專利名稱：一種治療冠心病的血管支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種治療冠心病的血管支架。
背景技術(shù)：
目前用于治療冠心病的支架有裸金屬支架(BMS)和藥物洗脫支架(DES)兩類。 裸金屬支架的材料主要有316L不銹鋼和鈷鉻合金兩種。DES是將裸金屬支架、聚合 物以及抗再狹窄藥物結(jié)合在一起的支架(該聚合物是將藥物攜載到裸金屬支架上的載 體)，按照支架所攜載的抗再狹窄藥物分為雷帕霉素及其衍生物洗脫支架(如美國 生產(chǎn)的Cyphe,M和Endeaver ;中國生產(chǎn)的FirebirdTM、 PartnerTM和EXCEl/M等)和 紫杉醇洗脫支架(如美國生產(chǎn)的TAXUSTM系列支架)兩種；按照支架使用的聚合物 是否可降解分為聚合物不可降解藥物洗脫支架(如CypherTM、EndeaVerTM、Firebird . Partner 以及TAXUSTM系列支架)和聚合物可降解藥物洗脫支架(如EXCEL )。 冠狀動脈內(nèi)植入裸金屬支架后再狹窄率高達20% 30% (研究認(rèn)為，裸金屬支架術(shù)后 再狹窄的主要原因是血管平滑肌細(xì)胞增殖)，導(dǎo)致患者術(shù)后心臟不良事件發(fā)生率增加； 為了克服裸金屬支架的這些缺點，人們首先研制出了聚合物不可降解的DES，它可使 支架術(shù)后再狹窄率降至10%以內(nèi)，因此DES被譽為冠心病介入治療史上的第三個里 程碑。
但是，除EXCEL 支架外，其它的DES均是在支架所有部位都涂有聚合物和抗 再狹窄藥物涂層的全面涂層支架(稱為對稱涂層)，支架接觸血管壁一側(cè)所攜載的抗 再狹窄藥物通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖起到抗再狹窄的作用，而支架接觸血管腔一 側(cè)所攜載的抗再狹窄藥物則抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長，使得血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)延遲，導(dǎo)致 支架段血管內(nèi)皮化不完全，從而，增加了支架內(nèi)血栓形成甚至造成患者死亡的危險； 另一方面，使用不可降解聚合物的DES因為其聚合物永久殘留，導(dǎo)致血管壁發(fā)生炎癥 反應(yīng)，甚至嚴(yán)重的超敏反應(yīng)，因此，使血管內(nèi)皮修復(fù)更加延緩，而且還存在導(dǎo)致晚期 支架貼壁不良(LSM)及支架處動脈瘤形成等危險的發(fā)生。
針對不可降解聚合物全面涂層DES的上述缺點，本專利實用新型人(是否有語
病？)王吉成研制出了聚合物可降解(該聚合物在體內(nèi)最終降解為C02和H20)、單
面涂層(即僅在支架接觸血管壁一側(cè)涂有聚合物和藥物涂層，稱為非對稱涂層)的藥
物洗脫支架一EXCEI/m。初步的臨床研究顯示它能夠有效預(yù)防支架內(nèi)再狹窄和支架
內(nèi)血栓事件的發(fā)生(張玉霄，盧才義，薛橋，等.載雷帕霉素可降解聚合物涂層支架
治療冠心病的臨床觀察.中華心血管病雜志.2006; 34(11): 971-974.);動物實驗顯示 支架段血管的內(nèi)皮化時間比文獻報道的Cypher 支架短，局部炎癥反應(yīng)輕，與裸金屬 支架相似(張玉霄，盧才義.載雷帕霉素可降解聚合物涂層支架治療冠心病的臨床及 實驗研究.中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院博士論文.2006.)。也說明單面涂層的 EXCEL 支架在血管內(nèi)皮化方面，并不優(yōu)于裸金屬支架，仍然存在因為支架段血管內(nèi) 皮化不完全而引發(fā)支架內(nèi)血栓形成的危險。
目前的動物實驗及臨床研究認(rèn)為，血管平滑肌細(xì)胞增殖、支架段血管內(nèi)皮化延遲 和不可降解聚合物永久殘留導(dǎo)致的局部血管壁炎癥反應(yīng)是植入DES后發(fā)生再狹窄和
晚期支架內(nèi)血栓的主要原因。因此，只有同時解決血管平滑肌細(xì)胞增殖、支架段血管 內(nèi)皮化延遲和不可降解聚合物永久殘留的問題，才能從根本上解決支架內(nèi)再狹窄和因 為支架段血管內(nèi)皮化不全所導(dǎo)致的支架內(nèi)血栓形成的問題。
針對支架段血管內(nèi)皮化延遲和內(nèi)皮化不全的問題，DirkH博士等人研制了一種基 因洗脫支架一一是用聚合物將促進血管內(nèi)皮增生的phVEGF-2攜載到裸金屬支架上制 成的支架，動物實驗證明該支架具有顯著的促進支架段血管內(nèi)皮化的作用，但是，該 支架上沒有攜載抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的藥物，理論上，它不能阻止因為血管平滑 肌細(xì)胞增殖造成的再狹窄發(fā)生，因此它是否具備肯定而有效的抗再狹窄作用有待進一 步實驗證實。
人血管內(nèi)皮生長因子 (hVEGF, GeneID: 7422 ， http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)是由兩個相同多肽鏈以二硫鍵組成的二聚體糖蛋 白，分子量為46 kD (Connolly DT， Heuvelman DM, Nelson R， et al.[J]. J Clin Invest,1989;84(5):1470-1478)可促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，其編碼基因位于染色體的 6q21.3，全長14kb，包括交替剪接的8個外顯子和7個內(nèi)含子(WeiMH, PopescuNC, Lerman Ml, et al. Localization of the human vascular endothelial growth factor gene,VEGF， at chromosome 6ql2[J]. Hum Genet, 1996， 97(1): 794 — 797)，可以形成人血管內(nèi) 皮生長因子121 (hVEGF121)、人血管內(nèi)皮生長因子165 (hVEGF165)、人血管內(nèi) 皮生長因子189 (hVEGF189)、人血管內(nèi)皮生長因子206 (hVEGF206)和人血管內(nèi) 皮生長因子145(hVEGF145)等至少5種蛋白異構(gòu)體(Mingqing S, Sreemathy R, Sumathi R, et al. Angiogenic role for glycodelin in tumorigenesis[J]. Medical Sciences, 2001, 98 (16): 9 265—9 270.)。這幾型人血管內(nèi)皮生長因子生物活性相近，它們是由同一種原 始轉(zhuǎn)錄物按不同方式拼接形成的，在人類細(xì)胞中VEGF121和VEGF165是主要的異構(gòu) 體形式。而多數(shù)細(xì)胞分泌VEGF又以VEGF165為主，這也是VEGF發(fā)揮作用的主要 形式。目前，人們利用細(xì)胞表達VEGF及其各種亞型的技術(shù)已經(jīng)成熟。
成纖維生長因子(FGF)是一種對中胚層來源的細(xì)胞有強烈促增殖和分化作用的 細(xì)胞生長因子，這種中胚層來源的細(xì)胞包括了3種主要血管細(xì)胞成纖維母細(xì)胞、內(nèi) 皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。FGF有7種家族系列(Schott RJ,Morrow LA.[J].Cardiovasc res,1993;27(7):1155-1161)，研究較多的為酸性成纖維母細(xì)胞生長因子(aFGF)和堿 性成纖維母細(xì)胞生長因子(bFGF) ， aFGF由140個氨基酸組成，bFGF則由146個氨 基酸組成，兩者的氨基酸排列順序約53%相同，bFGF的分布較廣泛，見于血管內(nèi)皮、 血管平滑肌、心肌細(xì)胞以及富含血管的組織器官中，aFGF分布相對局限，未見其在 血管內(nèi)皮分布的報道。兩因子在腦、心臟等許多器官內(nèi)廣泛存在，并參與組織的分化 和修復(fù)。FGF通過其特異性受體發(fā)揮作用，F(xiàn)GF效應(yīng)細(xì)胞表面存在兩種受體高親和 力和低親和力受體，高親和力受體的分子克降表明，它們分別是FGFR1、 FGFR2、 FGFR3禾卩FGFR4 ( Jaye M,Schlessinger J,Dio皿e CA，et al.[J〗.Biochim Biophys Acta,1992;1135 (2):185-199)。體外研究發(fā)現(xiàn)在毛細(xì)血管中加入FGF，不但可以促進 細(xì)胞增殖、分裂和生長，而且還可以誘導(dǎo)毛細(xì)血管樣管腔形成。同時發(fā)現(xiàn)對血管內(nèi)皮 細(xì)胞有強烈的趨化作用(Thomas KA.Rios CM,Gimenez GG，et al.[J].Proc Natl Acad Sci USA,1985;82(19):6409-6419)。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)FGF有強烈的促血管形成作用(Clarke MSF，Khakee R,McNeil PL.[J].J Cell sci 1993,106(1):121陽123; Unger EF,Banai S， Shou M,etal.[J].Am Jphysiol,1994;266(4pt2):H1588-1595) 。 FGF促進血管形成的作用主要 有①促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；②促進內(nèi)皮細(xì)胞的遷移；③促進具有降解基底膜作 用的蛋白激酶的釋放；④促進內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔。

實用新型內(nèi)容
針對裸金屬支架、不可降解聚合物全面涂層DES、可降解聚合物單面涂層藥物洗 脫支架和單純phVEGF基因洗脫支架存在的不足，本實用新型提供了具有非對稱涂層 的可同時抗再狹窄、促進血管內(nèi)皮生長的治療冠心病的血管支架。
本實用新型所提供的治療冠心病的血管支架，含有非對稱的載抗再狹窄藥物的可 降解聚合物涂層和載可表達人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維生長因子的重組表達 載體的可降解聚合物涂層的血管支架；是由裸金屬支架、裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)
涂層和裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層構(gòu)成；所述裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層是 抗再狹窄藥物與可降解聚合物的混合物；所述裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層是可表 達人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維生長因子的重組表達載體與可降解聚合物的混 合物。所述抗再狹窄藥物為雷帕霉素和/或雷帕霉素衍生物和/或紫杉醇；所述雷帕霉 素衍生物可為Biolimus A9、 ABT578、 Everolimus或Tacrolimus。
所述人血管內(nèi)皮生長因子可為人血管內(nèi)皮生長因子165 (hVEGF165)和/或人血 管內(nèi)皮生長因子121 (hVEGF121)和/或人血管內(nèi)皮生長因子2 (hVEGF2)。
所述可表達人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維生長因子的重組表達載體優(yōu)選為 可表達人血管內(nèi)皮生長因子的重組表達載體；所述可表達人血管內(nèi)皮生長因子的重組 表達載體優(yōu)選為可表達人血管內(nèi)皮生長因子165的重組表達載體。
所述可表達人血管內(nèi)皮生長因子165的重組表達載體是將人血管內(nèi)皮生長因子 165的編碼基因插入到真核表達載體中得到的可表達人血管內(nèi)皮生長因子165的重組 表達載體。所述可表達人血管內(nèi)皮生長因子165的重組表達載體優(yōu)選為 pcDNA3-VEGF165。
所述裸金屬支架為不銹鋼血管支架或鈷鉻合金血管支架，可為市售任意治療冠心 病的裸金屬支架，其結(jié)構(gòu)為管狀，管壁有鏤空，外觀呈網(wǎng)管狀。所述裸金屬支架規(guī)格 (直徑x長度)范圍為2.5mm 4.0mmxi4mm 33mm。
所述可降解聚合物為聚乳酸。所述聚乳酸優(yōu)選為外消旋聚乳酸(D,L-PLA)。 所述裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層或所述裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層的 厚度為5微米 10微米。
由于本實用新型的支架采用了抗再狹窄藥物和可表達人血管內(nèi)皮生長因子和/或 人成纖維生長因子的重組載體分別涂于支架血管壁和血管腔一側(cè)的不對稱涂層設(shè)i十， 使支架的功能得到了優(yōu)化。 一方面，在血管壁一側(cè)涂層中有抗再狹窄藥物，而在血管 腔一側(cè)涂層中沒有抗再狹窄藥物，既起到抑制平滑肌細(xì)胞增殖防止再狹窄的作用，又 避免了抗再狹窄藥物對血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)延遲和支 架段血管內(nèi)皮化不全的不良后果(即避免了抗再狹窄藥物對血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的抑制 作用)；另一方面，支架接觸血管腔一側(cè)涂層中的人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維 生長因子的重組表達載體起促進支架段血管內(nèi)皮化，避免支架內(nèi)血栓形成的作用；在 支架接觸血管壁一側(cè)涂層中沒有人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維生長因子的重組 表達載體，避免了人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維生長因子對支架接觸的血管壁一 側(cè)細(xì)胞的影響。
本實用新型的支架使用的聚乳酸作為抗再狹窄藥物和促進內(nèi)皮化基因的載體，在 人體內(nèi)可以完全降解為對人無害的C02和H20，不在體內(nèi)殘留，動物實驗結(jié)果證明在 同一枚裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂具有抗再狹窄作用的雷帕霉素和支架接觸血管 腔一側(cè)涂具有促進支架段血管內(nèi)皮化的可表達人血管內(nèi)皮生長因子的重組表達質(zhì)粒 是安全而有效的，提示本實用新型的支架可以應(yīng)用于冠心病的臨床介入手術(shù)中。

圖1為本實用新型的血管支架截面圖。 圖2為本實用新型的血管支架展開后正視圖(平面圖)。 圖3為本實用新型的血管支架展開后立體圖。
圖4為本實用新型的血管支架植入術(shù)后24小時支架和支架撐桿周圍的血管內(nèi)皮 細(xì)胞掃描電鏡照片。圖4中A為支架撐桿表面改變的掃描電鏡照片；圖4中B為支架 撐桿周圍內(nèi)皮細(xì)胞變化的掃描電鏡照片。
圖5為實施例1制備的支架植入術(shù)后1個月支架段血管內(nèi)皮化情況和支架撐桿不 同部位血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及其排列的掃描電鏡照片；A為實施例l制備的支架植入術(shù) 后1個月支架撐桿表面100%被新生內(nèi)膜覆蓋；B為支架撐桿不同部位內(nèi)皮細(xì)胞的形 態(tài)和排列；C為支架撐桿部位新生內(nèi)皮細(xì)胞呈"鋪路石"樣形態(tài)；D為遠(yuǎn)離支架撐桿部 位新生內(nèi)皮細(xì)胞呈"梭形"，其長軸與血流方向一致；E為在支架撐桿弧線走行部位內(nèi)
皮細(xì)胞呈"漩渦樣"排列。
圖6為實施例1制備的支架植入術(shù)后1個月，支架段血管壁合成態(tài)血管平滑^l細(xì) 胞和收縮態(tài)血管平滑肌細(xì)胞的透射電鏡照片；圖中A為合成態(tài)血管平滑肌細(xì)胞；B為 收縮態(tài)血管平滑肌細(xì)胞。
圖7為實施例1制備的支架植入術(shù)后1個月支架段血管光鏡觀察的結(jié)果；圖中A 為支架段血管壁三層結(jié)構(gòu)、新生內(nèi)膜增生與中膜和外膜受壓情況的光鏡照片，B為支 架段血管壁炎癥反應(yīng)的光鏡照片(HE染色，xlOOO)。
具體實施方式

如圖1 圖3所示，為本實用新型所提供的一種血管支架，它包括有 裸金屬支架2、裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層1和裸金屬支架接觸血管腔一側(cè) 涂層3;裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層1是雷帕霉素與可降解聚合物的混合物；裸 金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層3是可表達人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維生長因 子的重組表達載體與可降解聚合物的混合物。圖1、圖2和圖3中1為支架接觸血管 壁一側(cè)涂層，2為支架的金屬部分，3為支架接觸血管腔一側(cè)涂層。
由于本實用新型的支架采用了抗再狹窄藥物和可表達人血管內(nèi)皮生長因子和/或 人成纖維生長因子的重組載體分別涂于支架血管壁和血管腔一側(cè)的不對稱涂層設(shè)計， 使支架的功能得到了優(yōu)化。 一方面，在血管壁一側(cè)涂層中有抗再狹窄藥物，而在血管 腔一側(cè)涂層中沒有抗再狹窄藥物，既起到抑制平滑肌細(xì)胞增殖防止再狹窄的作用，又 避免了抗再狹窄藥物對血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)延遲和支 架段血管內(nèi)皮化不全的不良后果(即避免了抗再狹窄藥物對血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的抑制
作用)；另一方面，支架接觸血管腔一側(cè)涂層中的可表達人血管內(nèi)皮生長因子和/或人 成纖維生長因子的重組表達質(zhì)粒載體起促進支架段血管內(nèi)皮化，避免支架內(nèi)血栓形成 的作用；在支架接觸血管壁一側(cè)涂層中沒有可表達人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維
生長因子的重組表達載體，避免了人血管內(nèi)皮生長因子和/或人成纖維生長因子對支架 接觸的血管壁一側(cè)細(xì)胞的影響。
以下述實施例l一4為例制備本實用新型的血管支架，并進行效果實驗。
實施例l、本實用新型的血管支架的制備
以2.5mmxl4mm支架為例介紹該支架的制作工藝及主要參數(shù)
將10.0g粘度為0.9dl/g的聚乳酸(外消旋聚乳酸)加入4.5g雷帕霉素，置于一潔 凈的燒杯內(nèi)，加入100ml的乙酸乙酯在0-6(TC下500轉(zhuǎn)/分鐘混合10分鐘，然后在 20KHZ下超聲20分鐘，所得溶液即為涂層液，即裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層液。
將10.0g粘度為0.9dl/g的聚乳酸(外消旋聚乳酸)加入1.0gpcDNA3-VEGF165 質(zhì)粒(購自北京億利高科生物技術(shù)研究所有限公司，pcDNA3-VEGF165是以pcDNA3.1 為出發(fā)質(zhì)粒，插入人VEGF165的編碼基因片段得到的可表達人VEGF165的重組質(zhì) 粒)，加入100ml的乙酸乙酯在0-60。C下500轉(zhuǎn)/分鐘混合10分鐘，然后在20KHZ 下超聲20分鐘，制得裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層液。
將裸金屬支架(新加坡百盛公司生產(chǎn)的S支架，支架的型號(直徑x長度)為 2.5mmxl4mm)浸泡于水中，超聲清潔，直到支架表面無污染物(支架清潔液在光線 明亮處檢査應(yīng)無肉眼可見的顆粒)。
用沾涂法將清洗過的裸金屬支架的接觸血管腔一側(cè)涂上上述制得的裸金屬支架 接觸血管腔一側(cè)涂層液，涂層厚度為7微米；在裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)用沾涂法 涂上上述制得的裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層液，涂層厚度為7微米。
將完成涂層后的支架置于一潔凈的容器內(nèi)，保持真空度為0.1-0.07MPa， 0-6(TC溫 度下，使溶劑揮發(fā)，即得到支架接觸血管壁一側(cè)涂有聚乳酸和雷帕霉素，支架接觸血 管腔一側(cè)涂有聚乳酸和pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒的血管支架。
支架經(jīng)過上述處理后，在生產(chǎn)線上將支架預(yù)裝到球囊上，給予該球囊爆破壓的壓 力充盈球囊，肉眼觀察支架伸展是否均勻、涂層是否有爆裂和脫落等問題，之后在電 鏡下觀察涂層是否爆裂或脫落。結(jié)果表明，上述制備的血管支架在球囊完全充盈后無 伸展不均勻、涂層爆裂和涂層脫落等現(xiàn)象發(fā)生。
用金相顯微鏡測定表明，該支架接觸血管壁一側(cè)的涂層厚度為7微米，接觸血管 腔一側(cè)的涂層厚度為7微米。用HPLC測定表明，該支架接觸血管壁一側(cè)涂層的雷帕 霉素含量為140pg/cm、接觸血管腔一側(cè)涂層的pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒含量為 110ng/cm2。該血管支架的結(jié)構(gòu)圖如圖1、圖2和圖3所示，圖l為本實用新型的血管 支架截面圖，圖2為本實用新型的血管支架展開后圖，自血管壁一側(cè)正視圖，圖3為 本實用新型的血管支架展開后立體圖；圖1、圖2和圖3中1為支架接觸血管壁一側(cè) 涂層，2為支架的金屬部分，3為支架接觸血管腔一側(cè)涂層。
實施例2、本實用新型的血管支架的制備
以2.75mmxl4mm支架為例介紹該支架的制作工藝及主要參數(shù)
將10.0g粘度為0.2dl/g的聚乳酸(外消旋聚乳酸)中加入2.5g雷帕霉素，置于一 潔凈的燒杯內(nèi)，加入100ml的丙酮在0-6(TC下500轉(zhuǎn)/分鐘混合10分鐘，然后在20KHZ 下超聲20分鐘，所得溶液即為涂層液，即制得裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層液。
在10.0g粘度為0.2dl/g的聚乳酸中加入0.03gpcDNA3-VEGF165質(zhì)粒(購自北京 億利高科生物技術(shù)研究所有限公司，pcDNA3-VEGF165是以pcDNA3.1為出發(fā)質(zhì)粒， 插入人VEGF165的編碼基因片段得到的可表達人VEGF165的重組質(zhì)粒)，加入100ml 的丙酮在0-60。C下500轉(zhuǎn)/分鐘混合10分鐘，然后在20KHZ下超聲20分鐘混勻，制 得裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層液。
將裸金屬支架(新加坡百盛公司生產(chǎn)的S支架，支架的型號(直徑x長度)為 2.75mmxl4mm)浸泡于堿溶液(濃度為0.5M的NaOH溶液)中，超聲清潔，直到支 架表面無污染物(支架清潔液在光線明亮處檢査應(yīng)無肉眼可見的顆粒)。
用沾涂法將清洗過的裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂上上述制得的裸金屬支架接 觸血管腔一側(cè)涂層液，涂層厚度為10微米；在支架接觸血管壁一側(cè)用沾涂法涂上上 述制得的裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層液，涂層厚度為IO微米。
將完成涂層后的支架置于一潔凈的容器內(nèi)，保持真空度為0.1-0.07MPa， 0-6(TC溫 度下，使溶劑揮發(fā)，即得到支架接觸血管壁一側(cè)涂有聚乳酸和雷帕霉素，支架接觸血 管腔一側(cè)涂有聚乳酸和pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒的血管支架。
支架經(jīng)過上述處理后，在生產(chǎn)線上將支架預(yù)裝到球囊上，給予該球囊爆破壓的壓 力充盈球囊，肉眼觀察支架伸展是否均勻、涂層是否有爆裂和脫落等問題，之后在電 鏡下觀察涂層是否爆裂或脫落。結(jié)果表明，上述制備的血管支架在球囊完全充盈后無 伸展不均勻、涂層爆裂和涂層脫落等現(xiàn)象發(fā)生。
用金相顯微鏡測定表明，該支架的接觸血管壁一側(cè)涂層厚度為IO微米，接觸血 管腔一側(cè)涂層為10微米。用HPLC測定表明，該支架的接觸血管壁一側(cè)涂層的雷帕 霉素濃度為llOpg/cm2;接觸血管腔一側(cè)涂層的pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒濃度為 72pg/cm2。該血管支架的結(jié)構(gòu)圖如圖1、圖2和圖3所示，圖1為本實用新型的血管 支架截面圖，圖2為本實用新型的血管支架展開后，自血管壁一側(cè)正視圖，圖3為
本實用新型的血管支架展開后立體圖；圖1、圖2和圖3中1為接觸血管壁一側(cè)涂層， 2為支架的金屬部分，3為接觸血管腔一側(cè)涂層。
實施例3、本實用新型的血管支架的制備
以3.0mmxl4mm支架為例介紹該支架的制作工藝及主要參數(shù)
將10.0g粘度為1.2dl/g的聚乳酸加入15g雷帕霉素，置于一潔凈的燒杯內(nèi)，加入 100ml的氯仿在0-6(TC下500轉(zhuǎn)/分鐘混合10分鐘，然后在20KHZ下超聲20分鐘， 所得溶液即為涂層液，即裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)的涂層液。
將10.0g粘度為1.0的聚乳酸加入10.0gpcDNA3-VEGF165質(zhì)粒(購自北京億利 高科生物技術(shù)研究所有限公司，pcDNA3-VEGF165是以pcDNA3.1為出發(fā)質(zhì)粒，插入 人VEGF165的編碼基因片段得到的可表達人VEGF165的重組質(zhì)粒)，加入100ml 的氯仿在0-6(TC下500轉(zhuǎn)/分鐘混合10分鐘，然后在20KHZ下超聲20分鐘混勻，制 得裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層液。
將裸金屬支架(新加坡百盛公司生產(chǎn)的S支架，支架的型號(直徑x長度)為 3.0mmxl4mm)，浸泡于20g丙酮中，振蕩清潔，直到支架表面無污染物(支架清潔 液在光線明亮處檢查應(yīng)無肉眼可見的顆粒)。
用沾涂法將清洗過的裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂上上述制得的裸金屬支架接 觸血管腔一側(cè)涂層液，涂層厚度為5微米；在支架接觸血管壁一側(cè)用沾涂法涂上上述 制得的裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層液，涂層厚度為5微米。
將完成涂層后的支架置于一潔凈的容器內(nèi)，保持真空度為0.1-0.07MPa， 0-6(TC溫 度下，使溶劑揮發(fā)，即得到支架接觸血管壁一側(cè)涂有聚乳酸和雷帕霉素，支架接觸血 管腔一側(cè)涂有聚乳酸和pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒的血管支架。
支架經(jīng)過上述處理后，在生產(chǎn)線上將支架預(yù)裝到球囊上，給予該球囊爆破壓的壓 力充盈球囊，肉眼觀察支架伸展是否均勻、涂層是否有爆裂和脫落等問題，之后在電 鏡下觀察涂層是否爆裂或脫落。結(jié)果表明，上述制備的血管支架在球囊完全充盈后無 伸展不均勻、涂層爆裂和涂層脫落等現(xiàn)象發(fā)生。
用金相顯微鏡測定表明，該支架接觸血管壁一側(cè)的涂層厚度為5微米，接觸血管 腔一側(cè)涂層為5微米。用HPLC測定表明，該支架的接觸血管壁一側(cè)涂層的雷帕霉素 濃度為180pg/cm2;接觸血管腔一側(cè)涂層的pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒濃度為140叫/cm2。
該血管支架的結(jié)構(gòu)圖如圖1、圖2和圖3所示，圖1為本實用新型的血管支架截面圖，
圖2為本實用新型的血管支架展開后，自血管壁一側(cè)正視圖，圖3為本實用新型的 血管支架展開后立體圖；圖l、圖2和圖3中1為接觸血管壁一側(cè)涂層，2為金屬裸 金屬支架，3為接觸血管腔一側(cè)涂層。
實施例4、本實用新型的血管支架的制備
以4.0mmxl4mm支架為例介紹該支架的制作工藝及主要參數(shù)
將10.0g粘度為1.5dl/g的聚乳酸，15g雷帕霉素，置于一潔凈的燒杯內(nèi)，加入100ml 的氯仿在0-60。C下500轉(zhuǎn)/分鐘混合10分鐘，然后在20KHZ下超聲20分鐘，即制得 裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層液。
在10.0g粘度為1.0dl/g的聚乳酸中加入10.0gpcDNA3-VEGF165質(zhì)粒(購自北京 億利高科生物技術(shù)研究所有限公司，pcDNA3-VEGF165是以pcDNA3.1為出發(fā)質(zhì)粒， 插入人VEGF165的編碼基因片段得到的可表達人VEGF165的重組質(zhì)粒)，加入100ml 的氯仿在0-6(TC下500轉(zhuǎn)/分鐘混合10分鐘，然后在20KHZ下超聲20分鐘混勻，制 得裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層液。
將裸金屬血管支架(新加坡百盛公司生產(chǎn)的S支架，支架的型號(直徑x長度) 為4.0mmxl4mm)浸泡于20g丙酮中，振蕩清潔，直到支架表面無污染物(支架清潔 液在光線明亮處檢查應(yīng)無肉眼可見的顆粒)。
用沾涂法將清洗過的裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂上上述制得的裸金屬支架接 觸血管腔一側(cè)涂層液，涂層厚度為5微米；在支架接觸血管壁一側(cè)用沾涂法涂上上述 制得的裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層液，涂層厚度為5微米。
將完成涂層后的支架置于一潔凈的容器內(nèi)，保持真空度為0.1-0.07MPa， 0-6(TC溫 度下，使溶劑揮發(fā)，即得到支架接觸血管壁一側(cè)涂有聚乳酸和雷帕霉素，支架接觸血 管腔一側(cè)涂有聚乳酸和pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒的血管支架。
支架經(jīng)過上述處理后，在生產(chǎn)線上將支架預(yù)裝到球囊上，給予該球囊爆破壓的壓 力充盈球囊，肉眼觀察支架伸展是否均勻、涂層是否有爆裂和脫落等問題，之后在電 鏡下觀察涂層是否爆裂或脫落。結(jié)果表明，上述制備的血管支架在球囊完全充盈后無 伸展不均勻、涂層爆裂和涂層脫落等現(xiàn)象發(fā)生。
用金相顯微鏡測定表明，該支架的接觸血管壁一側(cè)涂層厚度為5微米，接觸血管
腔一側(cè)涂層為5微米。用HPLC測定表明，該支架的接觸血管壁一側(cè)涂層的雷帕霉素 濃度為110pg/cm2;接觸血管腔一側(cè)涂層的pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒濃度為140pg/cm2。 該血管支架的結(jié)構(gòu)圖如圖1、圖2和圖3所示，圖1為本實用新型的血管支架截面圖， 圖2為本實用新型的血管支架展開后，自血管壁一側(cè)正視圖，圖3為本實用新型的 血管支架展開后立體圖；圖1、圖2和圖3中1為接觸血管壁一側(cè)涂層，2為金屬裸 金屬支架，3為接觸血管腔一側(cè)涂層。
實施例5、本實甩新型的血管支架的植入效果檢測 一、動物血管支架植入
1、 動物來源
健康雜種犬6只(由中國人民解放軍總醫(yī)院動物實驗中心提供)，于其冠狀動脈 內(nèi)植入實施例1制備的血管支架(每只犬各植入l枚支架)；支架的參數(shù)(直徑x長 度)均為2.5mmxl4mm，術(shù)中選擇支架球囊直徑/血管直徑=U 1.3:l的血管段植入 支架。
2、 實驗過程中動物的處理
將步驟1所述的實驗犬進行如下實驗(支架植入過程中有1只犬于支架植入后發(fā) 生室顫死亡)
1 )隨機取1只犬于支架植入術(shù)后24小時處死；
2)其余犬于支架植入術(shù)后1個月處死。
所有實驗犬均于支架植入術(shù)前12小時禁食水；術(shù)前24小時喂阿司匹林腸溶片 300mg，術(shù)后150mg/天，直至動物處死；支架植入術(shù)中用肝素抗凝。
處死前進行冠狀動脈造影(CAG)觀察有無支架內(nèi)和支架邊緣再狹窄及冠狀動 脈瘤樣擴張發(fā)生；
對支架段血管進行掃描電鏡觀察支架段血管內(nèi)皮化情況；
透射電鏡觀察新生內(nèi)膜血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量和表型變化；
光鏡觀察支架段血管壁結(jié)構(gòu)；中膜、外膜的受壓程度和相應(yīng)部位的內(nèi)膜增生程 度、新生內(nèi)膜厚度和面積;管腔面積和新生內(nèi)膜的細(xì)胞成分。
定義血管壁中膜受壓程度分為輕度、中度和重度三級；與相鄰未受壓的中膜比較， 輕度受壓為厚度減少20%;中度為厚度減少〉30%￡60%;重度為厚度減少>60%;血 管壁外膜受壓程度分為輕度、中度和重度三級；與相鄰未受壓的外膜比較，輕度受壓 為厚度減少￡30%;中度為厚度減少>30%￡60%;重度為厚度減少〉60%。 在整個過程中對實驗犬進行的各種檢查的方法如下所述
(1) 冠脈造影檢查
動物麻醉及術(shù)中監(jiān)護按20 25mg/kg給3。/。戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉，保留套 管針靜脈輸液及追加戊巴比妥鈉以維持適當(dāng)?shù)穆樽砩疃?；麻醉成功后，將動物固定?專用手術(shù)架上進行氣管插管、心電圖和血壓監(jiān)測并記錄心電圖和血壓。
冠狀動脈造影先切開犬右側(cè)頸部皮膚，分離皮下組織，暴露頸總動脈，直視下 以Seldinger法穿刺右側(cè)頸總動脈，置入7F動脈鞘并結(jié)扎固定鞘管，同時結(jié)扎頸總動 脈遠(yuǎn)心端；鞘管內(nèi)給肝素300IU/kg，術(shù)程每增加l小時追加肝素500IU;直接選擇 7F/JR3.5 4.0或6F/JR3.5 4.0大腔指引導(dǎo)管在左前斜位40。 45。行冠狀動脈造影。
(2) 支架植入手術(shù)
冠狀動脈內(nèi)支架植入術(shù)植入支架前經(jīng)導(dǎo)管向冠狀動脈內(nèi)注射硝酸甘油50pg， 5-10分鐘后采用支架球囊直徑/血管直徑=1.1 1.3:1對目標(biāo)段血管進行直接植入支 架，擴張壓力為14 18個大氣壓，擴張時間為10 15秒。
術(shù)后處理手術(shù)結(jié)束時拔除動脈鞘管，結(jié)扎頸總動脈近心端，逐層縫合肌肉、皮 下組織和皮膚并用復(fù)合碘消毒創(chuàng)口；術(shù)后連續(xù)肌注青霉素400萬單位/d，共3天。
(3) 處死前冠狀動脈造影
采取與支架植入相同的手術(shù)方式經(jīng)左側(cè)頸總動脈途徑進行冠狀動脈造影檢查， 觀察有無支架內(nèi)和支架邊緣再狹窄及冠狀動脈瘤樣擴張發(fā)生。
(4) 動物處死、取材及相關(guān)檢查標(biāo)本的制作
① 動物處死冠狀動脈造影檢查結(jié)束后，放血處死動物，之后立即開胸取出心 臟(保留升主動脈)。
② 支架段血管的沖洗每個標(biāo)本均在支架近、遠(yuǎn)端的支架網(wǎng)眼之間各取約lmm3 的組織1塊，放入3%的戊二醛中固定，用以制作透射鏡標(biāo)本。
③ 取材固定將步驟②中的支架段血管加壓沖洗，分離出支架段及支架近、遠(yuǎn) 端各5mm的血管段，先將非支架段血管組織剪下分別放入4%的中性甲醛中固定以備
制作光鏡標(biāo)本；根據(jù)方便操作的原則，從一端沿血管長軸剪開支架段血管長度的1/2 后，再沿垂直血管長軸方向剪下該段血管，小心展開后放入3%的戊二醛中固定以備 制作掃描電鏡標(biāo)本；另一半放入4%的中性甲醛中固定以備制作光鏡標(biāo)本。
(5) 掃描電鏡標(biāo)本制作
① 樣品的清洗將步驟(4)中的步驟③中固定好的用于制作掃描電鏡標(biāo)本的樣 品，用等滲的生理鹽水清洗表面。
② 固定將步驟①得到的樣品用戊二醛和鋨酸雙固定。
③ 脫水將步驟②得到的樣品用乙醇脫水。
干燥將步驟③得到的樣品在六甲基二硅胺烷中干燥。 ⑤金屬鍍膜將步驟④得到的樣品按常規(guī)方法給標(biāo)本表面鍍金。
照相、記錄及結(jié)果分析將步驟⑤得到的樣品在專業(yè)技術(shù)人員和心血管病理醫(yī) 師的指導(dǎo)下照相、記錄并分析結(jié)果。
(6) 透射電鏡標(biāo)本制作 按照下述步驟進行標(biāo)本制作和結(jié)果分析
① 樣品脫水將步驟(4)的步驟②中處理后用于制作透射鏡的標(biāo)本按常規(guī)采用 體積百分濃度為70% 100%丙酮溶液進行梯度脫水。
② 浸透將步驟①得到的樣品，按常規(guī)用812包埋劑、DMP-30及丙酮浸透。
③ 包埋將步驟②得到的樣品，常規(guī)包埋在多孔橡膠包埋模板中，然后烘干、聚 合硬化，形成包埋塊。
④ 半薄切片及定位將步驟③得到的樣品，用超薄切片機制作半薄切片；在光鏡 下觀察定位。
⑤ 載網(wǎng)和支持膜將步驟④得到的樣品，固定到200目的銅網(wǎng)中并制作支持膜覆 蓋組織切片。
⑥ 染色將步驟⑤得到的樣品，用含鉛染液進行染色。
⑦ 照相、記錄及結(jié)果分析在專業(yè)技術(shù)人員和心血管病理醫(yī)師的指導(dǎo)下照相、記 錄并分析結(jié)果。
(7) 含支架組織的光鏡標(biāo)本的制作 ①組織包埋的基本步驟
15
A:固定脫水將固定好的標(biāo)本用自來水沖洗過夜后先后浸泡于如下步驟脫水(此 過程均在4。C環(huán)境中進行)用體積百分含量為40%的乙醇溶液浸泡1 2天，然后
用體積百分含量為70%的乙醇溶液浸泡1 2天，然后用體積百分含量為95%的乙醇 溶液浸泡2天，然后用100%乙醇浸泡1天，最后用用二甲苯浸泡l天。
B:浸透包埋首先配制浸液，之后對固定脫水的組織進行包埋。 浸液的配制
溶液I :甲基丙烯酸甲酯75ml和鄰苯二甲酸二丁酯25ml攪拌混勻3小時。 溶液II:甲基丙烯酸甲酯75ml，鄰苯二甲酸二丁酯25ml，過氧化苯甲酰2.5g攪 拌混勻3小時。
溶液III:甲基丙烯酸甲酯75ml，鄰苯二甲酸二丁酯25ml，過氧化苯甲酰62.5g攪 拌混勻4 6小時。
浸液浸泡程序用溶液i浸泡2天，然后用溶液n浸泡2天，最后用溶液ni浸
泡1 2天。
包埋程序在干凈的25ml玻璃瓶中加入5ml新鮮配制的溶液in，加蓋后室溫過 夜，再放入42。C烤箱內(nèi)，1 3聚合成固體。把浸液的標(biāo)本放入上述準(zhǔn)備好的玻璃瓶 中，擺好位置，再裝滿新鮮溶液ni，加蓋后室溫過夜，之后再放入42"C烤箱內(nèi)聚合凝 固，包埋好的標(biāo)本在室溫下存放。
② 組織切片
將裝有包埋好的組織塊的玻璃瓶放入冰箱內(nèi)冷凍片刻后，用錘子擊碎玻璃瓶，取 出包埋塊，用專用工具修剪成適當(dāng)大小和形狀(標(biāo)本周圍要保留至少數(shù)毫米)以便于 切片時固定；用骨科專用切片機(碳化鎢鋼刀)按每片10 15pm厚度垂直管腔長軸 方向切片，每個標(biāo)本連續(xù)切6片，經(jīng)過脫塑處理后，任選三片進行染色。
③ 染色、封片、照相
將處理好的標(biāo)本固定在經(jīng)過預(yù)處理的載玻片上，Giemsa-伊紅和HE染色后封片； 在光鏡下根據(jù)觀察目的選取不同部位照相；采用Image-Pro Plus 5.0微圖像分析軟件測 定支架段血管的新生內(nèi)膜厚度、面積、管腔面積和包括新生內(nèi)膜的血管橫截面積；每 個標(biāo)本的各個參數(shù)都取3個切片測量值的平均值。 (8)不含支架組織的光鏡標(biāo)本制作
① 組織包埋
A:脫水將固定好的標(biāo)本用自梯度乙醇按常規(guī)方法脫水。
B:透明先后用二甲苯透明處理2次。
C:浸蠟在62。C 65。C的液蠟中反復(fù)浸蠟3次。
D:包埋將完成浸蠟的標(biāo)本用石蠟包埋
② 切片、染色、照相及圖像分析按常規(guī)石蠟包埋組織的切片方法對每個標(biāo)本連 續(xù)切6片，任選三片進行染色；觀察非支架段血管的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成份并與支架段 血管進行比較。
二、支架效果的檢測結(jié)果
1、植入實施例1制備的血管支架的冠狀動脈造影結(jié)果
實施例1制備的血管支架植入術(shù)后24小時處死實驗犬1只；術(shù)后1個月處死實 驗犬4只。
對術(shù)后l個月處死的實驗犬，于處死前行冠狀動脈造影檢査4只犬均無支架內(nèi) 再狹窄、支架邊緣再狹窄和支架段血管瘤樣擴張發(fā)生。
2、植入實施例1制備的血管支架后支架段血管的內(nèi)皮化情況
(1) 大體觀實施例1制備的血管支架植入術(shù)后24小時處死實驗犬1只，其支 架部位無內(nèi)皮覆蓋；l個月處死的實驗犬4只，其支架部位全部被半透明新生內(nèi)膜覆
蓋o
(2) 掃描電鏡觀察結(jié)果
① 實施例1制備的血管支架植入術(shù)后24小時處死的1只犬，于支架撐桿上覆蓋 有纖維蛋白、血小板和少量血細(xì)胞，支架撐桿附近的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量極少，而且內(nèi)皮細(xì) 胞的排列及結(jié)構(gòu)均被破壞(圖4中A,B)。圖4中A為支架撐桿表面改變的掃描電 鏡照片；圖4中B為支架撐桿周圍內(nèi)皮細(xì)胞變化的掃描電鏡照片。
② 術(shù)后1個月處死的4只犬，其新生內(nèi)皮細(xì)胞的共同特點是支架撐桿表面100%
被新生內(nèi)膜覆蓋，但新生內(nèi)皮細(xì)胞在支架撐桿的不同部位形狀和排列不同，在支架撐 桿表面及其附近的內(nèi)皮細(xì)胞呈"鋪路石"樣，可見細(xì)胞核部位突起和細(xì)胞表面的微絨毛
結(jié)構(gòu)，細(xì)胞之間的間隙增大，在支架撐桿的直線走行部位內(nèi)皮細(xì)胞的長軸沿血流方向 排列，在弧線走行部位內(nèi)皮細(xì)胞呈"漩渦樣"排列，細(xì)胞的長軸與血管長軸的關(guān)系不固
定；遠(yuǎn)離支架撐桿部位的內(nèi)皮細(xì)胞呈"梭形"，可見細(xì)胞核部位突起和細(xì)胞表面的慎i絨 毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列較密集，長軸與血流方向一致(圖5中A,B,C,D和E)。圖5中， A為實施例1制備的支架植入術(shù)后1個月支架撐桿表面100。/。被新生內(nèi)膜覆蓋;B為支 架撐桿不同部位內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和排列；C為支架撐桿部位新生內(nèi)皮細(xì)胞呈"鋪路石" 樣形態(tài)；D為遠(yuǎn)離支架撐桿部位新生內(nèi)皮細(xì)胞呈"梭形"，其長軸與血流方向一致；E 為在支架撐桿弧線走行部位內(nèi)皮細(xì)胞呈"漩渦樣"排列。
3、植入實施例1制備的血管支架后支架段血管平滑肌細(xì)胞及新生內(nèi)膜的變化
(1) 透射電鏡觀察結(jié)果
植入實施例1制備的血管支架后1個月處死的4只犬，新生內(nèi)膜中血管平滑肌細(xì) 胞數(shù)量相對較少，以膠原和細(xì)胞外基質(zhì)為主；其中，處于去分化狀態(tài)的"合成態(tài)"血管 平滑肌細(xì)胞比分化程度較好的"收縮態(tài)"血管平滑肌細(xì)胞少，"合成態(tài)"血管平滑肌細(xì)胞 的胞體大而致密、細(xì)胞核增大、胞漿內(nèi)線粒體和游離核糖體增多、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴 張和肌絲含量較少，而"收縮態(tài)"的血管平滑肌細(xì)胞胞體及核相對較小,胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)、高爾基體、線粒體較少、肌絲含量比"合成態(tài)"血管平滑肌細(xì)胞多(見圖6中A和 B)。圖6中A為合成態(tài)血管平滑肌細(xì)胞；B為收縮態(tài)血管平滑肌細(xì)胞。
(2) 光鏡觀察結(jié)果
① 血管壁結(jié)構(gòu)和受壓程度的改變術(shù)后1個月，血管壁三層結(jié)構(gòu)清晰(即內(nèi)膜、 中膜和外膜)，非支架撐桿部位的內(nèi)彈力膜完整，部分支架撐桿部位的內(nèi)彈力膜斷裂， 均未見支架撐桿貼壁不良現(xiàn)象。在不同部位的支架撐桿處，中膜和外面的受壓程度不 同，85% 90%的支架撐桿部位中膜輕度受壓，而外膜無受壓改變，相應(yīng)部位的新生 內(nèi)膜增生程度較輕；10% 15%的支架撐桿部位中膜中到重度受壓，相應(yīng)部位的外膜 表現(xiàn)為輕度到中度受壓，該部位的新生內(nèi)膜增生程度較受壓程度輕的部位明顯，總體 趨勢是中膜和外膜的受壓程度越重則該部位新生內(nèi)膜增生越明顯(見圖7中A)。
② 支架段血管的新生內(nèi)膜厚度支架段血管的平均新生內(nèi)膜厚度為(0.04±0.03)mm。
③ 新生內(nèi)膜面積支架段血管的平均新生內(nèi)膜面積為(0.46±0.21) mm2。
管腔面積支架段血管的平均管腔面積為(2.70±0.15) mm2。
新生內(nèi)膜的細(xì)胞成分支架段血管的新生內(nèi)膜主要成分為平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞
外基質(zhì)；遠(yuǎn)離支架撐桿部位的細(xì)胞成份與支架撐桿部位的細(xì)胞成份基本相同。支架撐 桿周圍可見少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，偶見巨噬細(xì)胞，未見嗜酸性粒細(xì)胞(見圖7中 B)。圖7中A為支架段血管壁三層結(jié)構(gòu)、新生內(nèi)膜增生與中膜和外膜受壓情況的光 鏡照片；B為支架段血管壁炎癥反應(yīng)的光鏡照片(HE染色，x1000) 實施例6、實施例2—4所制備的支架的效果
將實施例2、 3、 4所制備的支架按照實施例5所述的方法分別植入6只犬中，按 照實施例5的方法對所述的實驗犬進行如下實驗
1) 隨機取1只于支架植入術(shù)后24小時處死；
2) 其余犬于支架植入術(shù)后1個月處死。
所有實驗犬均于支架植入術(shù)前12小時禁食水；術(shù)前24小時喂阿司匹林腸溶片 300mg，術(shù)后150mg/天，直至動物處死；支架植入術(shù)中用肝素抗凝。
處死前進行冠狀動脈造影(CAG)觀察有無支架內(nèi)和支架邊緣再狹窄及冠狀動 脈瘤樣擴張發(fā)生；
對支架段血管進行掃描電鏡觀察支架段血管內(nèi)皮化情況；
透射電鏡觀察新生內(nèi)膜血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)量和表型變化；
光鏡觀察支架段血管壁結(jié)構(gòu)；中膜、外膜的受壓程度和相應(yīng)部位的內(nèi)膜增生程 度、新生內(nèi)膜厚度和面積；管腔面積和新生內(nèi)膜的細(xì)胞成分。 實驗結(jié)果如下所述 ' 1、植入實施例1制備的血管支架的冠狀動脈造影結(jié)果
對實施例2、 3、 4所制備的支架植入術(shù)后l個月處死的實驗犬，于處死前行冠狀 動脈造影檢査均無支架內(nèi)再狹窄、支架邊緣再狹窄和支架段血管瘤樣擴張發(fā)生。 2、植入實施例1制備的血管支架后支架段血管的內(nèi)皮化情況
(1) 大體觀實施例2、 3、 4所制備的支架植入術(shù)后均于24小時處死實驗犬1 只，其支架部位均無內(nèi)皮覆蓋；實施例2、 3、 4所制備的支架植入術(shù)后l個月處死的 實驗犬，其支架部位全部被半透明新生內(nèi)膜覆蓋。
(2) 掃描電鏡觀察結(jié)果
①實施例2、 3、 4所制備的支架植入術(shù)后24小時處死的1只犬，于支架撐桿上 覆蓋有纖維蛋白、血小板和少量血細(xì)胞，支架撐桿附近的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量極少，而且內(nèi)
皮細(xì)胞的排列及結(jié)構(gòu)均被破壞。
②實施例2、 3、 4所制備的支架植入術(shù)后l個月處死的犬，其新生內(nèi)皮細(xì)胞的共 同特點是支架撐桿表面100%被新生內(nèi)膜覆蓋，但新生內(nèi)皮細(xì)胞在支架撐桿的不同 部位形狀和排列不同，在支架撐桿表面及其附近的內(nèi)皮細(xì)胞呈"鋪路石"樣，可見細(xì)胞 核部位突起和細(xì)胞表面的微絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞之間的間隙增大，在支架撐桿的直線走行 部位內(nèi)皮細(xì)胞的長軸沿血流方向排列，在弧線走行部位內(nèi)皮細(xì)胞呈"漩渦樣"排列，細(xì) 胞的長軸與血管長軸的關(guān)系不固定；遠(yuǎn)離支架撐桿部位的內(nèi)皮細(xì)胞呈"梭形"，可見細(xì) 胞核部位突起和細(xì)胞表面的微絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列較密集，長軸與血流方向一致。
3、植入實施例2、 3、 4所制備的支架后支架段血管平滑肌細(xì)胞及新生內(nèi)膜的變
化
(1) 透射電鏡觀察結(jié)果
植入實施例2、 3、 4所制備的支架后l個月處死的犬，新生內(nèi)膜中血管平滑肌細(xì) 胞數(shù)量相對較少，以膠原和細(xì)胞外基質(zhì)為主；其中，處于去分化狀態(tài)的"合成態(tài)"血管 平滑肌細(xì)胞比分化程度較好的"收縮態(tài)"血管平滑肌細(xì)胞少，"合成態(tài)"血管平滑肌細(xì)胞 的胞體大而致密、細(xì)胞核增大、胞漿內(nèi)線粒體和游離核糖體增多、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴 張和肌絲含量較少，而"收縮態(tài)"的血管平滑肌細(xì)胞胞體及核相對較小，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)、高爾基體、線粒體較少、肌絲含量比"合成態(tài)"血管平滑肌細(xì)胞多。
(2) 光鏡觀察結(jié)果
血管壁結(jié)構(gòu)和受壓程度的改變實施例2、 3、 4所制備的支架植入術(shù)后1個月， 血管壁三層結(jié)構(gòu)清晰(即內(nèi)膜、中膜和外膜)，非支架撐桿部位的內(nèi)彈力膜完整，部 分支架撐桿部位的內(nèi)彈力膜斷裂，均未見支架撐桿貼壁不良現(xiàn)象。在不同部位的支架 撐桿處，中膜和外面的受壓程度不同，85% 90%的支架撐桿部位中膜輕度受壓，而 外膜無受壓改變，相應(yīng)部位的新生內(nèi)膜增生程度較輕；10% 15%的支架撐桿部位中 膜中到重度受壓，相應(yīng)部位的外膜表現(xiàn)為輕度到中度受壓，該部位的新生內(nèi)膜增生程 度較受壓程度輕的部位明顯，總體趨勢是中膜和外膜的受壓程度越重則該部位新生內(nèi) 膜增生越明顯。
新生內(nèi)膜的細(xì)胞成分支架段血管的新生內(nèi)膜主要成分為平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基 質(zhì)；遠(yuǎn)離支架撐桿部位的細(xì)胞成份與支架撐桿部位的細(xì)胞成份基本相同。支架撐桿周
圍可見少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，偶見巨噬細(xì)胞，未見嗜酸性粒細(xì)胞。 上述實驗結(jié)果得出的結(jié)論
(1) 本實用新型的血管支架接觸血管壁一側(cè)的雷帕霉素涂層具有顯著的抑制支 架術(shù)后再狹窄的作用。
(2) 本實用新型的血管支架接觸血管腔一側(cè)的可表達hVEGF165的重組載體涂 層具有促進支架段血管內(nèi)皮化的作用。
(3) 涂層中所使用的可降解聚乳酸引起的支架段血管壁的炎癥反應(yīng)較輕。
(4) 本實驗結(jié)果還證明在同一枚裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂具有抗再狹窄作 用的雷帕霉素和支架接觸血管腔一側(cè)涂具有促進支架段血管內(nèi)皮化的可表達
hVEGF165的載體是安全可行的，而且能夠?qū)崿F(xiàn)我們最初的實用新型設(shè)想。
總之，通過動物實驗，發(fā)現(xiàn)本實用新型的血管支架在取得理想的抑制再狹窄作用 的同時具有促進支架段血管內(nèi)皮化的作用。
權(quán)利要求1、一種治療冠心病的血管支架，包括裸金屬支架和裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層，其特征是，所述血管支架還包括裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管支架，其特征在于所述裸金屬支架為不銹鋼血 管支架或鈷鉻合金血管支架。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血管支架，其特征在于所述裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層或所述裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層的厚度為5微米 10微米。
專利摘要本實用新型公開了一種治療冠心病的血管支架。該支架包括裸金屬支架和裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層，其特征在于，所述血管支架還包括裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層。所述裸金屬支架為不銹鋼血管支架或鈷鉻合金血管支架。所述裸金屬支架接觸血管壁一側(cè)涂層或所述裸金屬支架接觸血管腔一側(cè)涂層的厚度為5微米～10微米。本實用新型支架采用兩層涂層制作而成；使支架同時解決平滑肌細(xì)胞增殖、血管內(nèi)皮化延遲的一系列問題。
文檔編號A61F2/82GK201200505SQ20082007980
公開日2009年3月4日 申請日期2008年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月8日
發(fā)明者張玉霄, 王吉成 申請人:張玉霄;王吉成