專利名稱：用于包封親水性和/或親油性分子的水性-核脂質(zhì)納米膠囊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括水性核脂質(zhì)納米膠囊的新型組合物及其制備方法和在包封親水 性和/或親油性分子中的用途。
背景技術(shù)：
納米膠囊(NC)總體上描述為具有核_殼結(jié)構(gòu)的膠態(tài)物體，核用作藥物的液體儲(chǔ) 器，而殼用作保護(hù)性膜。在近十年來(lái)，NC體系已顯示不僅是用于藥物遞送的非常有希望的 可能的載體，而且是治療和診斷應(yīng)用的非常引人注意的膠體，例如作為對(duì)比劑。關(guān)于常規(guī)納 米球體和納米顆粒，所述藥物載體的強(qiáng)有力的優(yōu)點(diǎn)在于以下幾點(diǎn)(i)由于藥物在納米顆 粒核中的溶解度最優(yōu)化而使藥物包封效率高；(ii)與聚合物納米球體相比，顯著降低聚合 物含量；和(iii)待包封的藥物可認(rèn)為在NC核內(nèi)“被保護(hù)”，還保護(hù)藥物本身防止可能的降 解。根據(jù)組成其液體核的材料的性質(zhì)來(lái)定義兩種根本上不同種類的NC，也就是， 油-核納米膠囊或水性-核納米膠囊，且兩者均分散在水連續(xù)相中。實(shí)際上，前一種(油-核 NC)由于其在水本體相中更容易配制而組成最廣泛遇到的體系，通常從水包油型納米乳液 體系到原位界面聚合物殼合成或納米沉淀預(yù)先形成的聚合物。但是，這些油-核NC體系僅可用于包封親油性物類，因此，為了包封親水性物質(zhì)， 近年來(lái)努力致力于(與當(dāng)前的研究一樣)產(chǎn)生分散于水性本體相中的水性-核納米膠囊。 在這種意義上采用不同策略，從反相精細(xì)分散的乳液的界面聚合(Lambert，G.等人，2000 ； Lambert, G.等人，2000)或油包水型微乳液(Hillaireau，H.等人，2006)的界面聚合到 由通過(guò)在脂質(zhì)之間原位聚合來(lái)穩(wěn)定脂質(zhì)體組成的可選的方法，形成水性_核聚合物質(zhì)體納 米"結(jié)構(gòu)(Ruysschaert T.等人，2006 ；Gomes, J. F. P. d. S.等人，2006)。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了一種用于制備形成水性_核儲(chǔ)器納米膠囊的納米_組件的方法，由油 包水型納米-乳液模板產(chǎn)生，特別是低能量方法，且得到新型多官能物體，該物體也由為納 米膠囊殼的油儲(chǔ)器組成。這些水性核納米膠囊特別可用于包封和遞送親水性或親油性物類，特別是易碎藥 物。此外，這些水性核納米膠囊還具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，能高收率地同時(shí)包封水性核中的親水性 物類和脂質(zhì)殼中的親油性物類。因此，根據(jù)第一個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明涉及一種用于制備組合物的方法，該組合物含有在水相中直徑在20-500nm范圍內(nèi)的顆粒(P)，所述顆粒含有-油相；_在所述油相中，含有-水性液滴，或
-納米膠囊(NC)，所述納米膠囊包括-水性核，和_聚合物殼或由兩親型物質(zhì)組成的殼；和_表面活性劑；所述方法包括以下步驟i)制備油包水型(w/o)乳液(E1)，其中，液滴的流體動(dòng)力學(xué)平均直徑為10-400nm，其中，連續(xù)相含有兩種油，揮發(fā)性油(O1)和非揮發(fā)性油(O2)，所述揮發(fā)性油(O1)比水更易揮 發(fā)，所述非揮發(fā)性油(O2)比水的揮發(fā)性差；ii)任選地，加入單體或者加入兩親型物質(zhì)，以形成水性核_殼納米膠囊(NC)；所 述單體可溶于乳液(E1)的連續(xù)相且當(dāng)與水接觸時(shí)聚合的；和iii)加入水相并除去所述揮發(fā)性油(O1)，從而形成期望的組合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“平均直徑”是指測(cè)量的所有可測(cè)量顆粒的大小測(cè)量值的總和除 以測(cè)量顆粒的總數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的乳液E1 (在本文中是指“納米乳液”)的液滴的“流體動(dòng)力學(xué)平均直 徑”根據(jù)基于動(dòng)力學(xué)光散射的方法，通過(guò)在乳液上進(jìn)行的顆粒大小測(cè)量來(lái)確定。顆粒(P)的直徑通過(guò)在透射式電子顯微鏡(TEM)和/或在低溫-TEM上進(jìn)行的顆 粒大小測(cè)量來(lái)確定。步驟i)油包水型(w/o)乳液(E1)包括水作為不連續(xù)相、兩種油(O1)和(O2)的混合物作 為連續(xù)相、和表面活性劑。其可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)技術(shù)來(lái)制備，包括特別是所謂的 高能量方法(該方法涉及高剪切裝置，例如高壓均化器或超聲破碎器(sonifiers))和低能 量方法(例如自發(fā)乳化(或溶劑擴(kuò)散)和相轉(zhuǎn)化溫度(PIT)方法)。其中，優(yōu)選低能量方法，更特別是PIT方法，特別是用于藥物包封，該方法在待包 封的易碎分子的加工過(guò)程中可防止降解。PIT方法為Shinoda和Saito介紹了三十年的不含有機(jī)溶劑的方法(Shinoda， K.等人，1968 ;Shinoda，K.等人，1969)，該方法基本上報(bào)道用于水包油型乳液的制備。該方 法包括通過(guò)熱敏非離子表面活性劑穩(wěn)定水/油乳液，其在兩個(gè)不混溶的相中的溶解度隨溫 度而變。采用這種方式，整個(gè)粗滴乳液進(jìn)行過(guò)渡相轉(zhuǎn)化，當(dāng)固定組成時(shí)，對(duì)樣品逐漸進(jìn)行溫 度變化。接著，油包水型(w/o)乳液將變成水包油型(O/V)乳液，隨之樣品溫度上升，反之， 則樣品溫度下降。在相轉(zhuǎn)化溫度(PIT)時(shí)，表面活性劑對(duì)水和油的親和力達(dá)到平衡，導(dǎo)致建 立雙連續(xù)微乳液，納米級(jí)結(jié)構(gòu)化。由此，適用于制備油/水乳液的‘PIT方法’與形成動(dòng)力學(xué) 穩(wěn)定的納米乳液液滴的不可逆的方法相似，包括通過(guò)在PIT下進(jìn)行，突然破碎雙連續(xù)的納 米網(wǎng)絡(luò)，快速冷卻和/或突然水稀釋。本發(fā)明人近來(lái)開(kāi)發(fā)了一種基于PIT方法的方法，該方法經(jīng)改變并適用于在油連續(xù) 相中產(chǎn)生納米乳液。將該方法主要分成G1)在PIT附近的溫度循環(huán)的階段，和(i2)突然稀 釋用于破碎過(guò)渡微乳液結(jié)構(gòu)從而立即產(chǎn)生納米_乳液的階段。因此，當(dāng)該步驟通常通過(guò)用 水稀釋來(lái)進(jìn)行以產(chǎn)生o/w納米乳液時(shí)，過(guò)渡微乳液突然被油稀釋，導(dǎo)致形成w/o納米乳液。因此，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，(w/o)乳液(E1)是根據(jù)PIT方法制備的，并含有表面活性劑(S1)，當(dāng)溫度超過(guò)相轉(zhuǎn)化溫度(PIT)時(shí)，該表面活性劑在非揮發(fā)性油(O2)中比在水中更易溶；當(dāng)溫度低于PIT時(shí)，該表面活性劑在水中比在非揮發(fā)性油(O2)中更易溶。更具體地，油包水型(w/o)乳液(E1)是根據(jù)包括下述步驟的方法來(lái)制備的I1)通過(guò)在PIT附近進(jìn)行溫度循環(huán)，由三元混合物形成納米結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體系， 所述三元混合物含有-所述非揮發(fā)性油(O2)；-水；和-所述表面活性劑(S1)；i2)通過(guò)加入揮發(fā)性油(O1)，從而形成w/o乳液，其中，液滴的流體動(dòng)力學(xué)平均直徑 在10-400nm范圍內(nèi)；和i3)任選地，加入進(jìn)一步量的表面活性劑(S2)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“揮發(fā)性油”是指比水更易揮發(fā)的油，也就是其沸點(diǎn)低于水的沸 點(diǎn)，特別是沸點(diǎn)低于50°C，優(yōu)選在25°C至50°C范圍內(nèi)的油。適用于根據(jù)步驟i)制備納米乳 液的揮發(fā)性油的實(shí)例特別是異戊烷(Bp = 280C )或戊烷(Bp = 360C )。本文使用的術(shù)語(yǔ)“非揮發(fā)性油”是指比水揮發(fā)性差的油，也就是沸點(diǎn)超過(guò)水的沸 點(diǎn)，優(yōu)選沸點(diǎn)超過(guò)150°C的油。優(yōu)選，非揮發(fā)性油(O2)是藥學(xué)上可接受的。本文使用的“藥學(xué)上可接受的”是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)、適用于與人類和動(dòng) 物的組織接觸，而無(wú)過(guò)度毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)、或其它問(wèn)題復(fù)雜性，同時(shí)具有合理的收益/ 風(fēng)險(xiǎn)比的那些油。優(yōu)選，非揮發(fā)性油(O2)為所謂的‘輕質(zhì)礦物油’，其為標(biāo)準(zhǔn)化命名，是指得自石油的 飽和烴的混合物，且有利地是藥學(xué)上可接受的。優(yōu)選，O1Ai2的體積比超過(guò)1，特別是超過(guò)3，更特別是超過(guò)5。優(yōu)選，表面活性劑(S1)的相轉(zhuǎn)化溫度(PIT)低于50°C。優(yōu)選，表面活性劑(S1)為非離子型。優(yōu)選，它含有聚氧乙烯部分，特別是聚氧乙烯 C6-C18脂肪酸酯，例如P0E-300-硬脂酸酯?？紤]由輕質(zhì)礦物油(O2)、水和P0E-300-硬脂酸酯(S1)組成的三元混合物，100X 水/ (水+油)重量比優(yōu)選在30-90的范圍內(nèi)，和/或相對(duì)于三元混合物的總重量，(S1)表 面活性劑的量在5-15重量％范圍內(nèi)，優(yōu)選在8-13重量％范圍內(nèi)。步驟D在適用于制備w/o納米乳液(E1)的PIT方法的步驟D中，將三元混合物{水/ 非揮發(fā)性油(O2)/表面活性劑(S1M結(jié)構(gòu)化為納米結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體系，該體系是在熱力學(xué) 和動(dòng)力學(xué)上非常穩(wěn)定的中間階段。本文使用的術(shù)語(yǔ)“納米結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體系”是指油相和水相共存于連通的連 續(xù)疇，該連續(xù)疇含有位于界面的表面活性劑分子。這些納米結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體系也稱為 "ffinsor IV雙連續(xù)微乳液，，。溫度循環(huán)基本上包括將溫度升高超過(guò)PIT，特別是超過(guò)高達(dá)30°C，和將溫度降至 PIT。出于該考慮，PIT優(yōu)選不超過(guò)70°C。該溫度循環(huán)能形成和導(dǎo)致雙連續(xù)體系的穩(wěn)定。此 夕卜，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在減小液滴直徑和降低多分散性指數(shù)(PDI)以及減少循環(huán)次數(shù)方面，制得的納米乳液(E1)的品質(zhì)得到提高。溫度循環(huán)的加熱和冷卻速率不是關(guān)鍵的，且可以在寬范圍內(nèi)變化。加熱和冷卻速 率實(shí)際上僅對(duì)形成納米乳液E1所需的循環(huán)次數(shù)有影響。作為一個(gè)實(shí)例，當(dāng)加熱和冷卻速率 為dT/dt = 士丨.5°C /min時(shí)，6次循環(huán)，甚至3次循環(huán)可足以獲得具有低多分散性指數(shù)的納 米乳液E1。使用所選次數(shù)的循環(huán)可實(shí)現(xiàn)溫度循環(huán)，獲得的雙連續(xù)體系在接近PIT的溫度下是 穩(wěn)定的，優(yōu)選仍在適度攪拌下。應(yīng)注意到，當(dāng)該方法適用于制備具有包括由兩親型物質(zhì)組成的殼的納米膠囊的組 合物時(shí)，作為一種選擇，兩親型物質(zhì)可在步驟ii)開(kāi)始時(shí)加入，而不是在步驟ii)中加入。步驟i2)隨后，在步驟i2)中，將在該給定溫度下顯示半透明和帶藍(lán)色外觀的雙連續(xù)體系突 然用揮發(fā)性油O1稀釋，立即并不可逆地產(chǎn)生w/o納米乳液Ep該連續(xù)相現(xiàn)在實(shí)際上是揮發(fā) 性油O1與非揮發(fā)性油O2的混合物。應(yīng)注意到，在稀釋步驟期間攪拌雙連續(xù)體系以及攪拌速率不影響納米_液滴的形 成機(jī)理，但是可改進(jìn)和確保中間物的均化，從而制得具有特別低的多分散性指數(shù)的納米乳 液。根據(jù)該方法，所述揮發(fā)性油O1優(yōu)選為粘度比水低的物質(zhì)，例如戊烷或異戊烷。通常，加入至少等于雙連續(xù)體系體積兩倍體積的O1,以產(chǎn)生w/o納米乳液(E1)。由于揮發(fā)性油O1的粘度比水低，該揮發(fā)性油O1將更加快速地互相滲透連通的雙連 續(xù)疇，因此，產(chǎn)生油包水型乳液(E1)。步驟i3)根據(jù)本發(fā)明的PIT方法，該方法還可以包括在步驟i3)中加入進(jìn)一步量的表面活 性劑(S2)。實(shí)際上，已觀察到，在納米乳液連續(xù)油相中加入其它表面活性劑不可逆地穩(wěn)定懸 浮液，也就是，防止液滴的聚集過(guò)程。為了確保良好的穩(wěn)定液滴，優(yōu)選，所述進(jìn)一步量的表面活性劑(S2)為所述表面活 性劑總重量的30-40重量％。假定表面活性劑分子(S2)包裹和涂布水性液滴，從而導(dǎo)致液滴之間空間穩(wěn)定。附加的表面活性劑(S2)可與在步驟I1)中使用的(S1)相同或不同。優(yōu)選，所述表面活性劑(S2)在油相中比在水相中更易溶。所述表面活性劑(S2)可 以特別是聚氧乙烯脂肪酸，例如POE 300硬脂酸酯。步驟ii)在步驟iii)之前，在步驟i)結(jié)束時(shí)形成的乳液(E1)的水性液滴可任選地被“殼”增強(qiáng)。在本發(fā)明的上下文中，“殼”是指圍繞水性液滴且可增強(qiáng)水性液滴穩(wěn)定性的層。因此，在該方法的任選的步驟ii)中，乳液(E1)的液滴的界面被聚合物的二維網(wǎng) 絡(luò)或兩親型物質(zhì)增強(qiáng)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，乳液(E1)的液滴被聚合物增強(qiáng)。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，單體對(duì)水相具有反應(yīng)性，因此 引發(fā)界面聚合，該單體可 溶于油相，即，在油相中比在水相中更易溶，和/或?qū)Ρ砻婊钚詣?S1)和/或(S2)或存在于乳液E1中的任何其它化合物不具有反應(yīng)性。優(yōu)選，所述單體包括兩個(gè)二異氰酸酯(-N = C = 0)基團(tuán)。作為單體的實(shí)例，可提及甲苯-2，4- 二異氰酸酯(TDI) (tolylene-2,4-diisocyanate)、異佛爾酮二異氰酸酯或4， 4-甲基-雙(異氰酸苯酯)(4，4-methyl-biS(phenyliSOCyanate))。最優(yōu)選的單體為甲 苯-2，4-二異氰酸酯(TDI)。不希望局限于理論，假定單體分子的異氰酸酯官能團(tuán)在與水液滴接觸時(shí)使得形成 胺基，其后來(lái)比水更具有反應(yīng)性，并優(yōu)選與另一種異氰酸酯單體反應(yīng)，從而形成聚脲。因此， 由于該化學(xué)反應(yīng)為逐步聚合，且為了生長(zhǎng)，由于聚脲鏈需要與水和油(單體儲(chǔ)器)均連續(xù)接 觸，導(dǎo)致聚合物殼的厚度有利地在分子范圍內(nèi)，并形成格柵樣界面網(wǎng)絡(luò)。有利地，已觀察到，聚合物“格柵”密度可根據(jù)單體濃度而改變。單體含量越高，則 越接近形成聚合物“格柵”。因此，為包封親水性大分子比為包封較小的親水性分子需要的 單體濃度更低。優(yōu)選，在乳液(E1)的油相中，單體的濃度超過(guò)O.OSmg.L—1，特別是超過(guò)O.Smg.L—1， 且特別是在0. 6-0. 8mg. L—1的范圍內(nèi)。在另一具體的實(shí)施方式中，乳液(E1)的液滴被兩親型物質(zhì)增強(qiáng)。所述兩親型物質(zhì)特別包括表面活性劑、合成的或生物聚合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物聚合物”應(yīng)理解為是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的分子，它包括多于 30個(gè)單體單元，通常包括高達(dá)上百個(gè)單個(gè)的單體單元。單體單元可特別為糖、氨基酸和核苷 酸。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“生物聚合物”還包括含有30個(gè)或更少單體單元的“生 物低聚物”。作為生物聚合物的實(shí)例，可提及肽、蛋白質(zhì)(球形或纖維質(zhì))例如骨膠原(氨基酸 單體)、多糖例如纖維素、藻酸鹽或甲殼質(zhì)(糖單體)、核酸例如RNA和DNA(核苷酸單體)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“合成的聚合物”是指通常包括高達(dá)上千個(gè)可相同或不同的單個(gè) 單體單元的大分子。因此，術(shù)語(yǔ)“合成的聚合物”包括均聚物或共聚物。在本發(fā)明的上下文 中，合成的聚合物可包括表面活性劑。優(yōu)選，所述兩親型物質(zhì)為表面活性劑S4，特別是非離子表面活性劑。優(yōu)選，所述表面活性劑的親水親油平衡(HLB)超過(guò)或等于10。優(yōu)選，所述表面活性劑S4為聚山梨酸酯，最優(yōu)選聚山梨酸酯80。步驟iii)在該階段，在任選的步驟ii)中制得的體系包括分散在揮發(fā)性油O1與非揮發(fā)性油 O2的混合物中的聚合物殼水性核納米膠囊(NC)?？蛇x擇的是，在步驟ii)中制得的體系包 括具有由兩親型物質(zhì)組成的殼的水性核納米膠囊(NC)。根據(jù)另一種實(shí)施方式，在該階段，該體系包括分散在揮發(fā)性油O1與非揮發(fā)性油O2 的混合物中的乳液(E1)的水性液滴。在步驟iii)中，顆粒(P)的組合物是通過(guò)如下方法制得的加入一定體積(優(yōu)選 占由步驟ii)或i)制得的分散體體積的4-5倍)的水，和通過(guò)在超過(guò)仏沸點(diǎn)的溫度下并 優(yōu)選超過(guò)(E1)沸點(diǎn)20°C下加熱，除去(優(yōu)選同時(shí))揮發(fā)性油O1，特別是通過(guò)蒸發(fā)。不希望局限于任何理論，可解釋脂質(zhì)殼水性核顆粒(P)形成的假說(shuō)為除去(特別是蒸發(fā))揮發(fā)性油所提供的能量能良好均化體系，更特別是當(dāng)揮發(fā)性油的量變得非常低 時(shí)。在納米膠囊(NC)上鋪展的非揮發(fā)性油02最初存在于油相中，從而制得小的水性核脂 質(zhì)殼顆粒(P)。因此，顆粒(P)的大小可有利地適應(yīng)非揮發(fā)性油(02)的殘余量。此外，已觀察到，只要揮發(fā)性油蒸發(fā)，即油相的體積減少，可溶于油相的表面活 性劑(Si)在油相中逐漸結(jié)晶，特別是在02中結(jié)晶。最后，固體表面活性劑(Si)被封入圍繞 液滴的油相中，因此，形成包裹任選被聚合物殼或兩親型物質(zhì)(NC)保護(hù)的水性核的包括無(wú) 定形固體表面活性劑和油(02)的基質(zhì)脂質(zhì)殼。步驟iv)根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的方面，所述方法進(jìn)一步包括在水相中加入親水性表面活性劑(S3) 的步驟iv)。該附加的步驟實(shí)際上有利地使制得的顆粒(P)穩(wěn)定，并防止它們聚集。本文使用的“親水性表面活性劑”是指“親水親油平衡”(HLB)超過(guò)12，且更特別 是超過(guò)14的表面活性劑。作為合適的親水性表面活性劑(S3)的一個(gè)實(shí)例，可提到P0E 660羥基硬脂酸酯 (Solutol HS15 :)，它的 HLB 在 14-16 之間。作為選自，所述方法還可以包括附加的步驟，該步驟包括用水進(jìn)一步稀釋在步驟 iii)中制得的組合物。親水件和/或親油件物質(zhì)的包封可將可通過(guò)本發(fā)明方法制得的顆粒(P)摻入親水性物質(zhì)或親油性物質(zhì)或親水性 物質(zhì)和親油性物質(zhì)中。親水性和親油性物質(zhì)可特別選自藥物、診斷產(chǎn)品、化妝品、獸醫(yī)產(chǎn)品、植物檢疫產(chǎn) 品、或經(jīng)加工的食品。可將所述親水性物質(zhì)摻入該方法的步驟i)中，更具體地，摻入預(yù)期用于形成納米 結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體系的水相中。優(yōu)選，在根據(jù)步驟形成雙連續(xù)體系之后，在根據(jù)步驟i2)加入揮發(fā)性油A之前， 加入含有親水性物質(zhì)的水溶液。因此，對(duì)三元混合物{非揮發(fā)性油(02)/水/表面活性劑 (Si)}進(jìn)行溫度處理以形成雙連續(xù)體系不會(huì)有利地影響待包封的親水性物質(zhì)。優(yōu)選加入的水溶液的體積非常低，相對(duì)于雙連續(xù)體系的體積，加入的水溶液的體 積可特別為1-5%體積。因此，該濃溶液將非?？焖俚亟Y(jié)合雙連續(xù)體系的水性部分，并在根 據(jù)步驟i2)用揮發(fā)性油稀釋后，將同樣產(chǎn)生納米乳液Ep關(guān)于親油性物質(zhì)，優(yōu)選在界面聚合步驟ii)之后并在步驟iii)之前加入親油性物 質(zhì)。從而，在揮發(fā)性油完全蒸發(fā)后，親油性物質(zhì)同樣共存于顆粒(P)的油相上。根據(jù)其它目的，本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物在水相中含有直徑在20-500nm 范圍內(nèi)的顆粒(P)，所述顆粒含有_ 油相；_在所述油相中，含有_水性液滴，或-納米膠囊(NC)，所述納米膠囊包括-水性核，和-聚合物殼或由兩親型物質(zhì)組成的殼；
禾口_表面活性劑。所述組合物可根據(jù)本發(fā)明的方法制得。根據(jù)本發(fā)明的一方面，顆粒(P)在油相中含有水性液滴，任選包括親水性物質(zhì)。該 實(shí)施方式特別適用于包封各種親水性物質(zhì)，特別是具有高分子量的物質(zhì)。這種親水性物質(zhì)的實(shí)例包括特別是蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、抗體、多糖。在其它方面，顆粒⑵在油相中含有納米膠囊(NC)，該納米膠囊包括水性核和殼。根據(jù)一方面，所述納米膠囊(NC)包括由兩親型物質(zhì)組成的殼。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述納米膠囊(NC)包括聚合物殼。優(yōu)選，所述聚合物殼由聚脲組成。優(yōu)選，顆粒(P)的納米膠囊(NC)的直徑在10-400nm范圍內(nèi)，特別是約50nm，通過(guò) 在透射式電子顯微鏡(TEM)和/或在低溫-TEM上進(jìn)行的顆粒大小測(cè)量來(lái)確定。優(yōu)選，所述水性核含有親水性物質(zhì)。優(yōu)選，油相含有親油性物質(zhì)。有利地，本發(fā)明組合物表征為多分散性指數(shù)低于0. 5，特別是為約0. 1。根據(jù)其它目的，本發(fā)明涉及一種可根據(jù)包括以下步驟的方法制得的油包水型(w/ o)乳液恨)通過(guò)在PIT附近進(jìn)行溫度循環(huán)，由一種混合物形成納米結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體系， 所述混合物含有-非揮發(fā)性油(02)；_ 水；和-表面活性劑(SD；以及i2)加入揮發(fā)性油(0)，從而形成w/o乳液(ED，其中，液滴的流體動(dòng)力學(xué)平均直徑 在10-400nm范圍內(nèi)；和i3)任選地，加入進(jìn)一步量的表面活性劑(S2)，其中，非揮發(fā)性油(02)為石蠟油，而揮發(fā)性油(0D為戊烷或異戊烷。在又一目的中，本發(fā)明涉及一種油包水型(w/o)乳液(ED，所述乳液含有_作為連續(xù)相，異戊烷或戊烷作為揮發(fā)性油，而石蠟油作為非揮發(fā)性油；-作為不連續(xù)相，水；和-表面活性劑餌)。優(yōu)選，表面活性劑(SD含有聚氧乙烯部分。由于具有良好的穩(wěn)定性，這些乳液(ED特別有利，因此，能根據(jù)本發(fā)明制備顆粒 (P)的穩(wěn)定的組合物。根據(jù)其它目的，本發(fā)明涉及本發(fā)明的顆粒(P)的組合物在用于包封親水性和/或 親油性物質(zhì)中的用途。


圖1 根據(jù)本發(fā)明的制備顆粒(P)的組合物的示意方法。在該方法中，縮聚時(shí)間tp 固定為2小時(shí)。
圖2 :TEM偶聯(lián)負(fù)染色技術(shù)(染色劑乙酸雙氧鈾)，根據(jù)本發(fā)明的顆粒(P)的組合 物的稀釋的(1/10)樣品。圖3的(a)、(b)、(c)根據(jù)本發(fā)明的顆粒(P)的組合物的稀釋的(1/10)樣品的低 溫-TEM，和采用在(a)、(b)、(c)中表示的路徑的詳細(xì)的電子強(qiáng)度。圖4和圖5 制劑參數(shù)對(duì)親水性分子的包封收率的影響。圖4 制劑中加入的單體的量的影響，在亞甲基藍(lán)(MB)與BSA-FITC之間比較，縮 聚時(shí)間tp固定為2小時(shí)。圖5 在三種不同的單體量(0. 07,0. 22和0. 44mg ml/1)下，tp對(duì)MB的影響。箭 頭表示在顆粒(P)制備的整個(gè)過(guò)程中所選的時(shí)間。圖6 單體含量對(duì)同時(shí)包封的親水性(亞甲基藍(lán)(MB))分子和親油性(蘇丹紅(Red Soudan) (RS))分子的包封收率的影響?？s聚時(shí)間tp固定為2小時(shí)。圖7 單體含量對(duì)氯水合多柔比星(D0X)的包封收率的影響。圖8 氯水合多柔比星從顆粒(P)中釋放的動(dòng)力學(xué)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.材料和方法1. 1.材料工業(yè)級(jí)聚乙氧基化表面活性劑C18E6由Stearinerie-Dubois (Boulogne,法 國(guó))友好提供。其通常為泊松樣環(huán)氧乙烷(E0)分布約為6的商品。該偏親油性的兩親 物(即，E0值低)可穩(wěn)定由‘輕質(zhì)礦物油’和水加上電解質(zhì)(NaCl)組成的乳液。輕質(zhì) 礦物油購(gòu)自CoopeHMelim，法國(guó))，其為涉及由石油制得的飽和烴的混合物的標(biāo)準(zhǔn)化命 名。超純水通過(guò) MilliQ :過(guò)濾體系(Millipore, Saint-Quentin-en-Yvelines，法國(guó)) 和得自Prolabc^Fontenay-sous-Bois，法國(guó))的氯化鈉制得。最后，非常具有流動(dòng)性和 揮發(fā)性的非極性相也用作第二種油，且也是該方法的關(guān)鍵異戊烷(2-甲基丁烷)得自 Riedel-de-Han (德國(guó))，其 25°C 的絕對(duì)粘度 n = 0. 35mPa s，且沸點(diǎn) Bp = 28°C。亞甲基藍(lán)(MB)、牛血清白蛋白-熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的(BSA-FITC)、蘇丹紅 (RS)購(gòu)自 Sigma。1.2.顆粒(P)的組合物的制備基于以下成分(表1)，根據(jù)以下通用方法來(lái)制備顆粒(P)的組合物。表1 1. 2. 1.油包水型納米-乳液恨)制備由‘輕質(zhì)礦物油，和MilliQ水(100X水/(水+油)重量比TOR = 40)加上 NaCl(在水中的濃度0.51M)組成的粗滴乳液通過(guò)含有短PE0鏈(PE0-300硬脂酸酯， 10wt. % )的非離子聚乙氧基化(PE0)表面活性劑穩(wěn)定。PE0-300硬脂酸酯大量地溶于這種 “輕質(zhì)礦物油”中，且不溶于水(Yu，C. D.，1994)。該體系最后能隨溫度進(jìn)行乳液相轉(zhuǎn)化(Salager, J. L.等人，2004 ；Anton, N.等 人，2007)。該現(xiàn)象，制劑和組合物參數(shù)的影響，以及該三元體系的特征在以前的研究中已進(jìn) 行了深入的研究(Anton，N.等人，2007)。因此，當(dāng)體系精確保持在乳液相轉(zhuǎn)化溫度(PIT) 時(shí)，自發(fā)形成具有帶藍(lán)色和半透明外觀的雙連續(xù)微乳液(Winsor IV-like)，以納米級(jí)結(jié)構(gòu) 化(Kahlweit，M.等人，1985 ；Forster, T.等人，1995 ；Morales, D.等人，2003 ;Izquierdo， P.等人，2004)。接著，在PIT附近(35 < T < 60°C )進(jìn)行溫度循環(huán)處理，以‘結(jié)構(gòu)化’過(guò)渡 微乳液，逐漸增加納米級(jí)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)度以及溫度循環(huán)次數(shù)。作為最后一步，在PIT下將該納米雙連續(xù)體系突然用另一種油(異戊烷)稀釋， 這種油與水相比非常具有流動(dòng)性。立即產(chǎn)生油包水型納米乳液，通常液滴流體動(dòng)力學(xué)直 徑為約40nm，且具有約0. 05的非常令人滿意的多分散性指數(shù)(使用Nano ZS Malvern Instruments進(jìn)行測(cè)量)。這種w/o納米乳液的去穩(wěn)定機(jī)理顯示遵循膠態(tài)聚集過(guò)程，通常是 其中液滴間相互作用曲線通常呈現(xiàn)深度初級(jí)最低值的反向乳液。此外，已觀察到，在已建立納米-乳液后，在納米乳液連續(xù)油相(P0E-300硬脂酸 酯)中加入其它表面活性劑，不可逆地導(dǎo)致穩(wěn)定懸浮液，也就是，防止聚集過(guò)程。實(shí)際上，為 了確保液滴良好穩(wěn)定，加入相應(yīng)于表面活性劑總量的約35襯％的表面活性劑。假定非離子 表面活性劑分子包裹和涂布水性液滴，從而導(dǎo)致液滴之間空間穩(wěn)定。
1.2. 2.界面縮聚界面縮聚階段為在w/o納米乳液模板上產(chǎn)生二維聚脲膜的逐步法。選擇單體的標(biāo) 準(zhǔn)為(i)隨意溶解于連續(xù)的油混合物(異戊烷加上礦物油)中，和(ii)與分散的水相具 有良好的反應(yīng)性。參見(jiàn)圖1，在該實(shí)施方式中選擇甲苯-2-4-二異氰酸酯(TDI)。采用這種 方式，單體分子的異氰酸酯官能團(tuán)在與水液滴接觸時(shí)形成胺基，隨后比水更具有反應(yīng)性，并 優(yōu)選與另一種TDI分子反應(yīng)。因此，由于該化學(xué)反應(yīng)為逐步聚合，且為了生長(zhǎng)，由于聚脲鏈需要與水和油(單體 儲(chǔ)器)均連續(xù)接觸，導(dǎo)致聚合物殼的厚度在分子范圍內(nèi)，并形成界面網(wǎng)絡(luò)，可將該界面網(wǎng)絡(luò) 想象為格柵(這種觀念由關(guān)于包封收率的以下結(jié)果得到支持)。假定單體和待包封的分子 的可能的NH2基團(tuán)之間的反應(yīng)不妨礙聚合物膜的形成。以下研究縮聚時(shí)間tp對(duì)包封收率 的影響，且對(duì)于最優(yōu)化制劑，tp最后固定為2小時(shí)。1. 2. 3.納米膠囊(NC)的制造在該階段，實(shí)驗(yàn)體系由水性納米_液滴組成，被假定具有格柵樣結(jié)構(gòu)的聚脲二維 膜圍繞，并分散在異戊烷(來(lái)自PIT稀釋)和礦物油(來(lái)自初始乳液)的本體油混合物中。 此外，還認(rèn)為在油中可能存在一些仍未反應(yīng)的單體分子。因此，⑴通過(guò)加入作為外部相的附加的水相，和同時(shí)(ii)在蒸發(fā)器中，于明顯超 過(guò)異戊烷沸點(diǎn)(Bp = 28°C )的溫度(例如50°C )下，通過(guò)其自身蒸發(fā)1小時(shí)，通過(guò)除去異 戊烷相，簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)獲得水性核納米膠囊(參見(jiàn)圖1)。從而，該蒸發(fā)階段提供的能量不僅能快速除去揮發(fā)性油，而且確保樣品適當(dāng)均化， 這樣可防止液滴立即聚集，同時(shí)使球形油的體積下降。水性液滴可能同樣鋪展于非極性相 上，導(dǎo)致在水中產(chǎn)生截然不同的膠態(tài)物體。采用這種方式，由于在非極性相中存在非揮發(fā)性 礦物油，當(dāng)異戊烷蒸發(fā)完成時(shí)，最后在新形成的膠態(tài)顆粒上共享。此外，由于使用的PE0非 離子表面活性劑完全不溶于水，隨著油的蒸發(fā)，也就是，油體積的下降，兩親物在油中逐漸 結(jié)晶。最后，將固體表面活性劑封入所得到的圍繞液滴的礦物油中，因此，產(chǎn)生包裹被聚合 物膜保護(hù)的水性核的由無(wú)定形固體表面活性劑和礦物油制成的基質(zhì)脂質(zhì)殼(圖1所示的結(jié) 構(gòu))。該膠囊結(jié)構(gòu)被以下電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)以及其能同時(shí)包封親水性和親油性分子的高能力 充分支持。最后，關(guān)于可能保留在油中的游離的單體，看起來(lái)最后當(dāng)與形成的聚合物膜接觸 (通過(guò)末端NH2基)時(shí)或與外部水相接觸時(shí)被中和(由于也封入礦物油中)。1.2. 4.納米膠囊(NC)的特征顯微鏡觀察透射式電子顯微鏡(TEM)。將一滴每種水性分散體樣品首先放置在涂碳TEM銅 格柵(Quantifoil，德國(guó))上，并讓其風(fēng)干。隨后樣品用乙酸雙氧鈾(Merck，德國(guó))負(fù)染 色。為此，將涂有樣品的TEM格柵依次放置在一滴乙酸雙氧鈾水溶液(2wt. % )和一滴蒸 餾水上。隨后，在將它們置于電子顯微鏡中之前，將格柵風(fēng)干。使用于80kV下運(yùn)行的JE0L JEM-1230TEM觀察樣品。低溫-TEM。使用低溫浸漬低溫-固色裝置(Gatan，USA)制備用于低溫_TEM觀察的 樣品，其中將一滴水性懸浮液沉積在輝光放電的孔型涂碳格柵(Ted Pella Inc.，USA)上。 隨后制備TEM格柵將含有樣品的液滴吸至厚度約為50-500nm的薄液體層，該層保持橫穿 支撐碳膜中的孔。通過(guò)將格柵快速地投入到用液氮冷卻的液體乙烷中，使液體膜玻璃化。將玻璃化的樣品安裝在使用低溫轉(zhuǎn)移體系(Gatan，USA)插入顯微鏡中并用液氮冷卻的Gatan 910樣品夾具(Gatan，USA)中。隨后由保存在透明的冰中并橫過(guò)支撐碳基材中的孔懸浮的 樣品得到TEM圖像。于-178°C下，使用在80kV下運(yùn)行并配備LaB6燈絲的JEM 1230 ‘低溫， 顯微鏡(Jeol，日本)，在低劑量條件下(低于10e A2)下觀察樣品。在Gatan 1.35KX1， 04KX12bit ES500W Erlangshen CCD照相機(jī)中記錄所有顯微照片。表面勢(shì)能測(cè)量作為納米膠囊表面勢(shì)能的圖像，使用Nano ZS (Malvern Instruments)評(píng)估 (勢(shì)能。我們使用結(jié)合電泳淌度和(勢(shì)能的斯莫盧霍夫斯基(Smoluchowski)模式。 Helium-Neon laser，4mW，在633nm下操作，散射角固定為173°，溫度恒定為25°C。但是， 通過(guò)軟顆粒分析模式(H.0hshima，等人，2006)對(duì)表面性能的深入研究表明，包封的材料對(duì) 這些物體的表面勢(shì)能沒(méi)有影響。已表明，包封材料不構(gòu)成殼結(jié)構(gòu)的一部分。1. 2. 5摻入親水性和親油模式分子關(guān)于圖1中的整個(gè)制備過(guò)程，親水性和親油性物類的摻入看起來(lái)采用不同的方式 進(jìn)行。(i)最終，親水性材料必須分配到w/o納米乳液水液滴中，且這種分配從親水性材 料開(kāi)始時(shí)包括在粗滴乳液制劑的水相中就開(kāi)始進(jìn)行了。另一種較有效的方式包括在溫度循 環(huán)之后，且在異戊烷稀釋之前，在保持在PIT的微乳液中注射非常小體積(不多于2% (v./ v.))的非常濃的水溶液。注射在(仍)攪動(dòng)的微乳液中的液滴非常快速地結(jié)合雙連續(xù)網(wǎng) 絡(luò)的水性部分。由于油稀釋，立即形成納米乳液，使得注射的親水性分子在油中非常均勻地 分散。通過(guò)該原始方式摻入親水性物類，最后防止在加工過(guò)程中可能由于溫度循環(huán)處理而 使分子降解。選擇具有非常不同分子量的親水模式分子第一種為不穩(wěn)定的染料亞甲基藍(lán) (MB)，第二種為牛血清白蛋白熒光異硫氰酸酯標(biāo)記(BSA-FITC)的蛋白質(zhì)，最后一種為熒光 化合物氯水合多柔比星(DoxorubicinChlorhydrate) (D0X)，其為一種抗癌藥物。(ii)另一方面，在所選的聚合時(shí)間(最大程度防止與單體可能的相互作用)之后， 且在異戊烷蒸發(fā)階段之前，將親油性物類引入納米乳液的油相中。從而，在異戊烷蒸發(fā)完全 之后，加入的親油性材料同樣共存于封入殘余的礦物油中的液滴上，也就是，被無(wú)定形油/ 非離子表面活性劑基質(zhì)捕獲。最后出現(xiàn)的是殘余的礦物油位置的標(biāo)記，且確定顯著包封收 率應(yīng)支持提出的多官能水/油結(jié)構(gòu)。親油模式分子也是染料蘇丹紅III (red Soudan III) (RS)。此處重要的是注意到，含有親水性和親油性試劑的納米膠囊制劑的這些方法仍可看 作僅涉及低能量(也稱為‘低能量’方法)。從而，包封的分子不經(jīng)受‘高能量’乳化過(guò)程和 裝置(例如高壓均化器或sonifier)，且甚至不進(jìn)行溫度循環(huán)。防止待包封的易碎分子在加 工過(guò)程中可能降解。采用間接方法進(jìn)行所有量化，通過(guò)離心法(30分鐘，14500rpm)，在將外部水與 納米膠囊分離后，將其冷凍-干燥(RP2V，S⑶，Le CoudraySaint-Germer，法國(guó))，以確 保將可能殘留的納米膠囊破壞(并且還防止在量化過(guò)程中的額外的光吸收)。接著，將 冷凍-干燥的樣品溶解于二氯甲烷(DCM)中，并使用Spectrophotometer UV-visible Uvikon 922 分光光度計(jì)(Bio-TekKoutron instruments, Saint-Quentin-en-Yvelines, 法國(guó))，將存在于外部水中的除D0X以外的不同的摻入的分子簡(jiǎn)單量化。使用分光熒光計(jì) (FluoroskanAscent FL，類型 374，Thermo Electron Corporation，F(xiàn)inland)量化 D0Xo 激發(fā)光和發(fā)射光分別在485nm和550nm下通過(guò)通帶濾色片。1.2.6.多柔比星從顆粒(P)中的釋放收率為了建立藥物釋放動(dòng)力學(xué)(參見(jiàn)圖8)，將封閉在滲析15kDa膜(Spectra/Por. membrances, Fisher Bioblock Scientific，Illkirch，法國(guó))中的 2mL 新制備的含有負(fù)載 D0X的顆粒⑵的懸浮液加入到得自Sigma的40mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH 7.4)中。于 37°C下(在蒸發(fā)器中，Julabo SW22, JULABOLabortechnik GmbH, Seelbach，德國(guó))，將燒瓶 在暗處輕微機(jī)械攪拌(125rpm)。接著，在指定的時(shí)間點(diǎn)收集500 y L釋放介質(zhì)，如前所述，通 過(guò)分光熒光法確定D0X濃度。將該收集的體積系統(tǒng)地用相同體積的新的PBS代替，以確保 “沉降”實(shí)驗(yàn)條件。2.結(jié)果2.1納米膠囊特性圖2表示這些水性-核納米膠囊的負(fù)染色TEM圖，低溫透射電鏡圖如圖3所示。由 這兩個(gè)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)技術(shù)呈現(xiàn)補(bǔ)充信息，并最終，與圖1提出的結(jié)構(gòu)非常一致。首先關(guān)注液滴的 大小，它的大小在50nm左右，最后與(減去油、加上表面活性劑殼厚度)測(cè)量的w/o納米乳 液大小一致。此外，僅考慮形成納米膠囊的材料，可接近理論油/表面活性劑殼的厚度，已 知它們各自的比例，且假定納米膠囊具有假定的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生約7. 5nm的厚度。該計(jì)算結(jié)果看 起來(lái)也能得到如圖2所示的核/殼比例的支持。此外，這些電子顯微鏡照片顯示膠囊較良好的單分散性，并證明分散體和該配制 方法的較良好的品質(zhì)。當(dāng)然，由于膠態(tài)物體在測(cè)量和形成真空階段的過(guò)程中可能已爆破，而 在圖2中顯示出含有這些膠態(tài)物體的水性核的膠囊結(jié)構(gòu)。隨后空腔被(親水性)染色劑填 充，在納米膠囊內(nèi)產(chǎn)生有對(duì)比斑點(diǎn)。相反，圖3(a)、(b)、(c)中的低溫透射電鏡圖存在完整的納米膠囊，且由于顆粒的 中心與邊緣之間對(duì)比度的差異，也同樣顯示膠囊結(jié)構(gòu)。實(shí)際上，在不存在染色劑時(shí)，對(duì)比有 機(jī)物類與水之間的差異，足以顯示這樣的細(xì)節(jié)。最后，關(guān)于在圖3中所公開(kāi)的電子強(qiáng)度的詳 細(xì)描述，某些殼的質(zhì)地顯示有機(jī)材料(和聚合物排列)在納米膠囊殼中的無(wú)規(guī)分布。這點(diǎn) 仍與圖1所示的提出的機(jī)理和格柵樣結(jié)構(gòu)相關(guān)。2. 2穩(wěn)定性由于特定的納米膠囊結(jié)構(gòu)，組成殼框架的聚合物的存在，關(guān)于其親油性部分，由于 使用的表面活性劑具有短PE0-鏈，且還由于其大部分在油殼中結(jié)晶，像空間來(lái)源的靜電一 樣的排斥的分布力顯示出非常低。新形成的納米膠囊具有非常良好的單分散性且多分散性 指數(shù)(得自Nano ZS Malvern，在合適的稀釋條件下)相當(dāng)好，也就是，低于0. 1。接著，通 過(guò)在水中的膠態(tài)聚集過(guò)程，濃NC懸浮液明顯地快速去穩(wěn)定，儲(chǔ)存約1個(gè)月后，顯示乳狀液濃 度的NC。實(shí)際上，當(dāng)足夠大(> lym)時(shí)，簇(clusters)能經(jīng)受地心引力。另一方面，通過(guò) 簡(jiǎn)單地稀釋樣品(例如1/100)可使該過(guò)程明顯降低，且懸浮液顯示可穩(wěn)定數(shù)月。2. 3親水性和/或親油性分子的高效納米包封由于將親水性試劑包封在納米膠囊內(nèi)的組成部分本身分散于水性連續(xù)相中的實(shí) 際困難，首先涉及所選的親水性物類(亞甲基藍(lán)和BSA-FITC)可包封在該膠體內(nèi)的程度。采 用上述方法，在納米乳液產(chǎn)生步驟以及分子量化以確定包封收率的過(guò)程中進(jìn)行分子摻入。 從而，制劑參數(shù)(引入制劑中的單體的量和聚合時(shí)間tp)對(duì)包封收率的影響公開(kāi)于圖4。
因此，對(duì)于固定為tp = 2h的最優(yōu)化的縮聚時(shí)間，圖4比較了加入到w/o納米乳液 中的單體量對(duì)包封收率的影響，使用兩種不同的親水性分子MB和BSA-FITC。因此，趨勢(shì)看 起來(lái)非常類似，從在不存在單體時(shí)不可能包封(這時(shí)假定收率為0)且內(nèi)部水全部逸向外 部，到在最高單體含量下的非常令人滿意的收率。BM和BSA-FITC得到的平穩(wěn)狀態(tài)結(jié)果非常 類似，在0. 9附近，但是非常感興趣的點(diǎn)在兩種分子之間出現(xiàn)偏移。實(shí)際上，與較少染料相 比，大的蛋白質(zhì)保持較低單體量。BSA-FITC在約0. 05mg化―1時(shí)達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，而MB在偏遠(yuǎn) 的約0. 5mg化―1時(shí)達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，這點(diǎn)可能說(shuō)明在單體濃度與聚合物‘格柵’密度之間存在 關(guān)聯(lián)性單體含量越高，越接近于形成聚合物‘格柵’。最終，該結(jié)果與以上提出的納米膠囊 結(jié)構(gòu)相關(guān)，由于縮聚反應(yīng)僅產(chǎn)生二維膜，其中聚合物纖維共生(intergrown)形成‘格柵樣’ 網(wǎng)絡(luò)。從此以后，在異戊烷蒸發(fā)過(guò)程中，提供的能量將誘導(dǎo)一部分包封的分子逸向外部水， 同樣，由于聚合物格柵密度提高而使該逸出降低。此外，由MB與BSA-FITC之間觀察到的差 異看來(lái)，包封的分子的分子量在該過(guò)程中也是重要的。比起較小的分子，最大的分子更容易 被聚合物網(wǎng)絡(luò)阻擋，直至達(dá)到類似的包封收率(在約0. 5mg L—1處)。圖5說(shuō)明對(duì)于單體的三種所選的加入量，縮聚時(shí)間％對(duì)1 的包封收率的影響。這 樣，tp與在將單體加入到納米乳液中和異戊烷蒸發(fā)步驟之間的延遲相一致。在該期間樣品 仍于500rpm下輕微攪拌。最后證明在該過(guò)程中其值固定(tp = 2h)，這是由于看起來(lái)在每 種情況下類似地快速(低于1小時(shí))達(dá)到某種程度的穩(wěn)定。此外，由于在異戊烷蒸發(fā)步驟 中將單體封閉在薄油層中(因此迫使與內(nèi)部水、聚合物殼、或外部水接觸)，最后迫使所有 TDI分子反應(yīng)并連接聚脲網(wǎng)絡(luò)。在這種意義上，對(duì)于給定的短的tp以及由此合成的相同量 的包封收率的差異源自聚合物在納米膠囊結(jié)構(gòu)中的不均勻分布。甚至合理地想到該強(qiáng)制的 縮聚(對(duì)于短的tp)可在膠囊中產(chǎn)生聚合物孔，通過(guò)該聚合物孔，內(nèi)部水可通過(guò)油逸出?，F(xiàn)在關(guān)于親水性和親油性組分的同時(shí)包封，進(jìn)行在相同的納米膠囊內(nèi)摻入亞甲基 藍(lán)和蘇丹紅III (red Soudan III)的實(shí)驗(yàn)，并在圖6中所所報(bào)道。關(guān)于上述處理，測(cè)量包封 收率隨制劑中加入的單體的量的關(guān)系，且最優(yōu)化縮聚時(shí)間選擇為2小時(shí)。同樣，如NC結(jié)構(gòu) 預(yù)先提出的，MB在內(nèi)部水中，而RS在油狀環(huán)繞的殼中。當(dāng)然，與僅在納米膠囊中的圖4所 示的相比，亞甲基藍(lán)曲線具有非常類似的外觀。關(guān)于蘇丹紅III，明顯地看出，單體量對(duì)其包 封收率沒(méi)有影響，由于在界面縮聚之后親油性分子被加入到油相中，而最終，這是與該過(guò)程 相關(guān)的。因此，RS被封閉在油/無(wú)定形表面活性劑殼中，且具有非常高的包封收率，收率達(dá) 到約0.92。概括起來(lái)，這些物體不僅顯示出令人感興趣的包封親水性物類的能力(對(duì)聚合物 內(nèi)部框架有特定的影響)，而且它們還明顯地顯示出同時(shí)包封親水性(MB)和親油性(RS)模 式分子的能力。由于這些物體包括在其自身結(jié)構(gòu)液體水和油儲(chǔ)器中，且同樣由于它們具有 膠態(tài)范圍的大小，這些多官能性質(zhì)看起來(lái)較原始。該研究的其它方面關(guān)于D0X包封收率與制劑變量的隨動(dòng)。因此，充分的研究表明， 僅兩個(gè)參數(shù)對(duì)包封收率有顯著的影響單體量和縮聚時(shí)間(tp)。當(dāng)tp超過(guò)約1-1. 5h且無(wú) 論單體濃度如何時(shí)，收率快速地達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，因此，在該過(guò)程中將tp固定為2h。另一方面，單體量對(duì)D0X包封收率的影響顯示了如圖7所示的典型進(jìn)展。該性質(zhì) 公開(kāi)了納米膠囊結(jié)構(gòu)和均勻殼(不含孔)的形成與單體濃度密切相關(guān)，因此，與液滴界面處 的聚合物緊密性密切相關(guān)。通過(guò)限定包封收率與聚合物總量之間的折衷，這些結(jié)果可使該方法最優(yōu)化。然后，在生理?xiàng)l件下研究水性-核納米膠囊的釋放行為，結(jié)果示于圖8。這些結(jié)果 不僅為殼滲透性和D0X釋放機(jī)理提供信息，而且還為水性_核納米膠囊的結(jié)構(gòu)性能提供信 息。最終，這些結(jié)果還證實(shí)D0X在膠囊內(nèi)有效包封，且隨著時(shí)間完全釋放(通過(guò)曲線擬合，釋 放高達(dá)約100% )。第一點(diǎn)上應(yīng)注意到，釋放分布圖具有指數(shù)行為，與指數(shù)函數(shù)(R = 0. 992) 充分?jǐn)M合。2.4.未包封任何活性成分的顆粒(P)的細(xì)胞毒性在NIH/3T3細(xì)胞(鼠Mus肌的纖維組織母細(xì)胞)上評(píng)定根據(jù)上述1. 2制備的未包 封任何活性成分(下文中稱為NCB)的顆粒(P)的細(xì)胞毒性。將顆粒(P)暴露于各種顆粒 濃度下歷時(shí)4、24、48或72小時(shí)。通過(guò)MTT測(cè)試確定細(xì)胞存活率。結(jié)果報(bào)道于下表和圖9 中。注意到，在稀釋高達(dá)1/1000時(shí)沒(méi)有明顯的毒性。 2.5.含有納米膠囊(NC)的顆粒⑵的組合物的制備，所述納米膠囊包括由 Tween 80作為兩親型物質(zhì)組成的殼。基于以下成分，根據(jù)上述通用方法(參見(jiàn)1. 2. 1和1. 2. 3部分)制備組合物 在攪拌(500rpm)下，在35_60°C之間進(jìn)行3次溫度循環(huán)。在第三次循環(huán)冷卻相的 過(guò)程中，于50°C下，通過(guò)加入異戊烷和P0E 300硬脂酸酯將體系稀釋，從而形成穩(wěn)定的(w/ o)納米乳液。隨后通過(guò)在50°C的milliQ水中加入制得的納米乳液，并蒸發(fā)異戊烷歷時(shí)約1小 時(shí)，形成納米膠囊。通過(guò)監(jiān)測(cè)顆粒(P)的大小和(勢(shì)能的變化(使用nanosizer ZS測(cè)量，參見(jiàn)1. 2. 4 部分)來(lái)研究制得的組合物的穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化。結(jié)果顯示顆粒具有良好的穩(wěn)定性，相應(yīng)于大小和(勢(shì)能隨時(shí)間(一個(gè)月)保持恒定值。2. 6.在單體(通過(guò)水性液滴包封)存在下或沒(méi)有單體存在下，親水性抗癌藥物 (多柔比星)的包封收率的比較基于以下成分，根據(jù)上述通用方法(參見(jiàn)1. 2. 1和1. 2. 3部分)制備組合物 在攪拌(500rpm)下，在35_60°C之間進(jìn)行3次溫度循環(huán)，從而形成微乳液。該微乳 液隨后于39°C下穩(wěn)定。隨后將50 μ L多柔比星的水溶液(4. 18mg/ml)依次加入到微乳液中，從而在用異 戊烷稀釋后，形成負(fù)載多柔比星的w/o納米乳液。隨后將一部分該納米乳液與甲苯2，4-二異氰酸酯進(jìn)行界面聚合(參見(jiàn)以上1. 2. 2 部分)，而另一部分不進(jìn)行界面聚合。隨后通過(guò)在50°C的milliQ水中加入制得的納米乳液，并蒸發(fā)異戊烷歷時(shí)約1小 時(shí)，形成納米膠囊。這兩種納米乳液的水性納米膠囊或水性液滴的大小為130nm(使用nanosizer ZS 測(cè)量)。包封的多柔比星在聚合物納米膠囊中的收率為70%，在水性液滴中的收率為 30%。這些結(jié)果說(shuō)明，水性液滴能包封多柔比星，雖然與使用聚合物納米膠囊得到的包 封收率相比，包封收率較低。參考文獻(xiàn)Hillaireau, H. ；Le Doan, T. ；Besnard, M. ；Chacun, H. ；Janin, J. ；Couvreur, P., Int. 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權(quán)利要求
一種組合物，該組合物含有在水相中直徑在20-500nm范圍內(nèi)的顆粒，所述顆粒含有-油相；-在所述油相中，含有-水性液滴，或-納米膠囊，所述納米膠囊包括-水性核，和-聚合物殼或由兩親型物質(zhì)組成的殼；和-表面活性劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述納米膠囊包括由兩親型物質(zhì)組成的殼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中，所述兩親型物質(zhì)為表面活性劑S4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述表面活性劑S4為非離子表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述表面活性劑S4的親水親油平衡超過(guò)或等于10。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述表面活性劑S4為聚山梨酸酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述納米膠囊包括聚合物殼。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述聚合物殼由聚脲組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述納米膠囊或水性液滴的直 徑在10-400nm范圍內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述水性核或水性液滴含有親 水性物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述油相含有親油性物質(zhì)。
12.權(quán)利要求1-11所述的組合物的制備方法，該方法包括以下步驟i)制備油包水型乳液，其中，液滴的流體動(dòng)力學(xué)平均直徑為10-400nm，其中，連續(xù)相含 有兩種油，揮發(fā)性油和非揮發(fā)性油，所述揮發(fā)性油比水更具有揮發(fā)性，而所述非揮發(fā)性油的 揮發(fā)性比水差； )任選地，加入單體或者加入兩親型物質(zhì)，以形成水性核_殼納米膠囊，所述單體可 溶于所述乳液的連續(xù)相且當(dāng)與水接觸時(shí)聚合；和iii)加入水相并除去所述揮發(fā)性油，從而形成權(quán)利要求1-11所述的組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述乳液含有表面活性劑S1,當(dāng)溫度超過(guò)相轉(zhuǎn) 化溫度時(shí)，所述表面活性劑S1在所述非揮發(fā)性油中比在水中更易溶；當(dāng)溫度低于相轉(zhuǎn)化溫 度時(shí)，所述表面活性劑S1在水中比在所述非揮發(fā)性油中更易溶，并且其中，根據(jù)包括下述步驟的方法來(lái)制備所述油包水型乳液 I1)通過(guò)在相轉(zhuǎn)化溫度附近進(jìn)行溫度循環(huán)，由一種混合物形成納米結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體 系，所述混合物含有 -所述非揮發(fā)性油； -水；和-所述表面活性劑S1;12)加入所述揮發(fā)性油，從而形成油包水型乳液，其中，液滴的流體動(dòng)力學(xué)平均直徑在 10-400nm的范圍內(nèi)；和13)任選地，加入進(jìn)一步量的表面活性劑S2。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，在步驟i2)之前，將含有親水性物質(zhì)的水溶液 加入到制得的所述納米結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體系中。
15.根據(jù)權(quán)利要求13-14中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述表面活性劑S1含有聚氧乙 烯部分。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述表面活性劑S1為聚氧乙烯C6-C18脂肪酸酯。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述表面活性劑S1為P0E-300-硬脂酸酯。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述非揮發(fā)性油為輕質(zhì)礦物油。
19.根據(jù)權(quán)利要求12-18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述揮發(fā)性油為戊烷或異戊焼。
20.根據(jù)權(quán)利要求13-19中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述進(jìn)一步量的表面活性劑S2 占所述表面活性劑總量的30-40重量％。
21.根據(jù)權(quán)利要求12-20中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述單體含有兩個(gè)二異氰酸酯基團(tuán)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述單體選自甲苯-2，4-二異氰酸酯、異佛爾 酮二異氰酸酯或4，4-甲基-雙(異氰酸苯酯)。
23.根據(jù)權(quán)利要求12-22中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，在聚合步驟ii)之后，且在步驟 iii)之前，加入親油性物質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求12-23中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述親水性物質(zhì)和所述親油性 物質(zhì)選自藥物、診斷產(chǎn)品、化妝品、獸醫(yī)產(chǎn)品、植物檢疫產(chǎn)品、或經(jīng)加工的食品。
25.根據(jù)權(quán)利要求12-24中任意一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括在步驟iii)之后，在水 相中加入親水性表面活性劑S3的步驟iv)。
26.一種油包水型乳液，所述乳液可通過(guò)下述方法制得，所述方法包括以下步驟11)通過(guò)在相轉(zhuǎn)化溫度附近進(jìn)行溫度循環(huán)，由一種混合物形成納米結(jié)構(gòu)化的雙連續(xù)體 系，所述混合物含有-非揮發(fā)性油； -水；和-表面活性劑S1;以及12)加入揮發(fā)性油，從而形成油包水型乳液，其中，液滴的流體動(dòng)力學(xué)平均直徑在 10-400nm的范圍內(nèi)；和13)任選地，加入進(jìn)一步量的表面活性劑S2,其中，所述非揮發(fā)性油為石蠟油，所述揮發(fā)性油為戊烷或異戊烷。
27.一種油包水型乳液，所述乳液含有-作為連續(xù)相的揮發(fā)性油和非揮發(fā)性油，異戊烷或戊烷作為所述揮發(fā)性油，而石蠟油作 為所述非揮發(fā)性油；-作為不連續(xù)相的水；和 -表面活性劑S”
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的油包水型乳液，其中，所述表面活性劑含有聚氧乙烯 部分。
29.權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的組合物在包封親水性和/或親油性物質(zhì)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物在水相中含有直徑在20-500nm范圍內(nèi)的顆粒，所述顆粒含有油相和-表面活性劑；在所述油相中，含有-水性液滴，或-納米膠囊(NC)，所述納米膠囊包括水性核，和-聚合物殼或由兩親型物質(zhì)組成的殼。所述組合物特別可用于包封親水性和/或親油性物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K9/107GK101842088SQ200880114087
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者J·P·伯努瓦, N·安東, P·索尼耶 申請(qǐng)人:法國(guó)國(guó)家健康醫(yī)學(xué)研究院