專利名稱：：脂質(zhì)體魚肝油酸鈉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及臨床治療血管瘤及脈管畸形的局部硬化制劑，特別涉及脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。
背景技術(shù)：
：血管瘤是一種常見于嬰幼兒的良性腫瘤，發(fā)病率約為3%8%，發(fā)生于口腔頜面部的血管瘤約占全身的60%。血管瘤以內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和微血管形成為主要特征，有明顯的增殖期和消退期，但其增殖和消退的機(jī)制目前還不十分清楚。雖然大部分血管瘤可以自行消退，但其消退周期長(zhǎng)、消退不完全、大面積的血管瘤消退后仍留有局部后遺癥，這就給臨床的診斷和治療帶來了很大的困難，同時(shí)也使血管瘤成為臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。魚肝油酸鈉(SodiiumMorrhuate)臨床上局部注射硬化劑是治療血管瘤一項(xiàng)使用多年且療效肯定的傳統(tǒng)方法，主要使用的硬化劑有魚肝油酸鈉、平陽霉素、尿素等。魚肝油酸鈉局部注射治療血管瘤是一項(xiàng)使用多年且療效肯定的傳統(tǒng)方法，其治療血管瘤的主要機(jī)理是破壞血管內(nèi)皮，同時(shí)促進(jìn)血液蛋白的凝固，促使血小板附著于水腫的血管內(nèi)膜形成血栓，最終導(dǎo)致血管閉塞達(dá)到治療目的。臨床上通常采用5%魚肝油酸鈉進(jìn)行瘤體內(nèi)直接注射，但傳統(tǒng)劑型的魚肝油酸鈉在使用過程中存在著很多問題，如魚肝油酸鈉注入血管瘤體后，隨血流分散，難以在瘤體內(nèi)形成有效濃度聚集，往往需要反復(fù)多次注射，以求達(dá)到瘤體內(nèi)的有效濃度，注射后局部副反應(yīng)較重，從而使治療周期延長(zhǎng)，增加患兒痛苦，加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至出現(xiàn)局部潰破，感染等并發(fā)癥，且病變?nèi)菀讖?fù)發(fā)，用量過大或藥物外滲則引起組織壞死，存在大出血的危險(xiǎn)。尤其是在頜面部，治愈后遺留明顯瘢痕組織，影響面部美觀，同時(shí)給患者帶來心理上的傷害。普通劑型還會(huì)影響周圍正常組織的功能。目前臨床上的大部分藥物在體內(nèi)到達(dá)作用部位之前，己被部分降解或排除，使藥物的效價(jià)降低；另外藥物進(jìn)入到身體后不但作用于靶組織，而且還作用于非靶組織，引起毒性作用。在1972年Gregoriadis和Ryman根據(jù)脂質(zhì)體的主要原料是磷脂及其衍生物，而磷脂是細(xì)胞的固有組分，沒有免疫原性，是生物相容物質(zhì)等特點(diǎn)，提出可以用脂質(zhì)體作為藥物載體的可能性。脂質(zhì)體(liposome)脂質(zhì)體(liposome,又稱之為脂小球)，是由磷脂雙層膜構(gòu)成的中空小球。構(gòu)成脂質(zhì)體的主要成分是磷脂和其他類脂化合物。在研究中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體是一種新的藥物載體，制備工藝簡(jiǎn)單、在人體內(nèi)具有無毒、無免疫原性、可降解、緩釋等特點(diǎn)，所載藥物廣泛，并減少了所需藥量、增強(qiáng)其體內(nèi)穩(wěn)定性和藥理作用，降低毒副作用，使藥物具有被動(dòng)靶向性特征。脂質(zhì)體藥物的脂質(zhì)雙分子層與生物膜有較大的相似性和組織相容性，可通過各種途徑進(jìn)入血液循環(huán)，而進(jìn)入血液循環(huán)的脂質(zhì)體主要被富有吞噬細(xì)胞的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機(jī)體的自身免疫功能，故利用脂質(zhì)體作為藥物載體不僅可以增加藥物的溶解性，提髙藥物的生物利用度，而且可使藥物制劑具有相應(yīng)的靶向性，從而提高了藥物的治療效果，減少藥物的治療劑量。概括而言，脂質(zhì)體藥物作為先進(jìn)的藥物遞送系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn)①增強(qiáng)了藥物的溶解性；②減低了藥物毒性；③賦予藥物耙向性；④增加了藥物的緩釋作用；⑤提高了對(duì)藥物的保護(hù)作用；⑥通過融合作用將藥物送人細(xì)胞槳或細(xì)胞核中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服普通魚肝油酸鈉制劑治療脈管性疾病容易伴發(fā)并發(fā)癥的不足,提供一種脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，該制劑可以很好的緩解魚肝油酸鈉的毒性，在降低藥物不良反應(yīng)的同時(shí)，減小了藥物用量，并能達(dá)到治療血管瘤的目的，為臨床治療脈管性疾病提供一種的新的藥物劑型；不僅如此，我們發(fā)現(xiàn)所制得的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉可以誘導(dǎo)人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，而凋亡是某些血管瘤無癥狀自發(fā)消退的主要原因，這可能給血管瘤的治療甚至整個(gè)腫瘤的治療提供一條新的思路。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)過程為魚肝油酸鈉與脂質(zhì)體模材充分混合均勻，在磷脂及膽固醇形成閉合囊泡的過程中魚肝油酸鈉被包裹進(jìn)入磷脂膜中,然后通過擠壓過濾形成均勻脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，去除未被包裹的游離魚肝油酸鈉既得。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，包含的有效組分有1)作為藥物的魚肝油酸鈉，用量為1%10%(重量體積百分比)；2)作為脂質(zhì)體包材的卵磷脂及膽固醇，用量分別為4.31%10%及0%2.19%(重量體積百分比)；3)作為抗氧化劑的維生素E，用量為00.03%(重量體積百分比)；4)余量為PBS緩沖液。所述的卵磷脂是蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、人工合成卵磷脂、鞘磷脂中的一種或幾種；所述的魚肝油酸鈉是棕櫚油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、a亞麻酸(ALA)、亞油酸(LA，十八碳二烯酸)和花生四烯酸(AA，二十碳四烯酸)組成的混合物。一種用于治療血管瘤和脈管畸形的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉制劑。本發(fā)明基于臨床上治療血管瘤及脈管畸形的現(xiàn)狀，旨在傳統(tǒng)硬化治療的基礎(chǔ)上對(duì)于硬化藥物的劑型進(jìn)行改良，利用目前發(fā)展迅速的脂質(zhì)體技術(shù)包裹藥物,通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，初步探討脂質(zhì)體魚肝油酸鈉對(duì)人增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的作用，從而篩選一種低毒、高效的硬化治療新方案，為血管瘤的硬化治療提供一個(gè)新途徑，并為動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證療效，優(yōu)化配方，為制劑的臨床應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。本發(fā)明運(yùn)用吹膜擠壓法成功制備脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，其粒經(jīng)均勻，穩(wěn)定性較好，便要儲(chǔ)存運(yùn)用；將之應(yīng)用于體外培養(yǎng)之人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，顯示脂質(zhì)體制劑毒性作用緩和，且能達(dá)到對(duì)細(xì)胞的有效殺傷，發(fā)生病理變化與普通魚肝油酸鈉不同；將之初步應(yīng)用于構(gòu)建的人血管瘤裸鼠模型，顯示藥物局部毒性較低，并發(fā)癥發(fā)生較少，并能達(dá)到對(duì)血管瘤的良好抑制治療作用。1.本發(fā)明的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉能夠做到較好的穩(wěn)定性和包封率，原料藥物價(jià)廉易得，制備方法簡(jiǎn)捷，便于掌握及工業(yè)化生產(chǎn)，提供了一種很好的臨床藥物載體系統(tǒng)。2.所制備的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉對(duì)HEC呈現(xiàn)一種漸進(jìn)性的緩釋作用，毒性較為緩和，并對(duì)HEC有較明顯的促凋亡作用；人血管瘤發(fā)生自發(fā)消退是由血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡而引起的，由于凋亡不會(huì)引起炎癥，所以不會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的并發(fā)癥，對(duì)血管瘤的治療意義重大。對(duì)比形態(tài)學(xué)、毒理學(xué)，可以看出，普通制劑魚肝油酸鈉對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞存在較大的毒性作用；脂質(zhì)體魚肝油酸鈉對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)一種漸進(jìn)性緩釋作用，毒性作用較為緩和。通過凋亡研究,脂質(zhì)體魚肝油酸鈉作用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)了較為普遍的凋亡性變化，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率呈上升趨勢(shì)。圖1是本發(fā)明的制備工藝流程圖圖2是脂質(zhì)體魚肝油酸鈉粒徑檢測(cè)結(jié)果圖3是脂質(zhì)體魚肝油酸鈉電鏡觀察結(jié)果圖4是高效氣象檢測(cè)包封率結(jié)果圖5是穩(wěn)定性評(píng)價(jià)觀察結(jié)果圖6是倒置顯微鏡觀察結(jié)果圖7是Giemsa染色觀察結(jié)果圖8是電鏡觀察結(jié)果圖9是MTT結(jié)果圖io是流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果圖ll是凋亡定性檢測(cè)結(jié)果圖12是倒置顯微鏡觀察結(jié)果圖13是Giemsa染色觀察結(jié)果圖14是透射電鏡觀察脂質(zhì)體制劑組HEC超微結(jié)構(gòu)變化圖15是透射電鏡觀察普通制劑組HEC超微結(jié)構(gòu)變化圖16是MTT檢測(cè)結(jié)果圖17是流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)說明。具體實(shí)施例方式參照?qǐng)D1所示將脂質(zhì)體包材加入氯仿充分溶解后吹膜，形成均勻薄膜；然后加入魚肝油酸鈉溶液共同充分震蕩，形成均勻液體；分別通過400nm、200nm、100nm高強(qiáng)度濾膜反復(fù)擠壓；通過超濾器去除尚未包裹的魚肝油酸鈉即得到脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。參照?qǐng)D2所示所制備的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉粒徑呈現(xiàn)峰陡立的正態(tài)分布，平均粒徑為108.4腿。參照?qǐng)D3所示空白脂質(zhì)體和脂質(zhì)體魚肝油酸鈉均呈現(xiàn)白色囊泡狀，大部分為球形，少量為不規(guī)則形，成簇排列。參照?qǐng)D4所示根據(jù)幾組氣相曲線對(duì)照，選擇保留時(shí)間為6.7的棕櫚油酸作為考査魚肝油酸鈉包埋率指標(biāo)，脂質(zhì)體中魚肝油酸鈉實(shí)際量-49x(152649.016+310564.188x100%)=24.085mg包封率=24.085+25x100%=96.34%。參照?qǐng)D5所示制備樣品40天后通過觀察性狀、重新測(cè)定粒徑初步判斷脂質(zhì)體穩(wěn)定性情況。經(jīng)過40天貯存(4'C，除菌，封口)，脂質(zhì)體性狀沒有出現(xiàn)肉眼可見的變化，尤其是未出現(xiàn)任何沉淀，仍為清亮的黃白色混懸液。參照?qǐng)D6所示經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理40min時(shí)，細(xì)胞偽足變短甚至消失，部分細(xì)胞水腫呈氣球狀，界線清楚，尚未見細(xì)胞游離；處理80min時(shí)細(xì)胞全部呈現(xiàn)氣球樣擁擠，界線清楚，胞漿透光度增大，部分細(xì)胞游離；處理120min時(shí)細(xì)胞全部呈現(xiàn)空泡狀，僅剩細(xì)胞外形，細(xì)胞大量游離；處理160min時(shí)細(xì)胞全部裂解，僅剩部分點(diǎn)狀殘?jiān)?，貼壁或者游離。ECV-304細(xì)胞株經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理2h后，細(xì)胞均呈現(xiàn)典型的鋪路石狀排列，細(xì)胞偽足伸展充分，界線清楚，有新生細(xì)胞，貼壁良好；處理4h后細(xì)胞偽足開始變短，細(xì)胞間隙開始出現(xiàn)，呈現(xiàn)梭形、三角形、四邊形或不規(guī)則形；處理6h后大部分細(xì)胞偽足開始收縮呈圓形，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞間隙更加明顯，有個(gè)別細(xì)胞游離；處理8h后細(xì)胞全部變圓，體積變小固縮化，大量細(xì)胞游離。參照?qǐng)D7所示用魚肝油酸鈉普通劑型分別處理ECV-304細(xì)胞株40min，80min,120min，160min，進(jìn)行Giemsa染色后在顯微鏡下觀察，具體見圖1。處理細(xì)胞40min后，部分細(xì)胞發(fā)生水腫性變化，但胞膜完整，核圓居中，核膜、核仁清晰可辨，胞漿比較均一；處理細(xì)胞80min后，細(xì)胞全部發(fā)生水腫性變化，胞膜開始不完整，但是核仍然可辨，胞漿出現(xiàn)空泡；處理細(xì)胞120min后，細(xì)胞完全空泡化，胞漿和核內(nèi)容物全部消失，僅剩細(xì)胞外形；處理細(xì)胞160min后，無細(xì)胞形態(tài)，僅剩下點(diǎn)狀淡染顆粒物。用脂質(zhì)體劑型分別處理ECV-304細(xì)胞株2h，4h，6h,8h,然后進(jìn)行Giemsa染色，處理細(xì)胞2h后，細(xì)胞界線清楚，核大而圓，居中，12個(gè)核仁，胞槳均勻，胞膜完整；處理細(xì)胞4h后，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞偽足變短呈現(xiàn)三角形或圓形，核清晰可辨，核膜和胞膜均完整，胞漿變少且顏色加深；處理細(xì)胞6h后，大部分細(xì)胞偽足消失變圓，細(xì)胞固縮色深，胞漿和核成分不易區(qū)分，胞膜完整；處理細(xì)胞8h后，細(xì)胞全部變圓固縮化，色深，胞膜完整，部分細(xì)胞膜變皺褶，出現(xiàn)小突起。參照?qǐng)D8所示透射電鏡下觀察結(jié)果ECV-304細(xì)胞株經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理80min后，胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，結(jié)構(gòu)脂滴游離、空泡化，蛋白質(zhì)顆粒增多，核膜完整，染色體絮狀化分布。而經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理8h后，細(xì)胞形成凋亡小體，其中含有固縮化深染的染色體，同時(shí)含有胞漿成分。參照?qǐng)D9所示普通劑型組和脂質(zhì)體劑型組均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，其中以普通劑型組表現(xiàn)劇烈，而脂質(zhì)體劑型毒性作用緩慢。普通劑型組與脂質(zhì)體劑型組在各個(gè)相應(yīng)檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.05)。參照?qǐng)D10所示與普通劑型組相比，脂質(zhì)體劑型組出現(xiàn)了典型的亞二倍峰，凋亡率為22.23%。參照?qǐng)D11所示:脂質(zhì)體制劑組出現(xiàn)了大小為180-200bp整數(shù)倍DNA排列的典型梯狀圖譜。參照?qǐng)D12所示HEC經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理40min時(shí)，細(xì)胞偽足變短、消失，部分細(xì)胞體積變大，細(xì)胞腫脹呈氣球樣，但此時(shí)細(xì)胞膜尚完整，未見細(xì)胞游離;處理80min時(shí)，細(xì)胞均呈氣球樣腫脹，可見部分細(xì)胞的胞膜開始破裂，胞質(zhì)成分向胞外溢出;處理120min時(shí)，細(xì)胞均呈空泡狀改變，細(xì)胞內(nèi)無完整的細(xì)胞器和細(xì)胞核，僅剩細(xì)胞輪廓，大量細(xì)胞游離;處理160min時(shí)，細(xì)胞全部裂解，僅剰大量細(xì)胞殘片，無貼壁細(xì)胞。HEC經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理2h時(shí)，細(xì)胞仍貼壁良好，呈現(xiàn)典型的"鵝卵石"樣排列，細(xì)胞偽足伸展充分,界限清晰，尚可見新生細(xì)胞。處理4h時(shí)，細(xì)胞偽足開始變短,呈三角形、多角形或不規(guī)則形，細(xì)胞體積變小，開始出現(xiàn)間隙，有個(gè)別細(xì)胞游離,胞膜完整，胞核大而圓，核仁清晰;處理6h時(shí)，細(xì)胞幾乎均呈圓形,體積明顯縮小，胞核固縮，核仁不可見，有少量細(xì)胞開始游離，但此時(shí)胞膜仍完整;處理8h時(shí)，細(xì)胞全部變圓，體積變小，固縮化,大量細(xì)胞游離。參照?qǐng)D13所示用魚肝油酸鈉普通劑型處理HEC40、80、120、160min后，分別染色，在顯微鏡下觀察。處理細(xì)胞40min后,部分細(xì)胞發(fā)生水腫性變化，胞質(zhì)內(nèi)有空泡出現(xiàn)，但胞膜完整,核圓居中,核仁清晰可辨;處理細(xì)胞80min后,細(xì)胞幾乎全部發(fā)生水腫性變化,胞質(zhì)淡染，其中可見大量空泡出現(xiàn)，胞核被推擠到胞質(zhì)一側(cè),但核膜完整，核仁尚清晰，此時(shí)已有部分細(xì)胞膜發(fā)生破裂，胞質(zhì)成分溢出細(xì)胞外;處理細(xì)胞120min后，細(xì)胞破裂，已無完整細(xì)胞形態(tài),胞質(zhì)內(nèi)容物全部消失，胞核內(nèi)亦可見空泡狀改變,核仁消失;處理細(xì)胞160min后，僅剩下點(diǎn)狀淡染的顆粒,無明顯形態(tài)。用脂質(zhì)體劑型處理HEC后,分別于2、4、6、8h進(jìn)行Giemsa染色。處理細(xì)胞2h后，細(xì)胞界線清楚，細(xì)胞膜完整,染色均勻,核大而圓，居中，可見23個(gè)核仁;處理細(xì)胞4h后,細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙，細(xì)胞體積縮小，呈現(xiàn)三角形或圓形，胞核明顯固縮，胞質(zhì)變少且顏色加深;處理6h后，大部分細(xì)胞變圓，偽足消失,細(xì)胞固縮,顏色加深，胞質(zhì)和胞核成分不易區(qū)分，胞膜尚完整;處理細(xì)胞8h后，細(xì)胞全部變圓、固縮化，著色深，無明顯胞核和核仁結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞膜出現(xiàn)小突起。參照?qǐng)D14所示脂質(zhì)體劑型組(T):細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，對(duì)數(shù)細(xì)胞電子密度增加，細(xì)胞表面微絨毛樣突起消失，代之粗大的細(xì)胞突起，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)團(tuán)塊狀凝聚、邊集,呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。部分核染色質(zhì)高度凝集，其核內(nèi)形成高電子密度團(tuán)塊，且核膜缺損,核仁消失，核碎裂后分散在細(xì)胞內(nèi)，部分與細(xì)胞分離，形成凋亡小體。凋亡小體外有膜包繞，內(nèi)含染色質(zhì)碎塊及細(xì)胞質(zhì)成分。參照?qǐng)D15所示細(xì)胞多數(shù)腫脹,電子密度降低，部分細(xì)胞膜斷裂、溶解，連續(xù)性中斷,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴溶解，線粒體呈空泡樣，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池樣擴(kuò)張,部分細(xì)胞質(zhì)完全溶解，僅留裸核，未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞及凋亡小體。參照?qǐng)D16所示普通劑型組和脂質(zhì)體劑型組均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性，其中以普通劑型組表現(xiàn)劇烈,而脂質(zhì)體劑型組毒性作用較為緩慢。單因素方差分析，F(xiàn)-29.876,2組存在顯著差異(P-0.003〈0.01)。參照?qǐng)D十七所示HEC經(jīng)魚肝油酸鈉作用80min后，其壞死率為42.35%;而經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理后,各時(shí)間點(diǎn)的凋亡率分別為6.29%、8.80%、15.46%、26.50%及34.24%。1.本發(fā)明的處方、制備工藝、工藝流程1.1、本發(fā)明的最佳處方<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1.2制備工藝1)按處方量取蛋黃卵磷脂及膽固醇置于試管中，加入4ml氯仿充分溶解。2)通入氮?dú)獯党确?，使磷脂及膽固醇形成薄膜，繼續(xù)抽真空3h,取出預(yù)留氯仿。3)將配制好的魚肝油酸鈉溶液邊震蕩邊緩慢加入抽真空好的試管中，繼續(xù)震蕩40min，使之形成均勻凝乳狀液體。4)所得溶液經(jīng)高壓擠壓器均質(zhì)(氮?dú)猓?MPA)，其中400nm過濾2次，200nm過濾2次，100nm過濾5次，直至形成透亮的黃白色懸液。5)通過超濾取出未被包裹的游離魚肝油酸鈉，即得到脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。1.3工藝流程(見圖1)1.3.1吹膜稱取EPC525mg，CH0125mg置于試管中，加入4ml氯仿振蕩，使其徹底溶解，60'C水浴中，通氮?dú)獯党确?，待其氯仿即將全部除盡后，迅速抽真空形成絮狀薄膜，繼續(xù)抽真空3h，徹底除去氯仿1.3.2水合稱取250mg魚肝油酸鈉粉末溶于10mlPBS(pH6.84)中，振蕩使其徹底溶解，吸到一次性注射器中，一邊振蕩已經(jīng)真空抽完畢的試管，一邊緩慢滴入魚肝油酸鈉溶液，速度一定要慢，直到全部溶液全部滴盡(整個(gè)過程15min左右)，試管形成黃白色乳液繼續(xù)連續(xù)振蕩45min，即形成MLV1.3.3過濾將振蕩完成的MLV置于濾器中過濾(氮?dú)猓?MPA)，其中400nm過濾2次，200nm過濾2次，100nm過濾5次，直至形成透亮的黃白色懸液，即得到LUV1.3.4超濾將制備完成的LUV經(jīng)過超濾器除離未被包裹的魚肝油酸鈉，具體方法是MLV稀釋到50ml，10倍體積PBS(pH6.84)緩沖液，超濾5次，最后濃縮至10ml2.實(shí)施例部分本發(fā)明對(duì)魚肝油酸鈉在脂質(zhì)體制劑處方中的用量范圍進(jìn)行了驗(yàn)證。在本發(fā)明的工藝和條件下，脂質(zhì)體處方中的卵磷脂及膽固醇可以用量基本保持固定不變，魚肝油酸鈉的用量在1%—10%含量范圍內(nèi)的任一用量都保證可以制成穩(wěn)定的最終產(chǎn)品。雖然原則上魚肝油酸鈉含量在1%以下及10%以上仍然可以制成穩(wěn)定的脂質(zhì)體藥液，但是其藥液濃度過低或過高，基本沒有臨床藥用意義，故不在實(shí)施例中加以考察。而處方中的維生素E作為一種抗氧化物質(zhì)，為脂質(zhì)體藥物中的附加成分，劑量甚微，不予以單獨(dú)考察。實(shí)施例l:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含1%魚肝油酸鈉脂質(zhì)體藥物處方:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>按處方量稱取EPC、CHO置于試管中，加入4ml氯仿振蕩，使其徹底溶解，60'C水浴中，通氮?dú)獯党确?，待其氯仿即將全部除盡后，迅速抽真空形成絮狀薄膜，繼續(xù)抽真空3h，徹底除去氯仿。稱取100mg魚肝油酸鈉粉末溶于10mlPBS(pH6.84)中，振蕩使其徹底溶解，吸到一次性注射器中，一邊振蕩己經(jīng)真空抽完畢的試管，一邊緩慢滴入魚肝油酸鈉溶液，速度一定要慢，直到全部溶液全部滴盡(整個(gè)過程15min左右)，試管形成黃白色乳液繼續(xù)連續(xù)振蕩45min，即形成多室脂質(zhì)體(MLV)。將振蕩完成的MLV置于濾器中過濾(氮?dú)猓?MPA)，其中400nm過濾2次，200nm過濾2次，100nm過濾5次，直至形成透亮的黃白色懸液，即得到大單室脂質(zhì)體(LUV)。將制備完成的LUV稀釋到50ml，10倍體積PBS(pH6.84)緩沖液，經(jīng)過超濾器超濾5次，去除未被包裹的魚肝油酸鈉，最后濃縮至10ml，即得到平均粒徑為101nmi29nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，該脂質(zhì)體藥物為均勻半透明凝乳狀液體，無分層及沉淀現(xiàn)象，充氮?dú)夂竺芊?，?'C15'C和避光條件下貯藏。實(shí)施例2:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含2.5%魚肝油酸鈉<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為108.4nm士39nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例3:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含5%魚肝油酸鈉<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為103.6nm士32nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例4:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含7.5%魚肝油酸鈉脂質(zhì)體藥物處方-<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為110nm±42nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例5:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含10%魚肝油酸鈉脂質(zhì)體藥物處方:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為119nm±30nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。脂質(zhì)體粒徑檢測(cè)將制備完成的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉取25nl，加入到25ml容量瓶中，生理鹽水稀釋定容,取250pl置于小試管中，上NICOMPTM380PSS-NICOMPsubmicronparticlesizer檢測(cè)粒徑。結(jié)果所制備的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉粒徑呈現(xiàn)峰陡立的正態(tài)分布，平均粒徑為108.4nm。(圖2)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)檢測(cè)用10mmol/L的醋酸銨，50mmol/LTrispH7.5溶液懸浮脂質(zhì)體，樣品滴在有支持膜的銅網(wǎng)上，濾紙吸干，再滴醋酸銨，濾紙吸干，自然干燥30min,透射電鏡(HITACHIH-600)觀察脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。結(jié)果空白脂質(zhì)體和脂質(zhì)體魚肝油酸鈉均呈現(xiàn)白色囊泡狀，大部分為球形，少量為不規(guī)則形，成簇排列。(圖3)包封率測(cè)定1.色譜條件色譜柱PEG-20M30mX0.53mm柱溫恒溫200'C檢測(cè)器及進(jìn)樣口溫度240°C柱流速3ml/min分流比5:1H2:50ml/minAir:450ml/minMKUPN2:45ml/min2.方法2.1測(cè)試液的制備分為四組空白脂質(zhì)體組(對(duì)照)取lml魚肝油酸鈉干粉組(標(biāo)準(zhǔn)1)取49mg棕櫚油酸組(標(biāo)準(zhǔn)2)取166.1mg脂質(zhì)體魚肝油酸鈉組(試驗(yàn))取lml其中第一組和第四組分別加入10ml無水乙醇，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干水分，重復(fù)蒸三次2.2甲酯化將各組分別置于四個(gè)圓底燒瓶中，加入5mll5。/。的三氟化硼甲醇溶化，裝上冷凝器在水浴煮沸2min，經(jīng)冷凝器頂部加入lml庚烷于沸騰混合物中，繼續(xù)煮沸l(wèi)min，停止加熱。冷卻至室溫后取下冷凝器，加入少量氯化鈉飽和溶液并輕搖瓶子數(shù)次，繼續(xù)加入飽和氯化鈉溶液至燒瓶頸部。吸取上層溶液(庚烷層)于10ml小瓶中，加入適量無水硫酸鈉去除溶液中痕量水，直接取一定量(2"1)注入氣相色譜儀分析。3.結(jié)果包埋率計(jì)算根據(jù)幾組氣相曲線對(duì)照，選擇保留時(shí)間為6.7的棕櫚油酸作為考查魚肝油酸鈉包埋率指標(biāo)，脂質(zhì)體中魚肝油酸鈉實(shí)際量-49x(152649.016+310564.188x100%)=24.085mg包封率=24.085+25乂100%=96.34%。(圖4)穩(wěn)定性測(cè)試制備樣品40天后通過觀察性狀、重新測(cè)定粒徑初步判斷脂質(zhì)體穩(wěn)定性情況。經(jīng)過40天貯存(4'C,除菌，封口)，脂質(zhì)體性狀沒有出現(xiàn)肉眼可見的變化，尤其是未出現(xiàn)任何沉淀，仍為清亮的黃白色混懸液(圖5)。激光粒徑結(jié)果顯示脂質(zhì)體制劑粒徑為正態(tài)分布，平均粒徑為150.3nm。本發(fā)明對(duì)所列脂質(zhì)體各投料組分用量范圍進(jìn)行了驗(yàn)證。在本發(fā)明的工藝和條件下，保持含魚肝油酸鈉2.5%的用量固定不變，加上卵磷脂與膽固醇及維生素E及PBS緩沖液的總量為100%的前提下，卵磷脂用量的重量體積百分比為4.31%10%，膽固醇用量在O%2.19%,維生素E用量在0%0.03%的含量范圍內(nèi)的任一用量都可以制成穩(wěn)定的最終產(chǎn)品，同時(shí)我們還對(duì)卵磷脂本實(shí)驗(yàn)條件下的最大用量進(jìn)行了考察，顯示仍然可以制得較為穩(wěn)定得脂質(zhì)體產(chǎn)品。而處方中的維生素E作為一種抗氧化物質(zhì)，為脂質(zhì)體藥物中的附加成分，劑量甚微，不予以單獨(dú)考察。實(shí)施例6:2.5%脂質(zhì)體魚肝油酸鈉中含10%磷脂(最大量)的考察脂質(zhì)體藥物處方:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例1"，即得到平均粒徑為130nm士32nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例7:2.5%脂質(zhì)體魚肝油酸鈉中含磷脂6.5%脂質(zhì)體藥物處方:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為119nm±34nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例8:2.5%脂質(zhì)體魚肝油酸鈉中含磷脂膽固醇為9:1(摩爾比)脂質(zhì)體藥物處方<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為114nm±26nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例9:2.5%脂質(zhì)體魚肝油酸鈉中含磷脂膽固醇為2:1(摩爾比)脂質(zhì)體藥物處方<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例1"，即得到平均粒徑為108.4nm±39nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例10:2.5%脂質(zhì)體魚肝油酸鈉中含磷脂膽固醇為l:1(摩爾比)脂質(zhì)體藥物處方<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l",即得到平均粒徑為105nm土33nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。通過以上實(shí)施例的結(jié)果，我們可以看到在本發(fā)明的工藝和條件下，在卵磷脂用量的重量體積百分比在4.31%10%%，膽固醇用量0%2.19%的條件下，所制得的脂質(zhì)體藥物粒徑分布均勻，無分層及沉淀，均可以制成穩(wěn)定的脂質(zhì)體藥液。本發(fā)明對(duì)所列脂質(zhì)體主要投料組分磷脂的不同運(yùn)用情況進(jìn)行了驗(yàn)證。在本發(fā)明的工藝和條件下，保持含魚肝油酸鈉2.5%的用量固定不變，使磷脂與膽固醇的摩爾比例為2:1的前提下，蛋黃卵磷脂與大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、人工合成卵磷脂、鞘磷脂等進(jìn)行不同組合，都可以制成穩(wěn)定的最終產(chǎn)品。而處方中的維生素E作為一種抗氧化物質(zhì)，為脂質(zhì)體藥物中的附加成分，劑量甚微，不予以單獨(dú)考察。實(shí)施例ll:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含魚肝油酸鈉為2.5%(兩種磷脂)脂質(zhì)體藥物處方:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為117nm±25nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例12:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含魚肝油酸鈉為2.5%(三種磷脂)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為111.4nm±36nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例13:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含魚肝油酸鈉為2.5%(四種磷脂)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為119nm±37nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例14:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含魚肝油酸鈉為2.5%(五種磷脂)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為122nm±28nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。實(shí)施例15:脂質(zhì)體藥物產(chǎn)品中含魚肝油酸鈉為2.5%(六種磷脂)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>按處方量稱取上述原料，制備工藝同"實(shí)施例l"，即得到平均粒徑為117nm±20nm的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。通過以上實(shí)施例的結(jié)果，我們可以看到在本發(fā)明的工藝和條件下，脂質(zhì)體投料組成中的磷脂可以是蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、人工合成卵磷脂、鞘磷脂中的一種或幾種，所制得的脂質(zhì)體藥物粒徑分布均勻，無分層及沉淀，均可以制成穩(wěn)定的脂質(zhì)體藥液。實(shí)施例1至實(shí)施例15所述的魚肝油酸鈉是棕櫚油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、a亞麻酸(ALA)、亞油酸(LA，十八碳二烯酸)和花生四烯酸(M，二十碳四烯酸)組成的混合物。實(shí)施例16:最優(yōu)方案制備脂質(zhì)體魚肝油酸鈉運(yùn)用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察用魚肝油酸鈉普通劑型處理ECV-304細(xì)胞株，分別于處理40min,80min，120min，160min后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并進(jìn)行Giemsa染色，然后在顯微鏡下進(jìn)行觀察；用脂質(zhì)體劑型處理ECV-304細(xì)胞株，于2h,4h，6h，8h后作相同處理。ECV-304細(xì)胞株經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理80min后，而經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理8h后，懸浮，置于10mL離心管中，200r/min離心5min，PBS沖洗，同法離心2次，棄除上清，加入電鏡固定液，透射電鏡下觀察。倒置顯微鏡觀察結(jié)果ECV-304細(xì)胞株經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理40min時(shí)，細(xì)胞偽足變短甚至消失，部分細(xì)胞水腫呈氣球狀，界線清楚，尚未見細(xì)胞游離；處理80min時(shí)細(xì)胞全部呈現(xiàn)氣球樣擁擠，界線清楚，胞漿透光度增大，部分細(xì)胞游離；處理120min時(shí)細(xì)胞全部呈現(xiàn)空泡狀，僅剩細(xì)胞外形，細(xì)胞大量游離；處理160min時(shí)細(xì)胞全部裂解，僅剩部分點(diǎn)狀殘?jiān)?，貼壁或者游離。ECV-304細(xì)胞株經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理2h后，細(xì)胞均呈現(xiàn)典型的鋪路石狀排列，細(xì)胞偽足伸展充分，界線清楚，有新生細(xì)胞，貼壁良好；處理4h后細(xì)胞偽足開始變短，細(xì)胞間隙開始出現(xiàn)，呈現(xiàn)梭形、三角形、四邊形或不規(guī)則形；處理6h后大部分細(xì)胞偽足開始收縮呈圓形，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞間隙更加明顯，有個(gè)別細(xì)胞游離；處理8h后細(xì)胞全部變圓，體積變小固縮化，大量細(xì)胞游離。(圖6)Giemsa染色后顯微鏡下觀察結(jié)果用魚肝油酸鈉普通劑型分別處理ECV-304細(xì)胞株40min，80min，120min,160min,進(jìn)行Giemsa染色后在顯微鏡下觀察，具體見圖1。處理細(xì)胞40min后，部分細(xì)胞發(fā)生水腫性變化，但胞膜完整，核圓居中，核膜、核仁清晰可辨，胞漿比較均一；處理細(xì)胞80min后，細(xì)胞全部發(fā)生水腫性變化，胞膜開始不完整，但是核仍然可辨，胞漿出現(xiàn)空泡；處理細(xì)胞120min后，細(xì)胞完全空泡化，胞漿和核內(nèi)容物全部消失，僅剩細(xì)胞外形；處理細(xì)胞160min后，無細(xì)胞形態(tài)，僅剩下點(diǎn)狀淡染顆粒物。用脂質(zhì)體劑型分別處理ECV-304細(xì)胞株2h,4h,6h,8h,然后進(jìn)行Giemsa染色，處理細(xì)胞2h后，細(xì)胞界線清楚，核大而圓，居中，12個(gè)核仁，胞漿均勻，胞膜完整；處理細(xì)胞4h后，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞偽足變短呈現(xiàn)三角形或圓形，核清晰可辨，核膜和胞膜均完整，胞漿變少且顏色加深；處理細(xì)胞6h后，大部分細(xì)胞偽足消失變圓，細(xì)胞固縮色深，胞漿和核成分不易區(qū)分，胞膜完整；處理細(xì)胞8h后，細(xì)胞全部變圓固縮化，色深，胞膜完整，部分細(xì)胞膜變皺褶，出現(xiàn)小突起。(圖7)透射電鏡下觀察結(jié)果ECV-304細(xì)胞株經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理80min后，胞質(zhì)內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、崩解，結(jié)構(gòu)脂滴游離、空泡化，蛋白質(zhì)顆粒增多，核膜完整，染色體絮狀化分布。而經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理8h后，細(xì)胞形成凋亡小體，其中含有固縮化深染的染色體，同時(shí)含有胞漿成分。(圖8)細(xì)胞活性測(cè)定(MTT法)ECV-304細(xì)胞株經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理0min，20min，40min,60min，80min，100min，120min，MOmin，160min后，而ECV-304細(xì)胞株經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理Oh，1h，2h，3h，4h,5h，6h，7h,8h后，不同時(shí)間點(diǎn)分另ij力口入MTT溶液(5mg/ml>)20pL，37。C繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液。然后每3孔上酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，460nm下測(cè)定OD值；另加一個(gè)96孔板作空白板處理酶標(biāo)儀，460nm下測(cè)定OD值。結(jié)果普通劑型組和脂質(zhì)體劑型組均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，其中以普通劑型組表現(xiàn)劇烈，而脂質(zhì)體劑型毒性作用緩慢。普通劑型組與脂質(zhì)體劑型組在各個(gè)相應(yīng)檢測(cè)時(shí)間段內(nèi)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.05)。(圖9)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡新配制含PI50g/L和RNA酶50g/L的PBS液，ECV-304細(xì)胞株經(jīng)普通劑型干預(yù)處理后80min，而經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理后8h，懸浮，冰乙醇固定18h以上，室溫下PI染色0.5h，尼龍布(300目)過濾，上機(jī)分析。與普通劑型組相比，脂質(zhì)體劑型組出現(xiàn)了典型的亞二倍峰，凋亡率為22.23%。(圖IO)凋亡定性試驗(yàn)(DNAladder)1.干預(yù)條件準(zhǔn)備脂質(zhì)體魚肝油酸鈉(磷脂52.5mg/ml,魚肝油酸鈉25mg/ml)過0.22nm濾膜過濾除菌，4'C保存2.試驗(yàn)對(duì)象準(zhǔn)備取傳至第3代的ECV-304以5xl05/ml接種4個(gè)25ml培養(yǎng)瓶中，含15%小牛血清高糖型DMEM(含雙抗)培養(yǎng)2d3.干預(yù)處理A含15X小牛血清高糖型DMEM6ml+120nl脂質(zhì)體魚肝油酸鈉孵箱中孵育8hB輕輕吹打，懸浮細(xì)胞，收集于10ml離心管中離心(1000r/5min),PBS洗兩次，留下細(xì)胞團(tuán)塊和100nl上清，充分震蕩形成細(xì)胞懸液，收集放入eppendorf管中C加入DC2液500^1，溫和地翻轉(zhuǎn)顛倒混勻10—20次，成為均一的裂解液，靜置5min。D加入DC3液600^1，溫和地翻轉(zhuǎn)顛倒混勻10—20次，呈均質(zhì)乳糜狀液體后，離心7,500rpm，10min。E小心吸取上層液體400-500^1(注意不要攪動(dòng)界面層)至新的eppendorf管中，再加入2倍體積無水乙醇，立即顛倒混勻lmin，使絮狀DNA全部析出。離心12，OOOrpm，lmin。F小心吸棄上清，加洗液600nl，震蕩懸浮沉淀后，離心12，OOOrpm，lmin。再重復(fù)一次。G盡量吸盡液體后，倒置在吸水紙上室溫干燥H加入洗脫液10-200^1(或加入pH〉7.0的水)，輕輕吹打數(shù)次，溶解獲得基因組DNA。I配制2.0n/。TAE瓊脂糖凝膠，鋪板，點(diǎn)樣，TAE電泳(60V，50mA，40min)Marker為100-1000以100間隔的DNA片斷J上凝膠自動(dòng)分析系統(tǒng)拍照記錄4.結(jié)果-脂質(zhì)體制劑組出現(xiàn)了大小為180-200bp整數(shù)倍DNA排列的典型梯狀圖譜。(圖11)由實(shí)施例第二部分我們可以得出以下結(jié)論1.以蛋黃卵磷脂為膜材，用吹膜擠壓法制備，采取低溫除菌保存的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉制劑，能夠做到較好的穩(wěn)定性和包封率2.采用氣相法，用棕櫚油酸峰面積計(jì)算可以反映脂質(zhì)體魚肝油酸鈉的包埋率3.對(duì)比形態(tài)學(xué)、毒理學(xué)，可以看出，普通制劑魚肝油酸鈉對(duì)ECV-304細(xì)胞系存在較大的毒性作用；脂質(zhì)體魚肝油酸鈉對(duì)ECV-304細(xì)胞系作用呈現(xiàn)一種漸進(jìn)性緩釋過程4.通過凋亡研究，脂質(zhì)體魚肝油酸鈉作用于ECV-304細(xì)胞系可能出現(xiàn)了較為普遍的凋亡性變化，而其機(jī)制可能與脂質(zhì)體包裹后毒性降低，從而使PUFA起效以及脂質(zhì)體的靶向載體作用有關(guān)。實(shí)施例17:最優(yōu)方案制備脂質(zhì)體魚肝油酸鈉運(yùn)用于人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察用魚肝油酸鈉普通劑型處理人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HEC)，分別于處理后40、80、120、160min后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,并進(jìn)行Giemsa染色，然后在顯微鏡下觀察，并拍照記錄;用脂質(zhì)體劑型處理HEC，分別于處理2、4、6、8h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并進(jìn)行Giemsa染色，然后在顯微鏡下觀察，并拍照記錄。HEC經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理80min后，經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理8h后，懸浮,收集置于10ml離心管中,1200r/min離心5min，PBS(pH7.2)沖洗2次，同法離心,棄上清,離心管中加入電鏡固定液,送檢，染色，切片，透射電鏡下觀察并拍照記錄。倒置顯微鏡觀察結(jié)果HEC經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理40min時(shí),細(xì)胞偽足變短、消失，部分細(xì)胞體積變大，細(xì)胞腫脹呈氣球樣,但此時(shí)細(xì)胞膜尚完整，未見細(xì)胞游離;處理80min時(shí)，細(xì)胞均呈氣球樣腫脹,可見部分細(xì)胞的胞膜開始破裂，胞質(zhì)成分向胞外溢出;處理120min時(shí),細(xì)胞均呈空泡狀改變,細(xì)胞內(nèi)無完整的細(xì)胞器和細(xì)胞核，僅剩細(xì)胞輪廓，大量細(xì)胞游離;處理160min時(shí)，細(xì)胞全部裂解,僅剩大量細(xì)胞殘片,無貼壁細(xì)胞。HEC經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理2h時(shí)，細(xì)胞仍貼壁良好,呈現(xiàn)典型的"鵝卵石"樣排列，細(xì)胞偽足伸展充分，界限清晰，尚可見新生細(xì)胞。處理4h時(shí),細(xì)胞偽足開始變短，呈三角形、多角形或不規(guī)則形,細(xì)胞體積變小，開始出現(xiàn)間隙，有個(gè)別細(xì)胞游離,胞膜完整,胞核大而圓，核仁清晰;處理6h時(shí)，細(xì)胞幾乎均呈圓形,體積明顯縮小，胞核固縮,核仁不可見，有少量細(xì)胞開始游離，但此時(shí)胞膜仍完整；處理8h時(shí)，細(xì)胞全部變圓，體積變小,固縮化，大量細(xì)胞游離(圖12)。Giemsa染色結(jié)果用魚肝油酸鈉普通劑型處理HEC40、80、120、160min后，分別染色,在顯微鏡下觀察。處理細(xì)胞40min后，部分細(xì)胞發(fā)生水腫性變化，胞質(zhì)內(nèi)有空泡出現(xiàn),但胞膜完整,核圓居中,核仁清晰可辨;處理細(xì)胞80min后,細(xì)胞幾乎全部發(fā)生水腫性變化,胞質(zhì)淡染,其中可見大量空泡出現(xiàn),胞核被推擠到胞質(zhì)一側(cè),但核膜完整，核仁尚清晰，此時(shí)己有部分細(xì)胞膜發(fā)生破裂，胞質(zhì)成分溢出細(xì)胞外;處理細(xì)胞120min后，細(xì)胞破裂,已無完整細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)內(nèi)容物全部消失,胞核內(nèi)亦可見空泡狀改變，核仁消失;處理細(xì)胞160min后，僅剩下點(diǎn)狀淡染的顆粒，無明顯形態(tài)。用脂質(zhì)體劑型處理HEC后，分別于2、4、6、8h進(jìn)行Giemsa染色。處理細(xì)胞2h后，細(xì)胞界線清楚，細(xì)胞膜完整，染色均勻,核大而圓,居中，可見23個(gè)核仁;處理細(xì)胞4h后，細(xì)胞之間出現(xiàn)間隙，細(xì)胞體積縮小，呈現(xiàn)三角形或圓形，胞核明顯固縮，胞質(zhì)變少且顏色加深;處理6h后，大部分細(xì)胞變圓，偽足消失，細(xì)胞固縮,顏色加深，胞質(zhì)和胞核成分不易區(qū)分，胞膜尚完整;處理細(xì)胞8h后，細(xì)胞全部變圓、固縮化，著色深,無明顯胞核和核仁結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞膜出現(xiàn)小突起(圖13)。透射電鏡結(jié)果脂質(zhì)體劑型組(T):細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，對(duì)數(shù)細(xì)胞電子密度增加，細(xì)胞表面微絨毛樣突起消失,代之粗大的細(xì)胞突起,細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)團(tuán)塊狀凝聚、邊集,呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。部分核染色質(zhì)高度凝集，其核內(nèi)形成高電子密度團(tuán)塊，且核膜缺損,核仁消失，核碎裂后分散在細(xì)胞內(nèi),部分與細(xì)胞分離，形成凋亡小體。凋亡小體外有膜包繞，內(nèi)含染色質(zhì)碎塊及細(xì)胞質(zhì)成分(圖14)。普通劑型組(P)鄰胞多數(shù)腫脹，電子密度降低，部分細(xì)胞膜斷裂、溶解,連續(xù)性中斷，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴溶解，線粒體呈空泡樣，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池樣擴(kuò)張,部分細(xì)胞質(zhì)完全溶解，僅留裸核，未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞及凋亡小體(圖15)。細(xì)胞活性測(cè)定(MTT法)HEC經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理0、20、40、60、80、120、140、160min后，HEC經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理O、1、2、3、4、5、6、7、8h后,以每3孔為一組，在不同時(shí)間點(diǎn)分別加入MTT溶液(5mg/m1)20^，37'C繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)。最后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在4卯nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值;另加l個(gè)96孔板作空白板，處理酶標(biāo)儀。普通劑型組和脂質(zhì)體劑型組均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性,其中以普通劑型組表現(xiàn)劇烈,而脂質(zhì)體劑型組毒性作用較為緩慢。單因素方差分析，F(xiàn)=29.876，2組存在顯著差異(P=0.003<0.01)。(圖16)流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡HEC經(jīng)魚肝油酸鈉普通劑型處理80min，經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理8、12、16、20、24h后，分別懸浮收集，4'CPBS清洗3次，之后按照試劑盒說明進(jìn)行染色處理，15min后用流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。HEC經(jīng)魚肝油酸鈉作用80min后，其壞死率為42.35%;而經(jīng)脂質(zhì)體劑型處理后，各時(shí)間點(diǎn)的凋亡率分別為6.29°/。、8.80%、15.46%、26.50%及34.24%。(圖17)權(quán)利要求1.一種脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，其特征在于，制得制劑的有效組分及其百分比的原料組成按重量體積百分比為魚肝油酸鈉1～10％、卵磷脂4.31％～10％、膽固醇0％～2.19％、維生素E0～0.03％，余量為PBS緩沖液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，其特征在于，所說的卵磷脂是蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化蛋黃卵磷脂、氫化大豆卵磷脂、人工合成卵磷脂、鞘磷脂中的一種或幾種。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，其特征在于，所說的魚肝油酸鈉是棕櫚油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、a亞麻酸(ALA)、亞油酸(LA，十八碳二烯酸)和花生四烯酸(AA,二十碳四烯酸)組成的混合物。4、一種用于治療血管瘤和脈管畸形的脂質(zhì)體魚肝油酸鈉。全文摘要本發(fā)明公開了一種脂質(zhì)體魚肝油酸鈉，制得制劑的有效組分及其百分比的原料組成按重量體積百分比為魚肝油酸鈉1～10％、卵磷脂4.31％～10％、膽固醇0％～2.19％、維生素E0～0.03％，余量為PBS緩沖液。包裹藥物為魚肝油酸鈉，其為多種脂肪酸的鈉鹽混合物，主要成分為二十碳五烯酸(EPA)與二十二碳六烯酸(DHA)，其中不飽和脂肪酸是從十八碳三個(gè)烯鍵到二十二碳六個(gè)烯鍵脂肪酸，通過脂質(zhì)體包裹技術(shù)很好的解決了魚肝油酸鈉作為硬化劑有劇烈毒性問題，使藥物具有良好的被動(dòng)靶向遞藥功能，減少了藥物進(jìn)入全身血液循環(huán)系統(tǒng)所引起的毒副作用；本發(fā)明用于治療血管瘤和脈管畸形。文檔編號(hào)A61P9/10GK101336902SQ20081015061公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年8月12日優(yōu)先權(quán)日2008年8月12日發(fā)明者傅經(jīng)國(guó),蘭海龍,勇宋,屠軍波,楊壯群,王正輝申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)