專利名稱：：豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清的藥物在治療禿發(fā)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療禿發(fā)的藥物，特別是涉及一種豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清的藥物及其在治療禿發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：禿發(fā)是皮膚科臨床常見疾病之一，占皮膚科門診量的1015%，由于生活節(jié)奏的加快，這一數(shù)字還有進(jìn)一步升高的趨勢，禿發(fā)進(jìn)一步發(fā)展可演變?yōu)槠斩d和全禿，這給患者身心帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。一般認(rèn)為，毛乳頭細(xì)胞(dermalpapillacdls，DPC)在毛囊的發(fā)育及周期性生長調(diào)控中起重要作用。要闡明人毛乳頭細(xì)胞對調(diào)節(jié)毛囊生長和發(fā)育的機(jī)制，必須從人毛乳頭細(xì)胞自身分泌的生物活性成份著手，來建立人毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，應(yīng)用低傳代人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)上清制成條件培養(yǎng)基，觀察其對不同傳代的人毛乳頭細(xì)胞生長狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液(dermalpapillacellconditionalmediumDPCCM)能將非凝集生長的人毛乳頭細(xì)胞有效誘導(dǎo)為凝集性生長狀態(tài)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。人毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液在人體內(nèi)也證實(shí)有生物學(xué)活性；可以促進(jìn)禿發(fā)患者禿發(fā)區(qū)毛發(fā)的生長，并取得了良好的療效。但人毛乳頭細(xì)胞來源有限，為了產(chǎn)業(yè)化，我們用豬毛乳頭細(xì)胞來替代人毛乳頭細(xì)胞，為毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用于臨床治療禿發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容為進(jìn)一步驗(yàn)證豬毛乳頭細(xì)胞生長活性蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性，并將豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液制成凍干粉，本發(fā)明的目的在于提供一種豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清的藥物。初步應(yīng)用于禿發(fā)患者，發(fā)現(xiàn)其有確切的治療作用。本發(fā)明的另一目的在于提供制備豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清的藥物的方法。本發(fā)明的再一目的在于豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清作藥物在制備治療斑禿的藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種治療禿發(fā)的藥物，用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代豬毛乳頭細(xì)胞，收集低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清，將所收集上清液制備成凍干粉。上述低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清制備成凍干粉的步驟包括(1)豬皮標(biāo)本的處理及毛乳頭分離a).取健康版納微型豬軀干部位全層豬皮后保存于4'C生理鹽水中，在清洗臺上用手術(shù)刀剃除豬毛，刮胡刀刮豬皮至發(fā)白，自來水沖洗；存放于加80萬單位青霉素和100萬單位鏈霉素500mL生理鹽水中；b).在超凈臺上將己處理好的豬皮在不銹鋼腎形彎盤中用75%酒精泡20min,75%酒精棉球擦洗3遍，然后用生理鹽水反復(fù)用力沖洗5遍，每遍為5min，每一遍后均需換用新消毒的不銹鋼腎形彎盤；c).用組織剪剪去標(biāo)本邊緣部分，將豬皮放在己消毒好的木板上，用手術(shù)刀分離皮下筋膜層，用眼科剪清理殘留的皮下筋膜，隨后進(jìn)行細(xì)胞的消化分離；d).用組織剪將處理干凈的標(biāo)本剪成0.30.5cm寬，34cm長的皮條，再將皮條從真皮一皮下脂肪層交界處剪開，將位于脂肪層組織內(nèi)毛囊的毛乳頭置于直徑為5cm的平皿中，加入0.5%分離酶浸沒，將平皿放入已消毒好的不銹鋼飯盒中，4匸過夜10hrs;e).次日再將平皿37'C熱消化30min，以生理鹽水將組織漂洗3次，用眼科鑷將脂肪組織內(nèi)殘留毛囊下段擠出，用組織剪將脂肪組織剪成米粒樣大小，以0.29&IV型膠原酶于平皿中37°。消化4hrs，中間時(shí)間無菌攪動(dòng)一次，消化時(shí)搖動(dòng)消化平皿，在倒置顯微鏡下觀察，直到真皮鞘消化成游離細(xì)胞，而毛乳頭尚未開始消化，毛乳頭從蒂部游離時(shí)即可中止消化；f).將尚未消化組織去除，向消化液中加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合后移入50ml離心管中，以2000rpm10min離心，傾去上清液，管底沉淀組織移入含DMEM的平皿中清洗，將其中網(wǎng)絡(luò)的大量毛乳頭洗下，洗下液體再加入50ml離心管中，以1000rpm離心5min;g).將清洗液移入10mL的離心管中500rpm低速離心3次，每次3min，每次緩慢吸去上清液棄之，棄去上清液中含游離真皮鞘細(xì)胞，底層混懸液中含有大量的毛乳頭，少許毛球部雜質(zhì)，無其他游離細(xì)胞，在直徑為3cm的平皿中清洗；h).最后一次在10mL的離心管中以1000rpm離心5min,去上清后加入含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基后接種；j).將豬毛乳頭按80100個(gè)/瓶接種于50ml—次性培養(yǎng)瓶中，在37°C5XC02飽和水氣條件下培養(yǎng)，待毛乳頭貼壁后，換液即可將不貼壁的毛球部、雜質(zhì)去除；約2周左右細(xì)胞融合后可傳代培養(yǎng)；(2)豬毛乳頭的培養(yǎng)將豬毛乳頭按80100個(gè)/瓶接種于50ml—次性培養(yǎng)瓶中，在37°C5%C02飽和水氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待大部分毛乳頭貼壁后，更換培養(yǎng)基，同時(shí)亦可將不能貼壁或尚未貼壁的毛球部、纖維組織及其他雜質(zhì)除去，培養(yǎng)瓶中即為純的毛乳頭，約2周后細(xì)胞融合后可進(jìn)行1:3傳代培養(yǎng)；(3)豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集過程為a).培養(yǎng)時(shí)在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)，100ml培養(yǎng)瓶中加入7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)，3天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b).開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75%酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在離心機(jī)中離心；c).在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標(biāo)記，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?4)豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的凍干過程為a).凍干室紫外線消毒4小時(shí)；b).操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75%酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將藥物分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；C).將凍千瓶放入凍干機(jī)中；d).連續(xù)凍干過程:I-40°C4小時(shí)II-20°C3小時(shí)III-5°C10小時(shí)IV5°C4小時(shí)V15°C3小時(shí)VI25。C5小時(shí)e)在真空環(huán)境下，用手搖下壓力蓋，真空封包凍干瓶完成；f)打開凍干機(jī)凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；g)貼上標(biāo)簽，注明標(biāo)識和日期，4C保存?zhèn)溆谩Ｖ委煻d發(fā)的藥物的理化特性為顏色白色；形態(tài)粉末狀；pH值7.35;溶解度每瓶用3ml生理鹽水在3秒鐘內(nèi)可完全溶解，溶解后液體為橙紅色。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果是豬毛乳頭細(xì)胞為分泌性細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)可分泌許多蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可促進(jìn)毛囊的生長和發(fā)育，在體外實(shí)驗(yàn)已證明其有確切的生物學(xué)活性，但其應(yīng)用于臨床還未見報(bào)道，本發(fā)明在原有培養(yǎng)豬毛乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)上，改進(jìn)其培養(yǎng)基，用人AB型血清替代小牛血清，成功地培養(yǎng)出豬毛乳頭細(xì)胞，本發(fā)明收集培養(yǎng)過低傳代豬毛乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用于臨床治療禿發(fā)，觀察其治療效果，發(fā)現(xiàn)其有確切的治療作用，取得了良性的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。應(yīng)用本發(fā)明制備的藥物在治療禿發(fā)中有明顯的療效，明顯優(yōu)于其它藥物對禿發(fā)的治療效果，本發(fā)明用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)豬毛乳頭細(xì)胞，較以前用小牛血清培養(yǎng)豬毛乳頭細(xì)胞和用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞在技術(shù)上取得了突破，這就為本藥物應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。圖1禿發(fā)藥物治療前照片圖2禿發(fā)藥物治療后照片具體實(shí)施方式實(shí)施例1低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清制備成凍干粉的步驟主要分為人AB型血清制備和豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集(1)人AB型血清制備的步驟為a)采集健康獻(xiàn)血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37-C水箱中放置l小時(shí)；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，e)將人AB型血清在56""C水箱中放置1小時(shí)去除補(bǔ)體，注意其上下溫差應(yīng)小于0.5'C;f)在超凈臺上用2%碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；g)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；h)用吸管分裝為15ml/瓶，-201:凍存?zhèn)溆谩?2)上述人AB型血清制備的步驟也可為a)采集健康獻(xiàn)血員全血200ml入無抗凝劑的血袋；b)將全血血袋37。C水箱中放置1小時(shí)；c)2000rpm離心30分鐘；d)用血清分離器分離人AB型血清，所分離的AB型血清可放入-2(TC冷凍箱備用；e)將人AB型血清袋從-2(TC冷凍箱中取出，放入4。C冷藏箱中12小時(shí)；f)將人AB型血清室溫放置2小時(shí)；g)將人AB型血清在37'C水箱中放置1小時(shí)；h)將人AB型血清在56-C水箱中放置1小時(shí)去除補(bǔ)體，注意其上下溫差應(yīng)小于0.5"C;i)在超凈臺上用2%碘酊消毒血清袋出液管5分鐘，空干；j)用已消毒好的剪刀剪去封口帽，將血清倒入已消毒好的100ml瓶中；k)用吸管分裝為15ml/瓶，-20°0凍存?zhèn)溆谩?3)上述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法基礎(chǔ)培養(yǎng)基將15ml人AB型血清與85ml低糖培養(yǎng)基(DMEM)，0.24gH印es,0.2g碳酸氫鈉，0.03gL-谷氨酰胺混勻后，用0.22微米孔徑的微孔濾膜過濾除菌，直接使用或-2(TC凍存?zhèn)溆?。上述的低糖培養(yǎng)基(DMEM):購自Sigma公司。H印es:購自BoehringerMannheim公司。健康人AB型血清第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科提供。(4)豬皮標(biāo)本的處理及毛乳頭分離a).取健康版納微型豬軀干部位全層豬皮后保存于4°C生理鹽水中，在清洗臺上用手術(shù)刀剃除豬毛，刮胡刀刮豬皮至發(fā)白，自來水沖洗；存放于加80萬單位青霉素和100萬單位鏈霉素500mL生理鹽水中；b).在超凈臺上將己處理好的豬皮在不銹鋼腎形彎盤中用75%酒精泡20min，75%酒精棉球擦洗2遍，然后用生理鹽水反復(fù)用力沖洗5遍，每遍為5min，每一遍后均需換用新消毒的不銹鋼腎形彎盤；c).用組織剪剪去標(biāo)本邊緣部分，將豬皮放在已消毒好的木板上，用3號刀柄和11號一次性無菌刀片手術(shù)刀分離皮下筋膜層，用眼科剪清理殘留的皮下筋膜，隨后進(jìn)行細(xì)胞的消化分離；d).用組織剪將處理干凈的標(biāo)本剪成0.30.5cm寬，34cm長的皮條，再將皮條從真皮一皮下脂肪層交界處剪開，因生長期毛囊的毛乳頭大多數(shù)位于皮下脂肪層內(nèi)；將脂肪層組織置于直徑為5cm的平皿中，加入0.5%分離酶(分離蛋白酶(Protease/Dispase):購自Sigma公司，用0.01MpH7.4的PBS緩沖液配制，使用濃度為0.5%，裝入無菌三角燒瓶在搖床上以115rpm搖12小時(shí)，0.22um孔徑的微孔濾膜過濾除菌，分裝，-2(TC凍存?zhèn)溆?浸沒，將平皿放入已消毒好的不銹鋼飯盒中，4X:過夜10hrs;e).次日再將平皿37-C熱消化30min，以生理鹽水將組織漂洗2次，用眼科鑷將脂肪組織內(nèi)殘留毛囊下段擠出，此時(shí)毛囊真皮表皮完全相互分離，真皮成份的毛乳頭埋藏于脂肪組織中；用組織剪將脂肪組織剪成米粒樣大小，以0.29&rV型膠原酶(IV型膠原酶(Collagenase):購自美國Sigma公司，用DMEM液配制，使用濃度為0.2%，0.22tim孔徑的微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20°。凍存?zhèn)溆?于平皿中37-C消化4hrs,到離心時(shí)共68hrs，中間時(shí)間無菌攪動(dòng)一次，消化時(shí)不時(shí)搖動(dòng)消化平皿，在倒置顯微鏡下觀察，直到真皮鞘消化成游離細(xì)胞，而毛乳頭尚未開始消化，毛乳頭從蒂部游離，即可中止消化；f).將尚未消化組織去除，向消化液中加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合后移入50ml離心管中，以2000rpm10min離心，傾去上清液，管底沉淀組織移入含DMEM的平皿中清洗，將其中網(wǎng)絡(luò)的大量毛乳頭洗下，洗下液體再加入50ml離心管中，以1000rpm離心5min;g).將清洗液移入10mL的離心管中500rpm低速離心3次，每次3min，每次緩慢吸去上清液棄之，此步的目的在于去除殘留的IV型膠原酶，以減少其對毛乳頭貼壁的影響，同時(shí)用低速離心也可去除游離在真皮鞘中的其他散細(xì)胞，因毛乳頭體積大，易于沉淀于管底。棄去上清液中含游離真皮鞘細(xì)胞，底層混懸液中含有上千計(jì)的毛乳頭，少許毛球部雜質(zhì)，無其他游離細(xì)胞，在直徑為3cm的平皿中清洗；h).最后一次在10mL的離心管中以1000rpm離心5min，去上清后加入含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基后接種；j).將豬毛乳頭按80100個(gè)/瓶接種于50ml—次性培養(yǎng)瓶中，在37aC5%C02飽和水氣條件下培養(yǎng)，待毛乳頭貼壁后，換液即可將不貼壁的毛球部、雜質(zhì)去除；約2周左右細(xì)胞融合后可傳代培養(yǎng)；(5)豬毛乳頭的培養(yǎng)將豬毛乳頭按80100個(gè)/瓶接種于50ml—次性培養(yǎng)瓶中，在37°C5%C02飽和水氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待大部分毛乳頭貼壁后，更換培養(yǎng)基，同時(shí)亦可將不能貼壁或尚未貼壁的毛球部、纖維組織及其他雜質(zhì)除去，培養(yǎng)瓶中即為純的毛乳頭，約2周后細(xì)胞融合后可進(jìn)行1:3傳代培養(yǎng)；(6)豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集過程為-a).培養(yǎng)時(shí)在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)，100ml培養(yǎng)瓶中加入7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)，3天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b).開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75%酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在離心機(jī)中離心；c).在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標(biāo)記，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?7)豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的凍干過程為b)凍干室紫外線消毒4小時(shí)；b).操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75%酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將藥物分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；C).將凍干瓶放入凍干機(jī)中；d).連續(xù)凍干過程I-40°C4小時(shí)II-20°C3小時(shí)III國5。C10小時(shí)IV5°C4小時(shí)V15°C3小時(shí)VI25°C5小時(shí)e)在真空環(huán)境下，用手搖下壓力蓋，真空封包凍干瓶完成；f)打開凍干機(jī)凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞;g)貼上標(biāo)簽，注明標(biāo)識和日期，4。C保存?zhèn)溆谩?8)臨床使用時(shí)，凍干粉的溶解過程藥物的臨床應(yīng)用(1)藥物的配制每瓶用3ml生理鹽水溶解(恢復(fù)凍干前原始濃度)，溶解后的橙紅色溶液即為治療禿發(fā)的藥物。(2)治療禿發(fā)的藥物的臨床應(yīng)用及觀察過程選擇直徑在5厘米以下的禿發(fā)患部，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點(diǎn)注射，每周1次，每個(gè)患部每次最多3ml，共4次，治療完成后觀察2月。試驗(yàn)例(1)豬DPCCM治療組選擇50例年齡在1264歲的禿發(fā)患者，用前作皮內(nèi)注射試驗(yàn)，對皮試陰性的患者，選擇直徑在5厘米以下的禿發(fā)患部，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點(diǎn)注射，每周1次，每個(gè)患部每次最多3ml，共4次，治療完成后觀察2月。(2)人DPCCM治療組選擇50例年齡在1264歲的禿發(fā)患者，選擇直徑在5厘米以下的禿發(fā)患部，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點(diǎn)注射，每周l次，每個(gè)患部每次最多3ml，共4次，治療完成后觀察2月。(3)空白對照組選擇藥物治療組中多發(fā)性禿發(fā)患者10例，選擇與藥物治療部位距離在5cm以上的患部作為空白自身對照患部，用3mL生理鹽水，常規(guī)消毒患部皮膚后皮下多點(diǎn)注射，每周1次，共4次，治療完成后觀察2月。(4)治療效判斷標(biāo)準(zhǔn)病損部皮膚新生終毛大于20根/cn^為治愈，少于20根/ci^為有效，治療后無改變?yōu)闊o效。(5)藥物治療禿發(fā)的治愈率和有效率比較(見表l)表1各組禿發(fā)治療2月后情況(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*與空白對照組比較，P<0.05，*與人DPCCM治療組比較，P>0.05試驗(yàn)例2(1)藥物的生物安全性實(shí)驗(yàn)①小鼠急性毒性試驗(yàn)我們選用79周齡、體重為1822g的昆明種小鼠。按預(yù)試驗(yàn)公比0.8設(shè)立50.0ml/kg、40.0ml/kg、32.0ml/kg、25.6ml/kg、20.5ml/kg等5個(gè)劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。單次腹腔注射，藥后立即觀察、記錄動(dòng)物的中毒反應(yīng)、死亡情況及時(shí)間，連續(xù)觀察14天。②家兔熱原試驗(yàn)選3只體重為1.82.4kg的日本大耳白家兔。按10ml/kg耳靜脈注射給藥。測量家兔肛門體溫，深度為6厘米，以后每隔l小時(shí)測量體溫l次，共3次。③細(xì)菌培養(yǎng)隨機(jī)抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，4道劃線法接種于普通血平板上，培養(yǎng)48小時(shí)后觀察結(jié)果。④真菌培養(yǎng)隨機(jī)抽取5支凍干瓶，無菌生理鹽水溶解，接種于沙堡氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10日后觀察結(jié)果。結(jié)果小鼠急性毒性試驗(yàn)顯示在腹腔注射不同劑量豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各組動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)明確的中毒癥狀，在整個(gè)試驗(yàn)期限內(nèi)無動(dòng)物死亡或其它異常征象。家兔熱原試驗(yàn)顯示在耳靜脈注射豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液樣品溶液后，各動(dòng)物的體溫變化均符合熱原試驗(yàn)的要求。細(xì)菌和真菌培養(yǎng)均未見細(xì)菌和真菌生長。(2)典型病例介紹患者XX，女性，26歲，頭部出現(xiàn)斑塊狀禿發(fā)l月來我院診治，圖l為治療前，圖2為藥物治療后1月照片，可以看見有大約30根/cm2終毛長出。從臨床應(yīng)用中，我們認(rèn)識到毛乳頭在毛囊的生長發(fā)育、周期調(diào)控及維持毛發(fā)生長中起主導(dǎo)作用。毛乳頭的功能障礙是導(dǎo)致毛囊周期失衡和脫發(fā)的主要原因。目前對毛乳頭細(xì)胞的研究已發(fā)現(xiàn)一些活性蛋白對毛囊的生長有調(diào)節(jié)作用。在前期的研究中，我們證實(shí)了毛乳頭細(xì)胞在體外凝集性生長狀態(tài)下較非凝集性生長狀態(tài)下其生物學(xué)功能及誘導(dǎo)毛囊形成的能力均顯著增強(qiáng)，并在裸鼠體內(nèi)用人頭皮凝集性生長狀態(tài)的毛乳頭細(xì)胞與毛囊上皮細(xì)胞共同移植成功地誘導(dǎo)了分化成熟的毛囊結(jié)構(gòu)，提示毛乳頭細(xì)胞在凝集性生長狀態(tài)下可以表達(dá)某種具有誘導(dǎo)毛囊生長的蛋白，而在非凝集性生長狀態(tài)這種特性則減弱甚至消失。也就是說，毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長狀態(tài)可能與其調(diào)控毛囊生長功能緊密關(guān)聯(lián)，我們在體外試驗(yàn)也證實(shí)藥物可使非凝集性生長狀態(tài)的毛乳頭細(xì)胞向凝集性生長狀態(tài)轉(zhuǎn)化。我們收集毛乳頭細(xì)胞在凝集性生長狀態(tài)下的培養(yǎng)液并制成凍干粉，在確定其生物安全性得到保證且符合倫理的前提下，用于治療禿發(fā)患者，進(jìn)一步揭示藥物是否有促進(jìn)毛囊生長的作用。在前期的研究工作中，我們用人DPCCM治療禿發(fā)，發(fā)現(xiàn)其有確切的治療作用，但人毛乳頭細(xì)胞來源有限，要產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用于臨床比較困難，我們用豬毛乳頭細(xì)胞來替代人毛乳頭細(xì)胞，可以有效解決毛乳頭細(xì)胞來源有限這一瓶頸，為DPCCM產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)。豬DPCCM在通過生物安全鑒定后，我們在患者知情同意的情況下應(yīng)用于患部。50例豬DPCCM治療的禿發(fā)患者中，除3例無效外其余均有一定療效，這與人DPCCM治療組比較取得了相似的療效。權(quán)利要求1、一種豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清藥物，其特征在于用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代豬毛乳頭細(xì)胞，收集低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清，將所收集上清液制備成凍干粉。2、由權(quán)利要求1所述的一種豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清藥物，其特征在于上述低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清制備成凍干粉的步驟是(1)豬皮標(biāo)本的處理及毛乳頭分離a).取健康版納微型豬軀干部位全層豬皮后，保存于4'C生理鹽水中，在清洗臺上用手術(shù)刀剃除豬毛，刮胡刀刮豬皮至發(fā)白，自來水沖洗；存放于加80萬單位青霉素和100萬單位鏈霉素500mL生理鹽水中；b).在超凈臺上將已處理好的豬皮在不銹鋼腎形彎盤中用75%酒精泡20min，75%酒精棉球擦洗3遍，然后用生理鹽水反復(fù)用力沖洗5遍，每遍為5min，每一遍后均需換用新消毒的不銹鋼腎形彎盤；c).用組織剪剪去標(biāo)本邊緣部分，將豬皮放在已消毒好的木板上，用手術(shù)刀分離皮下筋膜層，用眼科剪清理殘留的皮下筋膜，隨后進(jìn)行細(xì)胞的消化分離；d).用組織剪將處理干凈的標(biāo)本剪成0.30.5cm寬，34cm長的皮條，再將皮條從真皮一皮下脂肪層交界處剪開，將位于脂肪層組織內(nèi)毛囊的毛乳頭置于直徑為5cm的平皿中，加入0.5%分離酶浸沒，將平皿放入已消毒好的不銹鋼飯盒中，4'C過夜10hrs;e).次日再將平皿37'C熱消化30min，以生理鹽水將組織漂洗3次，用眼科鑷將脂肪組織內(nèi)殘留毛囊下段擠出，用組織剪將脂肪組織剪成米粒樣大小，以0.2y。IV型膠原酶于平皿中37"C消化4hrs，中間時(shí)間無菌攪動(dòng)一次，消化時(shí)搖動(dòng)消化平皿，在倒置顯微鏡下觀察，直到真皮鞘消化成游離細(xì)胞，而毛乳頭尚未開始消化，毛乳頭從蒂部游離，即可中止消化；f).將尚未消化組織去除，向消化液中加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合后移入50ml離心管中，以2000rpm離心10min，傾去上清液，管底沉淀組織移入含DMEM的平皿中清洗，將其中網(wǎng)絡(luò)的大量毛乳頭洗下，洗下液體再加入50ml離心管中，以1000rpm離心5min;g).將清洗液移入lOmL的離心管中500rpm低速離心3次，每次3min，每次緩慢吸去上清液棄之，棄去上清液中含游離真皮鞘細(xì)胞，底層混懸液中含有上千計(jì)的毛乳頭，少許毛球部雜質(zhì)，無其他游離細(xì)胞，在直徑為3cm的平皿中清洗；h).最后一次在10mL的離心管中以1000rpm離心5min，去上清后加入含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基后接種；j).將豬毛乳頭按80100個(gè)/瓶接種于50ml—次性培養(yǎng)瓶中，在37'C5XC02飽和水氣條件下培養(yǎng)，待毛乳頭貼壁后，換液即可將不貼壁的毛球部、雜質(zhì)去除；約2周左右細(xì)胞融合后可傳代培養(yǎng)；(2)豬毛乳頭的培養(yǎng)-將豬毛乳頭按80100個(gè)/瓶接種于50ml—次性培養(yǎng)瓶中，在37°C5%C02飽和水氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待大部分毛乳頭貼壁后，更換培養(yǎng)基，同時(shí)亦可將不能貼壁或尚未貼壁的毛球部、纖維組織及其他雜質(zhì)除去，培養(yǎng)瓶中即為純的毛乳頭，約2周后細(xì)胞融合后可進(jìn)行1:3傳代培養(yǎng)；(3)豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集過程為a).培養(yǎng)時(shí)在50ml培養(yǎng)瓶中加入5ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)，100ml培養(yǎng)瓶中加入7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)，3天換一次基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b).開啟超凈臺并用紫外線消毒30分鐘，操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75%酒精消毒雙手后在超凈臺上將低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清從培養(yǎng)瓶中無菌倒入50ml無菌離心管中，用旋絲口蓋蓋上離心管并擰緊，在離心機(jī)中離心；c).在超凈臺上打開離心管，用無菌吸管吸出離心管中的上清，移入無菌玻璃容器中，加無菌橡皮塞后，作好標(biāo)記，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?4)豬毛乳頭細(xì)胞條件培養(yǎng)液的凍干過程為a).凍干室紫外線消毒4小時(shí)；b).操作時(shí)著隔離衣，戴一次性口罩和帽子，用75%酒精消毒雙手后在超凈臺上用無菌吸管將藥物分為3ml/凍干瓶，蓋上瓶塞且留出凍干孔；c).將凍干瓶放入凍干機(jī)中;d).連續(xù)凍干過程I-40°C4小時(shí)II-20。C3小時(shí)III-5°C10小時(shí)IV5°C4小時(shí)V15°C3小時(shí)VI25。C5小時(shí)e)在真空環(huán)境下，用手搖下壓力蓋，真空封包凍干瓶完成；f)打開凍干機(jī)凍干室門，取出凍干瓶，加瓶蓋并加壓封包瓶塞；g)貼上標(biāo)簽，注明標(biāo)識和日期，4"C保存?zhèn)溆谩?、權(quán)利要求1所述的豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清的藥物在制備治療斑禿的藥品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清的藥物在治療禿發(fā)中的應(yīng)用。用含人AB型血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)低傳代豬毛乳頭細(xì)胞，收集低傳代豬毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清，將所收集上清液制備成凍干粉。本發(fā)明所制備的藥物在治療禿發(fā)中有明顯的療效。豬毛乳頭細(xì)胞來源廣泛，可以有效解決毛乳頭細(xì)胞來源有限這一瓶頸，為產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用于臨床治療禿發(fā)奠定了基礎(chǔ)。文檔編號A61K9/19GK101336932SQ20081015066公開日2009年1月7日申請日期2008年8月9日優(yōu)先權(quán)日2008年8月9日發(fā)明者葉慶佾,洋羅,飛郝申請人:洋羅