專利名稱：一種人流感-禽流感聯(lián)合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人流感-禽流感聯(lián)合疫苗及其制備方法，尤其是一種包含H1N1型、H3N2型、B型流感和H5N1型禽流感疫苗的聯(lián)合疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
2005年10月14日WHO向世界呼吁“目前全世界正處在另一次流感大流行的邊緣，一旦發(fā)生，傳播迅速，不到3個(gè)月所有國家將受到感染，低估死亡人數(shù)在200萬至740萬，經(jīng)濟(jì)和社會破壞巨大，全世界每個(gè)國家都必須有所準(zhǔn)備”。
2003年至2008年9月10日，世界各地共發(fā)生H5N1禽流感病例387人，死亡245人，病死率高達(dá)63.3％，潛在危害性超過SARS，威脅著全世界人民的健康，人用禽流感疫苗的研制已經(jīng)引起各國政府的高度重視。
根據(jù)國際制藥企業(yè)協(xié)會聯(lián)合會(IFPMA)2006年1月對全球禽流感疫苗人體觀察的統(tǒng)計(jì)，包括法、美、英、德、日、澳大利亞、俄羅斯、比利時(shí)、(中國)等國的12個(gè)(14個(gè))單位開展了人用H5N1疫苗的研究。07年4月，美國在世界上第一個(gè)批準(zhǔn)巴斯德公司的H5N1疫苗上市，該公司宣布，將在3年內(nèi)向世界衛(wèi)生組織捐贈6千萬劑H5N1疫苗用于全球儲備。我國08年6月也批準(zhǔn)科興公司生產(chǎn)禽流感疫苗，作為奧運(yùn)會期間應(yīng)急的貯備疫苗。
目前禽流感疫苗生產(chǎn)廠家遇到的難題是市場問題。一般認(rèn)為禽流感病人周圍人群及密切接觸禽類者應(yīng)當(dāng)接種此疫苗，而對于廣大人民群眾是否需要進(jìn)行預(yù)防接種？這個(gè)問題回答是否定的，因?yàn)镠5N1病毒能否引發(fā)人傳人，是一個(gè)未知數(shù)，普遍接種，成本太高，因而目前僅作為技術(shù)貯備，或物資貯備，由于產(chǎn)品沒有市場，影響了生產(chǎn)廠家投資開發(fā)禽流感疫苗的積極性。
當(dāng)今，人群接種季節(jié)性流感疫苗不斷擴(kuò)大，尤其發(fā)達(dá)國家較為普遍，如美國接種率達(dá)27％，歐洲國家接種率在7.8％～17.7％不等。我國也不斷擴(kuò)大，如果在人流感疫苗中加入人用禽流感疫苗，成本不高又易被人們接受。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，在人流感疫苗中加入人用禽流感疫苗，成本不高又易被人們接受，并且解決了禽流感疫苗接種困難的問題。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，主要包括H1N1型人流感疫苗、H3N2型人流感疫苗、B型人流感疫苗和H5N1型人禽流感疫苗，各疫苗以血凝素計(jì)濃度為H1N1型人流感疫苗20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗20～40μg/mL、B型人流感疫苗20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗20～40μg/mL。以上為聯(lián)合疫苗的主要有效成分，其輔助成分，如溶劑緩沖液、穩(wěn)定劑、防腐劑等可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行選擇。
研究人-禽流感聯(lián)合疫苗的目的是通過此疫苗的接種，使人群獲得抗禽流感病毒的基礎(chǔ)免疫，一旦感染，可能不發(fā)病或病情減輕，如目前的H1N1流感，雖仍在人群中流行，但不像1918年H1N1病毒引發(fā)的“西班牙流感”大流行時(shí)病死數(shù)千萬人那樣可怕了，因此人流感-人用禽流感聯(lián)合疫苗，可解決禽流感疫苗接種困難的問題，在預(yù)防人流感的同時(shí)，也解決了禽流感的預(yù)防。因此本發(fā)明改變了目前對禽流感被動預(yù)防的局面，轉(zhuǎn)為積極預(yù)防的策略，由于流感傳播速度之快居病毒病之首，一旦H5N1禽流感病毒獲得人傳人的能力，1～2月內(nèi)，即可傳遍全球，故被動預(yù)防往往效果不理想，因?yàn)橐诙虝r(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出能滿足全球需求的禽流感疫苗，幾乎不可能。
所述聯(lián)合疫苗中還可含有防腐劑苯氧乙醇4～6mg/mL。硫柳汞，在我國傳統(tǒng)疫苗中廣泛地被用作防腐劑。硫柳汞中的49.6％是乙基汞，它具有很高的神經(jīng)毒性。1986年前，2歲幼兒接受乙基汞的總量為100微克。到1991年，由于含硫柳汞的乙肝和流感疫苗的接種，汞的總量增為246微克，為原來的2.5倍。汞主要從尿中排出，由于兒童腎臟尚未完全發(fā)育，年齡越小排汞能力越差，如果兒童不斷接種含汞的流感、乙腦和和流腦等疫苗，可能引起汞的積蓄中毒，現(xiàn)在認(rèn)為，兒童的孤獨(dú)癥的發(fā)病與汞中毒有關(guān)。因而含硫柳汞的疫苗已被美國的愛荷華州、加利福尼亞州、和英國及其他歐洲國家禁用。本發(fā)明選用苯氧乙醇作為防腐劑，它毒性低，屬非危險(xiǎn)品，安全性高。另外本發(fā)明推薦所述聯(lián)合疫苗中含有體積終濃度為0.004％～0.007％的吐溫-80作為穩(wěn)定劑。
各疫苗以血凝素計(jì)濃度為H1N1型人流感疫苗30μg/mL、H3N2型人流感疫苗30μg/mL、B型人流感疫苗30μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗30μg/mL。
所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗以0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液為稀釋劑配制。
所述H1N1型人流感疫苗來自WHO推薦或認(rèn)可的人流感H1N1/IVR-145毒種。所述H3N2型人流感疫苗來自WHO推薦或認(rèn)可的人流感H3N2/NYMC X-161B毒種。所述B型人流感疫苗來自WHO推薦或認(rèn)可的人流感B/Malysia-2506-2004毒種。所述H5N1人禽流感疫苗來自WHO推薦或認(rèn)可的禽流感H5N1減毒株毒種。
所述聯(lián)合疫苗可按本領(lǐng)域常規(guī)方法方便的獲得，主要路線如下病毒種雞胚→培養(yǎng)收獲→離心去沉淀→超濾濃縮→丙內(nèi)脂滅活→區(qū)帶離心→超濾去糖→柱層析→裂解→區(qū)帶離心→超濾去糖→過濾→單價(jià)原液，按照上述方法分別制得單價(jià)病毒原液混合后經(jīng)稀釋，即可得到聯(lián)合疫苗。所述聯(lián)合疫苗可不添加佐劑，也可添加氫氧化鋁作為佐劑。
本發(fā)明聯(lián)合疫苗制備方法優(yōu)選按如下步驟進(jìn)行 (1)人流感H1N1/IVR-145毒種、人流感H3N2/NYMC X-161B毒種、人流感B/Malysia-2506-2004毒種和禽流感H5N1減毒株毒種分別按下述步驟制取單價(jià)疫苗原液 ①毒種經(jīng)傳代、稀釋后接種于雞胚尿囊腔內(nèi)，33～35℃培養(yǎng)48～72小時(shí)； ②篩選活雞胚置2～8℃冷胚12～20小時(shí)，吸取外觀澄清的尿囊液加入甲醛溶液，置2～8℃下18～20小時(shí)，收集病毒液，超濾濃縮40～50倍；需取樣進(jìn)行無菌檢查及血凝效價(jià)測定，要求收獲液無菌檢查合格，血凝效價(jià)不小于1:320。
③濃縮后的病毒液加入病毒液體積1/4000的β-丙內(nèi)脂，2～8℃下滅活18～20小時(shí)； ④滅活后的病毒液經(jīng)純化后，加入終濃度為0.4％的Triton X-100或/和終濃度0.4％脫氧膽酸鈉作為裂解劑，混合后用600W～700W功率的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理2～4min，再置20～30℃下作用90～120分鐘，得到病毒裂解物； ⑤病毒裂解物經(jīng)純化后，加入體積為純化后裂解物體積0.006％的吐溫80作為穩(wěn)定劑，濾膜過濾，得到單價(jià)疫苗原液； (2)將制得單價(jià)疫苗原液按比例混合，以0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液按血凝素含量稀釋至H1N1型人流感疫苗濃度20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗濃度20～40μg/mL、B型人流感疫苗濃度20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗濃度20～40μg/mL，并加入終濃為4～6mg/mL的苯氧乙醇作為防腐劑，濾膜過濾，得到所述人流感-禽流感聯(lián)合疫苗。
具體的，所述聯(lián)合疫苗可按如下步驟獲得 (1)病毒接種與培養(yǎng)取工作種子批毒種，融化后用0.01mol/L的PBS稀釋103-105倍，并加入500μg/ml的卡那霉素。將稀釋后的病毒接種于雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0.2ml，接種后置33～35℃培養(yǎng)，48～72小時(shí)。工作種子批毒種融化后若一次未用完，不得再凍結(jié)使用。疫苗生產(chǎn)過程中不得加入青霉素或其他β-內(nèi)酰胺類抗生素。
(2)病毒收獲篩選活雞胚置2～8℃冷胚12～20小時(shí)，吸取外觀澄清的尿囊液于無菌容器中，加入終濃度為0.04％的比例加入甲醛溶液，置2～8℃下8～20小時(shí)。取樣進(jìn)行無菌檢查及血凝效價(jià)測定，要求收獲液無菌檢查合格，血凝效價(jià)不小于1:320。
(3)病毒收獲液濃縮滅活后的收獲液以13000～15000rpm/min的轉(zhuǎn)速，和不超過1500ml/min的流量進(jìn)行連續(xù)流離心澄清，然后用孔徑為100萬分子量的超濾膜超濾濃縮40～50倍，超濾時(shí)進(jìn)口壓力不超過0.2Mpa。
(4)病毒滅活濃縮后的病毒液內(nèi)加入1/4000(v/v)的β-丙內(nèi)脂，置2～8℃滅活18～20小時(shí)。
(5)病毒純化蔗糖密度區(qū)帶離心濃縮后的病毒液以不超過離心腔容積50％的量上樣，在0～55％的蔗糖溶液中以30000rpm/min的轉(zhuǎn)速梯度離心3小時(shí)，在280nm波長的紫外監(jiān)測下收集第三峰(蔗糖濃度為30％～42％的液段)，以提取病毒，然后在超濾器上用PBS進(jìn)行超濾清洗，以去除蔗糖。
超濾清洗方法為將提取的病毒液用0.01mol/L(pH7.2)的PBS稀釋2～4倍，再用100萬分子量的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，且邊超濾邊補(bǔ)加PBS，使超濾期間的液量保持恒定，并使超濾清洗的PBS總液量不少于所提病毒液的4倍。
(6)柱層析用Sephrose-4FF凝膠進(jìn)行層析純化，層析的上樣量不超過凝膠體積的8％，洗脫液為0.01mol/L的PBS(pH7.2)，洗脫流速為5-6mm/min，在280nm波長的紫外監(jiān)測下收集第一峰。
(7)病毒裂解純化后的病毒液加入終濃度為0.4％Triton X-100或/和0.4％脫氧膽酸鈉作為裂解劑，混合后用600W～700W功率的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理2～4min，再置20～30℃下作用90～120分鐘。
(8)病毒裂解后的純化病毒裂解物以不超過離心腔容積50％的量上樣，在0～55％的蔗糖溶液中以30000r/min的轉(zhuǎn)速梯度離心2小時(shí)，然后在280nm波長的紫外監(jiān)測下去除第一峰和最后一峰，收集蔗糖濃度為2％～42％的液段，再在超濾器上用PBS進(jìn)行超濾清洗，以去除蔗糖。
超濾清洗方法為將離心后的裂解物用0.01mol/L(pH7.2)的PBS稀釋2～4倍，再用10萬分子量的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，且邊濃縮邊補(bǔ)加PBS，使超濾期間的液量保持恒定，并使超濾清洗的PBS總液量不少于裂解物的6倍。
純化后的裂解物加入0.006％(v/v)的吐溫-80，經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過濾，即為單價(jià)原液，應(yīng)置于2～8℃保存。
(9)聯(lián)合疫苗配制將各型單價(jià)原液按血凝素含量稀釋成分別為20～40μg/ml，稀釋劑為0.01mol/L的PBS(pH7.2)，并加入終濃為4～6mg/ml的苯氧乙醇作為防腐劑，0.22μm孔徑的濾膜過濾即為所述聯(lián)合疫苗。
人流感疫苗原本是由甲型流感病毒A1(H1N1)、A3(H3N2)和B型病毒組成的3價(jià)聯(lián)合疫苗，而H5N1與它們同屬同種，與A1(H1N1)、A3(H3N2)同屬于A型，較B型更近，因而在人流感疫苗中加入H5N1成份，理論上相互之間不會有不良的影響。根據(jù)對流感病毒純化技術(shù)的掌握，可以做到聯(lián)合疫苗中與副反應(yīng)密切相關(guān)的4項(xiàng)指標(biāo)(卵蛋白、內(nèi)毒素、總蛋白的含量、總蛋白與血凝素之比)遠(yuǎn)比國家的流感生產(chǎn)規(guī)程低，這是保證聯(lián)合疫苗安全性的物質(zhì)基礎(chǔ)。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種包含H1N1型、H3N2型、B型流感和H5N1型禽流感疫苗的4價(jià)聯(lián)合疫苗及其制備方法，將本發(fā)明人流感-人用禽流感聯(lián)合疫苗，可解決禽流感疫苗接種困難的問題，在預(yù)防人流感的同時(shí)，也解決了禽流感的預(yù)防；按照本發(fā)明方法，制得合疫苗中與副反應(yīng)密切相關(guān)的4項(xiàng)指標(biāo)(卵蛋白、內(nèi)毒素、總蛋白的含量、總蛋白與血凝素之比)遠(yuǎn)比國家的流感生產(chǎn)規(guī)程低，安全性高。


圖1為測得的R1194株血凝素核苷酸序列； 圖2為R1194株血凝素核苷酸序列與原始毒株核苷酸序列差異； 圖3為R1194株血凝素核苷酸序列與原始毒株氨基酸序列變化； 圖4為R1194病毒裂解前的電鏡照片(×60K)； 圖5為R1194病毒裂解后的電鏡照片(×60K)； 圖6為R1194病毒裂解前后的SDS-PAGE電泳結(jié)果；Mmark；1裂解前；2裂解后-A；3～7裂解后-B； 圖7為用確診H5N1禽流感病毒的引物擴(kuò)增疫苗的結(jié)果圖；MMark；1疫苗。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此 實(shí)施例1 聯(lián)合疫苗的獲得 1.1 生產(chǎn)用雞胚 毒種傳代和制備用雞胚應(yīng)來源于SPF雞群；疫苗生產(chǎn)用雞胚應(yīng)來源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的健康雞群。
1.2 毒種 1.2.1 名稱及來源 禽流感毒種NIBRG-14株，來源于英國國家生物制品檢定所(NIBSC)；由A/VietNam/1194/2004 H5N1株經(jīng)反相遺傳的方法改造而成，簡稱R1194株。
流感毒種WHO推薦用于2007-2008年流感疫苗生產(chǎn)的毒株——A1/IVR-145、A3/NYMC X-161B、B/Malysia-2506-2004。
1.2.2 種子批的建立 應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》三部通則“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的要求。
1.2.3 種子批毒種的檢定 主種子批應(yīng)進(jìn)行以下全面檢定，工作種子批應(yīng)至少進(jìn)行1.2.3.1～1.2.3.5項(xiàng)檢定。
1.2.3.1 鑒別試驗(yàn) 用相應(yīng)(亞)型特異性免疫血清按3.1.4進(jìn)行單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，應(yīng)產(chǎn)生特異性沉淀反應(yīng)，證明樣品的抗原性與推薦病毒株一致。
1.2.3.2 血凝效價(jià) 采用直接血凝法進(jìn)行檢測，血凝效價(jià)應(yīng)不低于1:320。。
取樣品25uL于96孔血凝板中用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)稀釋度加等量1％雞紅細(xì)胞懸液，充分混勻于4～8℃放置30～60分鐘判定，以50％的雞紅細(xì)胞被凝集的最高稀釋度判為血凝效價(jià)。
1.2.3.3 病毒滴定 用雞胚感染法測定病毒滴度，應(yīng)不低于7.0Log EID50/mL。
將毒種樣品用普通肉湯培養(yǎng)基作10倍系列稀釋(凍干毒種先溶解并稀釋至1ml，其稀釋度為10-1)，選擇10-4～10-9稀釋度各接種4只9～11日齡雞胚尿囊腔，每胚接種量0.2ml，置34～35℃培養(yǎng)72小時(shí)，24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚應(yīng)廢棄，每胚分別取樣做直接血凝試驗(yàn)，根據(jù)血凝陽性的雞胚數(shù)計(jì)算病毒滴度EID50，以半數(shù)雞胚感染最高稀釋度的負(fù)對數(shù)為病毒滴度。
1.2.3.4 無菌檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
1.2.3.5 支原體檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
1.2.3.6 外源性禽白血病病毒檢測 流感毒種與相應(yīng)(亞)型的抗血清等量混合，37℃中和1小時(shí)后接種9日齡SPF雞胚的成纖維細(xì)胞，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃連續(xù)培養(yǎng)4代，每代7天，同時(shí)設(shè)陽性及陰性對照。采用ELISA法檢測培養(yǎng)物，檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。
1.2.3.7 外源性禽腺病毒檢測 流感毒種與相應(yīng)(亞)型的抗血清等量混合，37℃中和1小時(shí)后接種于用13日齡SPF雞胚肝制備的單層細(xì)胞，置5％CO2培養(yǎng)箱37℃連續(xù)培養(yǎng)4代，每代7天，同時(shí)設(shè)陽性及陰性對照。分別用血清學(xué)的方法檢查培養(yǎng)物中的I型和III型外源性禽腺病毒，檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。
1.2.4 毒種傳代 取毒種復(fù)溶至1mL，稀釋至103～105后接種9～11日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量0.2mL/胚，33～35℃培養(yǎng)72小時(shí)后收獲尿囊液并混合，加等量脫脂牛乳后分裝(0.2mL/支)凍干后保存于-70℃以下，經(jīng)檢定合格即為主代種子批。從主種子批取出的毒種按上述方法傳代，收獲液分裝并凍存于-20℃以下即為工作種子批。毒株自分離起至生產(chǎn)出的疫苗代次不得超過15代，生產(chǎn)企業(yè)自獲得毒種到制成工作種子批傳代不得超過4代。
1.2.5 毒種保存 凍干毒種在-70℃以下保存；液體毒種在-20℃以下保存。
1.3 單價(jià)原液的獲得 1.3.1 雞胚準(zhǔn)備 選用9～11日齡的無畸形、血管清晰、有活性的雞胚。
1.3.2 病毒接種與培養(yǎng) 取工作種子批毒種，融化后用0.01mol/L的PBS稀釋105倍，并加入500μg/mL的卡那霉素。將稀釋后的病毒接種于雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0.2mL，接種后置33～35℃培養(yǎng)72小時(shí)。工作種子批毒種融化后若一次未用完，不得再凍結(jié)使用。疫苗生產(chǎn)過程中不得加入青霉素或其他β-內(nèi)酰胺類抗生素。
1.3.3 病毒收獲 篩選活雞胚置2～4℃冷胚18小時(shí)，吸取外觀澄清的尿囊液于無菌容器中，加入終濃度為0.04％的比例加入甲醛溶液，置2～8℃下20小時(shí)。取樣進(jìn)行無菌檢查及血凝效價(jià)測定，要求收獲液無菌檢查合格，血凝效價(jià)不小于1:320。
1.3.4 病毒收獲液濃縮 滅活后的收獲液以15000rpm/min的轉(zhuǎn)速，和不超過1500mL/min的流量進(jìn)行連續(xù)流離心澄清，然后用孔徑為100萬分子量的超濾膜超濾濃縮50倍，超濾時(shí)進(jìn)口壓力不超過0.2Mpa。
1.3.5 病毒滅活 濃縮后的病毒液內(nèi)加入1/4000(v/v)的β-丙內(nèi)脂，置2～8℃滅活20小時(shí)。
1.3.6 病毒純化 1.3.6.1 蔗糖密度區(qū)帶離心 濃縮后的病毒液以不超過離心腔容積50％的量上樣，在0～55％的蔗糖溶液中以30000rpm/min的轉(zhuǎn)速梯度離心3小時(shí)，在280nm波長的紫外監(jiān)測下收集第三峰(蔗糖濃度為30％～42％的液段)，以提取病毒，然后在超濾器上用PBS進(jìn)行超濾清洗，以去除蔗糖。
超濾清洗方法為將提取的病毒液用0.01mol/L(pH7.2)的PBS稀釋4倍，再用100萬分子量的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，且邊超濾邊補(bǔ)加PBS，使超濾期間的液量保持恒定，并使超濾清洗的PBS總液量不少于所提病毒液的4倍。
1.3.7.2 柱層析 用Sephrose-4FF凝膠進(jìn)行層析純化，層析的上樣量不超過凝膠體積的8％，洗脫液為0.01mol/L的PBS(pH7.2)，洗脫流速為5～6mm/min，在280nm波長的紫外監(jiān)測下收集第一峰。
1.3.8 病毒裂解 純化后的病毒液加入終濃度為0.4％Triton X-100和0.4％脫氧膽酸鈉作為裂解劑，混合后用600W～700W功率的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理4min，再置20～30℃下作用120分鐘。
1.3.9 病毒裂解后的純化 病毒裂解物以不超過離心腔容積50％的量上樣，在0～55％的蔗糖溶液中以30000r/min的轉(zhuǎn)速梯度離心2小時(shí)，然后在280nm波長的紫外監(jiān)測下去除第一峰和最后一峰，收集蔗糖濃度為2％～42％的液段，再在超濾器上用PBS進(jìn)行超濾清洗，以去除蔗糖。
超濾清洗方法為將離心后的裂解物用0.01mol/L(pH7.2)的PBS稀釋2～4倍，再用10萬分子量的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，且邊濃縮邊補(bǔ)加PBS，使超濾期間的液量保持恒定，并使超濾清洗的PBS總液量不少于裂解物的6倍。
1.3.10 過濾 純化后的裂解物加入0.006％(v/v)的吐溫80，經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過濾，即為單價(jià)原液。
1.3.11 原液保存 應(yīng)置于2～8℃保存。
1.4 聯(lián)合疫苗半成品 1.4.1 聯(lián)合疫苗配制 將各型單價(jià)原液按血凝素含量稀釋成30μg/mL，稀釋液劑為0.01mol/L的PBS(pH7.2)，并加入終濃為5mg/mL的苯氧乙醇作為防腐劑，0.22μm孔徑的濾膜過濾即為聯(lián)合疫苗半成品。
1.5 聯(lián)合疫苗成品 1.5.1 分批 應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》三部通則“生物制品分批規(guī)程”的要求。
1.5.2 分裝 應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》三部通則“生物制品分裝和凍干規(guī)程”的規(guī)定。
1.5.3 規(guī)格 每瓶(支)0.5mL。每1人用劑量為0.5mL，含各流感病毒株血凝素應(yīng)不低于15μg。
1.5.4 包裝 應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》三部通則“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。
2、檢定 2.1 單價(jià)原液檢定 2.1.1 無菌檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
2.1.2 病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn) 將滅活后樣品按原倍及1:10和1:100稀釋后分組接種于9～11日齡雞胚尿囊腔中，每胚接種0.2mL，每個(gè)稀釋度接種10個(gè)雞胚，置33～35℃培養(yǎng)72小時(shí)。24小時(shí)內(nèi)死亡的不計(jì)數(shù)，每組雞胚至少存活80％。自存活雞胚中每胚取0.5mL尿囊液，按組混合后，再盲傳一代，每組接種于9～11日齡雞胚尿囊腔中，每胚0.2mL，每個(gè)稀釋度接種10個(gè)雞胚，置33～35℃培72小時(shí)，取尿囊液進(jìn)行直接血凝試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)血凝反應(yīng)。
2.1.3 鑒別試驗(yàn) 用相應(yīng)(亞)型特異性免疫血清按3.1.4進(jìn)行單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，應(yīng)產(chǎn)生特異性沉淀反應(yīng)，證明樣品的抗原性與推薦病毒株一致。
2.1.4 血凝素含量 采用單向免疫擴(kuò)散法。
制備含病毒標(biāo)準(zhǔn)血清的1％瓊脂糖凝膠板，打孔(孔徑為2.5～3mm)，將標(biāo)準(zhǔn)抗原和待檢樣品分別以每孔10μL的量加入，置20～25℃擴(kuò)散至少21小時(shí)，用PBS浸泡1小時(shí)后干燥、染色、脫色。準(zhǔn)確測量標(biāo)準(zhǔn)抗原和待檢樣品所形成的沉淀環(huán)直徑，以標(biāo)準(zhǔn)抗原形成的沉淀環(huán)的直徑及相應(yīng)抗原含量進(jìn)行直線回歸，求出直線回歸方程，代入檢品的沉淀環(huán)直徑，即可得到原液的血凝素的含量。
2.2 聯(lián)合疫苗半成品檢定 2.2.1 無菌檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
2.2.2 血凝素含量 按2.1.4項(xiàng)進(jìn)行，要求為24～36μg/株/mL。
2.2.3 總蛋白含 按“Lowry法”測定，應(yīng)不高于(420μg/mL)，且不超過疫苗血凝素含量的4.2倍。
2.2.4 卵清蛋白含量 采用對流免疫電泳法進(jìn)行檢測，應(yīng)不高于250ng/mL。
將抗卵清蛋白免疫血清加入1％瓊脂糖凝膠板上陰極孔、待測樣品加入1％瓊脂糖凝膠板上陽極孔，每孔10uL(孔徑2.5mm，孔間距約1cm)，在電泳儀上以120V～150V電壓電泳35～40min，然后在水中浸泡1小時(shí)，再進(jìn)行干燥、染色和脫色。同時(shí)做0～1000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，將樣品測定孔與標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行對照，觀察和判斷樣品中卵清蛋白含量。
2.2.5 Triton X100殘留量測定 殘留量應(yīng)不高于100μg/mL。
2.2.5 吐溫80含量的測定 含量應(yīng)不高于60μg/mL。
2.2.6 苯氧乙醇含量的測定 含量應(yīng)為4～6m g/mL。
2.2.7 脫氧膽酸鈉含量的測定 含量應(yīng)不高于100μg/mL。
2.3 成品檢定 2.3.1 外觀檢查 疫苗外觀為無色或微乳白色液體，無異物。
2.3.2 裝量 依法檢查，應(yīng)不低于標(biāo)示量。
2.3.3 無菌檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
2.3.4 鑒別試驗(yàn) 按2.1.3項(xiàng)進(jìn)行，結(jié)果證明其抗原性與推薦的病毒株相一致。
2.3.5 血凝素含量 按2.1.4項(xiàng)進(jìn)行，血凝素(HA)含量應(yīng)為(30±6μg/mL)。
2.3.6 pH 依法檢查，pH應(yīng)為7.0～7.6。
2.3.7 游離甲醛含量 依法檢查，應(yīng)不高于20μg/mL。
2.3.8 苯氧乙醇含量 含量應(yīng)為4～6mg/mL。
2.3.9 總蛋白含量 用Lowry法測定，應(yīng)不超過420μg/mL，且不超過疫苗血凝素含量的4.2倍。
2.3.10 卵清蛋白含量 按2.2.4項(xiàng)進(jìn)行，卵清蛋白含量應(yīng)不高于250ng/mL。
2.3.11 細(xì)菌內(nèi)毒素含量測定 依法檢查，應(yīng)不高于50EU/mL。
2.3.12 異常毒性檢查 依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
實(shí)施例2 一、實(shí)驗(yàn)材料及步驟 1、疫苗免疫動物試驗(yàn) 按實(shí)施例1方法制得的聯(lián)合疫苗，經(jīng)對多種動物免疫試驗(yàn)證明，雞和小鼠敏感性很差，大鼠又太敏感，而家兔較理想，表現(xiàn)在抗體反應(yīng)相對穩(wěn)定、量-效反應(yīng)明顯、強(qiáng)度適中接近于人體，血量大和采血容易等特點(diǎn)。
試驗(yàn)用的家兔為新西蘭種，2公斤左右，雌雄不分，來自浙江省農(nóng)科院。
2、疫苗免疫家兔試驗(yàn) 1)劑量與分組(按實(shí)施例1方法制得的各單價(jià)疫苗原液，以0.01mol/L的PBS(pH7.2)稀釋，配制成下述組成的單價(jià)或多價(jià)疫苗，含佐劑疫苗添加氫氧化鋁為佐劑，其用量為0.5mg/mL) ①各15μg HA/0.5mL無佐劑人流感3價(jià)疫苗。
②各15μg HA/0.5mL佐劑人流感3價(jià)疫苗。
③15μg HA/0.5mL無佐劑禽流感單價(jià)疫苗。
④15μg HA/0.5mL佐劑禽流感單價(jià)疫苗。
⑤各15μg HA/0.5mL無佐劑人流感-禽流感4價(jià)苗。
⑥各15μg HA/0.5mL佐劑人流感-禽流感4價(jià)疫苗。
⑦各15μg HA/0.5mL無佐劑人流感-禽流感4價(jià)苗。
⑧各15μg HA/0.5mL佐劑人流感-禽流感4價(jià)疫苗。
⑨空白對照(不接種任何疫苗)。
2)免疫方法每只家兔大腿肌肉分別接種各組疫苗0.5mL，每組5只，15天后同樣方法加強(qiáng)一針，共2針，(7)(8)2組不加強(qiáng)。
3)采血 1～6組于0、15、30天時(shí)采血共3次 ①首針前當(dāng)天(觀察免前抗體水平)； ②加強(qiáng)接種前當(dāng)天(觀察1針后15天的抗體水平)； ③加強(qiáng)接種后15天(觀察2針后的抗體水平)； 7～8組于0、30天時(shí)采血共2次 ①首針前當(dāng)天(觀察免前抗體水平)； ②首針后30天(觀察1針后30天的抗體水平)。
各靜脈采血5～10mL，分離血清，-30℃以下凍存，用于測血抑抗體和中和抗體。
2、急性毒性試驗(yàn) 上述6種疫苗，按我國的生物制品規(guī)程要求，分別在小鼠和豚鼠中進(jìn)行急性毒性安全性試驗(yàn)。
4、中和抗體檢測 在蛋胚中測定，固定病毒(103EID50/mL)，稀釋血清，病毒與血清等量混合，37℃中和90分鐘，每只蛋胚接種0.2mL(含100EID50)，每稀釋度接種4只蛋胚，4只全抑制的最高稀釋度為中和效價(jià)。
5、血凝抑制試驗(yàn) 按常規(guī)方法，血凝素，用R1194毒種蛋胚培養(yǎng)液自制；霍亂濾液由中國國家流感中心提供。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 1、R1194病毒傳代R1194各代病毒滴度的測定見表1 表1R1194各代病毒滴度的測定 2、R1194毒種的亞型鑒別 用A1、A3、B和H5N4種抗血清，與相應(yīng)抗原進(jìn)行交叉單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，以鑒別其亞型，結(jié)果(見表2)符合H5亞型。
表2各型流感病毒交叉單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)
3、R1194株核苷酸序列測定 1)測得的R1194株血凝素核苷酸序列見圖1 2)與原始毒株核苷酸序列差異見圖2 從圖2可知R1194株的核苷酸序列與原始毒株比較，去了1022至1033的12個(gè)堿基，在1015、1034和1036位置上的A由C取代。3)與原始毒株氨基酸序列變化見圖3 從圖3可知R1194株比原始毒株少RRRK四個(gè)氨基酸，下一個(gè)K由T取代?，F(xiàn)已知含有R-R-R-K-K-R氨基酸序列的禽流感毒株屬高致病力毒株。
4、接種滴度、溫度及培養(yǎng)時(shí)間的確定 表3不同接種滴度、溫度及培養(yǎng)時(shí)間病毒的效果比較
備注血凝滴度(1/)，病毒滴度(Lg) 確定培養(yǎng)溫度為34.5℃，接種滴度為104，培養(yǎng)時(shí)間為72h。
5、疫苗的檢定 1)單價(jià)疫苗原液檢定結(jié)果見表4 表4單價(jià)疫苗原液檢定結(jié)果 2)聯(lián)合疫苗半成品檢定結(jié)果見表5 表5聯(lián)合疫苗半成品檢定結(jié)果

3)R1194病毒裂解前后的電鏡形態(tài)見圖4和圖5 4)R1194病毒裂解前后的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖6 從圖6可知，純化病毒裂解前后，均可看到典型的核酸和血凝素條帶。
5)免疫源性檢查 丙內(nèi)脂滅活病毒，純化、裂解后，配成15μg/0.5ml，免疫家兔4只，每只肌肉接種0.5ml，15天后加強(qiáng)一針，首針后30天采血，測定血抑抗體和中和抗體，結(jié)果均大于1:40。
6)疫苗的核酸擴(kuò)增 用國家流感中心提供確診H5N1禽流感病毒的引物，擴(kuò)增疫苗的電泳，結(jié)果擴(kuò)增出378bp的禽流感病毒的基因片段(見圖7))。此法也可用于對此疫苗的鑒別試驗(yàn)。
7、免疫家兔血清中和抗體檢測結(jié)果干擾現(xiàn)象分析 1)無佐劑的禽流感單價(jià)疫苗和人流感-禽流感4價(jià)聯(lián)合疫苗，分別免疫家兔，比較產(chǎn)生禽流感病毒抗體的情況(見表6) 表6無佐劑的2種苗產(chǎn)生禽流感病毒中和抗體的滴度比較(1/)
“-”表示<1:10；結(jié)果干擾現(xiàn)象不明顯，抗體滴度均大于1:20。
2)含佐劑的禽流感單價(jià)疫苗和人流感-禽流感4價(jià)聯(lián)合疫苗，分別免疫家兔，比較產(chǎn)生禽流感病毒抗體的情況(見表7) 表7含佐劑的2種苗產(chǎn)生禽流感病毒中和抗體的滴度比較(1/)
“-”表示<1:10；結(jié)果干擾現(xiàn)象明顯(P<0.05)，但有1:76.9的抗體。
3)無佐劑的人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感4價(jià)聯(lián)合疫苗，分別免疫家兔，比較產(chǎn)生A1型流感病毒中和抗體的情況(見表8) 表8無佐劑的2種苗產(chǎn)生A1型流感病毒中和抗體的滴度比較(1/)
“-”表示<1:10；結(jié)果干擾現(xiàn)象一針不明顯；二針明顯(P<0.05)，但中和抗體滴度已高達(dá)1:615.1。
4)含佐劑的人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感4價(jià)聯(lián)合疫苗，分別免疫家兔，比較產(chǎn)生A1型流感病毒中和抗體的情況(見表9) 表9含佐劑的2種苗產(chǎn)生A1型流感病毒中和抗體的滴度比較(1/)
“-”表示<1:10；結(jié)果干擾現(xiàn)象一針不明顯；二針明顯(P<0.05)，但中和抗體滴度已高達(dá)1:637。
5)無佐劑的人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感4價(jià)聯(lián)合疫苗，分別免疫家兔，比較產(chǎn)生B型流感病毒中和抗體的情況(見表10) 表10無佐劑的2種苗產(chǎn)生B型流感病毒中和抗體的滴度比較(1/)
“-”表示<1:10；結(jié)果一針<1:10；二針均很高，干擾現(xiàn)象不明顯。
6)含佐劑的人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感4價(jià)聯(lián)合疫苗，分別免疫家兔，比較產(chǎn)生B型流感病毒中和抗體的情況(見表11) 表11含佐劑的2種苗產(chǎn)生B型流感病毒中和抗體的滴度比較(1/)
“-”表示<1:10；結(jié)果一針<1:10；二針均很高，干擾現(xiàn)象不明顯。
7)無佐劑的人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感4價(jià)聯(lián)合疫苗，分別免疫家兔，比較產(chǎn)生A3型流感病毒中和抗體的情況(見表12) 表12無佐劑的2種苗產(chǎn)生A3型流感病毒中和抗體的滴度比較(1/)

結(jié)果干擾現(xiàn)象不明顯；4價(jià)苗免疫后滴度高些，可能與免疫前滴度高有關(guān)。
8)含佐劑的人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感4價(jià)聯(lián)合疫苗，分別免疫家兔，比較產(chǎn)生A3型流感病毒中和抗體的情況(見表13) 表13含佐劑的2種苗產(chǎn)生A3型流感病毒中和抗體的滴度比較(1/)
結(jié)果干擾現(xiàn)象不明顯；4價(jià)苗免疫后滴度高些，可能與免疫前滴度高有關(guān)。
9)人-禽流感4價(jià)聯(lián)合無佐劑疫苗，免疫家兔1針30天后，檢查中和抗體的情況見表14 表14人-禽流感4價(jià)聯(lián)合無佐劑苗1針30天的中和抗體滴度(1/) ()內(nèi)的數(shù)字為免疫前的中和抗體，“-”表示<1:10；結(jié)果僅H5N1較低。
10)人-禽流感4價(jià)聯(lián)合含佐劑疫苗，免疫家兔1針30天后，檢查中和抗體的情況見表15 表15人-禽流感4價(jià)聯(lián)合含佐劑苗1針30天的中和抗體滴度(1/) ()內(nèi)的數(shù)字為免疫前的中和抗體，“-”表示<1:10；結(jié)果H5N1也大于1:20。
11)家兔免疫血清血抑抗體檢測結(jié)果基本與中和抗體相似。
12)對照組家兔在實(shí)驗(yàn)期間，與實(shí)驗(yàn)家兔一樣同時(shí)采血，結(jié)果除檢出相似滴度的A3型流感中和抗體外，均未檢出流感A1、B型和H5N1禽流感抗體，表明對照成立。
8、抗體檢測結(jié)果總結(jié) 1)免前家兔抗體檢查結(jié)果 (1)未查到禽流感H5N1和流感B型的中和抗體； (2)個(gè)別檢出低滴度的流感A1型中和抗體； (3)普遍有很高的流感A3型中和抗體。
2)含有禽流感抗原疫苗的接種 (包括禽流感疫單價(jià)苗和人-禽流感聯(lián)合4價(jià)疫苗) 1針后無佐劑或佐劑苗，均未檢查到中和抗體。
2針后無佐劑或佐劑苗，均檢查到中和抗體，均>1:20。
3)含有A型抗原疫苗的接種 (包括人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感聯(lián)合4價(jià)疫苗) 1針后無佐劑或佐劑苗，均檢查均值>1:20的A型中和抗體； 2針后無佐劑或佐劑苗，均檢查到很高的A型中和抗體， 4)含有B型抗原疫苗的接種 (包括人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感聯(lián)合4價(jià)疫苗) 1針后無佐劑苗未查到中和抗體；佐劑苗查到均數(shù)<1:20的中和抗體； 2針后無佐劑或佐劑苗，均檢查較高的中和抗體。
5)含有A3型抗原疫苗的接種 (包括人流感3價(jià)疫苗和人-禽流感聯(lián)合4價(jià)疫苗) 由于免前均有較高的中和抗體，均數(shù)已達(dá)1:800左右，1針和2針后，中和抗體高達(dá)1:5000以上，因而檢測禽流A3型中和抗體已無必要。家兔免前具有較高的中和抗體，可能是A3型流感病毒在人群和兔群廣泛傳播有關(guān)，從上海動物中心購得的每只300元的SPF家兔，免前也檢測到很高的中和抗體。
6)人-禽流感4價(jià)聯(lián)合無佐劑苗1針后15天，A1型流感病毒中和抗體已達(dá)1:49.2，而B型中和抗體<1:10，但1針后30天A1型更高，達(dá)1:236.9，B型也達(dá)1:81.9，由此可知，接種1針人-禽流感4價(jià)聯(lián)合無佐劑苗，對人流感的A1、A3、B型3種病毒與傳統(tǒng)的流感疫苗一樣，均能達(dá)到很好的預(yù)防效果，如果制成佐劑苗，則效果更好。
7)檢測免疫家兔血清中血抑抗體的結(jié)果，與中和抗體相似，由于中和抗體直接反映殺毒的能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果又穩(wěn)定、客觀，而血抑抗體雖方法簡便，但影響因素較多，可靠性不如中和抗體。
9、從上述結(jié)果可知人流感疫苗和禽流感疫苗的聯(lián)合，基本沒有發(fā)生干擾，特別是無佐劑苗，即使個(gè)別佐劑苗受一些干擾，但均已產(chǎn)生較高的中和抗體，提示2種疫苗的聯(lián)合是完全可能的。
10、6種苗均通過小鼠和豚鼠的急性安全性試驗(yàn)。
11、制造人-禽流感聯(lián)合疫苗的設(shè)想 工藝裂解疫苗—成人、兒童都適用。
劑型無佐劑苗—透明液體，同傳統(tǒng)流感苗，易推廣；或含氫氧化鋁佐劑(0.5mg/0.5ml)疫苗，其免疫效果更好些。
劑量各15μg—已證實(shí)人流感1針，禽流感2針有效。
程序1針，用于預(yù)防人流感；并作為禽流感基礎(chǔ)免疫，需突發(fā)預(yù)防禽流感時(shí)再加強(qiáng)1針。
2針，用于禽流感疫區(qū)居民，和接觸禽類的重點(diǎn)人群。
12、與流感疫苗一樣，隨著全社會每年不斷的重復(fù)接種和推廣，使H5N1禽流感抗體在人群中不斷地加強(qiáng)和擴(kuò)大，這樣可能達(dá)到和目前的H1N1流感一樣，即使H5N1病毒獲得人傳人的能力，也不可怕了。
權(quán)利要求
1.一種人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，主要包括H1N1型人流感疫苗、H3N2型人流感疫苗、B型人流感疫苗和H5N1型人禽流感疫苗，各疫苗以血凝素計(jì)濃度為H1N1型人流感疫苗20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗20～40μg/mL、B型人流感疫苗20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗20～40μg/mL。
2.如權(quán)利要求1所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，其特征在于所述聯(lián)合疫苗中還含有防腐劑苯氧乙醇4～6mg/mL。
3.如權(quán)利要求1所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，其特征在于所述聯(lián)合疫苗中還含有終濃度為0.004％～0.007％的吐溫-80。
4.如權(quán)利要求2所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，其特征在于各疫苗以血凝素計(jì)濃度為H1N1型人流感疫苗30μg/mL、H3N2型人流感疫苗30μg/mL、B型人流感疫苗30μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗30μg/mL。
5.如權(quán)利要求1～4之一所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗以0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液為稀釋劑制成。
6.如權(quán)利要求1～4之一所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，其特征在于所述H1N1型人流感疫苗來自人流感H1N1毒種。
7.如權(quán)利要求1～4之一所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，其特征在于所述H3N2型人流感疫苗來自人流感H3N2毒種。
8.如權(quán)利要求1～4之一所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，其特征在于所述B型人流感疫苗來自人流感B毒種。
9.如權(quán)利要求1～4之一所述的人流感-禽流感聯(lián)合疫苗，其特征在于所述H5N1人禽流感疫苗來自禽流感H5N1減毒株毒種。
10.如權(quán)利要求1所述人流感-禽流感聯(lián)合疫苗的制備方法，所述方法包括
(1)人流感H1N1/IVR-145毒種、人流感H3N2/NYMC X-161B毒種、人流感B/Malysia-2506-2004毒種和禽流感H5N1減毒株毒種分別按下述步驟制取單價(jià)疫苗原液
①毒種經(jīng)傳代、稀釋后接種于雞胚尿囊腔內(nèi)，33～35℃培養(yǎng)48～72小時(shí)；
②篩選活雞胚置2～8℃冷胚12～20小時(shí)，吸取外觀澄清的尿囊液加入甲醛溶液，置2～8℃下18～20小時(shí)，收集病毒液，超濾濃縮40～50倍；
③濃縮后的病毒液加入體積為病毒液體積1/4000的β-丙內(nèi)脂，2～8℃下滅活18～20小時(shí)；
④滅活后的病毒液經(jīng)純化后，加入終濃度為0.4％的Triton X-100或/和終濃度0.4％脫氧膽酸鈉作為裂解劑，混合后用600W～700W功率的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理2～4min，再置20～30℃下作用90～120分鐘，得到病毒裂解物；
⑤病毒裂解物經(jīng)純化后，加入體積為純化后裂解物體積0.006％的吐溫-80作為穩(wěn)定劑，濾膜過濾，得到單價(jià)疫苗原液；
(2)將制得單價(jià)疫苗原液按比例混合，以0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液按血凝素含量稀釋至H1N1型人流感疫苗濃度20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗濃度20～40μg/mL、B型人流感疫苗濃度20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗濃度20～40μg/mL，并加入終濃為4～6mg/mL的苯氧乙醇作為防腐劑，濾膜過濾，得到所述人流感-禽流感聯(lián)合疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種包含H1N1型、H3N2型、B型流感和H5N1型禽流感疫苗的4價(jià)聯(lián)合疫苗及其制備方法，各疫苗以血凝素計(jì)濃度為H1N1型人流感疫苗20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗20～40μg/mL、B型人流感疫苗20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗20～40μg/mL。將本發(fā)明人流感-人用禽流感聯(lián)合疫苗，可解決禽流感疫苗接種困難的問題，在預(yù)防人流感的同時(shí)，也解決了禽流感的預(yù)防；按照本發(fā)明方法，制得聯(lián)合疫苗中與副反應(yīng)密切相關(guān)的4項(xiàng)指標(biāo)(卵蛋白、內(nèi)毒素、總蛋白的含量、總蛋白與血凝素之比)遠(yuǎn)比國家的流感生產(chǎn)規(guī)程低，安全性高。
文檔編號A61K39/295GK101450207SQ20081016376
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者朱智勇 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心, 浙江天元生物藥業(yè)股份有限公司