專利名稱：：蝎源免疫調(diào)節(jié)多肽在治療多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種蝎源活性多肽BmKTX在治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：自身免疫性疾病(autoimmunedisease)機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導致自身組織損害所引起的疾病，即人體免疫系統(tǒng)攻擊自身的組織。全球約有5-8%的人口受到約40多種自身免疫性疾病的威脅。這些疾病涉及全身一種或多種組織和器官，嚴重影響人體健康及生命。針對自身免疫性疾病，目前無有效療法，且病情反復發(fā)作。目前常用對抗自體免疫性疾病的方法，一是利用類固醇來減緩因免疫系統(tǒng)攻擊組織所造成的炎癥反應(yīng)，二是使用免疫抑制藥物，抑制免疫系統(tǒng)的作用。不過，這兩種方法都會造成嚴重的副作用，而且都只能減緩病情的發(fā)展速度，非根治疾病。在自身免疫性疾病中，以T細胞介導為主的自身免疫性疾病包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞病、自身免疫性甲狀腺和病I型糖尿病等。這類疾病在影響著數(shù)百萬人的生命，針對這種人類難治疾病的發(fā)病機理，研發(fā)新型免疫抑制藥物已成為全球激烈競爭的領(lǐng)域之一。近年來，與疾病相關(guān)的T細胞上鉀通道Kvl.3被鑒定為治療自身免疫病的新耙標[/.C7/w.J請W"2003,111:1703;rmj<fe戶/ifl/7Wfla)tog/ca"c/e臟s,2004,25:280;Owri^flmi"es.2006,12(18):2199]，為搶奪未來巨大的藥物市場，現(xiàn)在國際上大制藥公司和大學科研機構(gòu)正掀起一輪以鉀通道Kvl.3為靶標的新藥研發(fā)熱潮。有機小分子藥物因價格低廉而成為研發(fā)的首選。到目前為止，Merck公司、澳大利亞WalterandElizaHall藥物研究技術(shù)中心、美國加利福利亞大學等機構(gòu)篩選、分離、合成、改造和鑒定了大量的有機小分子藥物候選物[rr朋^3尸力ar層o7。^/csJ5"ci認e51，2004,25:280;Mo厶iVifl,m腳/.,2004,65:1364;/離"fl/。/Aferf/"Vifl/Ore附/sfr，2006,49(4):1433jMo/.i^flf腳co/"2005,68:1254]。這些有機小分子藥物作用同源通道Kvl.1，Kvl.2，Kvl.4，Kvl.5等活性比Kv.1.3通道低2-70倍。這種作用不同鉀通道選擇性差、潛在的毒副反應(yīng)嚴重成為小分子藥物研發(fā)的致病缺點，這主要是有機小分子候選藥物作用Kvl.l-Kvl.7靶標區(qū)域的氨基酸殘基序列幾乎完全一致。與有機小分子耙點截然不同的是，多肽作用的靶區(qū)域呈現(xiàn)豐富的序列多樣性，這就決定了多肽藥物研發(fā)是必由之路。在靶向通道Kvl.3小分子藥物研發(fā)受阻情況下，國際上把眼光聚焦到鉀通道Kvl.3特異性動物毒素多肽抑制劑。中國傳統(tǒng)醫(yī)藥常用"以毒攻毒"的策略治療人類的疑難雜癥，有毒動物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等是首選。現(xiàn)代研究已表明這些有毒動物的毒液中富含動物毒肽多肽，這些多肽特異性作用細胞膜上離子通道。當今，靶特異性動物多肽毒肽已成為全球化研發(fā)/治療相關(guān)疾病重要藥物的資源(A^.及ev."r"g.i)/scov.20032:63)。當鉀通道KvL3逐步被認識到是治療自身免疫性疾病有效的藥物靶標過程中，以動物毒肽多肽為基礎(chǔ)的自身免疫調(diào)節(jié)新藥的篩選就成為了一個重要的研究方向。在各種有毒動物的天然毒素中，大部分高親和性的Kvl.3通道的抑制劑都來自于蝎源活性腺分泌的蝎源活性肽(jyrwdi尸Aflr附fl"/.200425:280，C"/r.戶Aa/w.Z)es.200612:2199)，這類多肽分子內(nèi)具有3-4對二硫鍵的結(jié)構(gòu)共性。美國加利福利亞大學和霍普金斯醫(yī)院正在聯(lián)合研發(fā)以海葵毒素多肽ShK為分子骨架的先導藥物[C"/rAfWO^m.2004:11:3041，Mo/./>/^wflco/.，2005,67(4):1369]。ShK是從海葵中分離到的3對二硫鍵的35殘基多肽，近兩年正通過多肽化學合成方法修飾和合成20多種ShK多肽的類似物。在2006年，成功地發(fā)現(xiàn)了ShK類似物(ShK-L5)可較好地治療風濕性關(guān)節(jié)炎和I型糖尿病(/WAS)2006，103:17414)，法國國家科學研究中心近年正在以通道Kvl.3特異性蝎源活性素多肽0SK1及A0SK1丄，2005,385:95;Mo/.尸/mr挑fla/.,2006,69:354]為分子骨架，設(shè)計和化學合成了30多種3對二硫鍵38個殘基類似多肽，加速新型免疫抑制多肽藥物研發(fā)。同有機小分子相比，靶向鉀通道Kvl.3的先導多肽藥物具有極高的特異性。如法國國家科學研究中心研發(fā)的A0SK1的IC50值為3pM，美國研發(fā)ShK多肽IC50值為16pM，而目前報道最好的有機小分子先導藥物的IC50值為3nM?？梢?，先導多肽藥物比有機小分子先導藥物的特異性提高了1000倍。同時，先導多肽藥物的選擇性也得到了極大提高。因此，潛在新型免疫抑制多肽藥物研發(fā)已成為治療T細胞介導自身免疫性疾病的新方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種蝎源活性多肽BmKTX在制備治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用。鉀通道Kvl.3已被鑒定為預(yù)防和治療T細胞介導自身免疫性疾病的耙標，在有機小分子藥物研發(fā)嚴重受挫情況下，目前美國、法國、澳大利亞等國家正在研發(fā)免疫抑制多肽藥物。本發(fā)明主要目的在于發(fā)現(xiàn)了一種蝎源活性多肽在作為制備治療或預(yù)防自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施制備了基因工程蝎源活性多肽BmKTX。將含有蝎源活性多肽BmKTX基因的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3(購自Novagen公司)。對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌IPTG(購自Merck公司)。誘導培養(yǎng)后收集菌體，超聲波破碎細菌并通過GST親和層析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再經(jīng)脫鹽濃縮、小腸激酶(EK)酶切、色譜分離，獲得重組蝎源活性多肽BmKTX(別oc/^附/s^v199736:13473)。通過膜片鉗技術(shù)鑒定蝎源活性多肽BmKTX對鉀通道Kvl.3的藥理學活性。重組蝎源活性多肽BmKTX可特異性抑制鉀通道Kv1.3電流，它IC50值為100pM，藥理學數(shù)據(jù)表明蝎源活性多肽BmKTX可特異性作用自身免疫疾病的耙標鉀通道Kvl.3。蝎源活性多肽BmKTX在作為制備治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥的藥物中的用途。選取近交系雌性Wistar大鼠(6-8周齡,體重150士10g)，豚鼠(300-400g購自武漢大學實驗動物中心)。主要試劑福氏完全佐劑(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)，豚鼠MBP(Sigma)。GPSCH-CFA(全脊髓勻漿-福氏完全佐劑混合乳劑)的配制將豚鼠處死后，迅速取出脊髓，用超聲破碎儀5(Sonics&MaterialsInc,America)制成50。/。的PBS勻漿，與等量的福氏完全佐齊U(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳劑。EAE的誘導Wistar大鼠EAE模型Wistar大鼠雙后腿足墊皮內(nèi)注射0.4mlGPSCH-CFA乳劑，或同時皮內(nèi)注射約1X10"'百日咳疫苗。每日稱重,觀察神經(jīng)癥狀。飼養(yǎng)2周即出現(xiàn)實驗性自身免疫性腦脊髓炎。然后將實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠隨機分為模型鼠+生理鹽水10只(模型陰性對照組)；模型鼠+多肽藥物10只；另設(shè)正常對照組10只(陰性對照組)。給藥組按15(Vgkg—'劑量皮下注射，每天上午l次；模型陰性對照組和陰性對照組皮下注射等量生理鹽水；連續(xù)給藥。給藥21天后，觀察大鼠患實驗性自身免疫性腦脊髓炎狀況。評分標準為O分:無任何臨床癥狀；l分尾部張力消失；2分后肢無力；3分后肢完全癱瘓；4分四肢癱瘓或瀕死狀態(tài)。實驗結(jié)果表明在沒有藥物治療情況下，模型陰性對照組得分最高(35分/10只)；多肽藥物BmKTX治療后，大鼠的癥狀得到顯著改善，得分為14分/10只，由此可見，蝎源活性BmKTX多肽能有效地治療多發(fā)性硬化癥?？梢?，本發(fā)明具有如下特點(l)特異性強。蝎源活性多肽BmKTX作用藥物靶標鉀通道Kvl.3的IC50值為102pM，是目前國際上已發(fā)現(xiàn)的活性強的多肽藥物；(2)藥物效果顯著。動物實驗表明，重組BmKTX多肽可以有效治療多發(fā)性硬化癥。(3)毒副作用小。動物實驗中，蝎源活性多肽BmKTX未對實驗動物造成明顯的毒性和副作用。圖1為重組蝎源活性多肽BmKTX及其融合表達蛋白GST-BmKTX的電泳檢測分析示意圖1為rBmKTX未經(jīng)IPTG誘導的全細胞蛋白；2為rBmKTX經(jīng)IPTG誘導的全細胞蛋白；3為超濾脫鹽濃縮后的融合蛋白GST-BmKTX;4為融合蛋白GST-BmKTX經(jīng)EK酶切后的產(chǎn)物5為經(jīng)HPLC分離純化得到的rBmKTX多肽。圖2為重組蝎源活性多肽BmKTX與GST蛋白質(zhì)的色譜分離純化示意圖圖3為不同濃度BmKTX多肽對鉀通道Kvl.3電流的抑制示意圖圖4為重組多肽BmKTX抑制鉀通道Kvl.3電流的濃度依賴性示意圖具體實施方式實施例l:重組蝎源活性多肽BmKTX的表達和純化將含有蝎源活性多肽BmKTX基因的表達載體質(zhì)粒pGEX-6p-l-BmKTX(由購自安瑪西亞公司的表達載體pGEX-6p-l插入了編碼BmKTX的基因序列構(gòu)建而成，5&c/^肌/.2000346:805-809)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3。對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌IPTG誘導培養(yǎng)后收集菌體，超聲波破碎細菌并通過GST親和層析得到融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再經(jīng)脫鹽濃縮、小腸激酶(EK)酶切、色譜分離，獲得重組蝎源活性多肽BmKTX。通過高壓液相色譜對BmKTX多肽進一步分離，去除GST蛋白質(zhì)，得到色譜純BmKTX多肽(圖2)，對不同階段得到的BmKTX多肽及其與GST融合蛋白進行了PAGE電泳檢測(圖1)。實施例2:重組蝎源活性多肽BmKTX對鉀通道Kvl.3靶標的藥理學活性分析將COS-7細胞在含10。/。的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，將鉀通道Kvl.3重組質(zhì)粒用Sofast的轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細胞在0.8mg/mlGeneticin培養(yǎng)基上選擇性培養(yǎng)。利用全細胞膜片鉗用儀器(EPC-10雙通道膜片鉗放大器HEKA,Elektronik,Lambrecht,Germany),對重組蝎源活性多肽BmKTX的藥理學活性進行測定和分析。實驗參數(shù)的設(shè)置、數(shù)據(jù)的采集和刺激的施加均通過Pulse軟件(Elektronik，L咖brecht,Germany)來控制。儀器的濾波器設(shè)置為10kHz(Bessel)，電極阻抗為2-5MQ,在電極與細胞膜之間形成高阻(1-5GQ)封接后，進行快電容自動補償(c-fast)，稍加負壓破膜后，進行慢電容自動補償(c-slow)，在-70mV的鉗制電位下，從-60mV起給予10mV步幅遞增、80ms步寬的去極化脈沖刺激至+50mV，觀察電流情況，BmKTX多肽通過MPS-2(INBIOInc,Wuhan,China)灌注系統(tǒng)實現(xiàn)精確灌注。將蝎源活性多肽BmKTX溶解后，經(jīng)DAD給藥系統(tǒng)(ALA)噴射給藥，給藥管尖端距記錄細胞100pm左右。BmKTX對鉀通道Kv1.3的藥理學活性為102pM(圖3和圖4)。實施例3:蝎源活性多肽BmKTX在作為制備治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用。選取近交系雌性Wistar大鼠(6-8周齡，體重150土10g)，豚鼠(300-400g購自武漢大學實驗動物中心)。主要試劑福氏完全佐劑(Gibcol/BRL)，卡介苗、百日咳疫苗(上海生物制品所)，豚鼠MBP(Sigma)。GPSCH-CFA(全脊髓勻漿-福氏完全佐劑混合乳劑)的配制將豚鼠處死后，迅速取出脊髓，用超聲破碎儀(Sonics&MaterialsInc,America)制成50。/。的PBS勻漿，與等量的福氏完全佐劑(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳劑。EAE的誘導Wistar大鼠EAE模型Wistar大鼠雙后腿足墊皮內(nèi)注射0.4tnlGPSCH-CFA乳劑，或同時皮內(nèi)注射約1X10'"百日咳疫苗。每日稱重，觀察神經(jīng)癥狀。飼養(yǎng)2周即出現(xiàn)實驗性自身免疫性腦脊髓炎。然后將實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠隨機分為模型鼠+生理鹽水10只(模型陰性對照組)；模型鼠+多肽藥物10只；另設(shè)正常對照組10只(陰性對照組)。給藥組按15(^gkg—'劑量皮下注射，每天上午l次；模型陰性對照組和陰性對照組皮下注射等量生理鹽水；連續(xù)給藥。給藥21天后，觀察大鼠患實驗性自身免疫性腦脊髓炎狀況。評分標準為O分:無任何臨床癥狀；l分尾部張力消失；2分后肢無力；3分后肢完全癱瘓；4分四肢癱瘓或瀕死狀態(tài)。打分結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實驗結(jié)果表明在沒有藥物治療情況下，模型陰性對照組得分最高(35分/10只)；多肽藥物BmKTX治療后，大鼠的癥狀得到顯著改善，得分為14分/10只，由此可見，蝎源活性BmKTX多肽能有效地治療多發(fā)性硬化癥。權(quán)利要求1、一種蝎源活性多肽BmKTX在制備治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種蝎源活性多肽BmKTX在制備治療或預(yù)防多發(fā)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用。通過基因工程生產(chǎn)重組蝎源活性多肽BmKTX。該多肽藥物具有如下特點(1)特異性強。蝎源活性多肽BmKTX作用藥物靶標鉀通道Kv1.3的IC50值為102pM，是目前國際上已發(fā)現(xiàn)的活性強的多肽藥物；(2)藥物效果顯著。動物實驗表明，重組BmKTX多肽可以有效治療大鼠的多發(fā)性硬化癥。(3)毒副作用小。動物實驗中，蝎源活性多肽BmKTX未對實驗動物造成明顯的毒性和副作用。本發(fā)明方法簡單易行，操作方便。文檔編號A61P43/00GK101422600SQ200810236670公開日2009年5月6日申請日期2008年12月4日優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日發(fā)明者吳英亮,曹志賤,李文鑫,松韓申請人:武漢莫爾元藥科技有限公司