專利名稱：：用于調(diào)節(jié)靶rna活性的寡核苷酸的制作方法用于調(diào)節(jié)靶RNA活性的寡核苷酸
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及可以用來影響靶RNA活性的寡核苷酸。第一代此類寡核苷酸是意圖影響靶mRNA活性的反義寡核苷酸。對此類寡核苷酸感興趣的一個原因是可以因特異性堿基配對而實現(xiàn)的強烈且可預測專一性的潛能。換句話說，設計針對給定核酸如mRNA為高度特異的寡核苷酸在理論上是極簡單的。然而，已經(jīng)證明簡單的堿基配對不足以實現(xiàn)調(diào)節(jié)給定靶mRNA，即與給定靶mRNA互補的寡核苷酸沒有實質(zhì)地影響靶mRNA的活性。若該寡核苷酸靶向mRNA的可讀框，例如可以是這種情況，即翻譯裝置在翻譯期間單純地替代該寡核苷酸。因而，開發(fā)了會改善該寡核苷酸的調(diào)節(jié)活性的手段。例如，開發(fā)了可以激活RNA酶H對靶mRNA切割的寡核苷酸。此類寡核苷酸的一個潛在缺點是它們可以介導除預期靶mRNA之外的其他RNA的切割，即產(chǎn)生脫靶效應。另外，借助RNA酶H切割發(fā)揮作用的此類寡核苷酸處于治療多種疾病的臨床試驗中。近來，研究已經(jīng)證實包括哺乳動物細胞在內(nèi)的真核細胞包含利用RNA作為專一性決定因素的一個復雜基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)(本文中也稱作RNAi機器)。該系統(tǒng)可以由所謂siRNA觸發(fā)，所述的siRNA可以被引導至目的細胞以調(diào)節(jié)靶mRNA的活性。目前，大量工作投入用siRN觸發(fā)RNAi機器以特異性地調(diào)節(jié)靶RNA，尤其靶mRNA。廣泛地認為這種方法有很大希望用于開發(fā)新治療劑。如下文還將概述，這種方法的主要優(yōu)點是siRNA的專一性取決于siRNA的引導鏈與靶RNA之間的互補性程度，即可以控制靶專一性。然而，已經(jīng)證明siRNA可以具有比最初設想更少的特異性。最初，認為僅攜帶對siRNA的引導鏈完全互補的區(qū)段的靶RNA會受到影響，即被RNAi機器靶向。新研究表明siRNA確實產(chǎn)生明顯的脫靶效應，即調(diào)節(jié)非預期的靶。現(xiàn)在認為這些脫靶起因于siRNA或而非充當微RNA的siRNA的引導鏈。微RNA是最近發(fā)現(xiàn)并且通過RNAi機器作為siRNA發(fā)揮作用的一類內(nèi)源性RNA分子。當前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約500種人類微RNA并且數(shù)目正在迅速增加。現(xiàn)在認為超過三分之一的人類基因可以受微RNA調(diào)節(jié)。因此，微RNA本身可以用來調(diào)節(jié)靶RNA的活性，并且因而例如用作治療劑。然而，微RNA通常對多于一種靶RNA起作用，即它們是不加區(qū)分的。因此，向細胞中導入微RNA或調(diào)節(jié)微RNA水平會影響多于一種靶mRNA的活性并且因而經(jīng)常產(chǎn)生不想要的脫靶效應。已經(jīng)提出一種新近方法，其中通過抑制微RNA的活性調(diào)節(jié)靶RNA活性?？梢允褂靡呀?jīng)命名為反微RNA(Kmir)(antimir)和拮抗微RNA(拮抗mir)(antagomir)的互補性寡核苷酸抑制微RNA。由于微RNA本身是不加區(qū)分的，反mir或拮抗mir也將是不加區(qū)分的并且影響多于一種靶RNA的活性。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)靶RNA活性的寡核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸可以激活RNA酶H,RNAi或阻止RNAi。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸能夠防止微RNA調(diào)節(jié)靶RNA。因此，本發(fā)明的第一方面是寡核苷酸，其包含與SEQIDNO:1_56中任意者或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1_56中任意者的至少8個鄰接堿基互補的鄰接序列。本發(fā)明的其他方面涉及調(diào)節(jié)靶RNA活性的方法、包含有效量的本發(fā)明寡核苷酸的藥物組合物、用作藥物的本發(fā)明寡核苷酸和治療方法，所述治療方法包括將治療有效量的本發(fā)明寡核苷酸給藥至有需要的人。發(fā)明詳述定義在以往申請PA200700860“來自微RNA靶的Xmirs”中，當指本發(fā)明的寡核苷酸時，使用術(shù)語“Xmir”。在這項申請中，偏好性地使用術(shù)語“本發(fā)明的寡核苷酸”或備選地“阻斷HiiR(Wockmir)”勝于術(shù)語Xmir。因此，當使用Xmir或阻斷miR時，指本本發(fā)明的寡核苷酸。阻斷miR是本發(fā)明寡核苷酸的具體的優(yōu)選實施方案，其中所述寡核苷酸可以用來阻止對特定靶RNA的微RNA調(diào)節(jié)作用。術(shù)語“調(diào)節(jié)”和“調(diào)變”在本文可互換地使用。當指“靶mRNA的活性”時，通常意指靶mRNA表達，即翻譯成蛋白質(zhì)或肽。因而，調(diào)節(jié)靶mRNA的活性可以包括降解該mRNA和/或翻譯性調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)也可以包括影響該mRNA的胞內(nèi)運輸。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述寡核苷酸能夠調(diào)節(jié)靶mRNA的表達。在另一個優(yōu)選的實施方案，所述寡核苷酸可以介導靶mRNA的降解。所述活性也可以是復制。當靶RNA是病毒RNA時，本發(fā)明的寡核苷酸可以影響病毒復制或干擾該病毒增殖。如本領域中所用，調(diào)節(jié)可以是正向的或負向的。即，調(diào)節(jié)物(例如寡核苷酸或微RNA)可以提高靶(例如靶mRNA)的活性或它可以降低該靶的活性。當指“RNA的靶序列”時，意指參與微RNA調(diào)節(jié)作用或?qū)ζ浔匦璧腞NA區(qū)域。術(shù)語“靶區(qū)域和靶序列”在本文中可互換地使用。意圖不受理論束縛，認為該區(qū)域包含在微RNA調(diào)節(jié)靶RNA期間與微RNA直接相互作用的堿基。在優(yōu)選的實施方案中，靶序列是對于微RNA調(diào)節(jié)作用必需的靶RNA區(qū)域?？梢允褂脠蟮老到y(tǒng)確定此類區(qū)域，其中針對系統(tǒng)性缺失靶RNA檢驗活性以確定靶序列。如將從該說明書顯而易見，本發(fā)明的寡核苷酸也可以用來確定對微RNA調(diào)節(jié)作用必需的靶RNA區(qū)域。優(yōu)選地，所述靶序列包含反種子序列，其中所述反種子序列與微RNA的種子序列互補并且還與本發(fā)明寡核苷酸的引導序列互補。如本領域中所用的術(shù)語“微RNA”具有與本領域一般已知那樣相同的意思。即，術(shù)語“微RNA”指能夠調(diào)節(jié)靶mRNA活性的一般18-22個核苷酸的非翻譯性小RNA。微RNA—般從原微RNA加工成稱作前微RNA的短莖-環(huán)結(jié)構(gòu)并且最終加工為成熟的miRNA。前微RNA的莖的兩條鏈可以加工為成熟的微RNA。miRBase(http//microrna.sanqer.ac.uk/sequences/)是已知微RNA的匯編。也可以在這個網(wǎng)站上找到預測和已知的微RNA靶。如本領域中所用的術(shù)語SiRNA(短干擾RNA)具有與本領域一般已知那樣相同的意思。即，術(shù)語siRNA指雙鏈RNA復合體，其中所述鏈的長度一般是18-22個核苷酸。極經(jīng)常地，該復合體具有3'-突出端。當指本文中的RNAi機器時，意指對siRNAs和微RNA的活性或?qū)τ赗NAi途徑必需的細胞成分。該RNAi機器的主要成員是RNA誘導沉默復合體(RISC復合體)。如本文提及，一個RNA單元是組成RNA聚合物的單體之一。因而，一個RNA單元也稱作一個RNA單體或一個RNA核苷酸。同樣地，一個DNA單元是組成DNA聚合物的單體之一并且DNA單元也可以稱作DNA單體或DNA核苷酸。當指堿基時，意指核苷酸的堿基。該堿基可以是DNA、RNA、INA、LNA或能夠特異性堿基配對的任何其他核酸的部分。該堿基也可以PNA(肽核酸)的部分或嗎啉代。在一些實施方案中，該堿基可以是通用堿基。當指序列的長度，可以指單元數(shù)目或堿基數(shù)。當指互補性序列時，G與C配對，A與T和U配對并且反之亦然。在優(yōu)選的實施方案中，G還與U配對并且反之亦然，以形成所謂搖擺堿基對。在另一個優(yōu)選的實施方案，可以在本發(fā)明的微RNA或寡核苷酸中包含次黃苷(I)堿基。I堿基與A、C和U配對。仍在另一個優(yōu)選實施方案中，可以使用通用堿基。通用堿基一般可以與G、C、A、U和T發(fā)生堿基配對。通用堿基往往不與另一條鏈上的相對堿基形成氫鍵。仍在另一個優(yōu)選實施方案中，互補性序列指僅含沃森-克里克(Watson-Crick)堿基對的鄰接序列。如本領域中所用，術(shù)語“能夠與......堿基配對”可互換地與“互補于”使用。因而，在一個實施方案中，該寡核苷酸包含一個或多個次黃苷堿基。第一方面在第一方面，本發(fā)明提供寡核苷酸，其包含與SEQIDNO:1_56中任意者或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1-56中任意者的至少8個鄰接堿基互補的鄰接序列。當指本文中的取代時，其意指可以將特定位置處的堿基取代為另一個堿基。所述取代可以起因于靶RNA中存在單核苷酸多態(tài)性。在一個實施方案中，術(shù)語“取代”也包括缺失和添加。更優(yōu)選地，術(shù)語“取代”不包括缺失和添加。SEQIDNOs1-56代表驗證的微RNA靶(也稱作靶RNAs)或推定性微RNA靶的序列。因而，本發(fā)明的寡核苷酸可以用來驗證SEQIDNOs1-56是否確實包含微RNA靶并且受微RNA調(diào)節(jié)。另外，本發(fā)明的寡核苷酸也可以用來調(diào)節(jié)靶RNA的活性，例如用來在基礎研究中研究調(diào)節(jié)網(wǎng)絡。本發(fā)明的寡核苷酸也可以找到治療性應用，例如當特定微RNA上調(diào)并且導致對靶RNA的不期望的微RNA調(diào)節(jié)作用。另一種情況是當SNP(單核苷酸多態(tài)性)的存在產(chǎn)生微RNA靶并且因此引起不想要的微RNA調(diào)節(jié)作用時。在實施例部分進一步給出例子。表1.靶序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>鄰接互補性序列在另一個實施方案，本發(fā)明的寡核苷酸包含與以下序列互補的鄰接序列，所述序列選自由SEQIDNO1-56中任意者或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1_56中任意者的至少9個鄰接堿基、至少10個鄰接堿基、至少11個鄰接堿基、至少12個鄰接堿基、至少13個鄰接堿基、至少14個鄰接堿基、至少15個鄰接堿基、至少16個鄰接堿基、至少17個鄰接堿基、至少18個鄰接堿基、至少19個鄰接堿基、至少20個鄰接堿基、至少22個鄰接堿基、至少25個鄰接堿基、至少30個鄰接堿基和至少35個鄰接堿基所組成的組中。又在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包含與以下序列互補的鄰接序列，所述序列選自由SEQIDNO1-56中任意者或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1_56中任意者的不多于8個鄰接堿基、不多于9個鄰接堿基、不多于個10鄰接堿基、不多于11個鄰接堿基、不多于12個鄰接堿基、不多于13個鄰接堿基、不多于14個鄰接堿基、不多于15個鄰接堿基、不多于16個鄰接堿基、不多于17個鄰接堿基、不多于18個鄰接堿基、不多于19個鄰接堿基、不多于20個鄰接堿基、不多于22個鄰接堿基、不多于25個鄰接堿基、不多于30個鄰接堿基和不多于25個鄰接堿基所組成的組中。在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包含與以下序列互補的鄰接序列，所述序列選自由SEQIDNO1-56中任意者或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1_56中任意者的8個鄰接堿基、9個鄰接堿基、10個鄰接堿基、11個鄰接堿基、12個鄰接堿基、13個鄰接堿基、14個鄰接堿基、15個鄰接堿基、16個鄰接堿基、17個鄰接堿基、18個鄰接堿基、19個鄰接堿基、20個鄰接堿基、21個鄰接堿基、22個鄰接堿基、23個鄰接堿基、24個鄰接堿基、25個鄰接堿基、30個鄰接堿基和35個鄰接堿基所組成的組中。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的寡核苷酸包含鄰接序列，其選自由與SEQIDNO:1_56中任意者或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1_56中任意者互補的8_25個堿基、10-22個堿基和12-20個堿基所組成的組中。因而，鄰接堿基對可以在本發(fā)明的寡核苷酸與SEQIDNO:1_56中任意者或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1_56中任意者之間形成。優(yōu)選地，鄰接堿基配對包括SEQIDNO:1_56中任意者或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1-56中任意者的第22-27位置。即，優(yōu)選地，本發(fā)明的寡核苷酸包含與SEQIDN0:l-56或包含1、2或3個取代的SEQIDNO:1_56中任意者的第22-27位置互補的鄰接序列。包括第22-27位置的鄰接堿基配對是重要的，因為該區(qū)域?qū)谖NA的種子區(qū)域。在一個實施方案中，堿基配對終于第27位置。在其他實施方案中，堿基配對分別終于第28、29、30、31、32和33位置。在一個實施方案中，堿基配對始于第22位置。在其他實施方案中，堿基配對分別始于第21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6和5位置。仍在另一個實施方案中，堿基配對包括第8-28、8-27、9-27、10-27、11-27、12-27、13-27、14-27、15-27、16-27、17-27、18-27、19-27、20-27、21-27、9_28、10-28、11-28、12-28、13-28、14-28、15-28、16-28、17-28、18-28、19-28、20-28和21-28位置。寡核苷酸的長度還如實施例部分中概述，可以在長度方面調(diào)整寡核苷酸以滿足各種標準。為了與其靶RNA強烈結(jié)合，可以增加長度。在一些情況下，使用較短的寡核苷酸，可以改善向細胞中送遞。另外，在其他情況下，可以調(diào)整寡核苷酸相對于靶RNA的反種子序列的位置，即可以調(diào)整與表1靶RNA(SEQIDNO1-56)的第22-27位置互補的堿基的位置，從而它們位于例如寡核苷酸的5'末端、位于3'末端或位于所述寡核苷酸的中部。優(yōu)選地，與第22-27位置互補的堿基的位置位于寡核苷酸中，從而所述堿基始于第1位置、第2位置、第3位置、第4位置、第5位置或第6位置或在第2位置、第3位置、第4位置、第5位置或第6位置上游的位置處或在第2位置、第3位置、第4位置、第5位置或第6位置下游的位置處，其中所述位置從寡核苷酸的5'末端計數(shù)。優(yōu)選地，本發(fā)明寡核苷酸的長度在8個和25個堿基之間。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明寡核苷酸的長度在10個和20個堿基之間。取代在一個實施方案中，SEQIDNO:1_56中任意者可以包含1或2個取代。還在一個實施方案中，SEQIDNO:1_56中任意者可以僅包含1個取代。在一個實施方案中，SEQIDNO:1_56中任意者可以不包含任何取代。又在另一個實施方案中，SEQIDNO1_56中任意者的取代位于本發(fā)明寡核苷酸與SEQIDNO:1-56中任意者之間的互補性區(qū)域內(nèi)。取代可以出于多種原因而存在于SEQIDNO1_56中任意者中。它們可以例如是可增強或降低對給定靶RNA的微RNA調(diào)節(jié)作用的SNP。SNP甚至可以創(chuàng)造新的微RNA靶位點，從而引起對給定靶RNA的異常微RNA調(diào)節(jié)作用。RNA編輯也可以產(chǎn)生取代。仍在另一個實施方案中，僅1個取代可以存在于SEQIDNOs:1_56中任意者的第22-27位置內(nèi)。在這個實施方案中，其他取代可以存在于靶序列中的其他地方。因而，可以例如在第22-27位置內(nèi)存在一個取代并且在靶RNA(SEQIDNOs:1_56中任意者)中的其他地方存在一個或兩個更多的取代。本發(fā)明寡核苷酸的活性RNA酶H激活在本發(fā)明的一個實施方案中，寡核苷酸能夠激活RNA酶H。RNA酶H將切割RNA-DNA雙鏈體的RNA部分并且技術(shù)人員熟知RNA酶H激活的結(jié)構(gòu)要求。這種機制極經(jīng)常地用來實現(xiàn)常規(guī)反義調(diào)節(jié)，例如通過使用所謂缺口聚體(gapmer)。缺口聚體是包含帶脫氧糖(缺口)和修飾側(cè)翼的中央?yún)^(qū)域的反義寡核苷酸。缺口聚體極經(jīng)常地包含改善生物穩(wěn)定性的硫代磷酸酯核苷酸間鍵并且側(cè)翼包含例如也改善生物穩(wěn)定性(即抵抗溶核攻擊)的2-0-修飾。所述也可以包含提高與互補性核酸發(fā)生堿基配對的缺口聚體的解鏈溫度的修飾。對所述側(cè)翼的一些2-0-修飾(例如2-0-甲基和LNA)能夠改善生物穩(wěn)定性和提高與互補性核酸發(fā)生堿基配對的缺口聚體的解鏈溫度。因而，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸包含至少5個單元脫氧核苷酸的鄰接序列以能夠激活RNA酶H并且因而能夠切割靶RNA。甚至應當存在6、7或8個鄰接脫氧核苷酸。在另一個實施方案，本發(fā)明的寡核苷酸不能夠激活RNA酶H。在這個實施方案中，該寡核苷酸不包含超過下述長度的未修飾DNA的鄰接序列，其中所述長度選自由3個堿基、4個堿基、5堿基、6個堿基、7個堿基、8個堿基、9個堿基、10個堿基和11個堿基組成的組。最優(yōu)選地，該段未修飾的DNA不超過3個堿基。技術(shù)人員將容易地能夠檢驗給定寡核苷酸是否確實激活RNA酶H。RNAi激活RNAi機器是由RNA引導的復雜基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)。因而，微RNA將RNAi機器引導至靶mRNA(或其他靶RNA如病毒靶RNA)以影響靶mRNA的活性。RNAi機器可以直接影響mRNA的翻譯或它可以影響靶mRNA的穩(wěn)定性，即介導靶mRNA的直接降解。意圖不受理論束縛，認為微RNA與靶mRNA之間互補性的程度是靶mRNA是否受到翻譯性調(diào)節(jié)或降解的關鍵要素。內(nèi)源性微RNA從前體莖-環(huán)加工而來并且并入所謂RNA誘導沉默復合體(RISC復合體)。仍然很少了解該過程的細節(jié)。通過引導稱作SiRNA的合成性雙鏈RNA復合體至細胞中，細胞RNAi機器已經(jīng)排他性地用來影響細胞mRNA的活性。如上文提及，siRNA是包含載客鏈和互補性引導鏈的雙鏈短RNA復合體。siRNA的引導鏈并入RISC復合體，而此后，RISC復合體可以影響攜帶與引導鏈互補的序列的mRNA的活性。因而，siRNA是被認為能夠高效且特異地靶向任何mRNA的一個新類型化合物，并且因而將siRNA潛在地視為一個新類型治療劑。siRNA和微RNA的共同特征是它們募集細胞RNAi機器以影響靶RNA的活性。在一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸能夠募集RNAi機器并且將該RNAi機器引導至靶RNA。這可以導致切割靶RNA或翻譯性阻抑該靶RNA。在這個實施方案中，該寡核苷酸可以是siRNA。即，該寡核苷酸與互補性寡核苷酸雜交，一般在20-22個堿基長度范圍內(nèi)，并且極經(jīng)常地帶有1-3個堿基的3'突出端。該寡核苷酸也可以作為微RNA起作用，無需與天然存在的微RNA相同。即便天然存在的微RNA一般調(diào)節(jié)眾多靶RNA，然而可以將作為微RNA起作用的本發(fā)明寡核苷酸設計成僅調(diào)節(jié)少數(shù)靶RNA或僅調(diào)節(jié)一種靶RNA。作為微RNA起作用的本發(fā)明的基因特異性寡核苷酸例如可以能夠與SEQIDNOs1-56中任意者的第22-28位置和例如還與第7_16位置或第7_18位置發(fā)生堿基配對。設計用于RNA酶H激活或RNAi激活的本發(fā)明寡核苷酸將比設計用于RNA酶H激活或RNAi激活的常見寡核苷更有力，因為它們靶向已經(jīng)借助反義機制而對相互作用進行演化并且因而比普通位點更易接近的微RNA靶位點。阻斷miR在另一個實施方案，本發(fā)明的寡核苷酸不能募集RNAi機器。在這個實施方案中，優(yōu)選本發(fā)明的寡核苷酸能夠阻斷RNAi機器對特定靶RNA的活性。所述寡核苷酸可以通過如此方式做到這一點，即隔絕靶RNA的靶序列(微RNA結(jié)合位點)，從而RNAi機器將不識別該靶序列，因為該靶序列與本發(fā)明的寡核苷酸發(fā)生堿基配對。具備這種活性的本發(fā)明寡核苷酸也可以稱作阻斷miR，因為它們阻斷給定微RNA對特定靶RNA的調(diào)節(jié)活性。因而，在優(yōu)選的實施方案中，該寡核苷酸能夠阻斷微RNA對特定靶RNA的調(diào)節(jié)活性。優(yōu)選地，此微RNA是內(nèi)源性微RNA。如該微RNA是靶RNA的正調(diào)節(jié)物，則所述寡核苷酸將是該靶RNA的負調(diào)節(jié)物。更經(jīng)常地，該微RNA是靶RNA的負調(diào)節(jié)物。因而，在另一個實施方案，所述寡核苷酸是靶RNA的正調(diào)節(jié)物并且因而增強該靶RNA的活性。這與一般作為負調(diào)節(jié)物通過介導靶RNA的翻譯性阻抑和/或降解而發(fā)揮作用的常規(guī)反義寡核苷酸、微RNA和siRNA相反。脫靶效應在大多數(shù)實施方案中，阻斷miR的脫靶結(jié)合作用將產(chǎn)生極小作用或無作用。這與反miR、由siRNA和微RNA介導的RNAi和RNA酶H介導的反義調(diào)節(jié)作用相反，它們均可以可以產(chǎn)生脫靶效應。阻斷miR僅在與其預期靶標即微RNA靶區(qū)域結(jié)合時才產(chǎn)生作用，并且因而阻止對靶RNA的微RNA調(diào)節(jié)作用。因而，在優(yōu)選的實施方案中與使用反miR調(diào)節(jié)靶mRNA活性相比，所述阻斷mir具有減低的脫靶效應。如本上下文中使用，反mir是可以與微RNA進行堿基對并因而抑制微RNA活性的寡核苷酸。由于大多數(shù)微RNA是不加區(qū)分的，即它們調(diào)節(jié)多于一種靶標，因而對特定RNA的調(diào)節(jié)會影響多于一種靶mRNA的活性。因而，當需要僅調(diào)節(jié)一種特定靶mRNA的活性時，對其他靶mRNA的調(diào)節(jié)可以稱作這種反mir的脫靶效應。此類作用也可能稱作反mir的非預期作用或副作用。使用微RNA代替反mir來影響或調(diào)節(jié)靶mRNA的活性也將明顯地產(chǎn)生脫靶效應?？傊?，本發(fā)明的阻斷mir的特征在于它們通過阻止對靶RNA的微RNA調(diào)節(jié)作用而影響靶RNA活性。因而，與使用微RNA與siRNA的常規(guī)反義寡核苷酸、反mir和RNAi介導的調(diào)節(jié)作用相比，本發(fā)明的阻斷mir將具有減低的脫靶效應。架構(gòu)和化學性質(zhì)本發(fā)明寡核苷酸的活性可以受架構(gòu)和化學性質(zhì)影響。因而，可以將不同修飾安置在不同位置處，以阻止寡核苷酸激活RNA酶H和/或阻止其能夠募集RNAi機器。在另一個實施方案，可以如此安置這些修飾從而允許RNA酶H激活和/或募集RNAi機器。如本文中所指，將任何非天然核苷酸稱作所述寡核苷酸的修飾。所述修飾可以是非天然堿基，例如通用堿基?？梢詫χ麈溙腔蜢⑺狨バ揎?，例如2'-0-修飾包括LNA或硫代磷酸酯鍵。如本領域中所用，不管修飾在摻入寡核苷酸之前的核苷酸上存在，還是寡核苷酸在合成后受到修飾，均無差異。優(yōu)選的修飾是提高寡核苷酸對互補性序列的親和力，即提高與互補性序列發(fā)生堿基配對的寡核苷酸的Tm(解鏈溫度)的那些修飾。此類修飾包括2'-0-氟、2'-0-甲基、2'-0-甲氧乙基。還優(yōu)選使用LNA(鎖核酸)單元、PNA(肽核酸)單元或INA(嵌入核酸)單元。對于較短的寡核苷酸，優(yōu)選醇在較高百分數(shù)的提高親和力的修飾。若寡核苷酸的長度小于12或10個單元，該寡核苷酸可以完全由LNA單元組成。還優(yōu)選提高寡核苷酸的生物穩(wěn)定性的修飾，所述修飾也包括2'-0-氟、2'-0-甲基、2'-0-甲氧乙基。還優(yōu)選使用LNA(鎖核酸)單元、PNA(肽核酸)單元或INA(嵌入核酸)單元。類型廣泛的非天然單元也可以構(gòu)筑到所述寡核苷酸中。例如嗎啉代、2'-脫氧-2‘-氟-阿糖核酸(FANA)和阿糖核酸(ANA)。在優(yōu)選的實施方案中，在堿基或糖處受修飾的單元相對在堿基或糖處未受修飾的單元的比例選自由小于99%、95%、小于90%、小于85%或小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于50%、小于45%、小于40%、小于35%、小于30%、小于25%、小于20%、小于15%、小于10%和小于5%、小于1%、大于99%、大于95%、大于90%、大于85%或大于75%、大于70%、大于65%、大于60%、大于50%、大于45%、大于40%、大于35%、大于30%、大于25%、大于20%、大于15%、大于10%和大于5%和大于組成的組。脂質(zhì)和/或肽也可以綴合至所述寡核苷酸。這種綴合可以改善生物利用率和阻止寡核苷酸激活RNA酶H和/或阻止其募集RNAi機器。優(yōu)選地在寡核苷酸的中央部分，例如在大多數(shù)中央單元的任意單元處進行較大體積部分的綴合。或者，在與SEQIDNOs1-56中任意者的第22-27位置之一互補的堿基之一處進行綴合。又在另一個實施方案中，所述部分可以綴合在寡核苷酸的5'末端或3'末端。優(yōu)選的疏水部分是可以與寡核苷酸綴合并阻止該寡核苷酸募集RNAi機器并且改善寡核苷的酸生物利用率的膽固醇部分?？梢栽谂cSEQIDNOs1-56中任意者的第22-27位置之一互補的堿基之一處、在該寡核苷酸的3'末端或5'末端處綴合膽固醇部分。另外，在優(yōu)選的實施方案中，硫代磷酸酯核苷酸間鍵可以連接所述單元以改善該寡核苷酸的生物穩(wěn)定性。該寡核苷酸的全部鍵可以是硫代磷酸酯鍵。在另一個實施方案中，硫代磷酸酯鍵的比例選自由小于95%、小于90%、小于85%或小于75%、小于70%、小于65%、小于60%、小于50%、大于95%、大于90%、大于85%或大于75%、大于70%、大于65%、大于60%和大于50%組成的組。又在另一個實施方案中，該寡核苷酸可以包含DNA單元和RNA單元的混合物，從而阻止寡核苷酸激活RNA酶H并且與此同時阻止該寡核苷酸募集RNAi機器。例如，DNA單元可以后接RNA單元，此RNA單元再次后續(xù)DNA單元，如此重復等。DNA單元和RNA單元可以形成嵌段。所述嵌段可以具有2個單元、3個單元、4單元、5個單元或6單元長度并且可以在相同的寡核苷酸中包含不同長度的單元。在另一個優(yōu)選的實施方案，該寡核苷酸包含帶有2'-0-甲基的LNA單元與RNA單元的混合物。此類LNA/2'0-甲基混合聚體已經(jīng)用作人免疫缺損病毒1型Tat依賴性反式激活和HIV-I感染性的空間位阻嵌段抑制劑(stericblockinhibitor)。Lna-dna在一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸不包含任何RNA單元?？梢岳蒙贁?shù)或缺少RNA單元來阻止寡核苷酸能夠募集RNAi機器。如上文概述，化學修飾/非天然單元可以產(chǎn)生相同作用。一個這樣的例子是包含LNA單元和DNA單元的寡核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，該寡核苷酸只包含LNA單元和DNA并且這些單元可以如上所述由硫代磷酸酯鍵連接。在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸不包含任何DNA單元。仍在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸不包含任何嗎啉代單元和/或LNA單兀。在優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸包含提高互補性序列親和力的眾多核苷酸單元，所述眾多核苷酸單元選自下組至少1個單元、至少2個單元、至少3個單元、至少4個單元、至少5個單元、至少6個單元、至少7個單元、至少8個單元、至少9個單元、至少10個單元、至少11個單元、至少12個單元、至少13個單元、至少14個單元、至少15個單元、至少16個單元、至少17個單元、至少18個單元、至少19個單元、至少20個單元、至少21個單元和至少22個單元。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸包含提高互補性序列親和力的眾多核苷酸單元，所述眾多核苷酸單元選自下組不多于1個單元、不多于2個單元、不多于3個單元、不多于4個單元、不多于5個單元、不多于6個單元、不多于7個單元、不多于8個單元、不多于9個單元、不多于10個單元、不多于11個單元、不多于12個單元、不多于13個單元、不多于14個單元、不多于15個單元、不多于16個單元、不多于17個單元、不多于18個單元、不多于19個單元、不多于10個單元、不多于21個單元和不多于22個單元。仍在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸包含提高互補性序列親和力的眾多核苷酸單元，所述眾多核苷酸單元選自下組1個單元、2個單元、3個單元、4個單元、5個單元、6個單元、7個單元、8個單元、9個單元、10個單元、11個單元、12個單元、13個單元、14個單元、15個單元、16個單元、17個單元、18個單元、19個單元、20個單元、21個單元和22個單元。在優(yōu)選的實施方案中，提高互補性序列親和力的核苷酸單元位于該寡核苷酸的側(cè)翼。例如，若該寡核苷酸例如包含10個LNA單元，5個LNA單元可位于5'末端，并且另外5個單元可以位于3'末端。在另一個實施方案中，提高互補性序列親和力的核苷酸單元位于該寡核苷酸的中央部分。因而，若該寡核苷酸長度的是18個單元，其中8個是LNA單元，則5個天然單元可以后續(xù)8個LNA單元，而這8個LNA單元再次后接5個天然單元。提高互補性序列親和力的核苷酸單元也可以均勻地分布在該寡核苷酸的整個長度范圍內(nèi)。例如，每隔2、3、4、5、6個位置或其任意組合。單鏈對雙鏈本發(fā)明的寡核苷酸優(yōu)選地不與互補性寡核苷酸發(fā)生堿基配對或不意圖隨與互補性寡核苷酸配對的堿基一起使用。即，它應當是單鏈的，旨在促進與靶RNA相互作用并且在某些實施方案中，還旨在阻止RNAi機器的募集。在另一個實施方案，該寡核苷酸與互補性寡核苷酸發(fā)生堿基配對。這可以例如是這種情況，此時該寡核苷酸作為SiRNA或微RNA起作用和/或它也可以用來改善寡核苷酸的送遞。因而，在一個實施方案中，寡核苷酸進入其起靶細胞時，該寡核苷酸與被RNA酶H降解的RNA分子發(fā)生堿基配對。以這種方式，將寡核苷酸釋放到位。特異性序列仍在本發(fā)明的另一個實施方案中，靶序列位于如實施例3中概述的丙型肝炎病毒5‘非編碼區(qū)內(nèi)。該靴序列如實施例3中所示(5‘GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCAC)。在這個實施方案中，寡核苷酸能夠能夠在一段寡核苷酸范圍內(nèi)與該靶序列發(fā)生堿基配對，所述的一段寡核苷酸選自由25個堿基、24個堿基、23個堿基、22個堿基、21個堿基、20個堿基、19個堿基、18個堿基、17個堿基、16個堿基、15個堿基、14個堿基、13個堿基、12個堿基、11個堿基、10個堿基、8個堿基、7個堿基和6個堿基組成的組。優(yōu)選地，Xmir(阻斷mir)至少覆蓋靶序列的反種子序列并且因而將能夠阻止mir-122與該反種子序列相互作用。該反種子序列與mir-122的種子序列互補，即與mir-122的至少第2_8位置互補。這種寡核苷酸將用于治療丙型肝炎病毒感染還用于研究mir-122促進的HCV復制。重要地，該寡核苷酸將不影響其他mir-122靶的表達，而若使用mir-122拮抗mir，則影響其他mir-122靶的表達。本發(fā)明的第二方面是調(diào)節(jié)靶RNA活性的方法，包括步驟a.提供包含靶RNA的系統(tǒng)；b.引導靶向靶RNA的本發(fā)明寡核苷酸至該系統(tǒng)；c.因而調(diào)節(jié)靶RNA的活性。優(yōu)選地，該寡核苷酸阻止微RNA對靶RNA的活性并且因而調(diào)節(jié)該靶RNA的活性。在另一個實施方案，該寡核苷酸誘導RNA酶H切割靶RNA并且因而調(diào)節(jié)該靶RNA的活性。又在另一個實施方案，該寡核苷酸誘導RNAi降解靶RNA并且因而調(diào)節(jié)該靶RNA的活性。在本發(fā)明第二方面的優(yōu)選實施方案中，所述系統(tǒng)是細胞提取物或細胞。在本發(fā)明第二方面的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法在體內(nèi)、離體或體外進行。藥物組合物和治療本發(fā)明的第三方面是包含本發(fā)明寡核苷酸的藥物組合物。如技術(shù)人員會從上文描述中理解，所述寡核苷酸可以按照與siRNA、微RNA和反義寡核苷酸相同的方式用于治療，因為可以使用它們來特異性地影響特定基因的表達。在實施例部分中描述具體疾病領域和病況。本發(fā)明的第四方面是治療方法，其包括將本發(fā)明的寡核苷酸或本發(fā)明的藥物組合物給藥至有需要的人。本發(fā)明的第五方面是本發(fā)明的寡核苷酸用作藥物。本發(fā)明的第六方面是本發(fā)明的寡核苷酸在制備用于治療癌癥、病毒感染、免疫疾病或心血管病的藥物的用途。本發(fā)明的第七方面是本發(fā)明的寡核苷酸用于調(diào)節(jié)靶RNA活性的用途。實施例實施例1用于治療糖尿病的靶向Mtpn的Xmir(阻斷mir)已經(jīng)證明mir-375是胰島分泌胰島素的調(diào)節(jié)物并且肌營養(yǎng)素(My0tr0phin，Mtpn)是mir-375調(diào)節(jié)作用的靶(Poy麗，2004)。另外，已經(jīng)證明對Mtpn的siRNA抑制模擬了miR-375對葡萄糖刺激胰島素分泌和胞吐過程的作用。因而，作者得出結(jié)論miR-375是胰島素分泌的調(diào)節(jié)物并且因而可以構(gòu)成用于治療糖尿病的藥理學靶。這里，我們提供可以通過抑制mir-375在MtpnmRNA3'UTR上對Mtpn活性的調(diào)節(jié)作用來調(diào)節(jié)Mtpn表達的Xmirs。該靶mRNA的相關部分是5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAU反種子序列以粗體顯示?？梢岳缤ㄟ^搜索靶RNA的反種子序列鑒定該靶RNA的這個靶區(qū)域?；蛟摪袇^(qū)域可以使用互聯(lián)網(wǎng)上可用的合適數(shù)據(jù)庫例如http://pictar.bio.nyu.edu、www,tarqetscan.org、http://microrna.sanqer.ac.uk找到。顯然，此信息也可以從實驗或從科學出版物(例如Poy等人，2004)獲得。mir-375的序列是5'UUUGUUCGUUCGGCUCGC⑶GA種子序列與反種子序列的配對產(chǎn)生例如以下相互作用。5'...A⑶UUUGUGUUGC—AAGAACAAAU...IIlmm3'AGUGCGC-UCGGCUUGCUUGUUU可見總體互補性是稀少的。Xmir能夠通過抑制mir-375調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)Mtpn表達的Xmir將必須能夠阻隔靶區(qū)域的反種子序列，即隱藏堿基配對中的反種子序列。因而，這里例舉Mtpn的Xmirs(下半部分鏈為3'方向)，其與靶序列(上半部分鏈為5'-3'方向)發(fā)生堿基配對5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιIGUUCAAAACACAACGUUCUUGUUUACCUUAUUUG5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUUCAAAACACAACGUUCUUGUUUACCUU5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGUUCAAAACACAACGUUCUUGUUU5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIICAAAACACAAC⑶UCUU⑶UUGCC5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIICACAACGUUCUUGUUUACC5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUιιιιιιιιιιιιιιιICAACGUUCUUGUUUACC5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUιιιιιιιιιιιιICGUUCUUGUUUACC5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUιιιιιιιιιιιIGUUCUUGUUUACC5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUIIIIIIIIIIGUUCUUGUUUAC5‘GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUGAAUIIIIIIIIIIGUUCUUGUUUA5'GU⑶UUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAUGGAAUAAACUUGAAUMIIIIICUUGUUUA就以下實施例而言，該結(jié)構(gòu)可以用于設計其他阻斷mir3'A⑶GCGCUCGGCUUGCUUGUUUIIIIII5'GUUUUAAGUUUU⑶⑶UGCAAGAACAAAUGGAAUAAACUUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'CAAAATTCAAAACACAACGTTCTTGTTTACCTTATTTGAA上半部分鏈是微RNA，中間部分鏈是靶RNA并且下半部分鏈是可以在兩端被截短的阻斷mir?？梢允褂帽绢I域已知的方法合成上文設計的Xmirs。如本說明書中所述，可以將它們作為DNA、RNA、LNA、INA合成或用混合單體合成。顯然，U單體可以與T單體交換，同時仍產(chǎn)生堿基配對。G-C堿基對也可以用G-U搖擺堿基對取代。用于合成上文所設計靶向MtpnmRNA的Xmirs的多種實施方案的方法是寡核苷酸合成領域中技術(shù)人員熟知的。特別優(yōu)選的實施方案在發(fā)明詳述中闡述。Xmirs與例如膽固醇的綴合也在技術(shù)人員的常識范圍內(nèi)。實施例2靶向TGF-β和SMAD3的用于治療單純皰疹病毒感染感染的Xmir最近證實單純皰疹病毒-1編碼能夠使病毒建立潛伏感染的微RNA(GuptaA，2006)。發(fā)現(xiàn)命名為mir-LAT的這種微RNA調(diào)節(jié)TGF-β和SMAD3，并因而影響細胞發(fā)生凋亡(感染細胞借以自我毀滅以阻止病毒子代產(chǎn)生的一種常見過程)的能力。因而，能夠阻斷mir-LAT對TGF-β和SMAD3表達的調(diào)節(jié)活性是有意義。TGF-βmRNA的靶區(qū)域序列是5'AGGTCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCGGCCCCACCmir-LAT的序列是5'UGGCGGCCCGGCCCGGGGCC因而，可以形成以下復合體5'CGCCCCGGCAGGCCCGGCC-CCAllllllliiiiiiiIl3‘CCGGGGCC-—CGGCCCGGCGGU可以如先前實施例中所做那樣設計一系列Xmirs。下半部分鏈是以3'-5'方向顯示的Xmir并且上半部分鏈是TGF-βmRNA的靶區(qū)域5‘AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCGGCCCCACCιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιIUCCAGGGCGGGGCGGGGCGGGGCGGGGCCGUCCGGGCCGGGGUGG5‘AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCGGCCCCACCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGGGGCGGGGCGGGGCGGGGCCGUCCGGGCCGGGGUGG5'AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCGGCCCCACCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGGCGGGGCGGGGCCGUCCGGGCCGGGGUGG5'AGGUCCCGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCGGCCCCACC111111111111111111111111GGCGGGGCCGUCCGGGCCGGGGUGG就以下實施例而言，該結(jié)構(gòu)可以用于設計其他阻斷mirCCGGGGCCCGGCCCGGCGGUMMΜ5‘CCGCCCCGCCCCGGCAGGCCCGGCC-CCACCCCGCCCCGCC111111111111111111111111111111111111111GGCGGGGCGGGGCCGTCCGGGCCGG-GGTGGGGCGGGGCGG上半部分鏈是微RNA，中間部分鏈是靶序列，并且下半部分鏈是可以在兩端被截短的示例性阻斷miR。此類序列的多種實施方案的合成完全處于技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。特別優(yōu)選的實施方案在發(fā)明詳述中闡述。實施例3用于治療丙型肝炎病毒感染的靶向HCV的Xmir背景已經(jīng)證實mir-122通過促進病毒RNA復制調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒RNA豐度(JoplingCL，2005)。HCV基因組在3'非編碼區(qū)和5'非編碼區(qū)包含能夠與mir-122的種子序列發(fā)生堿基配對的保守反種子序列。另外，證實當mir-122由所謂拮抗mir滅活時，HCV病毒復制子RNA的水平降低達大約80%。通過對預測性微RNA結(jié)合位點的突變分析和異位表達含有代償性突變的mir-122分子，揭示了mir-122和病毒基因組5'非編碼區(qū)之間的基因相互作用。所述作者建議靶向mir-122的拮抗mir可以用于抗病毒治療。靶向HCV的阻斷mir5'非編碼區(qū)中靶區(qū)域(反種子序列為粗體)的序列是5‘GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCAC種子序列加下劃線顯示的mir-122的序列如下3'U⑶UU⑶GGUAACA⑶⑶GAGGU種子和反種子之間的堿基配對如下5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCACIIIIIII3'U⑶UU⑶GGUAACA⑶⑶GAGGU因而，這里例舉HCV的Xmir(與HCV靶區(qū)域發(fā)生堿基配對)5‘GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCACIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIICGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTGGTATCTGGTG5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCAC1111111111111111111111111111111111CGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTGGTATC5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCAC11111111111111111111111111111111CGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTGGTA5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCAC11111111111111111111111111111CGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTG5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCACιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιCGGTCGGGGGACTACCCCCGCTGTGAGG5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCACιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιIGGGGACTACCCCCGCTGTGAGGTGGTATCTGGTG5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCACIIIIIIIIIIIIIIIIIIIITACCCCCGCTGTGAGGTGGTA5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCACιιιιιιιιιιιιιιιιιICTACCCCCGCTGTGAGGTG5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCAC1111111111111111111GGACTACCCCCGCTGTGAGG5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCAιιιιιιιιιιιιICCCCCGCTGTGAGG5'GCCAGCCCCCUGAUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCACIIIIIIIIGCTGTGAGG該Xmir可以是DNA或RNA，S卩T可以取代為U。其他實施方案在發(fā)明詳述中闡述。實施例4用于治療銀屑病的阻斷mir已經(jīng)證實銀屑病以特殊不同于健康皮膚或另一種慢性炎性疾病異位性濕疹的特殊miRNA表達譜為特征。在銀屑病中過量表達的miRNA當中，鑒定到一種角質(zhì)細胞特異性miRNA(miR-203)和一種白細胞來源的miRNA(miR-146a)。銀屑病病灶中miR-203的上調(diào)與miR-203的進化保守靶即細胞因子信號作用阻遏物3(S0CS-3)的下調(diào)同時發(fā)生，其中S0CS-3參與炎癥反應和角質(zhì)細胞功能(SonkolyE，2007年7月11日)。另一項研究證實銀屑病特異性miRNA之一miR-146a抑制IRAK-I(白介素_1受體相關激酶1)和TRAF-6(TNF受體相關因子6)蛋白的表達，其中前述兩種蛋白質(zhì)均是TNF-α信號途徑的調(diào)節(jié)物(TaganovKD，2006)。因此，可以構(gòu)思miR_146a通過調(diào)節(jié)皮膚中WTNF-ci信號作用參與銀屑病的病理發(fā)生過程。用于治療銀屑病的阻斷mirS0CS-3S0CS-3mRNA的靶區(qū)域是5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAU此處顯示與mir-203(上半部分鏈)的互補性，同時顯示潛在的阻斷mir(下半部分鏈)GAUCACCAGGAUUUGUAAA⑶GIIIIIIIII5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIATAAATATAAGTCTTTTCTTTGTAAAGTCATTAAATATTA此處顯示與S0CS_3mRNA的靶區(qū)域發(fā)生堿基配對的示例性阻斷mir5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIATAAATATAAGTCTTTTCTTTGTAAAGTCATTAAATATTA5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIATAAATATAAGTCTTTTCTTTGTAAAGTCATTAA5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIATAAATATAAGTCTTTTCTTTGTAAAGTC5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAU111111111111111111111111111111111ATAAGTCTTTTCTTTGTAAAGTCATTAAATATTA5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIITTTTCTTTGTAAAGTCATTAA5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAU11111111111CTTTGTAAAGTC5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAUIIIIIIIIITTTGTAAAGT5‘UAUUUAUAUUCAGAAAAGAAACAUUUCAGUAAUUUAUAAUIIIIIIGTAAAGT該Blockmir可以是DNA或RNA，即T可以取代為U。其他實施方案在發(fā)明詳述中闡述。同樣，可以制備阻止smir-146與Iraki和Traf-6結(jié)合的阻斷mir。顯然，可以如發(fā)明詳述中所述截短和修飾所述阻斷mir。與mir-146和阻斷mir發(fā)生堿基配對的Traf-6UUGGGUACCUUAA⑶CAAGAGUIIIIIII5'CAUAAUCCUUGGAAAACUUAAGUUCUCAUUCACCCCA⑶UιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιIGTATTAGGAACCTTTTGAATTCAAGAGTAAGTGGGGTCAA與mir-46和阻斷miR發(fā)生堿基配對的Irak-IUUGGGUACCUUAA⑶CAAGAGUIIIIIII5‘CCCCCAAAUCCGGAA⑶CAAAGUUCUCAUG⑶CAGAA⑶UIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGGGGGTTTAGGCCTTCAGTTTCAAGAGTACCAGTCTTCAA阻斷miR的其他實施方案在發(fā)明詳述中闡述。實施例5用于治療癌癥的靶向p27Kipl的阻斷mir癌癥中p27Kipl(—種細胞周期的關鍵負調(diào)節(jié)物)的水平往往下降。在大部分癌癥中，p27KipImRNA的水平不變并且認為p27Kipl蛋白的蛋白水解作用增加是其下調(diào)的主要機制。最近證實膠質(zhì)母細胞瘤和前列腺癌中p27Kipl蛋白水平也受Mir-221和mir_222下調(diào)(leSageC,2007)(GalardiS，2007)(GilliesJK,2007)并且建議微RNA作為治療靶。這兩種微RNA的序列是Mir-2215'AGCUACAUUGUCUGCUGG⑶UUCMir-2225'AGCUACAUCUGGCUACUGG⑶CUC鑒定到mir-221和mir_222的兩個靶。應當指出所述微RNA具有相同的種子序列并且靶區(qū)域?qū)@兩種微RNA是相同的，即一種阻斷mir可以用來阻止這兩種微RNA的調(diào)節(jié)作用。如上文，靶序列是中間的序列，上半部分序列是微RNA，下半部分序列是阻斷mir?？梢匀绨l(fā)明詳述中所述截短和修飾所述阻斷mir。CUUUGGGUC⑶CU⑶UACAUCGAIIIIIII5‘UCUGCCUCUAAAAGC⑶UGGAUGUAGCAUUAUGCAAUUAGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIITTACTAGACGGAGATTTTCGCAACCTACATCGTAATACGTCUUUGGGUC⑶CU⑶UACAUCGAIIIIII5'GUAUAUAGUUUUUACCUUUUAUGUAGCACAUAAACUUUGG111111111111111111111111111111111111111GGACACATATATCAAAAATGGAAAATACATCGTGTATTTG在p27Kipl3'UTR中鑒定到其他推定性靶區(qū)域CUUUGGGUC⑶CU⑶UACAUCGAIIIIIII5‘AAA⑶UU⑶UAGAUAGCUGCAU⑶GGCUUUUUUAAAAAAGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIITTTCAAACAATCTATCGACGTACACCGAAAAAATTTTTTCCUUUGGGUC⑶CU⑶UACAUCGAIlinin5‘UCUAGACAAUAUACAAGCCAAA⑶GGCAU⑶UUUGUGCAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIAAATTAGATCTGTTATATGTTCGGTTTCACCGTACAAAAC實施例6用于治療癌癥的靶向TPMl的阻斷mir最近證實TPMl(腫瘤抑制原肌球蛋白1)被mir-21靶向(ZhuS，2007)。如名字提示，TPMl是腫瘤抑制蛋白并且建議使用mir-21作為治療靶。mir-21的序列是UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA與靶區(qū)域發(fā)生堿基配對時A⑶UGUA⑶CAGACUAUUCGAUIIIIIII5‘C⑶UUCA⑶⑶CAAAUAAACACUGUGUAAGCUAAAAAAAAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGCAAAGTCACAGTTTATTTGTGACACATTCGAT再次，微RNA是中間的序列，TPMl的靶區(qū)域是中間序列并且阻斷mir以下半部分序列顯示?？梢匀绨l(fā)明詳述中所述截短和修飾該阻斷mir。實施例7用于治療癌癥的靶向Lats2的阻斷mir已經(jīng)證實mir-372和mir-373靶向Lats2(巨大腫瘤抑制蛋白同源物2)(VoorhoevePM，2006)。所述miRNA中和p53_介導的CDK抑制作用，這可能通過直接抑制腫瘤抑制蛋白LATS2表達做到。提供了這樣的證據(jù)，即這些miRNA是潛在的新癌基因，所述新癌基因通過使P53途徑失效，因此在野生型p53存在下引起致瘤生長而參與精原細胞瘤發(fā)育。鑒定到兩個靶區(qū)域。靶1Mir-3735'...GUACAGUUUAGAAAGAGCACUUA...IIIIIIII3‘UGCGAGUUUACAGCG-UC⑶GAAAMir-3725'...GUACAGUUUAGAAAGAGCACUUA...ιιIIIIII3'UGCGAGUUUACAGCG-UC⑶GAAA注意，這兩種微RNA靶向相同的靶區(qū)域并共有相同的種子序列。因而，可以從以下比對結(jié)果中設計有用的阻斷mirUGCGAGUUUACAGCGUCGUGAAAIIIIII5‘AUUUAGUACAGUUUAGAAAGAGCACUUAUUUUGUUUAUAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIITAAATCATGTCAAATCTTTCTCGTGAATAAAACAAAUAUA革巴25'...UUGUAUUUUAUCCAU-AGCACUUA...IIIIIIII3‘UGCGAGUUUACAGCGUCGUGAAAUGCGAGUUUACAGCGUCGUGAAAIIIIIII5‘UACAUUUGUAUUUUAUCCAUAGCACUUAUUCACAUUUAGGιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιIATGTAAACATAAAATAGGTATCGTGAATAAGTGTAAAUCC注意，針對mir-372、mir-373、mir-93、mir302a+b40和mir-520的靴是重疊的。實施例8用于治療癌癥的靶向RBI和TGFBR2的阻斷miRMirl06a與RBI最近證實Mir_106a調(diào)節(jié)腫瘤抑制蛋白RBI(視網(wǎng)膜母細胞瘤1)和TGFBR2(轉(zhuǎn)化生長因子，β受體II)(VoorhoevePM,2006)Mir-106a作為以下示意復合體中的下半部分鏈顯示5'...CAGUAUAUCCCAA⑶一GCACUUUC...IIIIIIII3'CGAUGGACGUGACAUUC⑶GAAAA因而，可以從如上文示意的以下結(jié)構(gòu)中設計出阻斷miR。CGAUGGAC⑶GACAUUC⑶GAAAAIIIIII5‘UAACACAGUAUAUCCCAAGUGCACUUUCUAAUGUUUCUGGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIICTGGGATTGTGTCATATAGGGTTCACGTGAAAGATTACAA對于Mir-20和TGFBR2，也是如此GAUGGAC⑶GAUACUC⑶GAAACIIIIII5‘UACAAUAGCCAAUAACAUUUGCACUUUAUUAAUGCCUGUA實施例9用于治療癌癥的靶向PTEN的阻斷mir在幾份報道中，已經(jīng)報道Mi1-21調(diào)節(jié)PTEN(MengF,2007)PTEN是通過FAK去磷酸化阻抑幾種MMP表達的腫瘤抑制蛋白。因而，阻止mir-21調(diào)節(jié)PTEN是有意義的。列出了可以在mir-21和PTEN3'UTR之間形成的幾種潛在復合體1)mfe-23.4kcal/molρ-值未定義位置1816靶5'GUAUAGA3'CAGCAUUA⑶UUGAUGGCGUUGUAGUCAGACUAUCGmiRNA3'AUAU5'2)mfe-21.9kcal/molρ-值未定義位置423IE5'GGAUACAGUUA3'CAACAA⑶UUGGGCUAGUUGUUCAGACUCGAUmiRNA3'AAGUAU5'3)mfe:_21·6kcal/molρ-值未定義位置2596IE5'GGCUUAUC3'CAGCACAGUCUGAA⑶UAGUUGUGUCAGACUUCGAUmiRNA3'AAAU5'4)mfe:_20·8kcal/mol40ρ-值未定義位置1759IE5'CUGUCCUA3'UAGCG⑶CUGAA⑶UAGUUGUCAGACUUCGAUmiRNA3'AUAGAU5'5)mfe-18.5kcal/molρ-值未定義位置86革巴5'GUAUACCU3'GACAUUGGUCGAUA⑶UAUUGUAGUCAGCUAUCGAUmiRNA3'AGAU5'在表1中列出從中可以設計出阻斷mir的全長靶序列并且從描述中顯而易見具體實施方案。實施例10用于治療HIV感染的靶向HIV的阻斷mir背景最近證實微RNA在保持人免疫缺損病毒-I型(HIV-1)處于潛伏狀態(tài)中發(fā)揮重要作用(HuangJ，2007年10月；13(10)，電子出版2007年9月30日)。該病毒可以在靜息的CD4+T細胞中建立潛伏狀態(tài)，并且這種潛伏性是在抑制性高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)下的患者中根除此病毒的主要障礙。前述論文的作者發(fā)現(xiàn)HIV-I的3'UTR被一系列與活化的CD4+T細胞相比富集的細胞miRNA靶向，所述細胞miRNA包括miR-28、miR_125b、miR-150、miR-223和miR-382。此外，建議為治療目的，使用拮抗miR來激活潛伏HIV-I。激活潛伏HIV-I的阻斷mir用拮抗mir抑制多種微RNA可能具有多種副作用，原因是每種微RNA具有一組靶RNA。因此，我們建議使用阻斷miR以特異性地破壞HIV-13‘UTR與微RNA之間的相互作用，因而激活潛伏HIV-I并使該病毒對HAART易感。下文列出靶序列。微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列是中間鏈并且阻斷mir序列作為下半部分鏈顯示。阻斷mir的具體實施方案將從發(fā)明詳述中顯而易見。Mir-125b=HIV-I相互作用3'GUGUCCAAUUUCCCAGAGUCCCUIIIII5‘GGAUUGUGGAACUUCUGGGACGCAGGGG⑶GGGAAGCCCUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘CCTAACACCTTGAAGACCCTGCGTCCCCCACCCTTCGGGAMir-150=HIV-I相互作用3'GUGACCAUGUUCCCAACCCUCUlllllllIlll5‘GAACUUCUGGGACGCAGGGG⑶GGGAAGCCCUCAAAUAUUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘CTTGAAGACCCTGCGTCCCCCACCCTTCGGGAGTTTATAAMir-223=HIV-I相互作用3‘CCCCAUAAACU⑶UUGACUGUIIIII5‘AGGGCCAGGG⑶CAGAUAUCCACUGACCUUUGGAUGGUGCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘TCCCGGTCCCCAGTCTATAGGTGACTGGAAACCTACCACGMir-382=HIV-I相互作用3'GCUUAG⑶GGUGCUUGUUGAAGlllllllIlMM5'GACAUCGAGCUUGCUACAAGGGACUUUCCGCUGGGGACUUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'CTGTAGCTCGAACGATGTTCCCTGAAAGGCGACCCCTGAAMir-28=HIV-I相互作用5'GA⑶UAUCUGACACUCGAGGAAIIIIII3'AGACCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGCUAACUAGGGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII5'TCTGGTCTAGACTCGGACCCTCGAGAGACCGATTGATCCC用于激活HIV-I感染的阻斷mir可以單獨或聯(lián)合地使用。即可以同時使用靶向全部序列的阻斷mir?；蛘撸梢酝ㄟ^阻斷mir同時靶向靶向4、3或2個靶序列。優(yōu)選地，相同的阻斷mir用來阻止mir-125b和mir_150與它們的靶序列結(jié)合。這是可能的，因為它們的靶序列是重疊的。優(yōu)選地與HAART療法聯(lián)合使用阻斷mir。實施例11用于免疫刺激的阻斷miR已經(jīng)證實mir-150能夠調(diào)節(jié)c_myb的表達(XiaoC,2007年10月5日；131(1))。用拮抗miR抑制mir-150導致多種表型如Bl細胞擴群和增強的體液免疫應答。因而，多種抗體的血清水平明顯提高。作者提出mir-150對免疫刺激的影響主要或甚至完全通過調(diào)節(jié)c-myb而介導。我們建議使用來阻斷miR阻斷在B和T-細胞激活時阻止mir-150對c-myb的調(diào)節(jié)作用。因此，這種阻斷miR可以與疫苗聯(lián)合使用以增強該疫苗的效果或用于免疫系統(tǒng)減弱的人。Mir-150與c_mybTargetscan預測到C_myb3'UTR中的4個mir-150靶。已經(jīng)實驗地驗證了其中(作為a和b首先列出的)兩個。下文列出靶序列。微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列是中間鏈并且阻斷miR序列作為下半部分鏈顯示。阻斷mir的具體實施方案將從發(fā)明詳述中顯而易見。a)3'GUGACCAUGUUCCCAACCCUCUIIIIIII5‘CAAUACAUUUGAAAACUU⑶UUGGGAGACUCUGCAUUUUUιιιιιιιιιιι||||ιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιI3'GTTATGTAAACTTTTGAACAAACCCTCTGAGACGTAAAAAb)3'GUGACCAUGUUCCCAACCCUCUIIIIIII5‘GCAUGC⑶UGCACUUCUUUUUUGGGAGAU⑶⑶⑶UGUUGιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιI3‘CGTACGCAACGTGAAGAAAAAACCCTCTACACACAACAACc)3'GUGACCAUGUUCCCAACCCUCUIIIIII5'CAACAUGAAACUUUUCAUGAAUGGGAGAAGAACCUAUUUU1111111111111111111111111111111111111113'GTTGTACTTTGAAAAGTACTTACCCTCTTCTTGGATAAAAd)3'GUGACCAUGUUCCCAACCCUCUIIIIII5'UAGCCUGACU⑶UUUAUAAUUUGGGA⑶UCUGCAUUUGAUιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιI3'ATCGGACTGACAAAATATTAAACCCTCAAGACGTAAACTA用于免疫刺激的阻斷miR可以單獨或聯(lián)合地使用。最優(yōu)選是a)和b)。為實現(xiàn)最強烈的作用，這些阻斷miR可以聯(lián)合使用。實施例12用于預防轉(zhuǎn)移性乳腺癌的阻斷miR最近證明異位性miR-lOb表達可以驅(qū)動非轉(zhuǎn)移性乳房腫瘤中的腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移，因而充當強烈的促轉(zhuǎn)移介質(zhì)(pro-metastaticagent)。另外，證實編碼同源盒DlO(H0XD10)的mRNA是mir-lOb調(diào)節(jié)作用的靶，并且HOXDlO下調(diào)導致一種充分表征的促轉(zhuǎn)移基因RHOC上調(diào)(MaL，2007年10月11日；449(7163)，電子發(fā)表2007年9月26日)。因而，我們提出阻斷mir-10b對H0XD10的調(diào)節(jié)并因而阻止或減少乳房腫瘤轉(zhuǎn)移。Mir-IOb對H0XD10已經(jīng)實驗地驗證H0XD10中的一個靶。下文列出靶序列。微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列是中間鏈并且阻斷mir序列作為下半部分鏈顯示。阻斷miR的具體實施方案將從發(fā)明詳述中顯而易見。UGUUUAAGCCAAGAU⑶CCCAUIlllIIIIIM5‘AUUAUUUUUUCAUCGUAAUGCAGGGUAACUAUUAUUGCGCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘TAATAAAAAAGTAGCATTACGTCCCATTGATAATAACGCG實施例13用于治療CMV感染的阻斷mir細胞巨化病毒編碼促進感染的微RNA。因而，證實人cmv-miR-UL112靶向I類主要組織相容性復合體相關鏈B(MICB)。另外，鑒定到MICA中的推定靶(Stern-GinossarN，2007年7月20日；317(5836))。MICB是天然殺傷(NK)細胞的應激誘導性配體，激活受體NKG2D，并且對NK細胞殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞是關鍵。人cmv-miR-ULl12在病毒感染期間特異性地下調(diào)MICB表達，導致NKG2D的結(jié)合作用下降和NK細胞殺傷作用降低。我們建議使用阻斷miR來防止人cmv-mir-UL112調(diào)節(jié)MICB和/或MICA。下文列出靶序列。微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列是中間鏈并且阻斷miR序列作為下半部分鏈顯示。阻斷miR的具體實施方案將從發(fā)明詳述中顯而易見。Mir-ULl12與MICB3'UCGGACCUAGAOTGGCAiiUGAAιιιιιιιιιιιιιιιιιI5'ACUCCCUGCCUGGAUCUCACCAGCACUUUCCCUCU⑶UUCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII5'TGAGGGACGGACCTAGAGTGGTCGTGAAAGGGAGACAAAGMir-ULl12與MICA3'UCGGACCUAGAOTGGCAiiUGAA111111111111111115'AUUCCCUGCCUGGAUCUCACGAGCACUUUCCCUCUUG⑶GIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'TAAGGGACGGACCTAGAGTGCTCGTGAAAGGGAGAACCAC實施例14用于治療或預防結(jié)直腸癌的阻斷miR最近證實Mir-21是腫瘤抑制蛋白Pdcd4的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)物(AsanganiIA，2007年10月29日)。作者證實結(jié)直腸細胞系中mir-21和Pdcd4的反向相關關系并且使用螢光素酶報道分子測定法證實mir-21調(diào)節(jié)Pdcd4。因而，反miR-21的轉(zhuǎn)染增加含有Pdcd4的3'UTR的螢光素酶報道分子表達并且前mir-21的轉(zhuǎn)染減少其表達。此外，證實在培養(yǎng)的結(jié)腸癌細胞中mir-21上調(diào)腫瘤細胞入侵并且反-mir-21的轉(zhuǎn)染導致進入血管和遠側(cè)轉(zhuǎn)移降低。最終，還證實mir-21和Pdcd4在切除腫瘤的患者中反比例地表達。由于mir-21的眾多作用很可能通過對腫瘤抑制蛋白Pdcd4的調(diào)節(jié)作用介導，我們提出使用本發(fā)明的阻斷miR干擾mir-21對Pdcd4的調(diào)節(jié)作用，作為治療或預防癌癥的手段、更特別作為治療或預防進入血管和轉(zhuǎn)移的手段。微RNA作為上半部分鏈顯示，Pdcd4的靶序列是中間鏈并且阻斷miR序列作為下半部分鏈顯示。阻斷miR的具體實施方案將從發(fā)明詳述中顯而易見。3'A⑶UGUA⑶CAGACUAUUCGAUIIIiiiiiii5‘CUUCUUAAGUGGAAUAUUCUAAUAAGCUACCUUUUGUAAGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGAAGAATTCACCTTATAAGATTATTCGATGGAAAACATTC實施例15用于免疫調(diào)節(jié)的靶向TNF-α的阻斷miR微RNA369-3對TNF最近報道證實微RNA369-3是TNF-α(腫瘤壞死因子-α)表達的調(diào)節(jié)物(VasudevanS，2007年11月29日[電子版先于印刷版])。有趣地，證實調(diào)節(jié)作用是正向的。因而，微RNA增加血清饑餓誘導的細胞周期停滯細胞中TNF-α的翻譯。腫瘤壞死因子α通常在受刺激的淋巴細胞中表達，并且對于炎癥反應和惡變是關鍵的。因而，目前在市場上銷售用于治療免疫相關疾病如類風濕性關節(jié)炎和Crohn病的多種TNF-α拮抗劑，并且正在開發(fā)第二代TNF-α拮抗劑。當循環(huán)性單核細胞在出血管至發(fā)炎組織的過程期間或在促血管生成性腫瘤浸潤中變得黏附時，細胞生長停滯，伴以細胞因子表達(包括TNF-α表達)快速變化，其中所述TNF-α進一步上調(diào)對于成熟為巨噬細胞所必需的其他細胞因子。這種應答可以在細胞培養(yǎng)中通過血清饑餓重現(xiàn)。由于微RNA369-3是TNF-表達的正調(diào)節(jié)物，故微RNA369_3抑制物可以用做tnf-拮抗劑。一種微RNA369-3抑制物可能是針對該微RNA的反義寡核苷酸，即反mir或拮抗mir。我們提出使用阻斷mir來防止微RNA369-3刺激TNF-α表達，例如當循環(huán)性單核細胞黏附至發(fā)炎組織時。這種方法具有潛在優(yōu)勢，在于它偏好性地靶向激活的單核細胞。TNF-α3'UTR具有互補于mir-369_3的兩個反種子序列并且它們對微RNA調(diào)節(jié)作用的重要性通過Vasudevan等人的突變分析驗證。這兩個反種子序列在以粗體字母在以下序列中顯示5‘AUGUUUGCACUU⑶GAUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUAUUU下文顯示與微RNA比對的靶序列。微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列是中間鏈并且阻斷HliR序列作為下半部分鏈顯示。阻斷HliR的具體實施方案將從發(fā)明詳述中顯而易見。3'UUUCUAGUUGGUACAUAAUAAlllllllmm5‘AUGUUUGCACUU⑶GAUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUAUUUιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιι3‘TACAAACGTGAACACTAATAAATAATAAATAAATAATAAA3'UUUCUAGUUGGUACAUAAUAAιιιιιιιιιιιιιιI5‘U⑶GAUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUAUUUAUUUAUUUACAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘ACACTAATAAATAATAAATAAATAATAAATAAATAAATGT重要地，相同的阻斷miR可以用來封閉這兩個靶位點。Mir-155對TNF另一個最新公開發(fā)現(xiàn)LPS對巨噬細胞的刺激導致mir-155上調(diào)和mir_125b下調(diào)，并且證實TNF受mir-155和mir-125b調(diào)節(jié)(TiliE，2007年10月15日；179(8))。有趣地，mir-155調(diào)節(jié)作用是正向的。因而，阻斷miR對mir-155調(diào)節(jié)TNF的阻止可以類似地用來阻斷miRs阻止mir-369.3調(diào)節(jié)作用。作者沒有報道TNFαmRNA的3‘UTR中mir-155的任意靶序列。然而，使用RNA雜交的序列分析鑒定到以下極佳的靶位點(微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列作為中間鏈顯示并且阻斷miR序列作為下半部分鏈顯示)3'ACAAUUACGAUUAUACAUCCUCmilIIImm5‘UUUACAGAUGAAUGUAUUUAUUUGGGAGACCGGGGUAUCCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘AAATGTCTACTTACATAAATAAACCCTCTGGCCCCATAGG3'ACAAUUACGAUUAUACAUCCUCIIIIIIII5'GGGUAUCCUGGGGGACCCAAUGUAGGAGCUGCCUUUUUUCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'CCCATAGGACCCCCTGGGTTACATCCTCGACGGAAAAAAGMir_125b對TNF證實當巨噬細胞以LPS刺激時，Mir-125b是TNF-α表達的負調(diào)節(jié)物。負向調(diào)節(jié)TNF-α可以是有意義的，例如對于接受以TNF-α拮抗劑治療的患者。眾所周知這種治療引起激活結(jié)核菌潛伏感染的風險和通常感染易感性升高。阻止時1-12513調(diào)節(jié)1順-(1可以引起巨噬細胞激活，因而產(chǎn)生抗感染免疫防御，甚至當患者以TNF-α拮抗劑治療時也是如此。應當注意大部分TNF-α拮抗劑屬于細胞外類型(抗體或可溶性受體)并且因而可以使用TNF-α拮抗劑在細胞外降低TNF-α并使用阻止mir_125b調(diào)節(jié)TNF-α表達的阻斷miR在細胞內(nèi)增加TNF-α。另外，可以存在時1-12513對1順-(1表達的調(diào)節(jié)作用確實是正向的病況。因而，如上所述，據(jù)報道一些微RNA是細胞增殖的阻遏物和細胞周期停滯細胞中的激活物。因此，阻止mir-125b調(diào)節(jié)作用的阻斷miR可以用于減少TNF-α表達。使用RNA雜交的序列分析鑒定到眾多靶位點。微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列作為中間序列顯示并且阻斷miR序列作為下半部分鏈顯示。阻斷miR的具體實施方案將從本發(fā)明的描述中顯而易見。a)3‘AGUGUUCAAUCCCAGAGUCCCUIIIIIIIIIIII5‘GCUCAAAAAGAGAAUUGGGGGCUUAGG⑶CGGAACCCAAGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘CGAGTTTTTCTCTTAACCCCCGAATCCCAGCCTTGGGTTCb)3‘AGUGUUCAAUCCCAGAGUCCCUIlIllll5‘CUAGAAAUUGACACAAGUGGACCUUAGGCCUUCCUCUCUCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘GATCTTTAACTGTGTTCACCTGGAATCCGGAAGGAGAGAGc)3‘AGUGUUCAAUCCCAGAGUCCCUIIIIII5'CUGACAUCUGGAAUCUGGAGACCAGGGAGCCUUUG⑶UCUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'GACTGTAGACCTTAGACCTCTGGTCCCTCGGAAACCAAGAd)3'AGUGUUCAAUCCCAGAGUCCCUIIIII5'CAUUGCUGAGCCUCUGCUCCCCAGGGGA⑶UGUGUCUGUAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'GTAACGACTCGGAGACGAGGGGTCCCCTCAACACAGACATMir-125b-l*(從相同的前mir加工為mir_125b)也具有TNF-UTR中的靶位點。a)3'UCGAGGGUUCUCGGAUUGGGCAIlmm5'AACCUGGGAUUCAGGAAU⑶⑶GGCCUGCACAOTGAAiiUGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'TTGGACCCTAAGTCCTTACACACCGGACGTGTCACTTCACb)3'UCGAGGGUUCUCGGAUUGGGCAIIIIII5'AGGCUGUUCCCAUGUAGCCCCCUGGCCUCUGUGCCUUCUUιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιι3'TCCGACAAGGGTACATCGGGGGACCGGAGACACGGAAGAA實施例16靶向腫瘤阻抑蛋白SuFu和Fus-I的阻斷miR最近證實MicroRNA-378通過靶向兩種腫瘤抑制蛋白SuFu和Fus-I表達促進細胞存活、腫瘤生長和血管生成(LeeDY,2007年12月18日，電子出版2007年12月11日)。通過突變分析證實微RNA結(jié)合位點，連同其他結(jié)合位點。阻止微RNA-378調(diào)節(jié)作用的阻斷miR可以用于治療或預防癌癥。Mir-378對sufu如前述實施例中那樣，微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列作為中間序列顯示并且阻斷miR序列作為下半部分鏈顯示。阻斷miR的具體實施方案將從本發(fā)明的描述中顯而易見。3‘U⑶⑶CCUGGACCUCAGUCCUCIIIIIIII5‘UGCCUGG⑶CCCU⑶UACAA⑶CAGGAGCCCUGUAGGGAGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘ACGGACCCAGGGACAATGTTCAGTCCTCGGGACATCCCTCMir-378與fus-1a)3'U⑶⑶CCUGGACCUCAGUCCUCIIIIIII5‘AGCACAGCAGGGCAUAUACCA⑶CAGGAAUGCCC⑶UACCIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘CAACTCTCTCACGTCCGACCCCAGTCCTGTCCGACGCCTAb)另一個潛在靶位點是3‘U⑶⑶CCUGGACCUCAGUCCUCIιιιιιιιιιI5'GUUGAGAGAGUGCAGGCUGGG⑶CAGGACAGGCUGCGGAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘CAACTCTCTCACGTCCGACCCCAGTCCTGTCCGACGCCTA實施例17用于阻止腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移的阻斷miR已經(jīng)證實微RNAmir-373和mir_520c促進腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移(HuangQ,2008年2月；電子出版2008年1月13日)。作者證實細胞mir-373和mir-520c的移行表型可以由⑶44下調(diào)解釋。先前已經(jīng)報道編碼乙酰透明質(zhì)酸細胞表面受體的⑶44表達減少引起與移行中作用相符合的腫瘤進展增強。在該論文中還給出3'UTR中兩個微RNA結(jié)合位點的證據(jù)，并且證實缺失距離該UTR的3'端約70和140nt的兩個微RNA結(jié)合位點取消了調(diào)節(jié)作用。作者推測這兩個微RNA的其他靶可以參與移行表型。然而，他們還證實⑶44的siRNA敲除也具有移行表型，從而支持⑶44下調(diào)對移行和入侵的重要性。我們提出使用阻斷miR阻斷⑶44下調(diào)。兩個優(yōu)選的靶位點是靠近該UTR3‘端的那兩個位點(位置3001和位置2927)Mir-373對CD4在該UTR3'端附近鑒定到mir-373的一個潛在靶位點。來自RNA雜合物的復合體位置3001靶5'UUGAA3'AUCUGAGUUGAAGCACUUUGGGUUUAGCUUC⑶GAAmiRNA3'UGGUG5'如前述實施例中所示的復合體，微RNA作為上半部分鏈顯示，靶序列作為中間序列顯示并且阻斷HliR序列作為下半部分鏈顯示。阻斷HliR的具體實施方案將從本發(fā)明的描述中顯而易見。3‘UGUGGG⑶UUUAGCUUC⑶GAAGIIIII5‘UAUGUAUAUUGCUGAGUUGAAAGCACUUAUUGGAAAAUAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'ATACATATAACGACTCAACTTTCGTGAATAACCTTTTATAMir-520c對CD4鑒定到mir-520c的三個潛在靶位點首先顯示來自RNA雜合物的復合體。隨后該復合體如前述實施例中那樣顯示。a)位置2083靶5'CUGUUCCACU3'CAGAGAGUUUCCUUCUAGAGUCUUUCGAAGGGAGAUCUmiRNA3'CAC5'3'GUCUUUCACGAAGGGAGAUCUCIIIIIIIII5'CCAGAGAUG⑶UUUCCACUCCUUCUAGAUAUUCCCAAAAAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'GGTCTCTACCAAAAGGTGAGGAAGATCTATAAGGGTTTTTb)位置485IE5'ACCA3'CAGACCCUCUAGAGUCUGGGAGAUCUmiRNA3'UUCACGAAC5'3'GUCUUUCACGAAGGGAGAUCUCIIIIIIII5'UACACAUCUUCAACAGACCCCCUCUAGAAAUUUUUCAGAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'ATGTGTAGAAGTTGTCTGGGGGAGATCTTTAAAAAGTCTAc)位置2927靶5'UCACACCCU3'CAGAGUUCCUCUGGGUCUUAGGGAGAUCmiRNA3'UCACGAUC5'3'GUCUUUCACGAAGGGAGAUCUCIIIIIIII5'GACUUUUCAGAGCACACCCUUCCUCUGGUUUUUGUAUAUUιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιιι3'CTGAAAAGTCTCGTGTGGGAAGGAGACCAAAAACATATAA實施例18用于治療癌癥的靶向PTEN的阻斷miR已經(jīng)證明Mir-214通過靶向PTEN的3'UTR誘導細胞存活和順鉬耐藥性，這導致PTEN的下調(diào)和Akt途徑激活(YangH,2008年1月)。證實PTEN3'UTR中的mir-214結(jié)合位點。使用突變分析和報道系統(tǒng)驗證該微RNA結(jié)合位點。另外，證實用缺少3'UTR的PTENcDNA繞過對PTEN的微RNA調(diào)節(jié)作用則降低細胞存活，也如導入Akt抑制物那樣。因而，阻斷miR可以用來阻止對PTEN的微RNA調(diào)節(jié)作用，這轉(zhuǎn)而將阻止Akt途徑激活。這種阻斷miR可以與順鉬或其他化療藥共同給藥以防止產(chǎn)生耐藥性。也可以使用針對mir-214的反miR，但是在這種情況下副作用的可能性可能提高。以下復合體可以在mir-214和以上論文中鑒定的靶位點之間形成。a)位置993革巴5'UAUCAAAUAAUAG3'ACUGUUUUCCCUGCUGUUGACGGAAGGGACGACAmiRNA3'CACAC5'3'UGACGGACAGACACGGACGACAIIIIIII5'ACUAGUUUUCAAUCAUAAUACCUGCUGUGGAUGCUUCAUGIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'TGATCAAAAGTTAGTATTATGGACGACACCTACGAAGTAC其他結(jié)合位點在以下復合體中顯示b)位置629靶5'GGCACU3'GCCU⑶CUGCUU⑶UGUCGGACAGACGGACGACAmiRNA3'UGAAC5'3‘UGACGGACAGACACGGACGACAIIIIIIIII5‘GGAAUUGGCCGCU⑶CACUGCUU⑶UGUUUGCGCAUUUUUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘CCTTAACCGGCGACAGTGACGAACAACAAACGCGTAAAAAc)位置3196革巴5'AUCAUCCCAAUCAGACAUUU⑶UAUA3'UGCCU⑶CU⑶⑶UU⑶UACGGACAGACACGGACGAmiRNA3'UGCA5'3'UGACGGACAGACACGGACGACAIIIIIIIII5‘AGAUGUCCAUUU⑶UAUU⑶⑶UU⑶UAACAACCCUUUAUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘TCTACAGGTAAACAATAACACAAACAATTGTTGGGAAATA實施例19用于治療癌癥的阻斷miR最近證實MicroRNA-27是ZBTBlO的阻遏物，其中所述的ZBTBlO是Spl、Sp3和Sp4的負調(diào)節(jié)物(Mertens-TalcottSU，2007年11月)。因而，用反義miR_27a轉(zhuǎn)染ER-陰性MDA-MB-231乳腺癌細胞導致ZBTBlOmRNA的表達增加和Spl、Sp3和Sp4的表達減少。另外，反義mir-27a轉(zhuǎn)染伴隨Sp-依賴性存活基因和血管生成性基因(包括存活、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和VEGF受體1(VEGFRl)基因)的表達減少。用ZBTBlO表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得相似的結(jié)果。因而，針對mir-27的反義分子可以用來治療癌癥。我們提出使用針對ZBTBlO的阻斷miR，阻斷對ZBTBlO的mir_27a抑制作用。Mir-27a與ZBTN103'UTR位置96靶5'UUUAGAUGUUA3'GCGGAUA⑶UGCU⑶GAACGCCUAUCGGUGACACUUmiRNA3'UGA5'3‘CGCCUUGAAUCG⑶GACACUUIIIIIIIIII5‘GCUGGAUAGUA⑶UAU⑶UGCU⑶GAAAACUGUAGGiiUCAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘CGACCTATCATCAATACAACGACACTTTTGACATCCCAGT如前述實施例中那樣，上半部分序列是微RNA，中間部分序列是靶序列，并且下半部分鏈是可以在兩端被截短的示例性阻斷miR。具體實施方案將從詳細描述中顯而易見。Mi-27a對Myt-I也證實Mir_27a調(diào)節(jié)Myt-I，這進一步有助于該微RNA的生癌活性。Myt-Ι在G2-M阻斷細胞周期進展。因而阻止Myt-I的mir-27a的阻斷miR也是有意義的。序列分析鑒定到兩個推定性靶位點和該微RNA與Myt-13'UTR之間的相應復合體。a)位置2620靶5'UCACAU3'GUGGAAUA⑶UGCU⑶GACGCCUUGUCG⑶GACACUmiRNA3'AAU5'3‘CGCCUUGAAUCG⑶GACACUUιιιιιιιιιI5'AAUGUGUGGAAUCACAA⑶UGCU⑶GAUACUUCAUUUUUAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3‘TTACACACCTTAGTGTTCAACGACACTATGAAGTAAAAATb)位置2414靶5'UUCUUCAUAAU3'GCGACUUGGUUAUU⑶GAGCGCUGAAUCGiiUGACACUUmiRNA3'CU5'3‘CGCCUUGAAUCG⑶GACACUUIIIIIIIII5'CUGACCUUUCAUAUGGAUUAUU⑶GA⑶CAUCAGAGUUUAIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII3'GACTGGAAAGTATACCTAATAACACTCAGTAGTCTCAAAT參考文獻AsanganiΙΑ,R.S.(2007年10月29日)·MicroRNA-21(miR-21)在結(jié)直腸癌中轉(zhuǎn)錄后方式下調(diào)腫瘤抑制蛋白Pdcd4并刺激入侵、進入血管和轉(zhuǎn)移(MicroRNA-21(miR-21)post-transcriptionallydownregulatestumorsuppressorPdcd4andstimulatesinvasion,intravasationandmetastasisincolorectalcancer).月中瘤基因(Oncogene).GalardiS,M.N.(2007).miR-221和miR-222表達通過靶向p27Kipl影響人前列腺癌細胞系的增殖潛能(miR-221andmiR-222expressionaffectstheproliferationpotentialofhumanprostatecarcinomacelllinesbytargetingp27Kipl).生物化學雜志(JBiolChem)，8月10日；282(32):23716_24·GilliesJK,L.I.(2007).通過miRNA221/222在膠質(zhì)母細胞瘤中調(diào)節(jié)p27Kipl(Regulationofp27KiplbymiRNA221/222inglioblastoma).細胞周期(CellCycle)，6月；6(16):2005_9.GuptaA,G.J.(2006).HSV-I潛伏相關轉(zhuǎn)錄物編碼的微RNA的抗凋亡功能(Anti-apoptoticfunctionofamicroRNAencodedbytheHSV-Ilatency-associatedtranscript).自然(Nature)，7月6日；442(7098):82_5.HuangJ,W.F.(2007年10月；13(10)，電子出版2007年9月30日).細胞微RNA有助于靜息原代CD4(+)T淋巴細胞中HIV-I潛伏(CellularmicroRNAscontributetoHIV-IlatencyinrestingprimaryCD4(+)Tlymphocytes).天然藥物(NatMed.),1241-7.HuangQ，G.K.-S.(2008年2月；電子出版2008年1月13日).微RNAmiR-373禾口miR-520c促進月中瘤入侵禾口轉(zhuǎn)移(ThemicroRNAsmiR-373andmiR-520cpromotetumourinvasionandmetastasis).自然細胞生物學(NatCellBiol.)，10(2):202_10.JoplingCL,Y.Μ.(2005).通過肝臟特異性微RNA調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒RNA豐度(ModulationofhepatitisCvirusRNAabundancebyaliver-specificMicroRNA).禾斗學(Science)，9月2；309(5740)1577-81.IeSageC，N.R.(2007).miR-221和miR_222D對p27(Kipl)腫瘤抑制蛋白的調(diào)節(jié)促進癌細胞增殖(Regulationofthep27(Kipl)tumorsuppressorbymiR-221andmiR-222promotescancercellproliferation).歐洲分子生物學組織雜志(ΕΜΒ0J.),8月8日；26(15)3699-708.電子出版2007年7月12日.LeeDY,D.Z.(2007年12月18日，電子出版2007年12月11日).微RNA-378通過靶向SuFu和Fus-I表達促進細胞存活、腫瘤生長和血管生成(MicroRNA-378promotescellsurvival,tumorgrowth,andangiogenesisbytargetingSuFuandFus-lexpression).美國國家科學院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)，104(51):20350_5.MaL,T.-F.J.(2007年10月11日；449(7163)，電子出版20079月26.).微RNA-IO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.根據(jù)權(quán)利要求29-30中任意一項所述的方法，其中，所述寡核苷酸誘導RNA酶H切割靶RNA并且因而調(diào)節(jié)該靶RNA的活性。32.根據(jù)權(quán)利要求29-30中任意一項所述的方法，其中，所述系統(tǒng)是細胞提取物或細胞。33.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任意一項所述的方法，其中，所述方法在體內(nèi)、離體或體外進行。34.一種藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求1-28中任意一項所述的寡核苷酸。35.一種治療方法，其包括將治療有效量的權(quán)利要求1-28中任意一項所述的寡核苷酸或者權(quán)利要求34所述的藥物組合物給藥至需要的人。36.用作藥物的權(quán)利要求1-28中任意一項所述的寡核苷酸。37.權(quán)利要求1-28中任意一項所述的寡核苷酸在制備用于治療癌癥、病毒感染、免疫疾病或心血管疾病的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)靶RNA活性的寡核苷酸。因而，本發(fā)明提供與靶RNA的微RNA結(jié)合位點結(jié)合的寡核苷酸。所述寡核苷酸可以激活RNA酶H或RNAi。在優(yōu)選的實施方案中，該寡核苷酸防止微RNA與靶RNA的結(jié)合位點結(jié)合并且因而防止該微RNA調(diào)節(jié)此靶RNA。此類寡核苷酸用于新治療劑的研究和開發(fā)中。文檔編號A61P31/14GK101821390SQ200880101758公開日2010年9月1日申請日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年6月14日發(fā)明者索爾萊夫·默勒申請人:米爾克斯治療有限責任公司