專利名稱：煤礦酸性礦井水底泥dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA的提取與純化，具體涉及煤礦酸性礦井水底泥DNA提取方法，屬 于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煤礦在開采過程中，因含煤地層中所含硫化物(主要為黃鐵礦)的賦存環(huán)境變化而自發(fā) 進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，可導(dǎo)致產(chǎn)生酸性礦排水。酸性礦排水具有低pH值和較高的礦化度特 征，有很強(qiáng)的溶解性和侵蝕性，這種礦排廢水能攜帶大量的重金屬及有害化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入環(huán) 境。煤礦酸性廢水中的一些有害物質(zhì)還會(huì)在河流底泥中沉積，底泥中各種污染物長時(shí)間釋 放同樣又會(huì)影響下游水體的水質(zhì)。目前對(duì)煤礦酸性廢水影響河流水質(zhì)方面進(jìn)行了較多的研 究。
微生物對(duì)煤礦酸性廢水中的一些有害物質(zhì)可以產(chǎn)生吸附、轉(zhuǎn)化、降解、富集等作用， 目前微生物分子生態(tài)學(xué)微生物分子生態(tài)學(xué)作為分子生物學(xué)與微生物生態(tài)學(xué)交叉而形成的 學(xué)科，在環(huán)境科學(xué)方面廣泛應(yīng)用。分子生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以了解微生態(tài)系統(tǒng)中微生物群體 結(jié)構(gòu)、多樣性及其功能相關(guān)性，了解體系中微生物具有的重要作用，從而進(jìn)一步利用生物 強(qiáng)化手段，處理還擊污染問題。目前，煤礦酸性廢水底泥的微生態(tài)研究很少，主要原因是 國外DNA提取試劑盒價(jià)格昂貴，采用自配試劑又難以脫除底泥中的PCR (DNA聚合酶鏈 式反應(yīng))抑制因子(如腐殖酸等)，且不能對(duì)微生物宏基因組DNA完整提取，不能完整了 解煤礦酸性廢水底泥微生物的群落結(jié)構(gòu)。目前有關(guān)DNA提取的專利有公開號(hào) CN1401782， CN1420124， CN1簡39， CN101148664, C畫1173274， C廳1230342等。 國外DNA提取相關(guān)專利有IPC: C12Q1/68; C12Q1/68; IPC: C12M1/18; C12Q1/68; C12M1/16; (+1)， IPC: A61K39/04; C12N1/21; C12P21/00; (+5)等。
本專利是提供一種采用助劑洗脫微生物，膜過濾，細(xì)菌裂解的微生物DNA提取方法， 本方法未見報(bào)道。利用本專利，可以加深對(duì)煤礦酸性廢水底泥的微生態(tài)了解，有助于對(duì)煤 礦酸性廢水中一些有害物質(zhì)進(jìn)行原位生物處理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是應(yīng)用生物化學(xué)，分子生物學(xué)技術(shù)，提供一種能夠高效提取純化煤礦酸 性礦井水底泥DNA的方法，以解決常規(guī)DNA提取試劑盒對(duì)煤礦酸性礦井水底泥DNA提取效率不高，必須進(jìn)行DNA后續(xù)純化工作并且提取產(chǎn)物腐殖酸類物質(zhì)較多，影響后續(xù)的 PCR等分子生物學(xué)操作的問題，以便更好的應(yīng)用于煤礦酸性礦井水底泥多樣性的分子生態(tài) 學(xué)研究。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的。 本發(fā)明為煤礦酸性礦井水底泥DNA的提取與純化方法，具體方法為
1. 煤礦酸性礦井水底泥微生物樣品的收集
收集煤礦酸性礦井水底泥樣品加入洗脫液，加入含有吐溫(吐溫80或40)pH 5.0-7.0 的磷酸緩沖洗脫液，37'C恒溫振蕩30分鐘，超聲波振蕩5分鐘，低轉(zhuǎn)速離心，大量 菌體留于上清中。
2. 膜過濾收集菌體0.5 Mm膜過濾上清，菌體停留于膜上。
3. DNA的提取
帶膜菌體加入裂解緩沖液(100-200 mM Tris-HCl [pH 8.0]， 50-100 mM EDTA [pH 8.0], 50-100 mM sodium phosphate [pH 8.0], 1.0-1.8 M NaCl)，同時(shí)加入蝸牛酶，溶菌 酶，使其終濃度均在10ng/ml-100ng/ml。 37'C恒溫振蕩20-60分鐘，再加入蛋白酶K， 使其終濃度均在1 Ong/ml-100ng/ml ， 37°C恒溫振蕩20-60分鐘，取出加入SDS溶液， 使SDS終濃度為0.4-1.2%， 6(TC恒溫30-60分鐘，每十分鐘劇烈震蕩30秒。加入等 體積氯仿異戊醇(V/V24: l)于提取液中，6000-8000g離心5-20分鐘，吸取上清。 加入三分之二體積異丙醇室溫15-30。C靜置2-6小時(shí)，10000-12000g離心10-20分鐘， 棄上清，70%乙醇洗滌兩次，無菌環(huán)境下千燥。
具體實(shí)施例方式
1. 煤礦酸性礦井水底泥樣品中微生物的收集
選定煤礦酸性礦井水底泥位點(diǎn)，五點(diǎn)取樣法取煤礦酸性礦井水底泥，加入100 ml 含有吐溫(吐溫80或40) pH 5.0-7.0的磷酸緩沖洗脫液，37'C恒溫振蕩器振蕩 30分鐘，超聲波振蕩6分鐘，每隔兩分鐘拿出劇烈搖勻，收集超聲波振蕩后的懸 濁液，1000 g離心10分鐘，收集上清。
2. 膜過濾菌體 0.5pm膜減壓抽濾，收集膜。
43. 破裂細(xì)胞
加入4. 5mL裂解緩沖液，20^L 20mM蝸牛酶，20pL 20mM溶菌酶，37°C， 250rpm恒溫振蕩30分鐘，取出加入20^iL20mM Proteinase K， 37°C， 250rpm恒溫 重新振蕩30分鐘，加入0.5 mL 20% SDS(十二垸基磺酸鈉)，60'C超級(jí)恒溫水浴鍋 水浴一個(gè)小時(shí)，每10分鐘取出在漩渦振蕩器上劇烈震蕩30秒，得到細(xì)胞裂解液。
4. DNA提取
將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入20 mL離心管，同時(shí)加入5mL分析純氯仿，8000g離心10分 鐘，取出水相，重復(fù)上次操作，注意不要引入水相與有機(jī)相界面上的蛋白沉淀。在第 二次離心所得水相中加入三分之二體積分析純異丙醇，室溫(25°C)靜置兩個(gè)小時(shí)， 10000g離心二十分鐘，棄上清，5mL70。/。乙醇洗滌兩次，無菌風(fēng)吹干，一20。C冷凍保 存
5. 瓊脂糖凝膠電泳測定
上步所得DNA融解于200 pL滅菌超純水中，5 加入0.7%瓊脂糖凝膠(含有0. 4 -0.5 ug/ml溴化乙啶)，5V/cm電泳30分鐘，檢測DNA濃度。
6. 微生物群落測定
選擇細(xì)菌V3區(qū)通用引物R518(5， ATTACCGCGGCTGCTGG 3，)與F357GC(5' CGCCCGCCGC
GCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 3 ， ) ， PCR體系為IX PCR buffer, 2. 5mM MgCU 200幽每種dNTP， 20 pmol R518與F357GC, 2. 5 units TaKaRa Taq DNA polymerase, lOng DNA。 PCR反應(yīng)程序92。C4 min; 92°C 1 min, 50°C30秒，72'C 2分鐘共30個(gè)循環(huán)，最后延伸10分鐘。36pLPCR產(chǎn)物中加入 lOXLoading buffer(0. 05%溴酚蘭，0.05%二甲苯青，70y。甘油)4pL， 10 V/M DGGE 電泳10小時(shí)，取出聚丙烯酰胺凝膠，50ug/ml溴化乙啶溶液染色10分鐘，超純 水脫色10分鐘，紫外照相，無菌條件下切下不同條帶，送至上海生工生物工程技 術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序引物為R518 ，將測定序列在 http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/上的Genbank中查詢，即可知道煤礦酸性礦井水底 泥內(nèi)微生物群落中所包含微生物種類。
權(quán)利要求
1.一種煤礦酸性礦井水底泥DNA提取方法，本發(fā)明的特征在于a.煤礦酸性礦井水底泥微生物樣品的收集；b.膜過濾收集菌體；c.DNA的提取。
2. 權(quán)利要求1所述的煤礦酸性礦井水底泥微生物樣品的收集，其特征在于含有吐溫(吐 溫80或40)的磷酸緩沖洗脫液通過振蕩，超聲波處理將菌體充分從土壤顆粒上洗脫 下來。
3. 權(quán)利要求l所述的煤礦酸性礦井水底泥微生物樣品的膜過濾，其特征在于采用微濾技術(shù)，膜孔徑為0.5-1.0pm。
全文摘要
本發(fā)明涉及煤礦酸性礦井水底泥微生物樣品DNA的提取的方法。本發(fā)明利用緩沖液洗脫，超聲波振蕩和膜過濾收集菌體，裂解細(xì)胞從而提取DNA。所提DNA不用經(jīng)過純化即可應(yīng)用于PCR擴(kuò)增、DGGE、TRFLP等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)煤礦酸性礦井水底泥微生物群落進(jìn)行分析。該方法簡單，快速，并且能夠真實(shí)反映煤礦酸性礦井水底泥中不同微生物群體的多樣性。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101648985SQ200810231369
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者劉道偉, 燁 吳, 崔樹軍, 廉有軒, 張慶甫, 張建云, 武秀琴, 谷立坤, 趙保生, 金維平 申請(qǐng)人:河南工程學(xué)院