基)氨基和苯基；R2選自低級(jí)烷基、單環(huán)芳基甲基和單環(huán)(芳氧基)甲基；R3選自三芳基甲基和氫；并且Y為氯氨基磷酸酯基團(tuán)。對(duì)于嗎啉代環(huán)氮(R3)，優(yōu)選的三芳基甲基保護(hù)基團(tuán)包括三苯甲基(三苯基甲基)、 4-甲氧基三苯甲基、4-甲基三苯甲基、4，4，-二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲基。如在4_(新戊酰氧基)芐氧基(POB)中的那樣，06保護(hù)基團(tuán)上的R1取代基優(yōu)選 SC1-C4烷基，特別是-C (CH3) 3(叔丁基)。然而，R1也能夠?yàn)橹T如二甲基氨基的二(低級(jí)烷
基)氨基或苯基。如上所述，在“活化的”單體中氯氨基磷酸酯基團(tuán)Y的取代根據(jù)所期望的磷酰二胺 鍵而變化。對(duì)于“標(biāo)準(zhǔn)的”不帶電荷的PMO鍵5’ -O-P( = 0) (-N(CH3)2)-3'(如上文的通式 II所示，其中R為甲基)的制備，氯氨基磷酸酯基團(tuán)Y為5’ -O-P ( = 0)C1-NR2 (參見例如 化合物2f，圖8)。如2007年5月10日提交的具有USSN 11/801，885的共有申請(qǐng)所描述的那樣，該 申請(qǐng)通過引用并入本文，能夠通過制備具有陽離子亞基間的鍵和中性亞基間的鍵的PMO來 獲得有利的性質(zhì)。在這樣的低聚物中，兩個(gè)連續(xù)的嗎啉代環(huán)結(jié)構(gòu)之間的至少一個(gè)亞基間的 鍵含有陽離子側(cè)基。該側(cè)基具有遠(yuǎn)端氮原子，該氮原子在中性或接近中性的PH值(例如生理pH值)下能夠具有正電荷。對(duì)于制備這樣的鍵，本發(fā)明的亞基單體中的氯氨基磷酸酯基團(tuán)Y可具有以下結(jié)構(gòu) 之一 其中，R為低級(jí)烷基，例如甲基或乙基；X = -R4-NHC( = 0)Rf，其中R4為二價(jià)烷基或寡PEG，并且Rf為完全或部分氟化的 甲基、乙基或異丙基；并且Z=如上文定義的X或低級(jí)烷基，注意含Z的基團(tuán)導(dǎo)致形成含5’ -胺的鍵。術(shù)語“寡PEG”是指諸如-(CH2-CH2_0)n-CH2-CH2-的基團(tuán)，其中n通常為1至3，并 且“二價(jià)烷基”通常為c2-c8烷基。如在共有的申請(qǐng)USSN 11/801,885中描述的那樣，用具有這樣的活化氯氨基磷酸 酯基團(tuán)的單體制備低聚物之后，將C( = 0)Rf保護(hù)基團(tuán)從末端氮原子中除去，該氮原子可以 被進(jìn)一步改性以形成例如末端胍基。IV. # PM0 ☆成洲〒_木代遍白句隨牛戶白句鄉(xiāng)■件如上所述，在PM0合成中，通常由諸如三苯甲基的三芳基甲基保護(hù)的嗎啉代環(huán)氮 的脫保護(hù)在每一步驟中必須完全足以將N-1缺失化合物降至最少。然而，支持本發(fā)明的研 究顯示，在現(xiàn)有技術(shù)中為了這一目的所用的試劑導(dǎo)致不期望量的主鏈水解(參見圖1)和降 解。因此，尋求同時(shí)將這樣的水解降至最低的有效的脫保護(hù)試劑。使用簡單的檢測測試了各種試劑在N-保護(hù)的嗎啉代亞基的脫保護(hù)(通常為脫三 苯甲基化)中的效力。將如下所示的模型化合物三苯甲基化的moCBz(即苯甲?；Ｗo(hù)的 胞嘧啶嗎啉代)亞基溶解在待研究的脫三苯甲基化溶液中。在不同的時(shí)間點(diǎn)(例如1、2、 4min)，將等分試樣猝滅并通過TLC或HPLC分析嗎啉代氮脫保護(hù)的完成。通常，為了在固相 PM0合成中預(yù)測有效的脫三苯甲基化，室溫下該模型反應(yīng)應(yīng)當(dāng)在約2分鐘內(nèi)完成。 采用該檢測和另外的實(shí)驗(yàn)，確定了三氟乙醇(TFE)和二氯甲烷(DCM)的混合物中 的強(qiáng)酸的各種吡啶鐺鹽為用于在固相PM0合成中將諸如三苯甲基的三芳基甲基保護(hù)基團(tuán) 從嗎啉代氮中除去的優(yōu)異的催化劑。對(duì)于合理的反應(yīng)速率和吡啶鐺鹽的增溶，最少量的TFE (約10 % v/v或更多)是優(yōu)選的。由于單獨(dú)的TFE不使無保護(hù)的聚苯乙烯膨脹，因此與DCM(二氯甲烷)的混合物是優(yōu) 選的，特別是在PM0合成的早期的周期中。優(yōu)選的溶劑組合物包含10%至75%的TFE。通過針對(duì)PDA裂解和脫三苯甲基化的不同機(jī)理，相信TFE溶劑的使用提高了超過 如上所述的酰胺化物的形成(水解)和磷酰二胺(PDA)的裂解的脫三苯甲基化反應(yīng)的選擇 性。TFE是強(qiáng)效的氫鍵溶劑并降低溶液中親核試劑的反應(yīng)能力；因此，相信其減慢P-N鍵裂 解所必需的磷上的攻擊。TFE還促進(jìn)sm型溶劑分解反應(yīng)。脫三苯甲基化反應(yīng)混合物的黃 色和脫甲氧基三苯甲基化反應(yīng)混合物的帶橙色的顏色證明了使用TFE的胺脫三苯甲基化 反應(yīng)的溶劑分解特性。因此，相信增加TFE濃度既抑制了 PDA鍵上的親核攻擊又促進(jìn)了脫 三苯甲基化。對(duì)于最佳的脫保護(hù)，未取代的吡啶鐺鹽沒有足夠的酸性，但是含有吸電子基(EWG) (例如鹵素、羰基、氰基)的吡啶鐺化合物的使用使得保護(hù)基團(tuán)迅速裂解。對(duì)于快速脫三苯 甲基化，在TFE DCM溶劑中，通常至少2% (w/v)的這樣的鹽是足夠的。優(yōu)選地，吡啶鐺鹽 的水平為2%至10% (w/v) 0用于形成吡啶鐺鹽的酸包括諸如甲磺酸、三氟甲磺酸和對(duì)甲苯磺酸的磺酸，三氟 乙酸和鹽酸。盡管如果存在羧酸三氟乙酸的話，其在偶聯(lián)反應(yīng)過程中不將生長的PM0鏈覆 蓋，并且其羧酸酯沒有足夠的親核性以促進(jìn)酰胺化物的形成。特別優(yōu)選的是三氟乙酸，尤其 是甲磺酸。用于形成吡啶鐺鹽的吡啶包括鹵素取代的吡啶，特別是廉價(jià)的氯吡啶，其中3-氯 吡啶是優(yōu)選的，和氰基吡啶，其中4-氰基吡啶是優(yōu)選的。3-氰基吡啶和4-氰基吡啶是容易 購買、廉價(jià)的散裝化學(xué)品。通常，鹽的效力與吡啶鐺化合物的pKa反向相關(guān)。具有吸電子基 的吡啶的 pKa 為 1 至 4(Fisher et al. 1964，Rogne 1970)。也可以使用煙酸衍生物(即諸如煙酸乙酯的酯和煙酰胺)及它們的酮和醛的同源 物。然而，這些試劑的效力通常比氰基吡啶鐺鹽差。應(yīng)當(dāng)理解，除吡啶外的雜環(huán)的鹽能夠在所描述的條件下起選擇性脫三苯甲基化試 劑的作用，其條件為該雜環(huán)的質(zhì)子化形式的PKa與本發(fā)明的取代吡啶的pKa相似。在文獻(xiàn) (例如Albert 1963)中發(fā)現(xiàn)的許多雜環(huán)的pKa的表中可以找到實(shí)例。實(shí)例包括噻唑(pKa 2. 53)、噠嗪(pKa2. 33)、吡唑(pKa 2. 47)、三唑(pKa 2. 30)和其取代的衍生物，特別是被如 上所述的EWG取代的衍生物。兩種特別優(yōu)選的鹽為3-氯吡啶鐺甲磺酸鹽(CPM)和4-氰基吡啶鐺三氟乙酸鹽 (CYTFA)，并且脫三苯甲基化試劑的特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括2% (w/v)的CPM或CYTFA的 含0.9%乙醇(v/v)的20%三氟乙醇/DCM(v/v)的溶液。如上文表1所示，與常規(guī)的氰基 乙酸試劑相比，使用這些試劑導(dǎo)致收率明顯增加。發(fā)現(xiàn)酸性更強(qiáng)的CYTFA比CPM稍稍更有效。然而，如在共有的并同時(shí)提交的題為 “用雙重保護(hù)的鳥嘌呤嗎啉代亞基改進(jìn)合成嗎啉代低聚物”的臨時(shí)申請(qǐng)中所公開的那樣，表 中CPM和CYTFA試劑之間的收率的大部分增加能夠歸功于雙重保護(hù)的鳥嘌呤單體(DPG)的 使用，其中用4-(新戊酰氧基)芐氧基保護(hù)06位。通常，DPG單體的使用減少了含有二氨基 嘌呤的副產(chǎn)物的量，同時(shí)，改進(jìn)的脫三苯甲基化試劑減少了主鏈水解或截?cái)嗟母碑a(chǎn)物的量。因此，該改良提供了合成嗎啉代低聚物的方法，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)方法，該方法減少 了主鏈中磷酰二胺鍵的水解，并且N-1缺失化合物的水平優(yōu)選降低或相等。在另一方面中，本發(fā)明提供了在合成嗎啉代低聚物過程中將三芳基甲基保護(hù)的嗎啉代環(huán)氮脫保護(hù)的方法， 相對(duì)于將氰基乙酸用作脫保護(hù)劑時(shí)所觀察到的情況，該方法減少了嗎啉代低聚物主鏈中的 磷酰二胺鍵的水解。優(yōu)選地，與將氰基乙酸用作脫保護(hù)劑時(shí)會(huì)觀察到的情況相比，該方法還 提供了降低的或相等的N-1缺失化合物水平。可用的另外的改良是使用諸如硫醇的三苯甲基捕獲劑以將反應(yīng)平衡轉(zhuǎn)向產(chǎn)物。已 經(jīng)采用硫醇捕獲劑用于合成核酸(Ravikumar et al.，U. S. Patent No. 5，510，476)。疏基 乙醇是用于該目的的容易購買的廉價(jià)試劑。對(duì)于捕獲，羥基的存在不是關(guān)鍵性的，這是由于 諸如芐硫醇的簡單硫醇同樣表現(xiàn)良好。諸如乙醇和丁醇的醇類以及甚至水也充當(dāng)三苯甲基 陽離子的捕獲劑。實(shí)施例實(shí)施例1 :N2-PhAc、06_P0B雙重保護(hù)的嗎啉代G(DPG)亞基的合成(參見圖8)3的制備(從35kg的lc開始)向100G反應(yīng)器中加入lc (35kg ;1. Oeq)、咪唑 (5. 0kg ；1. 3eq)和二氯甲烷(279kg)。將該批次冷卻至3°C。將50G反應(yīng)器冷卻至3°C并 加入叔丁基氯二甲基甲硅烷(10. lkg ；1. 2eq)和二氯甲烷(93kg)。將50G反應(yīng)器中的溶液 轉(zhuǎn)移至100G反應(yīng)器中并調(diào)節(jié)該批次至20°C。一旦反應(yīng)完成(1-3小時(shí))，將甲醇(1.8kg; 1. Oeq)加入100G反應(yīng)器中。30分鐘后，將100G反應(yīng)器中的溶液加入含有pH值為3的檸 檬酸鹽緩沖液(用固體NaOH將376kg的1M檸檬酸調(diào)節(jié)至pH值為3)的200G反應(yīng)器中。 將該批次攪拌30分鐘，并分離層。將下層有機(jī)層用pH值為3的檸檬酸鹽緩沖液再一次洗 滌，并用鹽水溶液(287kg的2. 5% NaCl/水(w w))洗滌一次。將所得到的有機(jī)溶液在 < 35°C下蒸餾直至該批次的Karl Fischer分析顯示水< 0. 05%。在100G反應(yīng)器中將該 溶液冷卻至3°C并直接用于制備化合物4。4的制備向含有化合物3的溶液的100G反應(yīng)器中加入三乙胺(6.8kg;1.2eq)、 4_ 二甲基氨基吡啶(0. 68kg ；0. leq)和三異丙基苯磺酰氯(18. 6kg ；1. leq)。將該批次加熱 至20°C。一旦反應(yīng)完成(3-9小時(shí))，將該溶液加入含有pH值為4. 5的磷酸鹽緩沖液(228kg 的1M KH2P04)的200G反應(yīng)器中。將該批次攪拌30分鐘，并分離層。用鹽水(212kg的2. 5% NaCl/水(w w))洗滌下層有機(jī)層。將所得到的有機(jī)溶液在<35°C下蒸餾直至該批次的 Karl Fischer分析顯示水< 0. 01%。在100G反應(yīng)器中將該溶液冷卻至3°C并直接用于制 備化合物5。4a的制備(從60kg的4_羥基苯甲醛開始)向750G反應(yīng)器中加入4_羥基苯甲 醛(60kg ；1. Oeq)、甲苯(260kg)和1_甲基咪唑(8. lkg ；0. 2eq)。向該溶液中加入碳酸氫鉀 (100kg ；2. Oeq)的水(400kg)溶液，隨后加入三甲基乙酰氯(83kg ；1. 4eq)。在20°C下攪拌 該兩相混合物。一旦反應(yīng)完成(1-5小時(shí))，將甲醇(15. 7kg ;1. Oeq)加入該批次中。將該 批次在20°C下攪拌1小時(shí)。分離層。向上層有機(jī)層中加入水(200kg)。將該批次攪拌30 分鐘，并分離層。向上層有機(jī)層中加入PH值為4. 5的磷酸鹽緩沖液(242kg水中16. 5kg的 KH2P04)。將該批次攪拌30分鐘，并分離層。向上層有機(jī)層中加入水(200kg)。將該批次攪 拌30分鐘，并分離層。在真空下將上層有機(jī)層在<30°C下蒸餾以獲得200L的批體積。將 THF(70kg)加入該批次中并將該批次轉(zhuǎn)移至含有Pd/C(9. 6kg ；0. 004eq ；5% Pd/C,50% wet Johnson Matthey Type A405028-5或A570129-5)的500G反應(yīng)器中。最初將該反應(yīng)器加 壓至5psi H2并將攪拌設(shè)置為50rpm。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，將壓力和攪拌速率緩慢增加至最大值25psi H2和90rpm。一旦反應(yīng)完成(8_48小時(shí))，通過硅藻土墊和隨后的0. 1微米的內(nèi) 聯(lián)過濾器將該批次過濾。用甲苯(20kg)沖洗該硅藻土。將pH值為6. 5的磷酸鹽緩沖溶液 (2. 7kg的KH2P04和2. 3kg的磷酸氫二鉀三水合物的水(200kg)溶液)加入該批次中。將該 批次攪拌30分鐘，并分離層。在真空下將上層有機(jī)層在< 30°C下蒸餾以獲得140L的批體 積。將甲苯(126kg)加入該批次中，并在真空下將該批次在<30°C下蒸餾以獲得140L的批 體積。將該批次調(diào)整至20°C，并轉(zhuǎn)移至含有保持在0°C的正庚烷(821kg)和化合物4a的晶 種(100克)的500G反應(yīng)器中。該批次在0°C下保持1-2小時(shí)。加入第二部分的晶種(100 克)，并將該批次在0°C下保持1-2小時(shí)。通過過濾將化合物4a分離。源于4-羥基苯甲醛 的收率=70% -80%。在與4a相似的條件下制備該衍生物，其中將苯酚部分作為其N，N_ 二甲基氨基甲 酸酯而不是三甲基乙酸酯保護(hù)。為了促進(jìn)4-羥基苯甲醛與二甲基氨基甲酰氯之間的反應(yīng) 的完成，在N-甲基咪唑作為堿以及0. 2eq的DMAP作為催化劑的存在下，在回流二氯甲烷中 進(jìn)行該反應(yīng)。5的制備向含有化合物4的溶液的100G反應(yīng)器中加入N-甲基吡咯烷(9. 5kg ； 2. Oeq溶解在23kg的二氯甲烷中)。10分鐘后，加入化合物4a (14. 0kg ；1. 2eq)，隨后加入 1，8-二氮雜雙環(huán)[5. 4. 0] -i^一碳-7-烯(10. 2kg ；在23kg 二氯甲烷中1. 2eq)。將該批次加 熱至20°C。一旦反應(yīng)完成(1-9小時(shí))，用327kg的二氯甲烷將溶液稀釋并加入含有pH值為 4. 5的磷酸鹽緩沖液(334kg的1M KH2P04)的200G反應(yīng)器中。將該批次攪拌30分鐘，并分 離層。將下層有機(jī)層采用pH值為4. 5的磷酸鹽緩沖液(111kg的1M KH2P04)再一次洗滌， 然后用鹽水(212kg的2. 5% NaCl/水(w w))洗滌一次。將所得到的有機(jī)溶液在< 35°C 下蒸餾直至該批次的Karl Fischer分析顯示水<0.05%。將該溶液直接用于制備化合物 If。If的制備向含有化合物5的溶液的100G反應(yīng)器中加入三乙胺三氫氟酸鹽 (18. 0kg ；2. Oeq)。將該批次在20°C下攪拌。一旦反應(yīng)完成(4_20小時(shí))，將該批次加入200G 反應(yīng)器中。向該200G反應(yīng)器中加入NaHC03溶液(230kg的5% (w w)溶液)。將該批次 攪拌30分鐘，并分離層。將下層有機(jī)層用NaHC03溶液(230kg的5% (w w)溶液)再一 次洗滌，然后用PH值為6. 5的磷酸鹽緩沖液(含9. 3kg KH2P04和14. 0kg K2HP04的215kg 水)洗滌一次。所得到的有機(jī)溶液經(jīng)歷將溶劑調(diào)換成THF(以獲得在該批次中< 重量比 的DCM)。將溶液用THF (124kg)稀釋并加熱至60°C。將水(基于L0E分析，8kg水/kg含化 合物If的溶液；預(yù)熱至60°C)緩慢加入THF溶液中。將該溶液緩慢冷卻至3°C并保持>4 小時(shí)。通過過濾分離粗化合物If。將粗材料再次溶解在THF(342kg)中并加熱至60°C。將 水(315kg;預(yù)熱至60°C)緩慢加入THF溶液中。將該溶液冷卻至;TC并保持> 4小時(shí)。通 過過濾分離化合物If。如果需要的話，能夠進(jìn)行第二次重結(jié)晶以進(jìn)一步純化化合物If。源 于lc的產(chǎn)率=53% -73%。2f的制備(從12虹的If開始)向50G反應(yīng)器中加入化合物If (12kg; 1. Oeq)、二 氯甲烷(159kg)、2，6-二甲基吡啶(2. 5kg;1.6eq)和 1_ 甲?；溥?0. 36kg ；0. 3eq)。將該 溶液蒸餾以獲得69L的批體積。并冷卻至5°C。將N，N-二甲基二氯磷酰胺(3.8kg;1.6eq) 加入該批次中。將該批次調(diào)節(jié)至20°C。一旦反應(yīng)完成(6-16小時(shí))，將甲苯(78kg)加入該 批次中。將所得到的混合物在25°C下蒸餾以獲得126L的批體積(該批次的GC分析必須顯示30% -45%重量比的DCM)，并轉(zhuǎn)移至含有pH值為3的檸檬酸鹽緩沖液(15. 4kg檸檬酸 一水合物、1.4kg Na0H、80kg水)的100G反應(yīng)器中。將該批次攪拌10分鐘，并分離層。將 下層水層送至廢料。將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)移至含有硫酸鈉(8.0kg)的50G反應(yīng)器中。將該批次 攪拌30分鐘，并通過過濾除去硫酸鈉廢料餅狀物。用二氯甲烷(16kg)沖洗硫酸鈉餅狀物。 在50G反應(yīng)器中將所得到的產(chǎn)物溶液蒸餾以獲得53L的批體積(該批次的GC分析必須顯 示11%-15%重量比的DCM)。向100G反應(yīng)器加入庚烷(238kg)。在2小時(shí)期間，將50G反 應(yīng)器中的批次轉(zhuǎn)移至100G反應(yīng)器中。在轉(zhuǎn)移結(jié)束時(shí)，將該批次在20°C下保持4-16小時(shí)。 通過過濾收集粗化合物6。將粗材料加入100G反應(yīng)器中。將甲苯(16kg)與庚烷(50kg)的 溶液加入粗固體中。將該混合物攪拌3小時(shí)并過濾。將重新打漿重復(fù)一次或多次。源于If 的粗2f的收率=80%。通過硅膠餼譜純化化合物2f (從約6. 5kg的粗化合物2f開始)通過將粗材料的 重量校正成HPLC純度和揮發(fā)物來計(jì)算粗化合物2f的“強(qiáng)度”。對(duì)于該純化步驟，在50cm 的色譜柱上每次注射使用5. 75kg的材料(校正成強(qiáng)度)。向50cm的色譜柱填充庚烷/硅 膠(51. 8kg的硅膠)的漿液。將粗材料作為二氯甲烷/2，6-二甲基吡啶(15kg 二氯甲烷、 0. 16kg 2，6-二甲基吡啶)的溶液加載至柱上。用4-甲基-2-戊酮(1081()/庚烷/2，6-二甲 基吡啶的兩步梯度(第一步為含有0.06%的2，6_二甲基吡啶(w w)的827 L 39 61的 MIBK 庚烷(w w)；第二步為含有0. 06%的2，6-二甲基吡啶(w w)的1343 L 73 27 的MIBK 庚烷(w w))來洗脫產(chǎn)物。通過薄膜蒸發(fā)將經(jīng)確認(rèn)的合并流分濃縮至150g/L 的濃度。將濃縮的合并物沉淀至6體積的庚烷上。通過過濾分離純化的2f。源于If 的純 化的2f的收率=50% ；源于粗2f的純化的2f的收率=65%。實(shí)施例2. CYTFA吡啶鎰鹽脫三苯甲基化溶液的制備將三氟乙酸(10. 5g ；1. Oeq)加入4_氰基吡啶(10. lg ；1. 055eq)的二氯甲 烷(790mL)溶液中，隨后加入2，2，2_三氟乙醇(198mL)和乙醇(10mL)，并將溶液攪拌 10-30mino實(shí)施例3 二硫化物錨的制備(參見圖10)N-三苯甲基哌嗪琥珀酸鹽(NTP)的制備將三苯基甲基(三苯甲基)氯(l.Oeq) 的甲苯(5mL/g三苯甲基氯)溶液緩慢加入哌嗪(10eq)的甲苯/甲醇(5 1甲苯/甲醇 (v v) ；5mL/g哌嗪)的涼溶液中。一旦反應(yīng)完成(1-2小時(shí))，將該溶液用水洗滌四次。 將琥珀酸水溶液(1. leq;13mL水/g琥珀酸)加入所得到的有機(jī)溶液中。將該混合物攪拌 90分鐘，并通過過濾收集固體產(chǎn)物。通過在丙酮中進(jìn)行兩次重新打漿來純化粗NTP。收率 =70%。對(duì)稱的二硫化物7的制備將1，1，-羰基二咪唑(CDI) (12. 402g;2. 2eq.)懸浮 在二氯甲烷(5.25mL/g)中并在冰浴上冷卻。將羥基乙基二硫化物6(5.36g;leq.)溶解 在二氯甲烷(10mL/g)和四氫呋喃(lmL/g)中。為了使反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，將二醇溶液緩慢加 入⑶I中從而使混合物的溫度停留在4°C以下。一旦反應(yīng)完成(一旦完成添加)，加入去 離子水(93.8iiL，0. 15eq.)使反應(yīng)猝滅。將N_三苯甲基哌嗪琥珀酸鹽(NTP) (32. 59g ； 2. leq.)獨(dú)立地溶解在甲苯(8mL/g NTP)、二氯甲烷(2mL/g NTP)和甲醇(2mL/g NTP)中。 將K2C03(22 . 09g ；4. 6eq.)溶解在去離子水中(10mL/g)。將K2C03溶液加入NTP的溶液中； 將混合物攪拌然后分離成兩層。將混濁的有機(jī)層蒸餾以除去90克；將所得到的水滴分離并將丙酮(8mL/g的NTP)加入有機(jī)層中。將CDI活化的二硫化二醇溶液加入游離堿的溶液 中并濃縮至225mL。加入丙酮(10mL/g NTP)并將混合物濃縮至225mL。將混合物加熱至回 流，并且固體開始從溶液中結(jié)晶。一旦完成，將反應(yīng)混合物冷卻并通過過濾分離固體(7)。 收率27. 92g ；93. 1 % (基于以重量為基礎(chǔ)的分析)。二硫化物醇8的制備將7 (36. 00g ；32. 1讓ol ； leq.)懸浮在丙酮(2. 8mL/g 7)中。 加入羥基乙基二硫化物(78. 51mL ；20eq.)，隨后加入丙酮(1. 7mL/g 7)。加入5%的NaOH/ 甲醇(2. 85mL ；0. leq.)；由pH試紙得到混合物的pH值為10。加入三苯基膦(8. 42g ；leq.)， 隨后加入丙酮(1. lmL/g 7)。將所有的固體放入溶液中然后產(chǎn)物開始結(jié)晶出來。16hr后， 用乙酸(2.4g ；0. 2eq.)中和反應(yīng)混合物。通過過濾分離粗產(chǎn)物。對(duì)粗固體8進(jìn)行兩次回流 的丙酮重新打漿(5mL/g 7)。過濾后，將粗產(chǎn)物懸浮在二氯甲烷(7. 25mL/g 7)中。將混合物加熱直至形成澄清 溶液(35°C )。用等體積的去離子水將溶液萃取五次并將最終的有機(jī)層濃縮至155mL。加入 二氯甲烷(4. 3mL/g 7)，并將溶液再次濃縮至155mL。加入CDI (9. 17g ；1. leq.)并將混合物 在室溫下攪拌。一旦反應(yīng)完成(約20min)，將反應(yīng)混合物用等體積的去離子水洗滌兩次，然 后加入乙苯(2. lmL/g 7)。將溶液濃縮至65. 2g，將溶液中的二氯甲烷減少至0. 17%，并在 冰浴上攪拌以結(jié)晶出產(chǎn)物。通過過濾分離產(chǎn)物9。收率44%。實(shí)施例4 三甘醇尾部(參見圖11)三苯甲基哌嗪苯基氨基甲酸酯10的制備將碳酸鉀(3. 2eq)的水溶液(4mL/g碳 酸鉀)加入NTP的二氯甲烷(6mL/g NTP)涼懸浮液中。將苯基氯甲酸酯(1. 03eq)的二氯 甲烷(2g/g苯基氯甲酸酯)溶液緩慢加入該兩相混合物中。將反應(yīng)混合物加熱至20°C。一 旦反應(yīng)完成(l_2hr)，分離層。將有機(jī)層用水洗滌并用無水碳酸鉀干燥。通過從乙腈中結(jié)晶 來分離產(chǎn)物10。收率=80%。氨基甲酸酯醇11的制備將氫化鈉(1. 2eq)懸浮在1_甲基_2_吡咯烷酮(32mL/ g的氫化鈉)中。將三甘醇(lO.Oeq)和化合物10(1. Oeq)加入該懸浮液中。將所得到的 漿液加熱至95°C。一旦反應(yīng)完成(l_2hr)時(shí)，將該混合物冷卻至20°C。將30%二氯甲烷/ 甲基叔丁基醚(v v)和水加入該混合物中。將含有產(chǎn)物的有機(jī)層先后用NaOH水溶液、琥 珀酸水溶液和飽和氯化鈉水溶液洗滌。通過從二氯甲烷/甲基叔丁基醚/庚烷中結(jié)晶來分 離產(chǎn)物11。收率=90%。尾部酸12的制備將琥珀酸酐(2. Oeq)和DMAP(0. 5eq)加入化合物11的四氫呋 喃(7mL/g 11)溶液中。將混合物加熱至50°C。一旦反應(yīng)完成(5hr)，將混合物冷卻至20°C 并用NaHC03水溶液調(diào)節(jié)至pH值為8.5。加入甲基叔丁基醚，并將產(chǎn)物萃取進(jìn)入水層。加入 二氯甲烷，并用檸檬酸將混合物調(diào)節(jié)至pH值為3。用pH = 3的檸檬酸鹽緩沖液與飽和氯化 鈉水溶液的混合物來洗滌含有產(chǎn)物的有機(jī)層。將沒有分離的12的DCM溶液用于制備化合 物13。13的制備將N-羥基-5-降冰片烯-2，3- 二酰亞胺(H0NB) (1. 02eq)、4_ 二甲基氨 基吡啶(DMAP) (0. 34eq)加入化合物12的溶液中，然后加入1_(3_ 二甲基氨基丙基)_N’_乙 基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) (1. leq)。將混合物加熱至55°C。一旦反應(yīng)完成(4_5hr)，將混合 物冷卻至20°C并先后用1 1 0.2M檸檬酸/鹽水和鹽水洗滌。二氯甲烷溶液經(jīng)歷將溶劑 調(diào)換成丙酮然后調(diào)換成N，N-二甲基甲酰胺，并且通過從丙酮/N，N-二甲基甲酰胺中沉淀進(jìn)入飽和氯化鈉水溶液中來分離產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物在水中重新打漿數(shù)次以除去殘余的N，N-二 甲基甲酰胺和鹽。源于化合物11的13的收率=70%。通過用于固相合成過程中添加亞基 的步驟在NMP中向二硫化物錨-樹脂上引入活化的“尾部”。_仿丨丨5身☆成順代傭__謝本_1 棚列5a顏聊縣訟)希-二獻(xiàn)_馳狐在具有粗孔隙率(40-60 μ m)玻璃粉、頂置式攪拌器和三通聚四氟乙烯活塞的硅 烷化的夾套式肽管(jacketed peptide vessel)(定制于ChemGlass，NJ，USA)中進(jìn)行該步 驟，通過玻璃粉或真空萃取使N2冒出。通過循環(huán)水浴實(shí)現(xiàn)反應(yīng)容器中的溫度控制。以下步驟中的樹脂處理/洗滌步驟由兩個(gè)基本操作組成樹脂流化和溶劑/溶液 萃取。對(duì)于樹脂流化，調(diào)整活塞位置使N2向上流動(dòng)通過玻璃粉，并將規(guī)定的樹脂處理/洗 滌液加入反應(yīng)器中并將樹脂浸透和完全潤濕。然后開始混合并將樹脂漿液混合至規(guī)定的時(shí) 間。對(duì)于溶劑/溶液萃取，停止混合和N2流，并啟動(dòng)真空泵，然后調(diào)整活塞位置使樹脂處理 /洗滌液排出至廢料。除非另有說明，樹脂處理/洗滌液的體積為15mL/g樹脂。向硅烷化的夾套式肽管中的氨基甲基聚苯乙烯樹脂(100-200目；約l.Ommol/ g N2 取代；75g，leq，Polymer Labs, UK, part #1464_X799)中加入 1_ 甲基 _2_ 吡咯燒酮 (NMP;20ml/g樹脂)，并使樹脂膨脹同時(shí)混合l-2hr。排空膨脹的溶劑之后，用二氯甲烷 (2Xl-2min)、含有5%二異丙基乙胺的25%異丙醇/ 二氯甲烷(2X3-4min)和二氯甲烷 (2Xl-2min)洗滌樹脂。排空最后的洗滌液之后，用二硫化物錨9的1-甲基_2_吡咯烷 酮(0. 17M;15mL/g樹脂，約2. 5eq)溶液使樹脂流化，并在45°C下將樹脂/試劑混合物加 熱60hr。反應(yīng)一完成，終止加熱并排空錨溶液，并且用1-甲基-2-吡咯烷酮(4X3-4min) 和二氯甲烷(6Xl-2min)洗滌樹脂。用10% (ν/ν)的重碳酸二乙酯的二氯甲烷(16mL/g ； 2X5-6min)溶液處理樹脂，然后用二氯甲烷(6Xl-2min)洗滌。將樹脂14在N2流下干燥 l_3hr，然后在真空下干燥至恒定重量(士2% )。收率初始樹脂重量的110% -150%。實(shí)施例5b 氨基甲基聚苯乙烯_ 二硫化物樹脂的填充量的確定通過光譜檢測每克樹脂中三苯基甲基(三苯甲基)的數(shù)目，來確定樹脂的填充量 (潛在可用的反應(yīng)位點(diǎn)的數(shù)目)。將已知重量的干燥樹脂(25士3mg)轉(zhuǎn)移至硅烷化的25ml容量瓶中，并加入約5mL 的含有2% (ν/ν)三氟乙酸的二氯甲烷。通過輕輕渦旋將所含物混合然后靜置30min。添 加含有2% (ν/ν)三氟乙酸的二氯甲烷使體積達(dá)到25mL，并且將所含物徹底混合。使用正 壓分注滴管，將一份等分的含有三苯甲基的溶液(500 μ L)轉(zhuǎn)移至IOmL容量瓶中，并用甲磺 酸使體積達(dá)到10mL。通過在431. 7nm的UV吸收測量最終溶液中的三苯甲基陽離子含量，并用合適的體 積、稀釋液、消光系數(shù)(CMlymor1cnT1)和樹脂重量以每克樹脂中的三苯甲基(ymol/g) 來計(jì)算樹脂填充量。將該檢測進(jìn)行三次并計(jì)算平均填充量。本實(shí)施例中的樹脂填充方法會(huì)提供具有約500 μ mol/g的填充量的樹脂。如果在 室溫下將二硫化物錨合并步驟進(jìn)行24hr，可獲得300-400 μ mol/g的填充量。實(shí)施例5c 尾部加載(參見圖12)使用與用于制備氨基甲基聚苯乙烯_ 二硫化物樹脂相同的方案和體積，能夠?qū)⑽?部引入分子中。對(duì)于偶聯(lián)步驟，使用13(0.2M)的NMP溶液來代替二硫化物錨溶液，該NMP含有4-乙基嗎啉(ΝΕΜ，0. 4M)。在45°C下進(jìn)行2hr后，將樹脂15用含有5%二異丙基乙胺 的25%異丙醇/ 二氯甲烷洗滌兩次，并用DCM洗滌一次。將苯酸酐(0.4M)與NEM(0.4M)的 溶液加入樹脂中。25min之后，將反應(yīng)器夾套冷卻至室溫，并將樹脂用含有5%二異丙基乙 胺的25%異丙醇/ 二氯甲烷洗滌兩次，并且用DCM洗滌八次。將樹脂15過濾并在高真空下 干燥。將樹脂15的填充量規(guī)定為在尾部加載中所用的初始氨基甲基聚苯乙烯_ 二硫化物 樹脂14的填充量。實(shí)施例6 嗎啉代低聚物的合成實(shí)施例6a 固相合成 以IOg的規(guī)模(起始樹脂重量)，在氨基甲基聚苯乙烯_ 二硫化物樹脂(約 500ymol/g的填充量)上通過固相低聚物合成人工制備受保護(hù)的低聚物。所使用的溶液如 下 脫三苯甲基化溶液CAA =含11 %氰基乙酸(w/w)的20%乙腈/DCM(ν/ν)的混合 物；CPM =含有2% 3-氯吡啶鐺甲磺酸鹽(w/v)和0. 9%乙醇(ν/ν)的20%三氟乙醇 /DCM(ν/ν)；CYTFA =含有2% 3_氰基吡啶鐺三氟乙酸鹽(w/v)和0. 9%乙醇(ν/ν)的20%三 氟乙醇/DCM (ν/ν)。中和溶液含有5%二異丙基乙胺的25%異丙醇/ 二氯甲烷；偶聯(lián)溶液含有0. 165Μ (對(duì)于2f(DPG)、2c和2d或其它T亞基)或者0. 18M (對(duì)于 2a和2b或其它A/C亞基)的活化的嗎啉代亞基和0. 4M N-乙基嗎啉的1，3-二甲基咪唑烷 酮(DMI)。按照Summerton et al. (1993)中的描述來制備活化的MPG (2c)。在將樹脂轉(zhuǎn)移至合成反應(yīng)器之后及開始合成周期之前，加入1-甲基-2-吡咯烷酮 (NMP，20mL/g樹脂)并靜置l_2hrs。用二氯甲烷(10mL/g樹脂)洗滌兩次后，采用下述的 合成周期，在每個(gè)周期加入合適的偶聯(lián)溶液以獲得合適的序列，該偶聯(lián)溶液為期望堿基和 期望鍵型的活化的嗎啉代亞基的偶聯(lián)溶液。
t墚加洗液的體積以補(bǔ)馇樹賴的膨脹；彝每個(gè)周斯,祙積為10mL/g實(shí)際的樹脂體積 **偶躲的體積美以保持良好的混合并將其增加以補(bǔ)償樹脂的膨脹引入最終的亞基之后，用含有0. 32M 4-甲氧基三苯基甲基氯化物和0.4M N-乙基 嗎啉的DMI進(jìn)行最后的周期(甲氧基三苯甲基化)。甲氧基三苯甲基化之后，將樹脂用NMP 洗滌八次，然后用由0. IM 1，4-二硫蘇糖醇(DTT)和0.73M三乙胺的NMP(27mL/g起始樹 月旨)溶液組成的裂解溶液處理30min。將受保護(hù)的低聚物溶液收集之后，用另外兩份裂解溶 液(13mL/g起始樹脂，并每次保持15min)洗滌樹脂(體積明顯降低)，并將洗滌液與主體溶 液合并。向在具有聚四氟乙烯活塞(AceGlasS，NJ，USA)的適當(dāng)大小的耐壓瓶中的受保護(hù)的 低聚物溶液中加入濃氨水(106mL/g起始樹脂，預(yù)先冷卻至-20°C)。將瓶密封，并通過渦旋 將所含物混合。將瓶放置在45°C爐中保持16-20hr以除去堿基和主鏈保護(hù)基團(tuán)。氨解之后，將粗低聚物溶液冷卻至室溫，然后用PLBC 3kd再生纖維素膜 (Millipore)將其對(duì)0. 28%氨水滲濾以在進(jìn)行離子交換色譜法之前除去溶劑和小分子。實(shí)施例6b 通過陰離子交換餼譜純化嗎啉代低聚物將從滲濾獲得的粗低聚物溶液調(diào)整至pH值為11-11. 5并加載至ToyoPearl Super-Q 650S陰離子交換樹脂(Tosoh Bioscience)的柱上。用5%-35% B的梯度通過 17個(gè)柱體積(緩沖液A IOmM氫氧化鈉；緩沖液B 含有IM氯化鈉的IOmM氫氧化鈉)來洗 脫甲氧基三苯甲基化的低聚物，并合并具有可接受純度的流分(陰離子交換HPLC和質(zhì)譜)。實(shí)施例6c 嗎啉代低聚物的脫甲氧基三苯甲基化將乙腈(10%體積比)加入來自陰離子交換色譜的合并的流分中，隨后加入2M H3PO4以調(diào)節(jié)pH值至3。將溶液混合45min，然后用濃氨水中和至pH值為7。用PLBC 3kd 再生纖維素膜(Millipore)將低聚物溶液對(duì)20mM乙酸鈉滲濾以在陽離子交換色譜之前交換緩沖液。
實(shí)施例6d 通過陽離子交換餼譜純化嗎啉代低聚物用乙酸調(diào)節(jié)低聚物溶液的pH值至4. 5，并加載至Source 30S陽離子交換樹脂(GE Healthcare)的柱上。用0% -35% B的梯度通過17個(gè)柱體積(緩沖液A :20mM乙酸鈉、 25%乙腈，pH 4. 5 ；緩沖液B :0. 5M氯化鈉、20mM乙酸鈉、25%乙腈，pH 4. 5)來洗脫低聚物， 并合并具有可接受純度的流分(陽離子交換HPLC和質(zhì)譜)。
權(quán)利要求
嗎啉代化合物，其包含以下結(jié)構(gòu)其中R1選自低級(jí)烷基、二(低級(jí)烷基)氨基和苯基；R2選自低級(jí)烷基、單環(huán)芳基甲基和單環(huán)(芳氧基)甲基；R3選自三芳基甲基和氫；并且Y選自受保護(hù)或未受保護(hù)的羥基或氨基、氯氨基磷酸酯基團(tuán)和與另外的嗎啉代化合物或嗎啉代低聚物的環(huán)氮鍵合的磷酰二胺鍵。FPA00001138208000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中Y選自受保護(hù)或未受保護(hù)的羥基和氯氨基磷酸酯基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中Y為三烷基甲硅烷基保護(hù)的羥基或未受保護(hù)的羥基。
4.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中Y為-0-P(= 0)-N(CH3)2Cl形式的氯氨基磷酸酯基團(tuán)。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R3選自三苯甲基(三苯基甲基)、4_甲氧基三苯 甲基、4-甲基三苯甲基、4，4，-二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲基。
6.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1為低級(jí)烷基。
7.如權(quán)利要求6所述的化合物，其中R1為_C(CH3)3(叔丁基)。
8.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中R2為芐基或_CH(CH3)2。
9.合成嗎啉代低聚物的方法，所述方法包括(a)使具有未受保護(hù)的環(huán)氮的固相支持的嗎啉代亞基與堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體反 應(yīng)，所述嗎啉代亞基單體具有三芳基甲基保護(hù)的環(huán)氮和5’ -環(huán)外碳上的活化的氨基磷酸酯 基團(tuán)，由此形成所述5’ -環(huán)外碳與所述未受保護(hù)的環(huán)氮之間的磷酰二胺鍵；(b)將所述受保護(hù)的環(huán)氮脫保護(hù)以形成未受保護(hù)的環(huán)氮；以及(c)用另外的堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體將步驟(a)和(b)重復(fù)一次或多次； 其中至少一種的所述堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體為具有以下結(jié)構(gòu)的雙重保護(hù)的鳥嘌呤嗎啉代化合物 其中R1選自低級(jí)烷基、二(低級(jí)烷基)氨基和苯基； R2選自低級(jí)烷基、單環(huán)芳基甲基和單環(huán)(芳氧基)甲基； R3選自三芳基甲基和氫；并且 Y為氯氨基磷酸酯基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中Y為-0-P(= 0)-N(CH3)2Cl形式的氯氨基磷酸酯基團(tuán)。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中R3選自三苯甲基(三苯基甲基)、4_甲氧基三苯甲 基、4-甲基三苯甲基、4，4，-二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲基。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中R1為低級(jí)烷基。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中R1為_C(CH3)3(叔丁基)。
14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中R2為芐基或_CH(CH3)2。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中步驟(b)的所述脫保護(hù)包括在含有三氟乙醇的溶劑 中，使所述三芳基甲基保護(hù)的環(huán)氮與包含雜環(huán)胺鹽的試劑溶液接觸，所述鹽為雜環(huán)胺與選 自磺酸、三氟乙酸和鹽酸的酸的鹽，所述雜環(huán)胺的質(zhì)子化形式的pKa為1-4。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述鹽選自3-氯吡啶鐺甲磺酸鹽(CPM)和4-氰 基吡啶鐺三氟乙酸鹽(CYTFA)。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述溶劑包含體積比為約90 10至25 75的 二氯甲烷和三氟乙醇。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述體積比為約80 20。
19.合成嗎啉代低聚物的方法，所述方法包括(a)使具有未受保護(hù)的環(huán)氮的固相支持的嗎啉代亞基與堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體反 應(yīng)，所述嗎啉代亞基單體具有三芳基甲基保護(hù)的環(huán)氮和5’ -環(huán)外碳上的活化的氨基磷酸酯 基團(tuán)，由此形成所述5’ -環(huán)外碳與所述未受保護(hù)的環(huán)氮之間的磷酰二胺鍵；(b)將所述受保護(hù)的環(huán)氮脫保護(hù)以形成未受保護(hù)的環(huán)氮；以及(c)用另外的堿基保護(hù)的嗎啉代亞基單體將步驟(a)和(b)重復(fù)一次或多次；其中所述脫保護(hù)包括在含有三氟乙醇的溶劑中，將所述三芳基甲基保護(hù)的環(huán)氮與包含 雜環(huán)胺鹽的試劑溶液接觸，所述鹽為雜環(huán)胺與選自磺酸、三氟乙酸和鹽酸的酸的鹽，所述雜 環(huán)胺的質(zhì)子化形式的PKa為1-4。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述雜環(huán)胺選自吸電子基取代的吡啶、噻唑、噠 嗪、吡唑、三唑以及吸電子基取代的這些化合物的取代衍生物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述雜環(huán)胺為吸電子基取代的吡啶。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述吸電子基選自鹵素、氰基、醛、酮、羧酸酯和甲酰胺。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述雜環(huán)胺為氯取代的吡啶或氰基取代的吡啶。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述鹽為選自烷基磺酸鹽、(氟烷基)磺酸鹽和對(duì) 甲苯磺酸鹽的磺酸的鹽，或者三氟乙酸鹽。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述鹽選自3-氯吡啶鐺甲磺酸鹽(CPM)和4-氰 基吡啶鐺三氟乙酸鹽(CYTFA)。
26.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述溶劑包含體積比為約90 10至25 75的 二氯甲烷和三氟乙醇。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述體積比為約80 20。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述三芳基甲基選自三苯甲基(三苯基甲基)、 4-甲氧基三苯甲基、4-甲基三苯甲基、4，4，-二甲基三苯甲基和4，4，，4”_三甲基三苯甲 基。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有結(jié)構(gòu)(I)的嗎啉代化合物其中R1選自低級(jí)烷基、二(低級(jí)烷基)氨基和苯基；R2選自低級(jí)烷基、單環(huán)芳基甲基和單環(huán)(芳氧基)甲基；R3選自三芳基甲基和氫；并且Y選自受保護(hù)或未受保護(hù)的羥基或氨基、氯氨基磷酸酯基團(tuán)和與另外的嗎啉代化合物或嗎啉代低聚物的環(huán)氮鍵合的磷酰二胺鍵。這樣的化合物包括雙重保護(hù)的嗎啉代鳥嘌呤(MoG)單體。本發(fā)明還描述了它們?cè)诤铣蓡徇途畚镏械挠猛荆约坝糜诤铣蓡徇途畚锏倪M(jìn)一步的改進(jìn)方法，其涉及在每個(gè)單體偶聯(lián)步驟中，受保護(hù)的嗎啉代環(huán)氮的脫保護(hù)。
文檔編號(hào)A61K31/70GK101861318SQ200880116219
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者克里斯蒂娜·瑪麗·約瑟芬·?？怂? 德懷特·D·懷勒, 李永福, 馬修·代爾·里烏斯 申請(qǐng)人:Avi生物制藥公司