專利名稱：：刺山柑提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及天然藥物化學(xué)，具體涉及刺山柑提取物及其制備方法和在制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性炎、肩周炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：刺山柑(Cfl/7戸nh/7/"cw"L.)又稱老鼠瓜、野西瓜、槌果藤，維語稱"波里克果"或"卡盤"，為白花菜科(Capparidaceae)山柑屬藤本植物，是荒漠、半荒漠、干旱、半干旱地區(qū)極有栽培價值的抗旱植物。該植物主要分布于歐洲、北美、大洋洲、亞洲西部，我國新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、西藏等省區(qū)均有分布。中國沙區(qū)僅產(chǎn)l屬l種，新疆各沙區(qū)有分布，以吐魯番盆地沙漠最多。新疆維吾爾族民間常用其鮮果搗碎貼敷治療關(guān)節(jié)炎和肩周炎等疾病，其根皮已收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(WS^BW-0050-98)。在位于環(huán)地中海及西亞的一些國家，如土耳其、意大利、西班牙、摩洛哥、伊朗等，刺山柑的花蕾被用作烹飪的香料。作為傳統(tǒng)藥，對刺山柑屬植物化學(xué)成分的系統(tǒng)研究始于20世紀(jì)50年代，迄今報(bào)道的山柑屬的化學(xué)成分主要有硫苷類、黃酮類、生物堿類、有機(jī)(酚)酸類、揮發(fā)油及多糖類等。其藥理活性主要包括有抗肝毒素作用、抗高血糖作用、降血脂作用、抑菌作用、軟骨細(xì)胞保護(hù)作用及抗腫瘤作用等。刺山柑也被用于利尿、抗高血壓、外敷治療關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)壯制劑。"野西瓜果實(shí)的化學(xué)成分研究"[哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2005，21(6):684-686]和文獻(xiàn)"lH-Indole-3acetonitrileglycosidesfromCfl[p戸r/515/7Zwosafruits"[Phytochemistry，1999，50:1205-1208]等文獻(xiàn)報(bào)道，從刺山柑果實(shí)中分離得到6-Hydroxy陽12-carboxy-blumeno1A-D-glucopyranoside、1H』引哚-3-乙腈4-0-卩-葡萄糖苷、(6S)-Hydroxy-3-OXO-a-iono1、3-醛基吲哚、腺苷、次黃嘌呤核苷、對苯甲酸鼠李糖醇苷、蔗糖、P-谷甾醇和胡蘿卜苷等成分。文獻(xiàn)"刺山柑化學(xué)成分的研究"[中草藥，2007，38(4):510-512]從刺山柑果實(shí)中分離得到漢黃芩素(wogonin)、千層紙素A(oroxylinA)、山柰酚(kaempferol)、開菜素(apigenin)、苯甲酸(benzoicacid)、對夢5基苯甲酸(p-hydroxy陽benzoicacid)、對羥基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde)、|3-谷甾醇(^-sitosterol)、|3-胡蘿卜苷((3-daucosterol)等化學(xué)成分。中國專利200610118369.8公開了一種從刺山柑藥用部位中獲得提取物及其應(yīng)用，該方法包括將刺山柑藥用部位粉碎，加熱回流，冷浸或滲漉提取，減壓濃縮，得到粗提物，將粗提物先用石油醚脫酯，其特征在于脫脂后的殘余物用氯仿萃取，得到提取物。該提取物含有P-谷甾醇、P-谷甾醇葡萄糖苷和l-氫-3-乙腈基-4-甲氧基-吲哚。含有以上3種成分的提取物對治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及肩周炎顯示良好的效果。中國專利200310113957.9公開了一種從植物槌果藤實(shí)中提取抗關(guān)節(jié)炎有效部位的方法，將槌果藤實(shí)原料粉碎，用50-90%的乙醇或甲醇加熱回流提取，減壓濃縮，得到粗提物，將粗提物用石油醚脫脂，殘余物用乙酸乙酯和正丁醇體系洗脫，分別得到含有一種或幾種棕櫚酸或咖啡酸、咖啡醛或原兒茶醛的乙酸乙酯和正丁醇有效部位。該有效部位具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抑制免疫的作用，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)及肩周炎疾病。但是，專利200610118369.8和200310113957.9在對化學(xué)成分方面的研究不夠深入，本發(fā)明對制備得到的3種提取物中治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)及肩周炎疾病的成分進(jìn)行了深入的研究，對其有效成分的基礎(chǔ)有比較清楚的認(rèn)識，并從中發(fā)現(xiàn)了5個新的化學(xué)成分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究刺山柑提取物，以及使用溫和環(huán)保的方法和溶劑系統(tǒng)制備刺山柑提取物的方法。本發(fā)明提供一種刺山柑提取物。本發(fā)明提取物包括提取物l、2和3。本發(fā)明的提取物1包括下列成分刺山柑堿A(1，capparisineA)、刺山柑酸(2，capparisideA)、刺山柑堿B(3，capparisineB)、朿lj山柑堿C(4，capparisineC)、朿[J山柑堿D(5，capparisineD)、對羥基苯甲酸(6，4-hydroxybenzoicacid)、原兒茶酸(7，protocatechuicacid)、香草酸(8，vanillicacid)、原JL醛(9，protocatechuicaldehy)、丁香酸(IO，syringicacid)、3,4-二羥基苯甲酸(11，3，4-dihydroxybenzoate)、反式丁烯二酸(12，E-butenedioicacid)、乙二酸(13，succinicacid)、5-15甲基糠醛(14，5-hydroxymethylfUrfUral)、5-羥甲基糠酸(15，5-hydroxymethylfiiroieacid)、2-糠酸(16，2-foroicacid)、二氫-4羥基-5-羥甲基-2(3H)呋喃酮(17，4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)dihydrofioraii-2(3H)-one)、7-hydroxy-2-oxoindolin-3-ylaceticacid(18)、尿B^、啶(19，uracil)、L-內(nèi)消旋肌醇(20，mesoinositol)、尿苷(21，uridine)、山萘酚蕓香苷(22，kaempferol陽3國0-rutinoside)、p-胡蘿卜苷隱6'-硬脂酸酯(23，p-sitosterylglucoside-6'-octadecanoate)、corchoionosideC(24)、spionosideB(25)、白花菜苷(26，glucocapperin)、p-谷甾醇(27，p-sitosterol)、p-胡蘿卜苷(28，p-daucosterol)、戸丁(29，rutin)、B引哚-3-甲醛(30，lH-indole-3-carbaldehyde)，其中包括5個新化合物，即化合物l、2、3、4和化合物5。本發(fā)明的提取物2包括下列化學(xué)成分化合物6，7，8，9，10，11，12，13，17,18,19，22，23，25，27，28，29，30等18個化合物。本發(fā)明的提取物3包括下列化學(xué)成分化合物l，2，3，4，5，14，15，16，20，21，24和26等12個化合物，其中化合物l，2，3，4，5為新化合物。本發(fā)明的另一目的是提供一種刺山柑提取物的制備方法。該方法包括下列步驟(1)將刺山柑藥材粉碎，用藥材510倍W/W水煎煮23次，或用藥材58倍W/W的乙醇(5095%)加熱回流提取23次，合并各次提取液；；(2)水煎液的濃縮液，加入乙醇(使溶液中含醇量為6080%)沉淀雜質(zhì)，醇沉2次，除去沉淀，上清液減壓濃縮(溫度5080。C，壓力0.080.1MPa)，回收乙醇后得濃縮液(密度1.03-1.1);或?qū)⒉襟E(1)的乙醇提取液減壓濃縮(溫度508(TC，壓力0.080.1MPa)，得濃縮液(密度1.03-1.1);(3)濃縮液經(jīng)減壓干燥(溫度5080。C，壓力0.080.1MPa)或冷凍干燥后得粗提取物l;(4)粗提取物1用粗提取物13倍量W/W水，分散溶解后，用11.5倍量V/V石油醚脫酯23次，用11.5倍量V/V乙酸乙酯萃取經(jīng)脫酯后的水溶液23次，得乙酸乙酯部分和水溶性部分，這兩部分液體分別經(jīng)減壓濃縮(溫度3050°C，壓力0.080.1MPa)后，再經(jīng)減壓(真空)或冷凍干燥后，制成乙酸乙酯提取物2和水溶性部位提取物3。本發(fā)明的提取物1、提取物2和提取物3均具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛活性，抗炎活性的強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛∥?〉提取物3〉提取物1;中樞性鎮(zhèn)痛活性的強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛∥?》提取物1〉提取物3，而外周性鎮(zhèn)痛活性的強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛∥?》提取物1>提取物2?；瘜W(xué)成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定乙酸乙酯提取物2(60g)經(jīng)硅膠(200300目)柱分離，以二氯甲烷一丙酮(100:o5:i)，再用二氯甲垸一丙酮(20:io:ioo)依次沖洗，將分得的樣品經(jīng)合并后得到10個部分A110。將A2，A3，A4和A5采用拌樣法上硅膠(200300目)柱，石油醚—乙酸乙酯(5:1)洗脫，分別分離得到化合物6，7，8，9。A6部分采用拌樣法上硅膠(200300目)柱，以石油醚一乙酸乙酯(5:1)洗脫，再經(jīng)反復(fù)柱層析和重結(jié)晶，得到化合物10，11，12，13，14，17，18和19。另外，A7部分采用硅膠柱層析，以二氯甲院一甲醇(15:1)洗脫，再經(jīng)反復(fù)柱層析得到化合物22，23和25。A7部分采用硅膠柱層析，以二氯甲烷一甲醇(10:1)洗脫，再經(jīng)反復(fù)柱層析得到化合物17，28，29。水溶性提取物3(ioog)上c-i8反相柱，以甲醇-水(o:i，i:3，1.5:i，和95:5)洗脫，分別得到B1B4個部分，其中B2再經(jīng)硅膠柱色譜、SephadexLH-20，ODS柱色譜分離純化，得到化合物14，15，16，20，21，26。B3經(jīng)硅膠柱色譜、SephadexLH-20，ODS柱色譜分離純化，得到化合物24，1，2，3，4，5。其中化合物1，2，3，4，5為新化合物。30種化合物的結(jié)構(gòu)式如下:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>30種化合物的波譜數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>本發(fā)明的另一目的是提供刺山柑提取物所述的1、2和3提取物在制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性炎、肩周炎藥物中的應(yīng)用。通過本發(fā)明方法得到的刺山柑提取物，經(jīng)藥效實(shí)驗(yàn)證明具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎活性。可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)及肩周炎疾病。并經(jīng)急性毒性試驗(yàn)證明，該提取物毒性很低。本發(fā)明的提取物1、提取物2和提取物3均具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛活性，抗炎活性的強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛∥?〉提取物3>提取物1;中樞性鎮(zhèn)痛活性的強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛∥?》提取物1〉提取物3，而外周性鎮(zhèn)痛活性的強(qiáng)弱順序?yàn)樘崛∥?》提取物1〉提取物2。本發(fā)明的剌山柑提取物可與藥用輔料制成片劑、膠囊劑、膏劑(巴布劑)、涂膜劑、噴劑等。圖l.刺山柑果實(shí)不同提取部位對小鼠痛閾提高百分率橫坐標(biāo)痛閾提高百分率(％)豎坐標(biāo)時間(分鐘)具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:取刺山柑干燥果實(shí)，粉碎，稱取11.5kg，用95%乙醇加熱回流提取3次，每次3h，第一次7倍量95%乙醇，后兩次均為5倍量溶劑。合并回流液，減壓回收溫度5080。C，壓力0.080.1MPa)至濃浸膏(比重為1.1L4)，冷凍干燥，得粗提取物干膏(2.40kg)。粗提物用水(1~4倍)分散溶解后用石油醚(1~4倍)萃取23次，減壓濃縮(溫度306(TC，壓力0.08t).1MPa)，冷凍干燥，得石油醚提取物(100g)。然后用乙酸乙酯(1~4倍)萃取，經(jīng)減壓濃縮(溫度306(TC，壓力0.08-0.1MPa)后再經(jīng)冷凍干燥后，分別制成乙酸乙酯提取物2(60g)和水溶性活性部位提取物3(1.81kg)。實(shí)施例2:取刺山柑干燥果實(shí)，粉碎，稱取11.5kg，用85%乙醇加熱回流提取3次，每次3h，第一次7倍量85%乙醇，后兩次均為5倍量溶劑。合并回流液，減壓回收溫度5080。C，壓力0.080.1MPa)至濃浸膏(比重為1.1-1.4),冷凍干燥，得粗提取物干膏(2.45kg)。粗提物用水(1~4倍)分散溶解后用石油醚(1~4倍)萃取23次，減壓濃縮(溫度3060。C，壓力0.080.1MPa)，冷凍干燥，得石油醚提取物(103g)。然后用乙酸乙酯(1~4倍)萃取，經(jīng)減壓濃縮(溫度3060。C，壓力0.080.1MPa)后再經(jīng)冷凍干燥后，分別制成乙酸乙酯提取物(64g)和水溶性活性部位提取物(1.9kg)。上述粗提物、乙酸乙酯提取物和水溶性活性部位提取物含有所述刺山柑堿A(CapparisineA)等30種化學(xué)成分。實(shí)施例3:取刺山柑干燥果實(shí)，粉碎，稱取11.5kg，用80%乙醇加熱回流提取3次，每次3h，第一次7倍量80%乙醇，后兩次均為5倍量溶劑。合并回流液，減壓回收溫度5080'C，壓力0.080.1MPa)至濃浸膏(比重為1.1~1.4)，冷凍干燥，得粗提取物干膏(2.5kg)。粗提物用水(1~4倍)分散溶解后用石油醚(1~4倍)萃取23次，減壓濃縮(溫度306(TC，壓力0.080.1MPa)，冷凍干燥，得石油醚提取物(106g)。然后用乙酸乙酯(1~4倍)萃取，經(jīng)減壓濃縮(溫度3060。C，壓力0.080.1MPa)后再經(jīng)冷凍干燥后，分別制成乙酸乙酯提取物(66g)和水溶性活性部位提取物(1.87kg)。上述粗提物，乙酸乙酯提取物和水溶性活性部位提取物含有所述刺山柑堿A(CapparisineA)等30種化學(xué)成分。實(shí)施例4:取刺山柑干燥果實(shí)，粉碎，稱取11.5kg，用60%乙醇加熱回流提取3次，每次3h，第一次7倍量60%乙醇，后兩次均為5倍量溶劑。合并回流液，減壓回收(溫度5080。C，壓力0.080.1MPa)至濃浸膏(比重為1.1-1.4)，冷凍干燥，得粗提取物干膏(2.6kg)。粗提物用水(1~4倍)分散溶解后石油醚(1~4倍)萃取23次，減壓濃縮(溫度5080°C，壓力0.080.1MPa)，冷凍干燥，得石油醚提取物(113g)。然后用乙酸乙酯(1~4倍)萃取，經(jīng)減壓濃縮(溫度3060。C，壓力0.080.1MPa)后再經(jīng)冷凍干燥后，分別制成乙酸乙酯提取物(69g)和水溶性活性部位提取物(1.96kg)。上述粗提物、乙酸乙酯提取物和水溶性活性部位提取物含有所述刺山柑堿A(CapparisineA)等30種化學(xué)成分。實(shí)施例5:取刺山柑干燥果實(shí)，粉碎，稱取11.5kg，用水加熱煎煮提取3次，每次3h，第一次7倍量水，后兩次均為5倍量溶劑。過濾后合并煎煮液，減壓(溫度5080°C，壓力0.080.1MPa)濃縮至濃浸膏(比重1.1-1.2)，加入乙醇使含醇量達(dá)到65%以上，靜置冷藏12h，過濾，濾液減壓(溫度5080。C，壓力0.080.1MPa)濃縮到稠膏(比重1.3-1.4)，冷凍干燥，得粗提物干膏(2.8kg)。粗提物用水(1~4倍)分散溶解后用石油醚(1~4倍)萃取23次，減壓濃縮(溫度3060°C，壓力0.080.1MPa)，冷凍干燥，得石油醚提取物(117g)。然后用乙酸乙酯(1~4倍)萃取，經(jīng)減壓濃縮(溫度3060。C，壓力0.080.1MPa)后再經(jīng)冷凍干燥后，分別制成乙酸乙酯提取物(70g)和水溶性活性部位提取物(2.20kg)。上述粗提物、乙酸乙酯提取物和水溶性活性部位提取物含有所述刺山柑堿A(CapparisineA)等30種化學(xué)成分。實(shí)施例6乙酸乙酯提取物2(60g)經(jīng)硅膠(200300目)柱分離，以二氯甲烷-丙酮(ioo:o5:i)，再用二氯甲垸-丙酮(20:io:100)依次沖洗，將分得的樣品經(jīng)合并后得到10個部分A110。將A2，A3，A4和A5采用拌樣法上硅膠(200300目)柱，石油醚-乙酸乙酯(5:1)洗脫，分別分離得到化合物6，7，8，9。A6部分采用拌樣法上硅膠(200300目)柱，以石油醚-乙酸乙酯(5:1)洗脫，再經(jīng)反復(fù)柱層析和重結(jié)晶，得到化合物IO，11，12，13，14,17，18和19。另外，A7部分采用硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇(15:1)洗脫，再經(jīng)反復(fù)柱層析得到化合物22，23和25。A7部分采用硅膠柱層析，以二氯甲垸-甲醇(10:1)洗脫，再經(jīng)反復(fù)柱層析得到化合物17，28，29。水溶性提取物3(ioog)上c-i8反相柱，以甲醇-水(o:i，i:3，1.5:i，禾n95:5)洗脫，分別得到Bl4個部分，其中B2再經(jīng)硅膠柱色譜、SephadexLH-20,ODS柱色譜分離純化，得到化合物15，14，16，20，21，26。B3經(jīng)硅膠柱色譜、SephadexLH-20,ODS柱色譜分離純化，得到化合物24，1，2,3，4，5。實(shí)施例7本發(fā)明涉及的刺山柑提取物的藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下供試品溶液的制備分別取實(shí)施例2中所列各提取物適量，用水配制成高低兩個劑量的藥液備用，所本配濃度分別如下提取物1高劑量(CT-H)(0.131g/ml)，提取物l低劑量(CT-L)(0.066g/ml);提取物2高劑量(CE-H)(0.0043g/ml)，提取物2低劑量(CE-L)(0.002g/ml);提取物3高劑量(CW-H)(0.122g/ml)，提取物3低劑量(CW-L)(0.060g/ml);石油醚提取物高劑量(CP-H)(0.0076g/ml)，石油醚提取物低劑量(CP-L)(0.0037g/ml)。溶解時，提取物2(CE)和石油醚提取物(CP)采用1%的吐溫-80水溶液溶解，其余均用NS溶解。稱取阿斯匹林(ASP)1.0g于250ml的容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容至刻度，配成濃度為0.004g/ml的溶液，作為陽性對照藥。給藥劑量經(jīng)急性毒性實(shí)驗(yàn)測定刺山柑乙醇總提取物l的半數(shù)致死量(LD5o)為154.3g/kg(當(dāng)于原藥材)。乙醇總提取物l按LD5o的l/10和l/20給藥，其余各部均按所占浸膏的比例計(jì)算其給藥量?？寡讓?shí)驗(yàn)(一)二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)取雄性小鼠100只，體重25i2g，稱重標(biāo)記后隨機(jī)分為10組，分別為按高、低2個劑量分為CT-H和CT-L、CE-H和CE-L、CP-H和CP-L、CW-H和CW-L實(shí)驗(yàn)組及空白對照組(NS)和陽性對照組(ASP)。各實(shí)驗(yàn)組分別按CT-H3.280g/kg、CT-L1.640g/kg、CE-H0.108g/kg、CE-L0.054g/kg、CW陽H0.190g/kg、CW-L0.095g/kg、CP陽H3.000g/kg、CP-L1.500g/kg劑量灌胃給藥(0.2ml/10g體重)，陽性對照組給予ASP0.080g/kg，空白對照組給予相同體積的NS。每dl次，連續(xù)給藥7d。分別于末次給藥lh后，將30nl二甲苯均勻涂布于小鼠右耳，左耳不涂作為對照。致炎20min后，脫頸椎處死小鼠，剪下左右兩耳片，用直徑8mm的打孔器沖下左右耳廓，分別在電子天平上稱重，左右耳片重量之差為腫脹度，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)?zāi)[脹抑制率(％)=[(致炎耳片重一未致炎耳片重)/未致炎耳片重]><100%。結(jié)果見表l。刺山柑不同提取部位對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響，如表1所示。經(jīng)t檢驗(yàn)分析可以看出，陽性對照藥ASP、乙酸乙酯部位(提取物2)和水溶性部位(提取物3)與空白對照NS組相比，對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的抑制率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(pO.05或p<0.01)，石油醚部位和乙醇總提物(提取物l)也表現(xiàn)出一定的抑制作用(p0.05)。其中乙酸乙酯部位(提取物2)和水溶性部位(提取物3)兩組與ASP組的抑制效果無顯著差異(pX).05)。_表l刺山柑不同提取部位對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(Mean士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>提取物3(CW隱H)3.0100.012±0.004"a29.5提取物3(CW-L)1.5100.012±0.004"a32.2石油醚提取物(CP-H)0.19100.014士0.004'23.5石油醚提取物(CP-L)0.095100.013士0.002'24.0注與NS組比較(P〈0.05);"與NS組比較(P〈0.01);a與ASP組比較(P>0.05)。抗炎實(shí)驗(yàn)(二)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的實(shí)驗(yàn)取小鼠100只，體重20±2g，雌雄各半，稱重標(biāo)記后隨機(jī)分為10組，每組10只。實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量和方法與二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)相同。分別于末次給藥lh后，尾靜脈注射0.5%伊文思蘭0.1ml/10g，立即腹腔注射0.6。/。醋酸溶液0.3ml/只，20min后，脫頸椎處死小鼠，剪開腹腔，用5mlNS沖洗腹腔數(shù)次，收集洗滌液于5ml量瓶中，用NS定至刻度，3000r/min離心5min，以NS為空白，用752型分光光度計(jì)于608nm波長處測定上清液的吸收度(OD值)，記錄結(jié)果，按下式計(jì)算毛細(xì)血管通透性抑制率。毛細(xì)血管通透性抑制率(％)=[(空白對照組OD值一實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對照組OD值]xl00n/。，結(jié)果見表2。刺山柑不同提取部位對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響，如表2所示。經(jīng)t檢驗(yàn)分析可見，刺山柑果實(shí)乙醇提取物的乙酸乙酯部位(提取物2)高劑量組和陽性對照ASP組對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的抑制作用與空白對照NS組比較有顯著性差異(P0.05)。而且，乙酸乙酯部位(提取物2)高劑量組與陽性對照藥ASP組比較無顯著性差異(pX).05)。_表2剌山柑不同提取部位對小鼠毛細(xì)管通透性的影響(Mean士s)_組別_劑量(g/kg)動物數(shù)(只)_OD值抑制率(。/0)生理鹽水(NS)/80.462±0.099/阿斯匹林(ASP)0.08100.286±0.102*38.2提取物l(CT-H)3.2890.346±0.14425.2提取物l(CT-L)1.6490.339±0.12026.7提取物2(CE-H)0.108100.323±0.141*a30.2提取物2(CE-L)0.054100.379±0.21518.0提取物3(CW-H)3.0100.398±0.11113.8提取物3(CW-L)1.5100.371±0.17119.8石油醚提取物(CP-H)0.19100.406±0.13312.2石油醚提取物(CP-L)0.09580.436±0.1265.6注與NS組比較(PO.05);a與ASP組比較(PX).05)。鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)(一)熱板法實(shí)驗(yàn)取雌性小鼠若干，于正式實(shí)驗(yàn)前先逐只用YLS-6B智能熱板儀(溫度調(diào)至55士0.5"C)進(jìn)行篩選。篩選時每次取小鼠l只，記錄小鼠足底接觸熱板至舔后足所需時間(s，熱板反應(yīng)潛伏期)作為痛閾指標(biāo)(共測定2次，求出2次測定的平均值)，先剔除反應(yīng)潛伏期大于30s的或小于5s的反應(yīng)遲鈍或過敏的小鼠。將篩選合格的動物(由150只小鼠篩選出合格動物100只)隨機(jī)分為10組，每組10只，體重20士2g，稱重后標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量和方法與二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)相同。分別于末次給藥后30、60、90、120min按上述基礎(chǔ)痛閾值測定法分別測定痛閾值，如痛閾超過60s,即停止測試而按60s計(jì)，以免燙傷足部。并按下式計(jì)算其痛閾提高百分率。痛閾提高百分率(％)=[(給藥后平均痛閾值一給藥前平均痛閾值)/給藥前平均痛閾值]x100%。結(jié)果見表3和圖1。刺山柑不同提取部位對小鼠熱板法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)痛閾的影響，如表3和圖1所示。以痛閾提高百分率大于50%時有鎮(zhèn)痛效力來說，乙醇總提物(提取物l)、乙酸乙酯部位(提取物2)和石油醚部位的高、低劑量組均能明顯提高小鼠熱板法實(shí)驗(yàn)的痛閾(痛閾提高百分率>50%)，并且隨著作用時間的延長，鎮(zhèn)痛作用有增強(qiáng)的趨勢，表現(xiàn)出較好的鎮(zhèn)痛效果。而水溶性部位(提取物3)的痛閾提高百分率雖然也大于50%，但相比之下作用較其它部位弱。表3刺山柑不同部位對不同時間段小鼠痛閾及痛閾提高率的影響(Mean士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注:括號內(nèi)數(shù)字為痛閾提高百分率(％)鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)(二)醋酸扭體法實(shí)驗(yàn)取小鼠100只，體重1822g，雌雄各半，稱重標(biāo)記后隨機(jī)分為10組，每組10只。實(shí)驗(yàn)分組及給藥劑量和方法與二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)相同。分別于末次給藥后lh，腹腔注射0.6n/。醋酸溶液0.1m1/10g(醋酸溶液臨用前配制)。5min后觀察并記錄15min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)(腹部收縮內(nèi)凹，伸展后肢，臀部抬高，蠕行)的次數(shù)，按下式計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率。扭體反應(yīng)抑制率(％)=[(對照組平均扭體次數(shù)一給藥組平均扭體次數(shù))/對照組平均扭體次數(shù)]xlOOX。結(jié)果見表4。刺山柑不同提取部位對醋酸扭體反應(yīng)的鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)的影響，如表4所示。從表4可以看出，乙醇總提物(提取物l)、石油醚部位、乙酸乙酯部位(提取物2)和水溶性部位(提取物3)均可以明顯減少醋酸注入腹腔內(nèi)引起的臟層和壁層腹膜較大面積較長時間的炎性疼痛，其中乙醇總提物(提取物l)的高劑量組和水溶性部位的高劑量組的鎮(zhèn)痛效果最好。表4刺山柑不同部位對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響(Mean士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>注與NS組比較(P0.05)權(quán)利要求1、一種刺山柑提取物，其特征在于該刺山柑提取物包括提取物1、2和3；所述提取物1含有以下30種化合物化合物1刺山柑堿A、化合物2刺山柑酸A、化合物3刺山柑堿B、化合物4刺山柑堿C、化合物5刺山柑堿D、化合物6對羥基苯甲酸、化合物7原兒茶酸、化合物8香草酸、化合物9原兒醛、化合物10丁香酸、化合物113，4-二羥基苯甲酸、化合物12反式丁烯二酸、化合物13乙二酸、化合物145-羥甲基糠醛、化合物155-羥甲基糠酸、化合物162-糠酸、化合物17二氫-4羥基-5-羥甲基-2(3H)呋喃酮、化合物187-hydroxy-2-oxoindolin-3-ylaceticacid、化合物19尿嘧啶、化合物20L-內(nèi)消旋肌醇、化合物21尿苷、化合物22山萘酚蕓香苷、化合物23β-胡蘿卜苷-6′-硬脂酸酯、化合物24corchoionosideC、化合物25spionosideB、化合物26白花菜苷、化合物27β-谷甾醇、化合物28β-胡蘿卜苷、化合物29蘆丁、化合物30吲哚-3-甲醛；它們的結(jié)構(gòu)式如下上述30種化合物的特征波譜數(shù)據(jù)編名稱波譜數(shù)據(jù)號1刺山柑堿A1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ(ppm)11.34bar(COOH)，9.34(1H，s，CHO)，7.13(1H，d，J＝3.8Hz，H-8)，6.29(1H，d，J＝3.9Hz，H-9)，5.64(1H，m，H-5)，5.40m(1H，s，NH)，3.08(1H，dd，J＝9.2Hz，17.0Hz，H-4a)，2.63(1H，dd，J＝6.6Hz，17.0Hz，H-4b)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)179.0(C-11)，175.2(C-12)，175.1(C-3)，125.8(C-8)，144.9(C-10)，131.3(C-7)，109.7(C-9)，54.8(C-1)，54.7(C-5)，37.3(C-4)；2刺山柑酸1H-NMR(DMSO，500MHz)δ(ppm)7.93(1H，s，H-2)，2.31(3H，s，CH3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)170.6(COOH)，152.2(C-4)，146.1(C-3)，143.2(C-5)，140.7(C-2)，14.8(CH3)；3刺山柑堿B1H-NMR(DMSO，500MHz)δ(ppm)9.54(1H，s，CHO)，6.98(1H，d，J＝4.01Hz)，6.21(1H，d，J＝3.78Hz)，5.84(1H，q，J＝7.24Hz)，5.48(1H，d，J＝14.13Hz)，5.39(1H，d，J＝14.93Hz)，1.72(3H，d，J＝7.27HzCH3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)179.7(C-11)，168.1(C-3)，130.8(C-6)，120.3(C-9)，124.0(C-7)，106.5(C-6)，63.3(C-1)，53.8(C-4)，19.1(C-10)；4刺山柑堿C1H-NMR(DMSO，500MHz)δ(ppm)9.46(1H，s，CHO)，6.93(1H，d，J＝3.69Hz，H-3)，6.03(1H，d，J＝3.52Hz，H-4)，4.96(1H，d，J＝15.35Hz，H-7a)，4.76(1H，d，J＝15.29Hz，H-7b)，4.66(1H，d，J＝14.01Hz，H-6a)，4.34(1H，d，J＝13.58Hz，H-6b)，4.34(1H，m，H-5′)，4.25(1H，m，H-4′)，3.77(1H，dd，J＝2.49，12.29Hz，H-3′a)，3.69(1H，dd，J＝3.64.49，11.87Hz，H-3′b)，2.27(1H，m，H-6′)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)178.9(C-8)，134.6(C-5)，131.2(C-2)，124.2(C-4)，105.0(C-3)，104.1(C-1′)，89.7(C-1′)，72.9(C-5′)，62.9(C-3′)，58.0(C-7)，50.3(C-6)，44.9(C-6′)；5刺山柑堿D1H-NMR(DMSO，500MHz)δ(ppm)9.45(1H，s，CHO)，6.92(1H，d，J＝3.80Hz，H-7′)，6.01(1H，d，J＝3.46Hz，H-8′)，4.82(1H，d，J＝15.18Hz，H-1′a)，4.74(1H，d，J＝15.67Hz，H-1′b)，4.70(2H，d，J＝14.37Hz，H-4′a)，4.02(1H，d，J＝13.82Hz，H-4′b)，4.17(1H，m，H-4)，3.88(1H，s，H-5)，3.89(1H，d，J＝12.07Hz，H-6a)，3.81(1H，d，J＝12.07Hz，H-6b)，2.04(1H，dd，J＝5.32，12.82Hz，H-3a)，1.91(1H，t，J＝12.43Hz，H-3b)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)178.8(C-10′)，134.1(C-9′)，131.2(C-6′)，124.0(C-7′)，104.8(C-8′)，95.4(C-2)，67.4(C-5)，65.1(C-4)，64.5(C-6)，57.8(C-1′)，52.2(C-4′)，35.8(C-3)；6對羥基苯甲酸1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)7.78(2H，d，J＝8.8Hz，H-3，5)，6.72(2H，d，J＝8.8Hz，H-2，6)，為鄰位酚羥基氫信號；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)170.4(C-7)，163.6(C-4)，133.3(C-2，C-6)，123.0(C-1)，116.3(C-3，C-5)；7原兒茶酸1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)7.31(1H，d，J＝1.7Hz，H-2)，7.2(1H，dd，J＝8.1，1.7Hz，H-6)，6.9(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)170.7(COOH)，151.8(C-4)，46.3(C-3)，124.2(C-6)，123.5(C-1)，118.1(C-2)，116.1(C-5)；8香草酸1H-NMR(CD3COCD3，500MHz)δ(ppm)12.44(1H，br.s，COOH)，9.81(1H，br.s，OH)，7.46(1H，dd，J＝8.2，1.7Hz，H-6)，7.43(1H，d，J＝1.7Hz，H-2)，6.77(1H，d，J＝8.2Hz，H-5)，3.79(3H，s，OCH3)；13C-NMR(CD3COCD3，125MHz)δ(ppm)167.5(C-1)，152.1(C-4)，148.1(C-5)，124.9(C-7)，122.9(C-2)，115.5(C-3)，113.5(C-6)，56.4(OCH3)；9原兒茶醛1H-NMR(CD3COCD3，500MHz)δ(ppm)9.67(s，1H)，8.64(2H，br.s，OH)，7.24(1H，d，J＝1.84Hz，H-2)，7.22(1H，dd，J＝8.03，1.86Hz，H-6)，6.87(1H，d，J＝8.01Hz，H-5)；10丁香酸1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ(ppm)7.20(2H，s，H-2，)，3.76(6H，s，OCH3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)167.5(COOH)，148.4(C-3，5)，141.6(C-4)，121.5(C-1)，108.2(C-2，6)，56.7(OCH3)；113，4-二羥基苯甲酸1H-NMR(MeOD，500MHz)δ(ppm)7.37(1H，d，J＝2.0乙酯HzH-2)，7.31(1H，dd，J＝2.0，8.3Hz，H-6)，6.76(1H，d，J＝8.3Hz，H-5)，4.13(2H，q，OCH2)，1.19(3H，t，-CH3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)166.6(C＝O)，150.7(C-4)，145.6(C-3)，123.3(C-1，6)，122.9(C-2，1)，117.2(C-5)，115.7(C-2)，60.8(OCH2)，14.6(CH3)；12富馬酸1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)6.81(1H，d，J＝15.8Hz，H-2)，6.48(1H，d，J＝15.8Hz，H-3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)134.8(C-2，C-3)，166.1(C-1，C-4)；13丁二酸1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)2.5(4H，d，J＝15.8Hz，H-2，3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)176.5(C-1，C-4)，30.1(C-2，C-3)；145-羥甲基糠醛1H-NMR(MeOD，400MHz)δ(ppm)11.16(1H，s，COOH)，7.78(1H，d，J＝0.82Hz，H-3)，7.22(1H，dd，J＝3.32，0.36Hz，H-5)，6.62(1H，dd，J＝3.33，1.73Hz，H-4)；13C-NMR(MeOD，125MHz)δ(ppm)159.4(C-1′)，147.6(C-5)，145.9(C-2)，118.6(C-3)，112.7(C-4)；155-羥甲基糠酸1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)7.06(1H，d，J＝3.42Hz，H-3)，6.36(1H，d，J＝3.43Hz，H-4)，4.47(3H，s，H2)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)162.08(C-2′)，160.99(C-2)，45.99(C-5)，120.28(C-3)，110.51(C-4)，57.8(C-5′)；162-糠酸1H-NMR(MeOD，400MHz)δ11.16(1H，s，COOH)，7.78(1H，d，J＝0.82Hz，H-5)，7.22(1H，dd，J＝3.32，0.36Hz，H-3)，6.62(1H，t，J＝3.33，1.73Hz，H-4)；13C-NMR(MeOD，125MHz)δ159.41(s，C-1′)，147.61(s，C-5)，145.96(s，C-2)，118.62(s，C-4)，112.71(s，C-3)；17二氫-4羥基-5-羥1H-NMR(MeOD，500MHz)δ4.42(1H，m，5-H)；4.36(1H，甲基-2(3H)呋喃酮t，J＝2.2Hz，J＝3.5Hz，4-H)；3.76(1H，dd，J＝12.4Hz，J＝3.3Hz6-H)；3.68(1H，dd，J＝12.5Hz，J＝3.6Hz，6-H)；2.91(1H，dd，J＝18Hz，J＝6.8Hz，3-H)；2.37(1H，dd，J＝17.8Hz，J＝2.6Hz，3-H)；13C-NMR(MeOD，125MHz)δ178.9(C-2)，90.5(C-5)，69.9(C-4)，62.8(C-6)，39.4(C-3)；187-hydroxy-2-oxoin1H-NMR(MeOD，500MHz)δ6.76(1H，t，J＝7.67，H-5)；dolin-3-ylacetic6.72(1H，dd，J＝1.1，7.52Hz，H-4)；6.66(1H，dd，J＝7.69，acid1.5Hz，H-6)；3.81(1H，dd，J＝3.45Hz，6.41Hz，H-3)；2.75(1H，dd，J＝16.44，J＝3.46Hz，H-11)；2.66(1H，dd，J＝16.44，J＝6.57Hz，H-11)；13C-NMR(MeOD，125MHz)δ175.9(C-11)，172.0(C-2)，145.8(C-7)，126.8(C-8)，124.6(C-5)，123.5(C-9)，121.0(C-4)，115.8(C-6)，44.0(C-3)，34.4(C-10)；19尿嘧啶1H-NMR(DMSOd6，500MHz)δ13.11(1H，s)，12.43(1H，s)，7.59(1H，d，J＝7.56Hz)，5.88(1H，d，J＝7.57Hz)。13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)δ165.9(C-4)，153.3(C-2)，101.4(C-5)，142.2(C-6)。1H-NMR上的質(zhì)子信號δH13.11(1H，s)，12.43(1H，s)為活潑質(zhì)子的信號，δH7.59(1H，d，J＝7.5H7)，5.40(1H，d，J＝7.5Hz)為烯質(zhì)子信號。13C-NMR譜顯示4個碳信號165.9，153.3，142.2，101.4分別歸屬為不飽和酰胺、脲基和雙鍵的碳信號；20內(nèi)消旋肌醇13C-NMR(DMSO，400MHz)δC74.3，72.4，72.2，71.1，都是連氧碳，δC72.4，71.1兩個碳信號峰較高，說明它們分別為兩個碳信號，化合物應(yīng)為六元環(huán)醇。1H-NMR(DMSOO，400MHz)δ4.52(1H，d，J＝3.72Hz)δ4.46(1H，d，J＝4.19Hz)，δ4.44(2H，d，J＝3.07Hz)，δ4.32(2H，d，J＝5.43Hz)，δ3.70(1H，d，J＝2.68Hz)，δ3.37(1H，dd，J＝2.68.9.34Hz)，δ3.11(2H，m)，2.90(1H，td，J＝9.1，4.07Hz)從它們的偶合常數(shù)看，有一個氫處在e鍵，其它五個氫都處于a鍵；21尿苷1H-NMR(DMSOd6，400MHz)δ7.98(1H，d，J＝8.1Hz，H-6)，5.89(1H，d，J＝4.6Hz，H-1′)，為糖端基氫信號，因偶合常數(shù)為4.6，表明為α構(gòu)型，5.69(1H，d，J＝8.1，H＝8.1Hz，H-5)，3.7～4.2，均為糖上的氫信號。13C-NMR(DMSO-d6，400MHz)δ166.5(C-4)，152.8(C-2)，143.0(C-6)，91.0(C-5)，為尿嘧啶的碳信號，102.9為糖端基碳信號，另外的δ86.6，76.0，71.6，62.6均為糖的碳信號，為五碳糖；22山萘酚3-O-蕓香苷1H-NMR(DMSO-d，500MHz)δ12.56(5OH)，10.80(1H，brs，OH)，10.09(1H，brs，OH)，7.98(2H，d，J＝8.6Hz，IH-2′，6′)，6.87(2H，d，J＝8.6Hz，H-3′，5′)，6.41(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.31(1H，d，J＝7.3Hz，H-1″，ofglucose)，4.38(1H，brs，H-rhamnose)，0.99(3H，d，J＝6.1Hz，rha-CH3)；13C-NMR(DMSO-d，125MHz)δ177.3(C-4)，164.1(C-7)，161.2(C-5)，159.8(C-4′)，156.8(C-9)，156.4(C-2)，133.1(C-3)，130.8(C-2′，6′)，120.9(C-1′)，115.0(C-3′，5′)，103.9(C-10)，101.3(C-1″)，100.7(C-1″′)，98.7(C-6)，93.7(C-8)，76.3(C-3″)，75.7(C-5″)，74.1(C-2″)，71.8(C-4″′)，70.6(C-3″′)，70.3(C-4″)，69.9(C-2″′)，68.2(C-5″′)，66.8(C-6″)，17.7(C-6″′)；23β-胡蘿卜苷-6′-硬1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ0.65(3H，s，C18-H)，0.80-0.98脂酸酯(m，CH3)，1.25(bra，CH2)，1.47-2.00(CH2和CH)，2.34(2H，t，J＝7.5Hz，CH2COO)，3.36(1H，m，C3-H)，3.51-4.37(m，糖上的氫)，5.34(1H，m，C6-H)。13C-NMR(CDCl3，125MHz)δ174.2，140.4，122.1，101.3，79.8，76.2，73.8，73.4，70.5，63.6，56.8，56.2，50.2，45.9，42.4，39.8，38.9，37.3，36.7，36.2，34.3，33.9，31.9，31.9，29.7-29.8，29.5，29.34，29.34，29.3，29.2，28.3，26.3，25.0，24.32，23.1，22.7，21.1，19.8，19.05，18.80，14.10，11.98，11.87；246，9-Dihydroxy-4，1H-NMR(MeOD-d6，500MHz)δ5.78(1H，s，H-5)，5.70(2H，7-megastigmadien-m，H-6，7)，4.22(1H，dq，J＝6.4，4.4Hz，H-9)，2.41(1H，3-oneld，J＝16.8Hz，H-a)，2.06(1H，d，J＝16.9Hz，H-2β)，1.82(1H，d，J＝1.2Hz，H-13)，1.14(3H，d，J＝6.5Hz，H-10)，0.94(3H，s，H-11)，0.91(3H，s，H-12)。13C-NMRδ201.5(C-3)，167.7(C-5)，137.3(C-7)，130.4(C-7)，130.3(C-8)，127.4(C-4)，80.3(C-6)，69.0(C-9)，51.1(C-2)，42.7(C-1)，24.8(C-12)，24.1(C-11)，23.8(C-4)，19.8(C-13)；25spionosideB1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ6.26(1H，d，J＝15.26Hz，H-7)，5.94(1H，dd，J＝15.25，6.11Hz，H-8)，4.75(OH)，4.48(1H，dq，J＝6.27，6.36Hz，H-9)，4.14(1H，d，J＝7.64Hz，H-1′)，3.75(2H，dd，J＝7.32，2.49Hz，H-11a)，3.49(1H，d，J＝7.39Hz，H-11b)，3.63(1H，m，H-6′a)，3.38(1H，m，H-6′b)，2.9～3.1(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.27(d，J＝17.47Hz，H-4a)，2.71(d，J＝17.2Hz，H-4b)，2.67(dd，J＝16.78，1.54Hz，H-2a)，2.22(d，J＝17.59Hz，H-2b)，1.22(d，J＝6.49Hz，H-10)，1.07(3H，s，H-13)，0.85(3H，s，H-12)。13C-NMR(DMSO，125MHz)δ208.1(C-3)，134.9(C-8)，127.6(C-7)，99.8(C-1′)，85.6(C-5)，80.8(C-6)，77.1(C-5′)，76.9(C-3′)，76.5(C-11)，73.4(C-2′)，71.7(C-9)，70.2(C-4′)，61.1(C-6′)，52.9(C-4)，47.7(C-1)，51.8(C-2)，22.2(C-10)，15.2(C-12)，18.9(C-13)；26白花菜苷1H-NMR(DMSOd6，500MHz)δ5.47(1H，d，J＝5.86Hz，H-8)，5.11(1H，d，J＝4.77Hz，H-8)，5.02(1H，d，J＝5.25Hz，H-8)，4.75(1H，d，J＝9.79Hz，H-8)，4.72(1H，t，J＝5.56Hz，H-8)，3.68(1H，dd，J＝11.16，5.29Hz，H-8)，3.19(1H，m，H-8)，3.17(1H，d，J＝4.98Hz，H-8)，3.063.17(2H，m，H-8)，2.23(3H，s，H)。13C-NMR(DMSO，125MHz)δ154.2(C-1)，82.0(C-1′)，81.1(C-5′)，78.1(C-2′)，72.8(C-3′)，70.0(C-4′)，61.1(C-6′)，18.2(C-2)；27β-谷甾醇略28β-胡蘿卜苷略29蘆丁略301H-indole-3-carbal-1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ7.09～7.15(2H，overlap，dehyde5，6-H)，7.41(1H，d，J＝7.7Hz，7-H)，8.05(1H，d，J＝2.9Hz-H)，8.09(1H，d，J＝7.3Hz，4-H)，9.94(1H，s，10-H)，11.02(1H，bar，N-H)；13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)8111.6(C-7)，118.7(C-3)，120.8(C-9)，121.6(C-4)，123.1(C-5)，124.1(C-6)，136.6(C-2)，136.9(C-8)，183.9(C-10)。2刺山柑酸！H-NMR(DMSO，500MHz)5(ppm):7.93(1H，s，H誦2)，2.31(3H，s，CH3);13C-NMR(CD3OD，125MHz)S(ppm):170.6(COOH)，152.2(C-4)，146.1(C陽3)，143.2(C-5)，140.7(C-2)，14.8(CH3);3刺山柑堿B'H-NMR(DMSO，500MHz)8(ppm):9.54(1H，s，CHO),6.98(1H，d，^4.01Hz)，6.21(1H，d，^3.78Hz)，5'84(1H，q，《/=7.24Hz)，5.48(1H，d，J-14.13Hz)，5.39(1H，d，J=14.93Hz)，1.72(3H，d，J=7.27HzCH3);13C-NMR(CD30D，125MHz)S(ppm):179.7(C-11)，168.1(C-3)，130.8(C-6)，120.3(C-9)，124.0(C-7)，106.5(C-6)，63.3(C-1)，53.8(C-4)，19.1(C-10);4刺山柑堿C'H-NMR(DMSO，500MHz)5(ppm):9.46(1H,s，CHO),6.93(1H，d，J二3.69Hz，H-3)，6.03(1H，d，J二3.52Hz，H-4)，4.96(1H，d，J45.35Hz，H-7a)，4.76(1H，d，《/=15.29Hz，H-7b)，4.66(1H，d,J=14.01Hz，H-6a)，4.34(1H，d，1.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>10.丁香酸'H-NMR(500MHz,CD3OD)5(ppm):7.20(2H，s，H-2，)，3.76(6H，s，OCH3);13C-NMR(CD3OD，125MHz)S(ppm):167.5(COOH)，148.4(C-3，5)，141.6(C-4)，121.5(C陽l)，108.2(C-2，6)，56.7(OCH3);11.3，4-二羥基苯甲酸巾-NMR(MeOD，500MHz)S(ppm):7.37(1H，d，^^2.0乙酯HzH-2)，7.31(1H，dd，J:2.0，8.3Hz，H國6),6.76(1H，d，7=8.3Hz,H-5)，4.13(2H，q，OCH2)，1.19(3H，t，-CH3);13C-NMR(CD3OD,125MHz)S(ppm):166.6(C=0)，150.7(C-4)，145.6(C-3),123.3(C-l，6)，122.9(C-2，1)，117.2(C-5),115.7(C-2)，60.8(OCH2)，14.6(CH3);12.富馬酸'H-NMR(CD30D，500MHz)S(ppm):6.81(1H，d，J45.8Hz，H-2)，6.48(1H，d，J-15.8Hz，H-3);13C-NMR(CD3OD，125MHz)5(ppm):134.8(C-2，C-3)，166.1(C-l，C-4);13.丁二酸'H-NMR(CD30D，500MHz)S(ppm):2.5(4H，d，J45.8Hz,H陽2，3);13C-NMR(CD3OD，125MHz)5(ppm):176.5(C隱l，C-4)，30.1(C-2，C-3);14.5-羥甲基糠醛iH-NMR(MeOD，400MHz)S(ppm):11.16(1H，s，COOH)，7.78(1H，d，《/=0.82Hz，H-3)，7.22(1H，dd，J=3.32，0.36Hz，H-5)，6.62(1H,dd，7=3.33，1.73Hz，H-4);13C-NMR(MeOD，125MHz)S(ppm):159.4(C-l')，147.6(C-5)，145.9(C陽2)，118.6(C-3)，112.7(C-4);15.5-羥甲基糠酸！H-NMR(CD30D，500MHz)S(ppm):7.06(1H，d，J=3.42Hz，H陽3)，6.36(1H，d，J:3.43Hz，H-4)，4.47(3H，s，H2);13C-NMR(CD3OD，125MHz)S(ppm):162.08(C-2')，160.99(C-2)，45.99(C-5)，120.28(C-3)，110.51(C-4)，57.8(C-5');16.2-糠酸'H-NMR(MeOD，400MHz)S:1L16(1H，s，COOH)，7.78(1H，d，A0.82Hz，H-5)，7.22(1H,dd,J=3.32，0.36Hz，H-3)，6.62(1H，t，《/=3.33，1.73Hz，H-4);13C-NMR(MeOD，125MHz)S:159.41(s，C陽l')，147.61(s，C-5)，145.96(s，C-2)，U8.62(s，C-4)，U2.71(s，C-3);17.二氫-4羥基-5-羥'H-NMR(MeOD，500MHz)S:4.42(1H，m，5-H);4.36(1H，甲基陽2(3H)呋喃酮t，《/=2.2Hz，J-3.5Hz，4-H);3.76(1H，dd，J=12.4Hz，J:3.3Hz6-H);3.68(1H，dd，J:12.5Hz，^^3.6Hz，6-H);2.91(1H，dd，《/=18Hz，^^6.8Hz，3-H);2.37(1H，dd，《/=17.8Hz，/=2.6Hz，3-H);13C-NMR(MeOD,125MHz)S:178.9(C-2)，90.5(C-5)，69.9(C-4)，62.8(C陽6)，39.4(C國3);18.7-hydroxy-2-oxoin'H-NMR(MeOD，500MHz)8:6.76(1H，t，J=7.67，H-5);dolin-3-ylacetic6.72(1H，dd，J4.1，7.52Hz，H-4);6.66(1H，dd，J=7.69，acid1.5Hz，H-6);3.81(1H，dd，J二3.45Hz，6.41Hz，H陽3);2.75(1H，dd，/=16.44，J=3.46Hz，H-ll);2.66(1H，dd，■7=16.44，J:6.57Hz，H-ll);13C-NMR(MeOD，125MHz)S:175.9(C陽ll)，172.0(C-2)，145.8(C-7)，126.8(C-8)，124.6(C-5)，123.5(C陽9)，121.0(C-4)，115.8(C-6)，44.0(C陽3)，34.4(C陽10);19.尿噴啶^國NMR(DMSOd6，500MHz)S:13.11(IH，s)，12.43(1H,s)，7.59(1H，d,/=7.56Hz),5.88(1H，d，《/=7.57Hz)。13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)S:165.9(C-4)，153.3(C-2)，101.4(05)，142.2(C-6)^H-NMR上的質(zhì)子信號SHl3.11(IH，s)，12.43(1H，s)為活潑質(zhì)子的信號，5H7.59(1H，d，7=7.5H7)，5.40(1H，d，《/=7.5Hz)為烯質(zhì)子信號。13C-NMR譜顯示4個碳信號165.9，153.3，142.2，101.4分別歸屬為不飽和酰胺、脲基和雙鍵的碳信號；20.內(nèi)消旋肌醇13C-NMR(DMSO，400MHz)Sc:74.3，72.4，72.2,71.1，都是連氧碳，Sc:72.4，71.1兩個碳信號峰較高，說明它們分別為兩個碳信號，化合物應(yīng)為六元環(huán)醇。'H-NMR(DMS00，400MHz):54.52(1H，d，A3.72Hz)S4.46(1H，d，《/=4.19Hz)，S4.44(2H，d，J=3.07Hz)，S4.32(2H，d，J:5.43Hz)，S3.70(1H，d，《/=2.68Hz)，S3.37(1H，dd，■7=2.68.9.34Hz)，S3.11(2H，m)，2.90(1H，td，J:9.1，4.07Hz)從它們的偶合常數(shù)看，有一個氫處在e鍵，其它五個氫都處于a鍵；21.尿苷iH-NMR(DMSOde，400MHz)S:7.98(1H，d，J-8.1Hz,H-6)，5.89(1H，d，^4.6Hz，H-l')，為糖端基氫信號，因偶合常數(shù)為4.6,表明為a構(gòu)型，5.69(lH，d，^8.1，H-8.1Hz，H-5)，3.7~4.2，均為糖上的氫信號。13C-NMR(DMSO-d6.400MHz)S:166.5(C-4)，152.8(C-2),143.0(C-6)，91.0(C-5)，為尿嘧啶的碳信號，102.9為糖端基碳信號，另外的S86.6，76.0，71.6，62.6均為糖的碳信號，為五碳糖；22.山萘酚3-(9-蕓香苷'H-NMR(DMSO-d，500MHz)S:12.56(50H)，10.80(1H，brs，OH)，10.09(1H，brs，OH)，7.98(2H，d，J=8.6Hz，IH-2'，6')，6.87(2H，d，A8.6Hz，H-3'，5')，6.41(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.31(1H，d，^7.3Hz，H-l"，ofglucose)，4.38(1H，brs，H國rh麵ose)，0.99(3H，d，J=6.1Hz，rha-CH3);13C-NMR(DMSO陽d，125MHz)S:177.3(C-4)，164.1(C-7)，161.2(C-5)，159.8(C-4')，156.8(C-9)，156.4(C-2)，133.1(C-3)，130.8(C-2'，6')，120.9(C-1')，115.0(C-3'，5')，103.9(C-10)，101.3(C-r)，100.7(C-1'")，98.7(C-6)，93.7(C-8)，1.76.3(C-3")，75.7(C-5")，74.1(C-2")，71.8(C-4"')，70.6(C-3'")，70.3(C-4")，69.9(C-2"')，68.2(C國5'")，66.8(C-6")，17.7(C-6m);卩-胡蘿卜苷-6'-硬'H-NMR(CDC13，500MHz)3.'0.65(3H，s,C18誦H)，0.80-0.98脂酸酯(m，CH3)，1.25(bra,CH2)，1.47-2.00(CHz和CH)，2.34(2H，t，片5Hz，CH2C00)，3.36(1H，m，C3-H)，3.5".37(m，糖上的氫)，5.34(1H，m,C6-H)。13C-NMR(CDC13，125MHz)S:174.2，140.4，122.1，101.3，79.8，76.2，73.8，73.4，70.5，63.6，56.8，56.2，50.2，45.9，42.4，39.8，38.9，37.3,36.7，36.2，34.3，33.9，31.9，31.9，29.7-29.8，29.5，29.34，29.34，29.3，29.2，28.3，26.3，25.0，24.32，23.1，22.7，21.1，19.8，19.05，18.80，14.10，11.98,11.87;6,9-Dihydroxy-4，'H-NMR(MeOD-d6，500MHz)S:5.78(1H，s，H-5)，5.70(2H，7-megastigmadien-m，H-6，7)，4.22(1H，dq，6.4，4.4Hz，H-9)，2.41(1H，3-oneld，《/=16.8Hz，H陽a)，2.06(1H，d，J=16.9Hz，H-2p),1.82(1H，d，J-l,2Hz,H-13)，1.14(3H，d,聲6.5Hz，H-10)，0.94(3H，s，H陽l1)，0.91(3H，s，H-12)。13C-NMRS:201.5(C隱3)，167.7(C陽5)，137.3(C-7)，130.4(C陽7)，130.3(C-8)，127.4(C-4)，80.3(C-6)，69.0(C-9)，51.1(C-2)，42.7(C-l)，24.8(012)，24.1(C-11)，23.8(C-4)，19.8(C-13);spionosideB力-NMR(DMSO陽d6,500MHz)S:6.26(1H，d，聲15.26Hz，H-7)，5.94(1H，dd，J45.25，6.11Hz，H-8)，4.75(OH)，4.48(1H，dq，凡27,6.36Hz，H-9)，4.14(1H，d，《/=7.64Hz，H-l')，3.75(2H，dd，《/=7.32，2.49Hz，H-lla),3.49(1H，d，聲7.39Hz，H-llb)，3.63(1H，m，H-6'a),3.38(1H，m，H-6'b)，2.9~3.1(4H，m，H-2'，3'，4'，5')，2.27(d,h7.47Hz，H-4a)，2.71(d，J:17.2Hz，H-4b)，2.67(dd，^16.78,1.54Hz，H-2a)，2.22(d，《/=17.59Hz，H-2b)，1.22(d，《/=6.49Hz，H-IO)，1.07(3H，s，H-13)，0.85(3H，s，H陽12)。13C-NMR(DMSO，125MHz)S:208.1(C-3)，134.9(C-8)，127.6(C-7)，99.8(C-r)，85.6(C-5)，80.8(C-6)，77.1(C-5')，76.9(C-3')，76.5(C-11)，73.4(C誦2')，71.7(C-9)，70.2(C國4'),61.1(C-6'),52.9(C-4)，47.7(C-1)，51.8(C-2)，22.2(C-10)，15.2(C-12)，18.9(C-13);白花菜苷^陽NMR(DMSOd6，500MHz)S:5.47(1H，d，7=5.86Hz，H隱8)，5.11(1H，d，《7=4.77Hz，H-8)，5.02(1H，d，J=5.25Hz，H陽8)，4.75(1H，d，《/=9.79Hz，H-8)，4.72(1H，t，7=5.56Hz，H-8)，3.68(1H，dd，/41.16，5.29Hz，H-8)，3.19(1H，m，H-8)，3'17(1H，d，^^4.98Hz，H-8)，3.063.17(2H，m，H陽8)，2.23(3H，s，H)。13C-NMR(DMSO，125MHz)S:154.2(C-1)，82.0(C-1')，81.1(C-5')，78.1(C-2')，72.8(C-3')，1..70.0(C-4')，61.1(C-6')，18.2(C國2);.27(3-谷甾醇.28p-胡蘿卜苷.29蘆丁.30lH-indole-3-carbal-dehyde!H-NMR(DMSO-d6，500MHz)S:7.097.15(2H，overlap,5，6-H)，7.41(1H，d，聲7.7Hz，7陽H)，8.05(1H，d，片9Hz-H)，8.09(1H，d，《/=7.3Hz，4陽H)，9.94(1H，s，10國H)，II.02(1H，bar，N-H);13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)8:III.6(C國7)，118.7(C-3)，120.8(C-9)，121.6(C-4),123.1(C-5)，124.1(C國6)，136.6(C-2)，136.9(C-8)，183.9(C-10)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺山柑提取物，其特征在于所述提取物2包括下列化學(xué)成分化合物6，7，8，9，10，11，12，13，17,18,19，22，23，25，27，28，29和30;提取物3包括下列化學(xué)成分化合物l，2，3，4，5，14，15，16，20，21，24和26。3、一種如權(quán)利要求1所述剌山柑提取物的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)將藥材粉碎，用藥材510倍W/W水煎煮23次，或用藥材58倍量W/W的5095%乙醇加熱回流提取23次，合并各次提取液；(2)水煎液的濃縮液，加入乙醇使溶液中含醇量為6080%，沉淀雜質(zhì)，共醇沉2次，除去沉淀，上清液減壓濃縮溫度5080°C，壓力0.080.1MPa，回收乙醇后得濃縮液密度1.03-1.1;或?qū)⒉襟E(1)的乙醇提取液減壓濃縮溫度5080°C，壓力0.080.1MPa，回收乙醇后得濃縮液密度1.03-1.1;(3)濃縮液經(jīng)減壓干燥溫度5080。C，壓力0.080.1MPa或冷凍干燥后得粗提取物1;(4)粗提取物1用粗提取物13倍量W/W水分散溶解后，用11.5倍量V/V石油醚脫酯23次，用11.5倍量V/V乙酸乙酯萃取，經(jīng)脫酯后的水溶液23次，得乙酸乙酯部分和水溶性部分，這兩部分液體分別經(jīng)減壓濃縮溫度3050'C，壓力0.08(UMPa后，再經(jīng)減壓、真空或冷凍干燥后，制成乙酸乙酯提取物2和水溶性部位提取物3。4、一種如權(quán)利要求1或2所述的刺山柑提取物在制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性炎或肩周炎藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述提取物包括以下30種化合物化合物1:刺山柑堿A、化合物2:刺山柑酸A、化合物3:刺山柑堿B、化合物4:刺山柑堿C、化合物5:朿I」山柑堿D、化合物6:對羥基苯甲酸、化合物7:原兒茶酸、化合物8:香草酸、化合物9:原兒醛、化合物10:丁香酸、化合物ll:3，4-二羥基苯甲酸、化合物12:反式丁烯二酸、化合物13:乙二酸、化合物14:5-羥甲基糠醛、化合物15:5-羥甲基糠酸、化合物16:2-糠酸、化合物17:二氫-4羥基-5-羥甲基-2(3H)呋喃酮、化合物18:7-hydroxy-2-oxoindolin-3-ylaceticacid、化合物19:尿嘧啶、化合物20:L-內(nèi)消旋肌醇、化合物21:尿苷、化合物22:山萘酚蕓香苷、化合物23:卩-胡蘿卜苷-6'-硬脂酸酯、化合物24:corchoionosideC、化合物25:spionosideB、化合物26:白花菜苷、化合物27:P-谷甾醇、化合物28:P-胡蘿卜苷、化合物29:蘆丁、化合物30:吲哚-3-甲醛。5.根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為刺山柑提取物與藥用輔料制成的片劑、膠囊劑、膏劑、巴布劑、涂膜劑或噴劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種刺山柑提取物及其制備方法。該方法包括將藥材粉碎后用水煎煮或用不同濃度的乙醇加熱回流提取、提取液濃縮后再加入乙醇沉淀雜質(zhì)、上清液或濃度高于80％的乙醇提取液減壓濃縮，回收乙醇后經(jīng)干燥后得提取物1。提取物1用水分散溶解后石油醚脫酯，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部位和水溶性部位分別經(jīng)減壓濃縮和干燥后，分別制成提取物2和3。提取物1含有刺山柑堿A等5個新化合物在內(nèi)的30個化合物。提取物2含有對羥基苯甲酸等18個化合物。提取物3含有刺山柑堿A等5個新化合物在內(nèi)的18個化合物。經(jīng)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示提取物1、2和3具有鎮(zhèn)痛、抗炎活性，可用于制備治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性炎或肩周炎的藥物。文檔編號A61K131/00GK101406497SQ20081020338公開日2009年4月15日申請日期2008年11月26日優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日發(fā)明者周吉燕,濤楊,王崢濤,王長虹,程雪梅申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué);上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心