專利名稱：犬埃里希體的同源28kD免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明更具體涉及犬埃里希體中同源 28-kDa蛋白質(zhì)基因的分子克隆和特征確定，以及編碼犬埃里希體該28kDa同源蛋 白質(zhì)的多基因基因座及其用途。
背景技術(shù)：
犬埃里希體病也稱作犬熱帶全血細胞減少癥，是一種犬扁虱攜帶的立克次氏 體疾病，首次于1935年在非洲和1963年在美國發(fā)現(xiàn)(Donatien和Lestoquard， 1935; Ewing， 1963)。該疾病在越戰(zhàn)期間，美國軍犬中流行性爆發(fā)后被更好的認識 (Walker等，1970)。
犬埃里希體病的病因是犬埃里希體， 一種小革蘭氏陰性專性胞內(nèi)細菌，顯示 對單核吞噬細胞的嗜性(Nyindo等，1971)，并由棕色犬虱U^'/ ic印力s^As ssA^&e"s)傳播(Groves等，1975)。犬埃里希體病的進展有三個階段急性、亞 臨床和慢性。急性階段的特征是發(fā)熱、食欲減退、抑郁、淋巴結(jié)病和中度血小板減 少(Troy和Forrester, 1990)。犬通常從急性期恢復(fù)，但是變成在幾個月或甚至幾 年中成為該病菌的持續(xù)傳染攜帶者，而沒有臨床癥狀(Harrus等，1998)。某些犬 進入慢性階段，特征是血小板減少、高球蛋白血癥、食欲減退、消瘦和出血，特 別是鼻出血，然后死亡(Troy和Forrester, 1990)。
表面抗原性的調(diào)節(jié)可能是在宿主中建立這種持續(xù)感染的重要機制。雖然對該 病的發(fā)病機制了解得很少，但在相關(guān)的埃里希體屬、無形體屬、考德里體屬的成員 中所述的多基因家族可能涉及主要表面抗原表達的改變，從而逃脫免疫監(jiān)視。著邊 無形體"朋/^3^/s歷argi'朋7e)， 一種與犬埃里希體密切相關(guān)的生物，顯示了主要表面蛋白3(歷^ -J)基因的改變，導(dǎo)致菌株之間的抗原多態(tài)性(Alleman等，1997)。 基于16S rRNA基因的分子分類學(xué)分析，確定了犬埃里希體和恰菲埃里希體(人 單核細胞埃里希體病(HME)的病因)是密切相關(guān)的(Anderson等，1991; Anderson 等，1992; Dawson等，1991; Chen等，1994)。報道了犬埃里希體和恰菲埃里希體 的64、 47、 40、 30、 29和23kDa抗原之間可觀的交叉反應(yīng)性(Chen等，1994; Chen 等，1997; Rikihisa等，1994; Rikihisa等，1992)。用人和犬恢復(fù)期血清作免疫 印跡分析免疫反應(yīng)性抗原，鑒定出許多犬埃里希體的免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)，包括30kDa 蛋白(Chen等，1997)。另外，已描述犬埃里希體的30kDa蛋白質(zhì)是免疫應(yīng)答早期 識別的主要免疫優(yōu)勢抗原，它與恰菲埃里希體的30kDa蛋白質(zhì)是不同的抗原 (Rikihisa等，1992; Rikihisa等，1994)。犬埃里希體的其它分子量在20-30kDa 之間的免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)也已被鑒定(Brouqui等，1992; Nyindo等，1991; Chen等， 1994; Chen等，1997)。
已在相關(guān)生物，包括恰菲埃里希體和反芻類考德里氏體(CbFra^^ry啦V7朋^鵬) 中報道了多基因家族編碼的同源28-32kDa免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)(Sulsona等，1999; 0hashi等，1998a; Reddy等，1998)。近來，描述了恰菲埃里希體中編碼23-28kDa 蛋白質(zhì)的21個成員的多基因家族(Yu等，2000)。恰菲埃里希體28kDa外膜蛋白質(zhì) 是表面暴露的，含有三個主要超變區(qū)(Oashi等，1998a)。重組恰菲埃里希體P28 似乎在小鼠中提供了抵抗同源攻擊感染的保護，針對重組蛋白產(chǎn)生的抗血清與犬埃 里希體的30kDa蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)(Ohashi等，1998a)。報道了恰菲埃里希體分離物 中pi^基因中的多樣性(Yu等，1999a)，用單克隆抗體的研究進一步證明了表達的 P28蛋白質(zhì)中的多樣性(Yu等，1993)。相反，報道了犬埃里希體地理學(xué)不同的分離 物中/^9基因完全保守，提示犬埃里希體在北美洲中可能是保守的(McBride等， 1999， 2000)。
現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于不能克隆和確定犬埃里希體的新的同源性28kDa免疫反 應(yīng)性蛋白質(zhì)基因，和含有同源28kDa蛋白質(zhì)基因的單個多基因基因座的特征。另夕卜， 現(xiàn)有技術(shù)的缺陷在于缺乏犬埃里希體免疫反應(yīng)性基因的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明填補了 本領(lǐng)域這一長期存在的需要。

發(fā)明內(nèi)容
5本發(fā)明的一些實施例描述了犬埃里希體同源成熟28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)基 因(稱為pi^-7、 -么-義-5、 -6、 -7、-幼的分子克隆、測序、特征確定和表達， 以及對含有9種犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因(p2《-J到-幼的一個基因座的鑒定 (10677bp)。 p^9基因中的8種位于一條DNA鏈上， 一種p28基因在互補鏈上。9 種p28基因成員中的核酸同源性是37-75%,氨基酸同源性是28-72%。
在本發(fā)明的一個實施例中，提供了編碼犬埃里希體30kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì) 的DNA序列。優(yōu)選蛋白質(zhì)具有選自SEQIDN0:2、 4、 6、 40、 42、 44、 46的氨基酸 序列，基因具有選自SEQIDN0:1、 3、 5、 39、 41、 43、 45的核酸序列，是多態(tài)性 多基因家族的成員。通常蛋白質(zhì)具有N-末端信號肽，它在翻譯后加工中被切下， 產(chǎn)生成熟28-kDa蛋白質(zhì)。另外，編碼28kDa蛋白質(zhì)的基因優(yōu)選包含在一個多基因 座中，它的大小是10，677bp，編碼9種犬埃里希體的同源28kDa蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種表達載體，它含有編碼犬埃里希體 28-kDa免疫反應(yīng)性的基因，并能在引入細胞時表達該基因。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種重組蛋白質(zhì)，它具有選自SEQ ID N0:2、 4、 6、 40、 42、 44、 46的氨基酸序列。優(yōu)選該氨基酸序列是由選自SEQ IDN0:1、 3、 5、 39、 41、 43、 45的核酸序列編碼的。優(yōu)選該重組蛋白質(zhì)含有4個可變區(qū)， 它們可以是暴露于表面、親水和具有抗原性。重組蛋白質(zhì)可用作抗原。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，包括步驟 獲得一種載體，它含有一個表達區(qū)，其中含有與啟動子可操縱性連接的、編碼選自 SEQIDN0:2、 4、 6、 40、 42、 44、 46的氨基酸序列的序列；將該載體轉(zhuǎn)染入細胞； 在有效表達該表達區(qū)的條件下培養(yǎng)細胞。
還在一些實施例中描述了本發(fā)明，作為在個體中抑制犬埃里希體感染的方法， 包括步驟在接觸前或懷疑已接觸，或已感染犬埃里希體時鑒定個體；和以抑制犬 埃里希體感染有效量施用含有犬埃里希體28kDa抗原的組合物。抑制可通過任何方 式，例如刺激個體的體液或細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，或通過其它方法，例如抑制28kDa 抗原的正常功能，或甚至與抗原競爭與個體體內(nèi)的一些因子相互作用發(fā)生。
可從下文為了公開而提供的本發(fā)明優(yōu)選例的描述中，更加清楚的了解本發(fā)明 的其它方面、特征和優(yōu)點。附圖簡述
因此，將獲得并詳細理解本發(fā)明上述特征、優(yōu)點和目的中的內(nèi)容，以及其它 將變得清楚的內(nèi)容，更具體的、對本發(fā)明上面簡述的內(nèi)容將參考某些在附圖中說明 的實施例。這些圖是說明書的一部分。然而要注意的是，


了本發(fā)明的優(yōu)選 例，因此不應(yīng)認為是對其范圍的限制。
圖1顯示了 p28-7基因，包括鄰近的5'和3'非編碼序列的核酸序列(SEQ ID N0:1)和推測的氨基酸序列(SEQ ID N0:2)。 ATG起始密碼子和TAA終止子用黑體標 示，23氨基酸前導(dǎo)信號序列下劃線標示。
圖2顯示了表達的50kDa重組p28-7硫氧還蛋白融合蛋白質(zhì)(泳道1，箭頭) 和16kDa硫氧還蛋白對照(泳道2，箭頭)的SDS-PAGE，和重組p28-7-硫氧還蛋白 融合蛋白用恢復(fù)期犬埃里希體犬抗血清的對應(yīng)免疫印跡(泳道3)。犬埃里希體抗血 清未檢測到硫氧還蛋白對照(未顯示)。
圖3顯示了 p28-7蛋白質(zhì)(ECa28-1， SEQIDN0:2)、 p28-5蛋白質(zhì)(ECa28SA2， 部分序列，SEQ ID NO:7)、 p28-4蛋白質(zhì)(ECa28SAl， SEQ ID NO:8)、恰菲埃里希 體P28(SEQ ID NO:9)、恰菲埃里希體OMP-1家族(SEQ ID NO: 10-14)和反芻類考德 里氏體r顯.腦"'鵬)MAP-1蛋白質(zhì)(SEQ ID NO: 15)的氨基酸序列的排列對比。 p28-7氨基酸序列作為共有序列。未顯示的氨基酸與p28-7相同，用點表示。用對 應(yīng)的一字母縮寫顯示分歧的氨基酸。為了氨基酸序列的最大排列引入的缺口用長劃 線標出?？勺儏^(qū)用下劃線標出并命名為(VR1、 VR2、 VR3和VR4)。箭頭表示信號肽 的推測的信號肽酶切割位點。
圖4顯示了用非平衡樹構(gòu)建從推測的氨基酸序列得到的犬埃里希體 p28-7(Eca28-1)、 p28—5 (ECa28SA2，部分序列)、p28-4 (ECa28SAl)，恰菲埃里希體 0歷^1多基因家族的成員，和反芻類考德里氏體/^/ -/蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)相關(guān)性。
每對分枝的長度代表配對氨基酸序列之間的距離。比例尺測定序列之間的距離。 圖5顯示了用6種不同的限制性酶完全消化犬埃里希體基因組DNA，并與p28-7
DIG標記的探針雜交的Southern印跡分析(泳道2-7); DIG標記的分子量標記(泳 道1和8)。
圖6顯示了犬埃里希體p28-7的預(yù)測的蛋白質(zhì)特征(ECa28-l， Jake株)和恰菲 埃里希體P28(Arkansas株)的比較。用6肽窗口，表面可能性預(yù)測了表面殘基。表面殘基是任何具有2. 0nm2以上的水可接觸表面積的殘基。預(yù)測值高于1的六肽被 視為表面區(qū)?？乖灾笖?shù)預(yù)測可能的抗原決定簇。指數(shù)值大于0的區(qū)域是可能的抗 原決定簇。T-細胞基序用5個氨基酸的基序(殘基1-甘氨酸或極性氨基酸，殘基2-疏水氨基酸，殘基3-疏水氨基酸，殘基4-疏水氨基酸或脯氨酸，和殘基5-極性或 甘氨酸)，確定了可能的T-細胞抗原決定簇的位置。比例尺表示氨基酸位置。
圖7顯示了犬埃里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因/^5S5X核苷酸1-849:SEQ ID N0:3; 氨基酸序列SEQ ID M):4)和/ i^-5(核苷酸1195-2031: SEQ ID N0:5;氨基酸序 列SEQIDN0:6)，包括基因間非編碼序列(NC2，核苷酸850-1194: SEQ訓(xùn)0:31) 的核酸序列和推測的氨基酸序列。ATG起始密碼子和TAA終止子用黑體標示。
圖8顯示了犬埃里希體28kDa蛋白基因的基因座(5. 592Kb，含有5個基因)示 意圖，表明基因組的朝向和基因間非編碼區(qū)域(28NC1-4)?；蜃?和2(陰影)顯 示的28kDa蛋白質(zhì)已被描述過(McBride等，1999; Reddy等，1998; Ohashi等， 1998) 。 p^-5的完整序列和新的28kDa蛋白質(zhì)基因(稱為； W^)已測定了序列。完 成了 p^9-5、/^S-6和p2S-7之間非編碼基因間區(qū)(28NC2-3)與先前未連接的基因座 1和2的連接。
圖9顯示采用非平衡樹構(gòu)建法根據(jù)氨基酸序列得到的犬埃里希體 p28—4(Eca28SAl)、 p28—5(ECa28SA2)、 p28-6 (ECa28SA3)， p28—7 (ECa28-l)和 p28-8 (ECa28-2)的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)相關(guān)性。每對分枝的長度代表配對氨基酸序列之間的
距離。比例尺測定序列之間的距離。
圖10顯示了犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因基因間非編碼核酸序列(SEQ ID N0:30-33)的排列對比。用點(.)表示的未顯示的核酸與非編碼區(qū)1 (28NC1)相同。 用對應(yīng)的一字母縮寫顯示分歧的氨基酸。為了氨基酸序列的最大排列對比，引入的 缺口用長劃線(-)標出。推測的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)(-10和-35)以及核糖體結(jié)合位點(RBS) 加框標示。
圖11顯示了 9種犬埃里希體基因p28基因座(10， 677bp)的示意性圖，表明基 因組朝向和基因間非編碼區(qū)域。實施例8中鑒定了p28基因(p28-1、 2、 3、 9)(沒 有陰影)。先前鑒定了陰影標示的p28基因，并命名如下p28-4， p30a(0hashi等， 1998b)和0RFl(Reddy等，1998); p28-5和p28-6 (McBride等，2000); p28-7、 p28(McBride等，1999)和p30(0hashi等，1998b);和p28-8、 p30-1 (0hashi等，1998b)。
圖12顯示了犬埃里希體P28-1到P28-9根據(jù)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。每 對分枝的長度代表配對氨基酸之間的距離。比例尺測定序列之間的分歧百分數(shù)。
圖13顯示了犬埃里希體p28-l基因的核酸序列(SEQ IDNO:39)和推測的氨基 酸序列(SEQ ID NO:40)。
圖14顯示了犬埃里希體p28-2基因的核酸序列(SEQIDNO:41)和推測的氨基 酸序列(SEQ ID NO:42)。
圖15顯示了犬埃里希體p28-3基因的核酸序列(SEQIDNO:43)和推測的氨基 酸序列(SEQ ID NO:44)。
圖16顯示了犬埃里希體p28-9基因的核酸序列(SEQIDNO:45)和推測的氨基 酸序列(SEQ ID NO:46)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明描述了編碼犬埃里希體30-kDa蛋白質(zhì)的同源性基因的克隆、測序和表 達。還進行了 7種犬埃里希體分離物和恰菲埃里希體omp-l多基因家族中的同源 性基因的比較性分子分析。如下鑒定了幾種新的28-kDa蛋白質(zhì)基因
p28-7(ECa28-l)具有一個834bp的開放閱讀框，編碼具有30.5kDa的預(yù)測分子 量的278個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:2)。鑒定出一個N-末端信號序列，提示蛋 白質(zhì)經(jīng)過翻譯后修飾變成27.7kDa的成熟蛋白質(zhì)。
P28-6(ECa28SA3)具有840bp的開放閱讀框，編碼280氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:6)。
用PCR擴增犬埃里希體的28kDa蛋白質(zhì)基因，得到先前未曾測序的 p28-5(Eca28SA2)區(qū)域。p28-5的序列分析揭示有一個編碼283個氨基酸蛋白質(zhì)(SEQ ID NO:4)的849bp的開放閱讀框。
采用對28kDa蛋白質(zhì)基因的基因間非編碼區(qū)特異性的引物作PCR擴增，對連 接先前分離的基因座的區(qū)域測序，從而鑒定了一個含有5種28kDa蛋白質(zhì)基因 (p28-4、 -5、 -6、 -7和-8)的基因座(5.592-kb)。預(yù)測該5種28kDa蛋白質(zhì)具有信號肽， 可得到成熟蛋白質(zhì)，并且具有51-72%氨基酸同源性。分析了基因間區(qū)，揭示各基 因的假設(shè)啟動子區(qū)，提示這些基因可獨立表達和差異性表達?；蜷g非編碼區(qū) (28NCl-4)的大小是299-355bp，具有48-71%的同源性。另外，對串聯(lián)排列的p28基因上述5個基因的基因座的DNA上游和下游先前 未知區(qū)域進行了測序，鑒定到p28-l、-2、-3和-9。因此，本發(fā)明鑒定到了橫跨10,677bp 的9基因犬埃里希體p28基因座。
本發(fā)明特別針對犬埃里希體的同源28kDa蛋白質(zhì)基因p28-l、 -2、 -3、 -6、 -7 和p28-9，和先前部分測序的p28-5的完整序列。還公開了編碼犬埃里希體的9種 同源28kDa外膜蛋白的多基因基因座。8種p28基因位于一條DNA鏈上，在互補 鏈上發(fā)現(xiàn)了一個p28基因。9個p28基因成員之間的核酸同源性是37-75。/。，氨基 酸同源性范圍是28-72%。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域能力范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重 組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有完整的解釋，見例如Maniatis,Fritsch& Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach,"巻I和II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M丄Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S丄Higgins eds. (1985)]; "Transcription and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal， "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)。
本發(fā)明包括基本純的DNA，它編碼犬埃里希體的28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的DNA編碼的蛋白質(zhì)可以與SEQIDNO:2、 4、 6、 40、 42、 44或46中列 出的氨基酸具有至少80%(優(yōu)選85%，更優(yōu)選90%，和最優(yōu)選95%)的序列相同性。 更優(yōu)選的，該DNA包括SEQIDNO:l、 3、 5、 39、 41、 43、 45的核苷酸編碼序列， 或這些序列的簡并變體。
本領(lǐng)域熟知蛋白質(zhì)的氨基酸序列是由編碼該蛋白質(zhì)的DNA的核苷酸序列確 定的。由于遺傳密碼的簡并性(即對于大多數(shù)氨基酸而言， 一種氨基酸有一種以上 的核苷酸三聯(lián)體(密碼子))，不同的核苷酸序列可以編碼特定的氨基酸或多肽。因此， 本發(fā)明的多核苷酸序列還包含那些編碼本發(fā)明多肽或其片段或變體的簡并序列。
本發(fā)明還包括基本純的DNA，它含有SEQIDNO:l、 3、 5、 39、 41、 43或45 所列出的核苷酸區(qū)域的至少15個連續(xù)核苷酸(優(yōu)選20，更優(yōu)選30，甚至更優(yōu)選50 和最優(yōu)選全部)序列。
"基本純的DNA"指通過將DNA的一些或全部分子從其天然存在的微環(huán)境中分離出來，或通過改變本發(fā)明DNA的側(cè)接序列，而分離出來(部分或完全純化) 的DNA。因此該術(shù)語包括例如摻入載體、自主復(fù)制質(zhì)?；虿《尽⒒蛟思毎蛘?合細胞的基因組DNA的重組DNA;或獨立于其它序列作為單個分子存在的 DNA(例如cDNA或基因組或聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的 cDNA片段)。還包括重組DNA，它是編碼其它多肽序列，例如融合蛋白的雜交基 因的一部分。本發(fā)明還包括重組DNA，它包括編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性 蛋白質(zhì)的SEQIDNO:l、 3、 5、 39、 41、 43或45中列出的核苷酸的一部分。
DNA應(yīng)該與SEQIDNO:l、 3、 5、 39、 41、 43或45中列出的核苷酸的編碼 序列具有至少約70%，優(yōu)選至少75%(例如至少80%)，最優(yōu)選至少90%的序列相同 性。兩條序列之間的相同性是匹配或相同位置數(shù)目的直接函數(shù)。當兩條序列中都有 的亞基位置被同一個單體亞基占據(jù)，例如如果兩條DNA分子中的給定的位置都被 腺嘌呤占據(jù)，那么它們在該位置是相同的。例如，如果長IO個核苷酸的序列中有 7個位置與第二條10個核苷酸的序列中相應(yīng)的位置相同，呢這么兩條序列具有70% 的序列相同性。比較序列長度通常至少是50個核苷酸，優(yōu)選至少60個核苷酸，更 優(yōu)選至少75個核苷酸，最優(yōu)選100個核苷酸。通常用序列分析軟件(例如遺傳學(xué)計 算機小組的序列分析軟件包，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，1710 University Avenue， Madison, WI 53705)測定序列相同性。
本發(fā)明還包括含有編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白基因的DNA序列的 載體，所述載體能在宿主中復(fù)制，含有可操縱性連接的a)復(fù)制起始點；b)啟動子； 和c)編碼所述蛋白質(zhì)的DNA序列。優(yōu)選本發(fā)明的載體含有SEQIDNO:l、 3、 5、 39、 41、 43或45所示的DNA序列的一部分。
"載體"可定義為可復(fù)制核酸構(gòu)建物，例如質(zhì)?；虿《竞怂?。載體可以用于 擴增和/或表達編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的核酸。表達載體是一種可 復(fù)制構(gòu)建物，其中編碼多肽的核酸序列與能影響多肽在細胞中的表達的合適控制序 列可操縱性連接。對控制序列的需要可根據(jù)所選的細胞和所選的轉(zhuǎn)化方法而變。通 ?？刂菩蛄邪ㄞD(zhuǎn)錄啟動子和/或增強子、合適的mRNA核糖體結(jié)合位點、和控制 轉(zhuǎn)錄終止和翻譯的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建含有合適轉(zhuǎn)錄和翻 譯控制信號的表達載體。見例如Sambrook等，1989, Mo/ecw/w C/omVzg: ^丄Worato^y Ma"wa/ (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press, N.Y.中描述的技術(shù)。如果轉(zhuǎn)錄控制序列有效控制基因的轉(zhuǎn)錄，基因及其轉(zhuǎn)錄控制序列定義為"可操縱性連接"。本發(fā)明的 載體包括但不限于質(zhì)粒載體和病毒載體。優(yōu)選本發(fā)明的病毒載體是衍生自反轉(zhuǎn)錄病 毒、腺病毒、腺伴隨病毒、SV40病毒或皰疹病毒。
一般含有促進插入的DNA片段有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列的表達載體與宿主聯(lián)
用。本文所用的術(shù)語"宿主"意味著不僅包括原核細胞，還包括真核細胞，例如酵
母、植物和動物細胞。編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)的重組DNA分子 或基因可使用任何本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的技術(shù)轉(zhuǎn)化宿主。尤其優(yōu)選的是用含有 編碼犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的基因編碼序列的載體轉(zhuǎn)化原核細胞。
原核細胞宿主可以包括大腸桿菌(五.co/Z)、鼠傷寒沙門氏菌(S. (ym/7/n'mwn'畫)、 粘質(zhì)沙雷氏菌(5^rart'" m^rayce"力和枯草桿菌(萬"c/〃wj 。真核宿主包括酵
母，例如巴斯德畢赤酵母(尸ic力is/^Wori力、哺乳動物細胞和昆蟲細胞?？梢杂?本領(lǐng)域已知的方法發(fā)酵并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主，以實現(xiàn)最佳細胞生長。
本文所用的術(shù)語"工程改造的"或"重組"的細胞是指一種引入了編碼犬埃 里希體抗原的重組基因的細胞。因此，工程改造的細胞與不含有重組引入的基因的 天然存在的細胞不同。工程改造的細胞是具有人工引入的一種或多種基因的細胞。 重組引入的基因可以是cDNA基因、基因組基因拷貝形式，或包含的基因鄰接一 啟動子，但不是天然與該引入基因相連。另外，重組基因可以整合入宿主基因組， 或可以包含在載體、或轉(zhuǎn)染入宿主細胞的細菌基因組中。
本發(fā)明還針對基本純的犬埃里希體28-30kDa免疫反應(yīng)性蛋白，它含有SEQ ID NO:2、 4、 6、 40、 42、 44或46列出的氨基酸序列。
"基本純的蛋白質(zhì)"意味著從與其天然相伴隨的至少一部分成分分開的蛋白 質(zhì)。通常當某蛋白質(zhì)至少60%重量沒有其它體內(nèi)天然相伴的蛋白質(zhì)和其它天然存 在的有機分子時，蛋白質(zhì)是基本純的。優(yōu)選蛋白質(zhì)制品的純度至少75%，更優(yōu)選 至少90%，最優(yōu)選至少99%重量?？赏ㄟ^例如，從天然來源提?。槐磉_編碼犬埃 里希體的28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的重組核酸；或化學(xué)合成該蛋白質(zhì)來獲得犬埃里 希體的基本純的28-kDa免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^任何合適的方法，例如使用對 犬埃里希體的28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的特異性抗體進行免疫親和層析等柱層析， 聚丙烯酰胺凝膠電泳，或HPLC分析方法測定純度。當將蛋白質(zhì)從其天然狀態(tài)伴 隨的至少一些污染物中分離出來時，該蛋白質(zhì)基本沒有天然伴隨成分。因此，化學(xué)合成的或在不同于天然起源細胞的細胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，定義為基本無天然伴 隨成分。因此，基本純的蛋白質(zhì)包括大腸桿菌、其它原核細胞或天然不存在的其它 生物中合成的真核蛋白質(zhì)。
除了基本上全長的蛋白質(zhì)，本發(fā)明還包括犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白 的片段(例如抗原片段)(SEQIDN0:2、 4、 6、 40、 42、 44或46)。本文所用的術(shù)語 "片段"用于指一般長度至少IO個殘基，更通常至少20個殘基，優(yōu)選至少30(例 如50)個殘基，但比全長完整序列短的多肽。犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的 片段可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生，例如通過酶消化天然存在的或重組的 犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白，或通過化學(xué)合成?？赏ㄟ^本文所述的方法評 估候選片段顯示犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的特征的能力(例如，與犬埃里 希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白特異性抗體結(jié)合)。
可用純化的犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白或犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng) 性蛋白的抗原性片段產(chǎn)生新的抗體，或通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準方法測 試現(xiàn)有抗體(例如作為診斷試驗中的陽性對照)。
如本領(lǐng)域熟知的那樣，某給定的多肽其免疫原性可改變。因此常需將免疫原(例 如本發(fā)明的多肽)與載體偶聯(lián)。示范性和優(yōu)選載體是匙孔蜮血藍蛋白(KLH)和人血 清清蛋白。偶聯(lián)多肽和載體蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括戊二醛、間馬來酰 亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺和雙固氮二氨基聯(lián)苯胺法。還知道可 通過本領(lǐng)域熟知的遺傳工程技術(shù)將肽偶聯(lián)于蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域還己知可使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑(稱為佐劑)來增強特定免疫 原的免疫原性。示范性和優(yōu)選的佐劑包括完全BCG、 Detox， (RIBI, Immunochem Research Inc.) ISCOMS和氫氧化鋁佐劑(Superphos, Biosector)。
本發(fā)明包括用犬埃里希體28kDa免疫反應(yīng)性蛋白或犬埃里希體28kDa免疫反 應(yīng)性蛋白的片段作為免疫原，在例如家兔中產(chǎn)生多克隆抗血清。使用本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的單克隆和多克隆抗體產(chǎn)生的標準方法。可篩選該方法產(chǎn)生的單克隆抗體是 否具有鑒定重組犬埃里希體cDNA克隆，和將其與已知cDNA克隆區(qū)分開來的能 力。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括免疫活性抗體片段，例如Fab或 (Fab)2片段；工程改造產(chǎn)生的單鏈Fv分子；或嵌合分子，例如含有一種抗體(如小鼠抗體)的結(jié)合特異性，和另一種抗體(例如人抗體)的剩余部分的嵌合抗體。
在一個實施例中，抗體或其片段可以與毒素或可檢測標記，例如放射性標記、 非放射性同位素標記、熒光標記、化學(xué)發(fā)光標記、順磁標記、酶標記或產(chǎn)色標記連 接。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)了解這些和其它適用于本發(fā)明的標記。這些標記與抗體 或其片段的結(jié)合可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的標準技術(shù)來完成。
還考慮了可用本發(fā)明的新穎蛋白質(zhì)制備藥物組合物。該藥物組合物含有本發(fā) 明的新穎活性組合物和藥物學(xué)上可接受的載體。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員無須過多實驗 不難確定施用本發(fā)明活性成分的合適劑量和給藥途徑。
詞組"藥物學(xué)上可接受的"指當給予個體時，不會產(chǎn)生過敏或類似不良反應(yīng) 的分子或組合物。含有作為活性成分的蛋白質(zhì)的水相組合物的制備是本領(lǐng)域熟知 的。通常，將這些組合物制備成可注射的溶液或懸液；也可制備成可在注射前溶解 或懸浮于液體中的固態(tài)形式。還可乳化該制備物。
可將蛋白以中性或鹽形式配制在組合物中。藥物學(xué)上可接受的鹽包括酸加成 鹽(由蛋白質(zhì)的游離氨基形成)，和與無機酸，如鹽酸或磷酸，或乙酸、草酸、酒石 酸、杏仁酸等有機酸形成的鹽。還可與無機堿，如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物， 和有機堿，如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等衍生的游離羧基形成鹽。
配制后，以與劑量配方兼容的方式，和治療有效量施用這些溶液。不難以各 種劑型，如可注射溶液施用這些制劑。
對于水溶液腸胃道外施藥，如需要可適當緩沖該溶液，首先用足夠的鹽水或 葡萄糖將稀釋液變成等滲。這些具體水溶液特別適合靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜 內(nèi)施用。就此而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員，根據(jù)本文公開內(nèi)容將了解可使用無菌水溶液。 例如，可將一劑量溶于1毫升等滲NaCl溶液中，或加到1000毫升作皮下灌注液或 注射到預(yù)定輸液部位(見例如"Remington藥物科學(xué)"15版，1035-1038頁和1570 一1580)。根據(jù)待治療個體的情況，須對劑量作某些改動。負責給藥的人員在任何 情況下都將能確定各個患者的合適劑量。
在本發(fā)明的一個實施例中，提供了編碼犬埃里希體30kDa免疫反應(yīng)性蛋白的 DNA序列。優(yōu)選該蛋白質(zhì)具有選自SEQ IDN0:2、 4、 6、 40、 42、 44、 46的氨基酸 序列，基因具有選自SEQIDN0:1、 3、 5、 39、 41、 43、 45的核酸序列，是多態(tài)性 多基因家族的成員。更優(yōu)選的，該蛋白質(zhì)具有N-末端信號序列，它在翻譯后加工后切斷，產(chǎn)生成熟的28kDa蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是編碼28kDa蛋白質(zhì)的DNA包含在一個 多基因基因座中，它的大小是10，677bp，編碼9個犬埃里希體的同源28kDa蛋白。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種表達載體，它含有編碼犬埃里希體 28kDa免疫反應(yīng)性蛋白的基因，當引入細胞時該載體能表達該基因。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種重組蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有選自SEQ IDN0:2、 4、 6、 40、 42、 44、 46的氨基酸序列。優(yōu)選氨基酸序列是由選自SEQ ID N0:1、 3、 5、 39、 41、 3、 45的核酸序列所編碼。更優(yōu)選該重組蛋白質(zhì)含有4個表 面暴露的、親水和抗原性可變區(qū)。仍然優(yōu)選的是該重組蛋白是一種抗原。
本發(fā)明的另一個實施例提供了一種產(chǎn)生該重組蛋白的方法，包括以下步驟-獲得含有表達區(qū)的一載體，該表達區(qū)含有選自與啟動子可操縱性連接的SEQ ID N0:2、 4、 6、 40、 42、 44、 46的氨基酸序列的編碼序列；將載體轉(zhuǎn)染入細胞，并 在有效表達該表達區(qū)的條件下培養(yǎng)細胞。
在一些實施例中還描述了本發(fā)明抑制個體犬埃里希體感染的方法，包括步驟 鑒定懷疑已接觸或感染犬埃里希體的個體；和給予能有效抑制犬埃里希體感染劑量 的含有犬埃里希體28kDa抗原的組合物。該抑制作用可以通過任何方法，例如刺激 個體的體液或細胞免疫應(yīng)答，或通過其它途徑，例如抑制28kDa抗原的正常功能， 或甚至同該抗原競爭與個體體內(nèi)一些的因子相互作用而發(fā)生。
給出下列例子，用于說明本發(fā)明的各種實施例，而不意味以任何方式限制本 發(fā)明。
實施例1
ECa28-1(p28-7)基因的未知5'和3'區(qū)域的測序 埃里希體和純化
Dr. Edward Breitschwerdt, (College of Veterinary Medicine, North Carolina State University, Raleigh, NC)提供了犬埃里希體(Florida株和分離物Demon, DJ, Jake,和 Fuzzy) 。 Dr. Richard E. Corstvet (School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, Baton Rouge, LA)提供了犬埃里希體(Louisana株)，Dr. Jacqueline Dawson (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)提供了犬埃里希體 (Oklahoma株)。以補充有10%胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)的DH82 細胞中37'C進行埃里希體的增殖。用一般的細胞染色法觀察犬埃里希體桑椹體的存在，監(jiān)測在DH82細胞中的胞內(nèi)生長。當100%細胞被埃里希體感染時，用細胞 刮棒收集鵬2細胞。17， 000xg離心細胞20分鐘。用Braun-Sonic2000超聲發(fā)生 器以40W30秒，在冰上破碎細胞沉淀兩次。如前所述純化埃里希體(WeissE， 1975)。 將細胞裂解液加到42%—36%—30%泛影葡胺的不連續(xù)梯度上，80， OOOxg離心 60分鐘。收集重帶和輕帶中的埃里希體，并用蔗糖-磷酸-谷氨酰胺緩沖液(SPG， 218mM蔗糖、3, 8mMKH2P04、 7, 2mM K異、4. 9mM谷氨酰胺，pH7. O)洗滌，離心沉 淀。
核酸制備
如前所述(McBride等，1996)，將泛影葡胺純化的埃里希體重新懸浮在600 微升10mM Tris-HC1緩沖液(pH7. 5)和1%十二烷基磺酸鈉(SDS， w/v)和100ng/ml蛋 白酶K中，制備犬埃里希體基因組DNA。將該混合物在56。C保溫1小時，用苯酚/ 氯仿/異戊醇(24:24:l)的混合物抽提核酸兩次。用純乙醇沉淀DNA，用70%乙醇洗 滌一次，干燥并重懸浮于10raM Tris(pH7. 5)中。用高純度質(zhì)粒分離試劑盒 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)純化質(zhì)粒DNA，并用QIAquick PCR純化試 劑盒(Qiagen， Santa Clarita, CA)純化PCR產(chǎn)物。
ECa28-l(p28-7)基因的克隆
用Universal GenomeWalker試劑盒(CLONTECH， Palo Alto, CA)根據(jù)廠商提供 的方法測定p28-7基因的全長序列。用5種限制性酶("ral, Seal, SM)
完全消化犬埃里希體(Jake分離物)基因組DNA，產(chǎn)生鈍端DNA。將試劑盒中提供 的接頭(AP1)與犬埃里希體DNA的每一端連接。將該基因組文庫用作模板，采用 與p28-7序列已知部分互補的引物，和對接頭AP1特異性的引物，通過PCR來尋 找p28-7基因的未知DNA序列。用于基因組步査的p28-7特異性引物是從衍生自 引物793(SEQIDNO:16)和1330(SEQ ID NO:17)PCR擴增p28-7的已知DNA序歹U 設(shè)計的。引物394((5'-GCATTTCCACAGGATCATAGGTAA-3';核苷酸687-710, SEQ ID NO. 21)和394C (5'-TTACCTATGATCCTGT GGAAATGC-3;核苷酸 710-687, SEQ ID NO. 22))用于與提供的引物API連接，通過PCR擴增p28-7基因 的未知5'和3'區(qū)。對相應(yīng)于用引物394C和API擴增的p28-7基因5'區(qū)(2000bp)的 PCR產(chǎn)物用引物793C(5'-GAGTA ACCAACAGCTCCTGC-3', SEQ ID No. 23)單向 測序。用同一引物雙向測序?qū)?yīng)于以引物394和API擴增的p28-7基因3'區(qū)(580bp)的PCR產(chǎn)物。對鄰接開放閱讀框的5'和3'區(qū)的非編碼區(qū)進行測序，設(shè)計與這些區(qū) 域互補的引物EC280M-F (5'-TCTACTTTGCACTTCC ACTATTGT-3', SEQ ID NO. 24)和EC280M-R (5'-ATTCTTTTGCCACTATTT TTCTTT-3', SEQ ID NO. 25)以擴
增整個p28-7基因。 DNA測序
用ABI Prism 377 DNA測序儀(Perkin陽Elmer Applied Biosystems， Foster City, CA)對DNA進行測序。用引物EC280M-F (SEQ ID No. 24)和EC280M-R (SEQ ID No. 25)， 95。C5分鐘，30輪95。C30秒，62°C1分鐘，72。C2分鐘，和72"延伸10 分鐘的熱循環(huán)方案通過PCR擴增7種犬埃里希體分離物(來自North Carolina的4 種，Oklahoma, Florida和Louisiana各一種)的整個p28-7基因。得到的PCR產(chǎn)物 用相同引物雙向測序。
實施例2
犬埃里希體ECa28-l(p28-7)基因的PCR擴增、克隆、測序和表達 表達載體
用弓I物-EC280M-F和EC280M-R PCR擴增了整個犬埃里希體p28-7基因，并 克隆入pCR2.1-TOPO TA克隆載體，獲得所需組的限制性酶切割位點(Invitrogen, Carlsbad, CA)。用BstX 1從pCR2.1-TOPO上切下插入物，連接入pcDNA3.1真核 表達載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)，稱為pcDNA3.1/EC28用于后面的研究。擴增 pcDNA3.1/EC28質(zhì)粒，用Kpnl-Xbal雙消化切下基因，并定向連接到pThioHis原 核表達載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。該克隆(稱為pThioHis/EC28)在大腸桿菌 BL21中產(chǎn)生了一個重組的硫氧還蛋白融合蛋白。
實施例2
犬埃里希體ECa28-l(p28-7)基因的PCR擴增、克隆、測序和表達 表達載體
用引物EC280M-F和EC280M-R PCR擴增了全長的犬埃里希體p28-7基因， 并克隆入pCR2.1-TOPO TA克隆載體，以獲得所需的限制性酶切位點組(Invitrogen, Carlsbad, CA)。用BstX 1從pCR2.1-TOPO上切下插入物，連接入pcDNA3.1真核 表達載體(Invitrogen, Carlsbad, CA)，稱為pcDNA3.1/EC28，用于隨后的研究。擴增 pcDNA3.1/EC28質(zhì)粒，用Kpnl-Xbal雙消化切下該基因，并定向連接入pThioHis原核表達載體中(Invitrogen, Carlsbad, CA)。該克隆(稱為pThioHis/EC28)在大腸桿菌 BL21中產(chǎn)生重組的硫氧還蛋白融合蛋白。離心粗純化呈不溶相的重組融合蛋白。 在天然條件下用鎳-NTA旋轉(zhuǎn)柱(Qiagen， Santa Clarita， CA)從溶解的細胞裂解物中， 純化得到對照的硫氧還蛋白融合蛋白。 蛋白質(zhì)印跡分析
在4-15%Tris-HCl梯度凝膠(Bio-Rad， Hercules, CA)上對重組犬埃里希體p28-7 融合蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并用半干轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad， Hercules, CA)轉(zhuǎn)移到純硝酸纖維素(Schleicher & Schuell, Keene， NH)膜上。將該膜 與1:5000稀釋的受犬埃里希體感染的恢復(fù)期犬抗血清保溫l小時，洗滌，然后與 抗犬IgG(H&L)堿性磷酸酶偶聯(lián)的親和層析純化的二抗(l:1000)保溫1小時 (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg， MD)。結(jié)合的抗體用5-溴-4-氯-3』引 哚磷酸/氮藍四唑(BCIP/NBT)底物(Kirkegaard & Perry Laboratories, Ga池ersburg， MD)。
Southern印跡分析
為了確定與p28-7基因同源的多基因是否存在于犬埃里希體基因組中，用標準 方法(Sambrook等，1989)進行了基因組的Southern印跡分析。用各限制性酶BanII、 EcoRV、 HaeII、 Kpnl和Spel完全消化犬埃里希體基因組DNA，它們不在p28-7 基因內(nèi)切割，Asel在核酸34、 43和656處切開p28-7。通過用引物EC280M-F和 EC280M-R和地高辛(DIG)-標記的脫氧核苷酸三磷酸(dNTP) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)作PCR擴增產(chǎn)生探針，并用Asel消化。用瓊脂糖凝膠電泳分離 消化的探針(566-bp)，凝膠純化然后用于雜交。完全消化的基因組犬埃里希體DNA 電泳并轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)上，與p28-7基因DIG-標記的探針在DIG Easy hyb緩沖液中，根據(jù)廠商的方案(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)4(TC雜交16小時。用抗-DIG堿性磷酸酶-偶聯(lián)抗體和發(fā)光底物 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)檢測結(jié)合的探針，并曝光BioMax科學(xué)顯影 膠片(Eastman Kodak, Rochester, NY)。
序列分析和比較
從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)獲得恰菲埃里希體p28和反芻類考德里氏體 map—1 DNA序列。用LASERGENE軟件(DNASTAR, Inc. Madison, WI)進行核苷酸和
18推測的氨基酸序列和蛋白質(zhì)以及系統(tǒng)發(fā)生分析。用McGeoch和von Heijine的方法， 使用PS0RT程序(McGeoch, 1985; von Heijne, 1986)進行翻譯后加工分析，以識別信 號序列。
用設(shè)計用于擴增該全長基因的引物對7種不同犬埃里希體株的p28-7進行序 列分析。分析揭示該基因的序列在North Carolina (4種)，Louisiana, Florida和 Oklahoma的分離物中是保守的。
結(jié)果
用Jotun-Hein算法排列對比了恰菲埃里希體p28和反芻類考德里氏體map-1 的核酸序列產(chǎn)生具有高同源(>90%)區(qū)域的共有序列。這些同源區(qū)(反芻類考德里氏 體map-1核苷酸313-332和823-843;恰菲埃里希體p28的307-326和814-834)被 定為PCR擴增的引物退火位點的目標。用引物793 (5-GCAGGAGCTGTTGGTTACTC-3') (SEQ ID NO. 16)和1330 (5'-CCTTCCTCCAAGTTCTATGCC-3') (SEQ ID NO. 17)完成了犬埃里希體p28-7基 因的PCR擴增，得到518bp的PCR產(chǎn)物。用引物793和1330擴增犬埃里希體DNA， 熱循環(huán)方案為95。C2分鐘，95°〇30秒、62°C1分鐘、72°C2分鐘的30輪循環(huán)，然 后72'C延伸10分鐘，保持在4i:。通過直接用引物793和1330對產(chǎn)物測序獲得犬 埃里希體PCR產(chǎn)物的核酸序列。
序列分析揭示有一個編碼170個氨基酸的蛋白質(zhì)的開放閱讀框，犬埃里希體 PCR擴增獲得的518bp序列和恰菲埃里希體p28基因的DNA序列的排列對比，揭 示70%以上的相似性，表明這些基因是同源的。
用引物394和793C迸行接頭PCR，以確定全基因序列的5'和3'區(qū)段。弓l物 394產(chǎn)生4種PCR產(chǎn)物(3kb、 2kb、 1拷貝禾卩0.8kb)，對0.8kb的產(chǎn)物用引物394和 AP1進行雙向測序。推測的序列與518bp產(chǎn)物的3'末端重疊，將開放閱讀框延伸 12個bp至終止密碼子。還對p28-7基因3'末端的另一個625bp非編碼序列進行了 測序。
用引物394C和提供的引物API擴增p28-7基因的5'末端。這些引物擴增得到 3種PCR產(chǎn)物(3.3、 3-kb和2kb)。用引物793C對2-kb片段進行單向測序。序列提 供了p28-7基因的推測的起始密碼子，并完整了編碼278個氨基酸的蛋白質(zhì)的834bp 開放閱讀框。產(chǎn)生p28-7基因5'非編碼區(qū)的其它144bp的可閱讀序列。從鄰近p28-7基因的互補非編碼區(qū)設(shè)計引物EC280M-F和EC280M-R。
用相同引物直接對用這些引物擴增的PCR產(chǎn)物進行測序。圖1顯示了犬埃里 希體p28-7基因(SEQ ID NO:l)的完整DNA序列。用這些引物擴增的p28-7 PCR片 段含有整個開放閱讀框和來自5'非編碼引物區(qū)的17個其它氨基酸。將基因直接亞 克隆入pThioHis表達載體，并用該構(gòu)建物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。表達的p28-7硫氧 還蛋白融合蛋白是不可溶的。表達的蛋白質(zhì)具有與硫氧還蛋白結(jié)合的另114個氨基 酸，5個氨基酸是腸激酶識別位點，32個氨基酸來自多克隆位點和N-末端的5'非 編碼引物區(qū)。來自犬埃里希體感染的犬恢復(fù)期抗血清識別表達的重組融合蛋白，但 不和硫氧還蛋白對照反應(yīng)(圖2)。
實施例3
犬埃里希體p28-7基因的序列同源性
用Clustal法排列對比了犬埃里希體p28-7(834bp)和包括信號序列的恰菲埃里 希體omp-l基因家族(p28-7、 omp-lA、 B、 C、 D、 E和F)的核酸序列，以檢測這 些基因之間的同源性(排列未顯示)。在犬埃里希體p28-7、恰菲埃里希體p28和 omp-lF之間核酸同源性相等保守(68.9y。)。恰菲埃里希體omp-l家族中的其它推定 的外膜蛋白基因，omp-lD(68.2%)、 omp-lE(66.7%)、 omp-lC(64.1%)、反芻類考德 里氏體map-l(61.8。/o)、犬埃里希體28kDa蛋白1基因(60%)和28kDa蛋白2基因(部 分)(59.5%)也與p28-7是同源的。恰菲埃里希體omp-lB與犬埃里希體p28-7的核酸 同源性(45.1%)最少。
犬埃里希體p28-7(SEQ ID NO:2)和恰菲P28的預(yù)測氨基酸序列的排列對比， 揭示了導(dǎo)致4個可變區(qū)(VR)的氨基酸取代。鑒定了犬埃里希體P28-7和恰菲埃里希 體OMP-l家族可變區(qū)的氨基酸序列和位置中的取代或缺失(圖3)。包括信號肽的氨 基酸比較揭示，犬埃里希體P28-7與恰菲埃里希體OMP-l家族的OMP-1F具有最 高的同源性(68%)，然后是恰菲P28(65.5%)、 OMP-lE(65.1%)、 0MP-1D(62.9%)、 0MP-1C(62.9%)、反芻類考德里氏體MAP-1(59.4%)、犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì) 1(55.6%)和28kDa蛋白質(zhì)2(部分)(53.6%)和0MP-1B(43.2%)?；诎被嵝蛄械南?統(tǒng)發(fā)生關(guān)系顯示，犬埃里希體P28-7和反芻類考德里氏體MAP-1、恰菲埃里希體 OMP-l蛋白以及犬埃里希體28kDa蛋白1和2(部分)是相關(guān)的(圖4)。
實施例4犬埃里希體P28-7的預(yù)測的表面可能性和免疫反應(yīng)性
用疏水和親水概況圖分析犬埃里希體P28-7，預(yù)測P28-7上的表面暴露區(qū)域(圖 6)。在犬埃里希體P28-7中鑒定出8個含有3-9個氨基酸的主要表面暴露區(qū)域，與 恰菲埃里希體P28上的表面暴露區(qū)域的情況相似(圖6)。犬埃里希體P28-7上較大 的表面暴露區(qū)域中的5個，位于蛋白質(zhì)的N末端區(qū)域。在犬埃里希體P28-7的全 部4個可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)了表面暴露的親水區(qū)域。用Rothbard-Taylor算法(Rothbard和 Taylor， 1988)在P28-7中預(yù)測了 10個T-細胞基序，用Jameson-Wolf抗原性算法(圖 6) (Jameson和Wolf, 1988)預(yù)測了犬埃里希體P28-7的高抗原性。在犬埃里希體 P28-7和恰菲埃里希體P28之間觀察到抗原性和T-細胞基序的相似性。
實施例5
犬埃里希體p28-7基因同源基因組拷貝的檢測
用限制性酶5朋II,五coRV, Ap"I， 5^1(在p28-7基因中沒有限制性內(nèi)切酶
位點)和Asel(在核苷酸34、 43和656有內(nèi)部限制性內(nèi)切酶位點)分別完全消化犬埃 里希體DNA，進行基因組Southern印跡分析，揭示存在至少3種同源p28-7基因 拷貝(圖5)。雖然犬埃里希體p28-7具有內(nèi)部Asel內(nèi)部限制位點，用于雜交實驗的 DIG-標記的探針針對Asel消化基因產(chǎn)生的一個DNA片段內(nèi)的基因區(qū)。用Asel消 化產(chǎn)生3個條帶(約566bp、 850bp和3kb)，它們與p28-7DNA探針雜交，表示基因 組中存在與p28-7同源的多基因。用EcoRV和SpeI消化，產(chǎn)生與p28-7基因探針 雜交的兩個條帶。
實施例6
犬埃里希體ECa28SA2(p28-5)、 ECa28SA3(p28-6)的PCR擴增
多基因基因座的基因和鑒定
為了特異性擴增ECa28SA2(p28-5)下游的可能未知基因，用對p28-5特異性的 引物46f(5'-ATATACTTCCTACCTAATGTCTCA-3', SEQ ID No. 18)和引物 1330(SEQIDNO:17)進行擴增，1330針對p28-7基因3'末端的保守區(qū)。凝膠純化擴 增產(chǎn)物，克隆入TA克隆載體(Invitrogen, Santa Clarita,CA)。對克隆進行雙向測序， 使用引物來自載體的M13反向、46f、五Cfl2&X42 (5'-AGTGCAGAGTCTTCGGTTTC-3', SEQ ID No. 19),五C"5J (5'-GTTACTTGCGGAGGACAT-3', SEQ ID No. 20)。用熱循環(huán)方案95°C2分鐘，30輪的95。C30秒，48。Cl分鐘，72。Cl分鐘，然后72。C延伸10分鐘，維持在4。C。
用這些引物擴增得到一含有2個開放閱讀框的2-kb PCR產(chǎn)物。第一個開放閱 讀框含有p28-5基因的已知區(qū)域和該基因先前未測序的3'部分。在p28-5下游發(fā)現(xiàn) 另一個不相同，但同源的28kDa蛋白基因，稱為ECa28SA3(p28-6)。
用對應(yīng)于p28-6內(nèi)區(qū)域的特異性引物，稱為fCaW3-2 (5'-CTAGGATTA GGTTATAGTATAAGTT-3', SEQ ID No. 26)和與p28-7內(nèi)某區(qū)域退火的引物 793C(SEQ ID NO:23)擴增基因p28-6和-p28-7之間的基因間區(qū)。用熱循環(huán)方案95 T2分鐘，30輪的95"C30秒，48°C1分鐘，72°C1分鐘，然后72°。延伸10分鐘， 維持在4"C擴增DNA。
擴增得到一 800bp PCR產(chǎn)物，它含有p28-6的3'末端，p28-6和p28-7(28NC3) 之間的基因間區(qū)，和p28-7的5'末端，與先前分離的基因座連接(圖8)。p28-5的849bp 的開放閱讀框編碼283氨基酸蛋白，p28-6具有編碼280個氨基酸蛋白質(zhì)的840bp 開放閱讀框。p28-6和p28-7之間的基因間非編碼區(qū)域長345bp(圖7和8)。
實施例7
犬埃里希體p28-4、 p28-5、 p28-6、 p28-7和p28-8蛋白質(zhì)的核酸和氨基酸同源
性
用Clustal法排列對比了全部5種犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因的核酸和氨基 酸序列，以檢測這些基因之間的同源性。核酸同源性是58-75%，在犬埃里希體 28-kDa蛋白質(zhì)基因成員之間觀察到67-72y。相似的氨基酸同源性。
轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域
通過與共有的大腸桿菌啟動子區(qū)和恰菲埃里希體的啟動子比較，分析28kDa 蛋白質(zhì)基因之間的基因間區(qū)的啟動子序列(Yu等，1997; McClure, 1985)。在對應(yīng)于 基因p28-5、 p28-6、 p28-7和p28-8(Eca28-2)的4個基因間序列中鑒定出推定的啟 動子序列，包括RBS， -10禾卩-35區(qū)(圖10)。 p28-4(ECa28SAl)的上游非編碼區(qū)是未 知的，沒有分析。
N-末端信號序列
氨基酸序列分析揭示，全長犬埃里希體p28-7具有30.5kDa的推測分子量，整 個p28-6具有30.7kDa的推測分子量。兩條蛋白質(zhì)具有23個氨基酸的推測N-末端 信號肽(MNCKKILITTALMSLMYYAPSIS， SEQ ID No. 27)，與恰菲埃里希體P28(顧YKKILITSALISLISSLPGV SFS, SEQ ID NO. 28)，和OMP-1蛋白家族預(yù)測 的相似(Yu等，1999a; Ohashi等，1998b)。
在p28-7的氨基酸21、22和23處發(fā)現(xiàn)信號肽酶的優(yōu)選切割位點(SIS; Ser-X-Ser) (Oliver, 1985)。在氨基酸位置25處還存在另一個推定的切割位點 (MNCKKILITTALISLMYSIPSISSFS, SEQ ID NO, 29)，與恰菲埃里希體P28的預(yù)測 切割位點(SFS)相同，這導(dǎo)致具有27.7kDa預(yù)測分子量的成熟p28-7。預(yù)測p28-5先 前報道的部分序列的信號切割位點在氨基酸30。然而，信號序列分析預(yù)測p28-4 具有不可切割的信號序列。
總結(jié)
從包括犬埃里希體、恰菲埃里希體、反芻類考德里氏體的多個立克次氏體鑒 定并克隆了具有相似分子量的蛋白質(zhì)(Reddy等，1998; Jongejan等，1993; Ohashi等, 1998)。先前描述了恰菲埃里希體中具有6個同源p28基因的一個基因座，和犬埃 里希體中的2個基因座，各含有一些同源28kDa蛋白質(zhì)基因。
本發(fā)明顯示了與恰菲埃里希體omp-1多基因家族以及反芻類考德里氏體 map-1基因同源的犬埃里希體編碼成熟28-kDa蛋白質(zhì)的基因的克隆、表達和特征 確定。鑒定出兩種新的28kDa蛋白質(zhì)基因p28-7和p28-6。在本發(fā)明中對于另一種 犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因，先前部分測序(Reddy等，1998)的p28-5完全測序。 還公開了含有5種犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因(p28-4、 p28-5、 p28-6、 p28-7和 p28-8)的犬埃里希體中的一個基因座的鑒定和特征確定。
犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)與恰菲埃里希體OMP-l家族以及反芻類考德里氏體 MAP-1蛋白是同源的。最同源的犬埃里希體28kDa蛋白(p28-6、 p28-7和p28-8)在 該基因座中依次排列。這些蛋白質(zhì)的同源性是67.5-72.3%。這些28kDa蛋白質(zhì)中 的趨多樣是27.3-38.6%。犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)p28-4和p28-5同源性最小，為 50.9-59.4%，多樣性是53.3-69.9%?；蜷g的不同主要在于4個超變區(qū)，提示這些 區(qū)域是表面暴露的，受到免疫系統(tǒng)的選擇壓力。報道了p28-7在7種犬埃里希體分 離物中的保守性(McBride等，1999)，提示犬埃里希體在北美可能是純系的。相反， 報道了恰菲埃里希體中p28的顯著多樣性(Yu等，1999a)。
全部犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)似乎是從30kD蛋白質(zhì)翻譯后加工成成熟28kD 蛋白的。近來，在恰菲埃里希體P28上鑒定出一條信號序列(Yu等，1999a)， N-末端氨基酸測序證實，蛋白質(zhì)翻譯后加工，切下信號序列產(chǎn)生成熟蛋白(Ohashi等， 1998)。 0MP-1F和0MP-1E的前導(dǎo)序列已被提出是前導(dǎo)信號肽(Ohashi等，1998)。 在恰菲埃里希體0MP-1F、 OMP-1E和P28上鑒定的信號序列與犬埃里希體28kDa 蛋白的前導(dǎo)序列是同源的。p28基因的啟動子序列未被實驗所確定，但通過與RBS、 大腸桿菌和其它埃里希體的-10和-35啟動子區(qū)的共有序列比較，鑒定了可能的啟 動子區(qū)(Yu等，1997; McClure， 1985)。這些啟動子區(qū)將使每個基因可能被轉(zhuǎn)錄和 翻譯，提示這些基因可以在宿主中差異表達。在犬中持續(xù)感染可能與p28基因的差 異表達有關(guān)，導(dǎo)致體內(nèi)抗原改變，因此使生物規(guī)避免疫應(yīng)答。
發(fā)現(xiàn)犬埃里希體28kDa蛋白基因顯示與恰菲埃里希體omp-l基因家族和反芻 類考德里氏體map-l基因的核酸和氨基酸序列同源性。先前研究已證明犬埃里希 體30kDa蛋白，它與針對恰菲埃里希體的恢復(fù)期抗血清反應(yīng)，但相信抗原是不同 的(Rikihisa等，1994)。根據(jù)犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)4個可變區(qū)中氨基酸取代比 較所得發(fā)現(xiàn)，支持該可能性。這些發(fā)現(xiàn)一起提示負責犬埃里希體和恰菲埃里希體 P28之間的抗原差異的氨基酸位于這些可變區(qū)中，可輕易接觸免疫系統(tǒng)。
報道了免疫反應(yīng)性肽位于反芻類考德里氏體、恰菲埃里希體、犬埃里希體 28kDa蛋白的可變區(qū)中(Reddy等，1998)。犬埃里希體和恰菲P28的分析揭示，所 有可變區(qū)具有預(yù)測的表面暴露的氨基酸。在犬中的研究顯示，缺乏犬埃里希體和恰 菲埃里希體的交叉保護(Dawson和Ewing， 1992)。該觀察可能與這些埃里希體品 種的P28可變區(qū)中以及其它免疫學(xué)重要抗原的抗原性差異有關(guān)。另一個研究發(fā)現(xiàn)， 恰菲埃里希體感染的病人的恢復(fù)期人抗血清識別恰菲埃里希體的29/28kDa蛋白， 也與犬埃里希體的同源蛋白質(zhì)反應(yīng)(Chen等，1997)。犬埃里希體28kDa蛋白和恰 菲埃里希體P28上的同源和交叉反應(yīng)性表位似乎被免疫系統(tǒng)識別。
犬埃里希體28kDa蛋白可能是重要的免疫保護性抗原。幾個報道證明，犬埃 里希體的30kDa抗原顯示強免疫反應(yīng)性(Rikihisa等，1994; Rikihisa等，1992)。人 和犬恢復(fù)期抗血清中的抗體與恰菲埃里希體和犬埃里希體的該大小范圍內(nèi)的蛋白 質(zhì)反應(yīng)，提示它們可能是重要的免疫保護性抗原(Rikihisa等，1994; Chen等，1994; Chen等，1997)。另夕卜，針對30、 24和21kDa蛋白的抗體在對犬埃里希體的免疫 應(yīng)答中很早產(chǎn)生(Rikihisa等，1994; Rikihisa等，1992)，提示這些蛋白質(zhì)可能在疾 病急性階段的免疫應(yīng)答中尤其重要。近來，在恰菲埃里希體中鑒定出分子量為28kDa的編碼外膜蛋白的同源基因家族，用重組恰菲埃里希體P28的免疫小鼠產(chǎn)生 針對同源攻擊的免疫力(Ohashi等，1998)。恰菲埃里希體P28被證明存在于外膜， 免疫電子顯微鏡將P28定位在該微生物的表面，因此提示它可能作為粘附素起作 用(Ohashi等，1998)。可能在該研究中鑒定的恰菲埃里希體的28kDa蛋白具有相同 的位置，可能起到相同作用。
不同犬埃里希體株p28-7的比較揭示，該基因明顯完全保守。用恰菲埃里希體 的研究顯示多樣性的免疫學(xué)和分子證據(jù)。恰菲埃里希體感染的病人具有對 29/28kDa蛋白質(zhì)可變化的免疫反應(yīng)性，提示其具有抗原多樣性(Chen等，1997)。 近來已產(chǎn)生了分子證據(jù)，支持恰菲埃里希體p28基因中有抗原多樣性(Yu等， 1999a)。 5種恰菲埃里希體分離物中的比較，揭示兩種分離物(Sapulpa和St. Vincent) 是100%相同的，但其它三種(Arkansas， Jax， 91HE17)具有多樣性，在氨基酸水平 上達13.4%。犬埃里希體p28-7的保守提示，美國發(fā)現(xiàn)的犬埃里希體株是基因相同 的，因此犬埃里希體28kDa蛋白是美國犬埃里希體病的吸引人的候選疫苗。美國 以外的其它犬埃里希體分離物可提供關(guān)于犬埃里希體起源和進化的信息。28kDa 蛋白的保守性使的它成為可靠血清診斷犬埃里希體病的重要的候選試劑。
現(xiàn)在還不知道多種同源性基因的作用；然而，犬中犬埃里希體的持續(xù)感染可 能與由于同源28kDa蛋白基因表達變化導(dǎo)致的抗原性改變相關(guān)，因此使犬埃里希 體能規(guī)避免疫監(jiān)視。msp-3基因在著邊無形體中的變化部分引起MSP-3蛋白的改 變，導(dǎo)致持續(xù)感染(Meman等，1997)。檢測急性和慢性感染犬中犬埃里希體28kDa 蛋白基因表達的研究，可提供28kDa蛋白基因家族在感染持續(xù)中的作用的理解。
實施例8
犬埃里希體p28-l、 p28-2、 p28-3和p28-9基因的鑒定
通過為；72S々(ECa28-75C)和；^S-5 (ECa28-5-818f)設(shè)計的基因特異性引物，雙 向延伸p28基因座，對上述串聯(lián)排列的p28基因的5個基因座的DNA上游和下游 的未知區(qū)域進行測序。進行多基因步查如下獲得未知序列用引物p28-5-818f (5'-TTA AAC ATA TGC CAC TTC GGA CTA-3，， SEQ ID No. 34)擴增5個基因座 1.9kp下游，并測序，產(chǎn)生900bp的擴增子，用1191 (5，-TATGATCGTGTAAAA TTGCTGTGAGTAT-3，，SEQIDNo. 35)，產(chǎn)生lkb的擴增子。用引物ECa28-75C (5'-TAC TGG CAC GTG CTG GAC TA陽3'， SEQ ID No. 36)對5個基因座DNA上游的3.67kbp進行擴增和測序，產(chǎn)生1.6kbp擴增子；用ECa5，-1600 (5'-CAC CAA TAA ATG CAG AGA CTT C-3，， SEQ ID No. 37)，產(chǎn)生1.6kbp擴增子；用3125 (5，-AAT CCATCATTTCTCATTACAGTGTG-3，，SEQIDNo. 38)，產(chǎn)生800bp擴增子。9 個串聯(lián)排列基因的該基因座含有4個新的p28基因和上述5個p28基因，命名為 p28-l到p28-9(圖11)。
用Clustal法排列對比了犬埃里希體p28基因的核酸和氨基酸序列，以檢測這 些基因之間的同源性。這些蛋白質(zhì)的同源性為67.5-75%，這些P28蛋白中的多樣 性為26.9-38%。犬埃里希體P28蛋白P28-l、 P28-2和P28-9與其它p28基因同源 性最小，為37-49%，多樣性為53-77%。 9個p28基因的核酸同源性是28-72%。圖 12顯示了基于犬埃里希體p28氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。
核苷酸序列和登錄號
完全的9基因犬埃里希體(Jake株)p28基因座的核酸和氨基酸序列的GenBank 登錄號是AF082744。該登錄號原來是給p28-7的，但已用9基因p28基因座的序 列，包括p28-7更新。本研究中描述的其它犬埃里希體分離物的p28-7的核酸和氨 基酸序列的GenBank登錄號是Louisiana, AF082745; Oklahoma, AF082746; Demon, AF082747; DJ, AF082748; Fuzzy, AF082749; Florida, AF082750。
用犬埃里希體感染的犬的恢復(fù)期血清的免疫印跡觀察到28kDa范圍內(nèi)的許多 條帶(Rikihisa等，1994)，多個p28蛋白的表達可能是該觀察結(jié)果的解釋。Southern 印跡研究提示，基因組中除了該基因座中的5個成員夕卜，存在其它p28基因(McBride 等，1999; Ohashi等，1998b)。
在該研究中，鑒定出含有編碼同源性，但非相同的p28基因的9個串聯(lián)排列 的犬埃里希體p28基因的一個基因座。9個基因的基因座包括4個新p28基因(圖 13-16)和上述報道的5個串聯(lián)排列的p28基因。8個p28基因位于一條DNA鏈上， 一個p28基因在互補鏈上。9個p28基因成員中核酸同源性是37-75。/。，氨基酸同 源性是28-72%。
發(fā)現(xiàn)犬埃里希體P28與其它物種，例如恰菲埃里希體的28kDa蛋白像其與自 身一樣密切相關(guān)(McBride等，2000)。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中的區(qū)別主要在幾個主要超變區(qū) 中，提示這些區(qū)域是表面暴露的，受到免疫系統(tǒng)的選擇壓力(McBride等，2000)。
報道了 7種地理學(xué)上不同的分離物中犬埃里希體p28基因(p28-7)的保守性(McBride等，1999)，提示犬埃里希體在北美可能是高度保守的。類似的，犬埃里 希體的120kDa糖蛋白在美國的分離物中也是保守的(Yu等，1997)。相反，恰菲埃 里希體的120kDa和28kDa蛋白質(zhì)基因在分離物中是多樣的(Yu等，1999a; Chen 等，1997)。恰菲埃里希體28kDa蛋白質(zhì)基因的多樣性似乎是由于超變區(qū)中的點突 變所致，該突變可能是由于選擇性免疫壓力(Yu等，1999a)。這些資料提示犬埃里 希體可能是較近被引入北美的，這可能是分離物中觀察到的保守的原因。犬埃里希 體分離物中p28基因的保守可提供機會來開發(fā)疫苗和血清診斷性抗原，它們對于疾 病預(yù)防和血清診斷將特別有效。P28的混合物可提供最可靠的血清診斷試驗，但用 一種P28血清診斷對于免疫診斷是有用的(Ohashi等，1998b; McBride等，1999)。 本文引用了下列文獻
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本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解，本發(fā)明適用于實施提到的目的和獲得提到的結(jié)
果和優(yōu)點，以及與之相關(guān)的。本文描述的實施例、方法、程序、處理、分子和特定
的化合物以優(yōu)選例為代表，是示范性的，而不意味著限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技 術(shù)人員對其中所作的改變和其它用途都將包括在權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
28序列表
<110> D.H.沃克(Walker, David H.)
J.W.麥克布里奇(McBride, Jere W.) 于學(xué)杰(Yu, Xue-Jie)
<120〉犬埃里希體的同源28kD免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì)基因及其用途
<130> D6152CIP2/PCT
<141〉 2001-09-12
<150> 09/660,587 <151> 2000-09-12
<160〉 46
<210〉 1
<211> 1607
<212> DNA
<213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis)
<220〉
<223〉犬埃里希體p28-7核酸序列 <400> 1
attttatttattaccaatcttatataeitat50
atctctaatgttttatacctaatatatatattctggcttgtatctacttt100
gcacttccactattgttaatttattttcactattttaggtgtaatatgaa150
caactgcattaatatcattaatgtactcta200
ttccaagcatatctttttctgatactatacaagatggtaacatgggtggt250
ttagtggaaagtatgtaccaagtgtctcacattttggtag300
cttctcagcttgttggagtttttggatt肌350
aacatgattgggatggaagtccaatacttacgctgacttt400
actgttccaaactattcgttcagatacgsgaacaatccatttctagggtt450
tgcaggagctatcggttactc犯tgggtggcccaag犯tagaattcg犯3500
tatcttatgaagcattcgacgtaaaaagtcctaatatcaa550
gacgcgcacaggt3CtgCgCtctatctcatcacacatcggcagccatgga600
agctgata犯tttgtcttctgacatatcac650
ttgcaMaaatgcatgttatatgacaaagtacctgtttct700
ccttatatatgcgcaggtattggtactgatttgatttctatgtttg犯gc750
tacaagtcctaaaatttcctaccaagg犯aactgggcattagttactcta800
ttaatccggaaacctctgttttcatcggtgggcatttccacaggatcata850
ggt犯tgagtttagagaitattcctgc犯tagtacctagta900
ccacaatttgcaacagtaacactaaatgtgtgtcactttg950
gtttagaacttggagga.ttteiacttctaattttattgttgccacata1000
tctaaacttgtttttawtattgctacatac1050
aaatagtggcggggggggggggaccaaatt1100
tatcttctatgcttcccaagttttttcycgctatttatgacttaaacaac1150
atcctcacggttca犯tattttatttatta1200
ccaatcttatataatatattaaatttctcttacaaaaatcactagtattt1250
t at ac c aaaatatatattctgacttgcttttcttctgcacttctactatt1300
tttaatttatttgtcactattaggttataataawatgaattgcmaaeigEit1350
ttttcatagcaagtgcattgtgtctttcttacctagcgta1400
tctttttctgacttttacat1450
tagtgcaaagtatatgccaagtgcctcacactttggcgtattttcagtta1500aagaagagaa aaacacaaca actggagttt tcggattaaa acaagattgg 1550 gacggagcaa cactaaagga tgcaagcwgc agccacacaw tagacccaag 1600 tacaatg 1607
<210> 2
<211〉 278
<212〉 PRT
<213> 犬埃里希體(Ehrlichia canis)
<220〉 <223〉
<400>
犬埃里希體p28-7蛋白氨基酸序列
2
Met Asn Cys Lys Met Tyr Ser lie Gly Asn Met Gly Ser Val Ser His Ser Thr Val Gly Pro lie Leu Lys Ser Phe Arg Tyr lie Gly Tyr Ser Tyr Glu Ala Phe Asp Ala His Arg Met Glu Ala Asp Asp lie Ser Leu Lys Val Pro Val Leu lie Ser Met Gly Lys Leu Gly Phe lie Gly Gly Asp lie Pro Ala Pro Gin Phe Ala Glu Leu Gly Gly
Lys 5Pro
20
Gly
35
Phe
50
Val
65
Asn
80
Glu
95
Met
110
Asp
125
Tyr
140
Lys
155
Ala
170
Ser
185
Phe
200
lie
215
His
230
lie
245
Thr
260
Arg
275
lie Ser Asn Gly Phe Lys Asn Gly Val Cys Phe lie Pro Glu Ser Phe Val Val Phe
Leu lie Phe Ser Gly His Asn Gly Lys Ala Val Asn Tyr Ala Tyr His Pro Thr Asn
lie Ser Tyr Phe Leu Ala Pro Pro Ser Leu Phe Ala lie 丁hr Ser Arg Ser Leu Phe
Thr Phe lie Ser Lys Asp Phe Arg Pro Ser Leu Cys Cys Ser lie lie Asn Asn
Thr Als Leu 10
Ser Asp Thr 25
Ser Gly Lys 40
Ala Lys Glu 55
His Asp trp 70
Phe Thr Val 85
Leu Gly Phe 100
lie Glu Phe 115
Asn lie Asn 130
His His Thr 145
Lys Asn Glu 160
Tyr Asp lie 175
Ala Gly lie 190
Pro Lys lie 205
Asn Pro Glu 220
lie Gly Asn 235
Ser Thr Thr 250
Val Cys His
lie Ser Leu 15
lie Gin Asp 30
Tyr Val Pro 45
Glu Ser Lys 60
Asp Gly Ser 75
Pro Asn Tyr 90
Ala Gly Ala 105
Glu lie Ser 120
Tyr Gin Asn 135
Ser Ala Ala 150
Gly Leu lie 165
lie Asn Asp 180
Gly Thr Asp 195
Ser Tyr Gin 210
Thr Ser Val 225
Glu Phe Arg 240
lie Ser Gly 255
Phe Gly Leu
265 270
<210〉 3 <211> 柳 <212〉 腿<213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis) <220>
<221〉 mat—peptide
<223> p28-5的核酸序列
<400〉 3
atgaattgtacacaataagtgcattgatatcattccatata50
cttcctacctaatgtctcatactctaacccagtatatggtaacagtatgt100
atggtaatttttacatatxaggaaagtacatgccaagtgttcctcatttt150
ggaattttttcagctgaagaaagacaactgtagtatatgg200
咖tgggc站atctagtcaaagtccagatg250
ataattttaccattcgaaattactcattcaagtatgc犯gcaacaagttt300
tt鄉(xiāng)gtttgcagtagctattggttactcgataggcagtc350
agttg卿tgtcttatgaagcatttgatgtga犯犯tcc3ggtgataatt400
acaaaaacggtgcttacaggtattgtgctttatctcatca卿tgatgcg450
gatgatgacatgactagtgcaactgacaaatttgtatatt500
aggattacttcatatgttatgaaacaigcaa550
acctctctctccttacatatgtgcaggtattggtactgat600
tgtttgaaactacacatcctaaaatttctt650
gctagggttggcctacttcgtaagtgcagagtcttcggtttcttttggta700
tatattttca犯taataagtttaaaaatgttccagccatg750
gtacctattaactcagacgagatagtaggaccacagtttgcaacagt犯c800
tgctactttgg已ttag肌cttggatgtaggttcaacttc849
<210〉 4
<211〉 283
〈212〉 PRT
<213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis)
<220>
<223〉 p28-5蛋白的氨基酸序列 <400〉 4
Met Asn Cys Lys Lys Val Phe Thr lie Ser Ala Leu lie Ser Ser
5 10 15
lie Tyr Phe Leu Pro Asn Val Ser Tyr Ser Asn Pro Val Tyr Gly
20 25 30
Asn Ser Met Tyr Gly Asn Phe Tyr lie Ser Gly Lys Tyr Met Pro
35 40 45
Ser Val Pro His Phe Gly lie Phe Ser Ala Glu Glu Glu Lys Lys
50 55 60
Lys Thr Thr Val Val Tyr Gly Leu Lys Glu Asn Trp Ala Gly Asp
65 70 75
Ala lie Ser Ser Gin Ser Pro Asp Asp Asn Phe Thr lie Arg Asn
80 85 90
Tyr Ser Phe Lys Tyr Ala Ser Asn Lys Phe Leu Gly Phe Ala Val
95 100 105
Ala lie Gly Tyr Ser lie Gly Ser Pro Arg lie Glu Val Glu Met
110 115 120
Ser Tyr Glu Ala Phe Asp Val Lys Asn Pro Gly Asp Asn Tyr Lys
125 130 135
Asn Gly Ala Tyr Arg Tyr Cys Ala Leu Ser His Gin Asp Asp Ala
140 145 150
Asp Asp Asp Met Thr Ser Ala Thr Asp Lys Phe Val Tyr Leu lieAsn Glu Gly Leu Glu Thr Ala Ser Gly lie Gly Thr Lys lie Ser Tyr Ala Glu Ser Ser Asn Asn Lys Phe Asp Glu lie Val Cys Tyr Phe Gly
155 Leu 170 Lys 185 Asp 200 Gin 215 Val 230 Lys 245 Gly 260 Leu 275
Asn
Asn
Leu
Gly
Ser
Asn
Pro
Glu
lie Ser lie Pro lie His Lys Leu Phe Gly Val Pro Gin Phe Leu Gly
Phe
Leu
Met
Gly
lie
Ala
Ala
Cys
160 Met 175 Ser 190 Phe 205 Leu 220 Tyr 235 Met 250 Thr 265 Arg 280
Thr Pro Glu Ala Phe Val Val Phe
Asn Tyr Thr Tyr His Pro Thr Asn
lie lie Thr Phe Lys lie Leu Phe
165 Cys Tyr
180 Cys AIei
195 His Pro
210 Val Ser
225 lie lie
240 Asn Ser
255 Asn Val
270
<210> 5
<211> 840
<212〉 DNA
<213> 犬埃里希體(Ehrlichia canis) <220〉
<221> mat_peptide
<223〉 p28-6的核酸序列
<400〉 5
atgaattgcatataacaactgcattaatgtcattaatgta50
ctatgctccaagcatatctttttctgatactEitaicaagacgataacactg100
gtagcttctacatcagtggacaagtgtttcacattttggt150
gttttctcagaagaaactcaactgttggagtttttggatt200
"tggaatggaggtac犯tatctaactcttct250
tattcacagttcaaaattattcgtttaaatcccattctta300
gggtttgcaggagctattggttattc犯tgggtggcccaa350
tgaagttctgtax;g3ga^ttcgatgtgaa犯atceig犯c400
ag犯cggcgcacacagatactgtgctttatctcatcatagttcagcaaca450
agcatgtcctccgcaagtaaC3犯tttgttttcttaiaaaaatg肌gggtt500
aattgacttatcatttatgataaatgcatgctatgacata550
gaatgcctttttcaccttatatttgtgcaggtgttggtactgatgttgtt600
tccatgtttgtcctaaaatttcttaccaag650
attaggttatcagaagcctctgtttttatcggtggacact700
ttcacagagtcataggtaatg犯tttagagacatccctgctatggttcct750
agtggatcaaatcttccagagcaatagtaacactaaatgt800
gtgtcactttggcataigaacttggaggaagatttaacttc840
<210〉 6
〈211〉 280
〈212〉 PRT
<213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis) <220>
<223〉 p28-6蛋白的氨基酸序列<400> 6
Met Met Asp Val Thr lie Ser lie Tyr Gly Ser Gly lie Gly Ser Ala Glu Pro Gly
Asn Cys Lys Tyr Tyr Ala Asn Thr Gly Ser His Phe Val Gly Val Ser Asn Ser Phe Lys Tyr Gly Tyr Ser Glu Thr Phe Ala His Arg Met Ser Ser Leu lie Asp lie Glu Gly Thr Asp Val Tyr Gin Gly Ser Val Phe Phe Arg Asp Glu Asn Gin lie Glu Leu
Lys 5
Pro
20
Ser
35
Gly
50
Phe
65
Ser
80
Glu
95
Met
110
Asp
125
Tyr
140
Ala
155
Leu
170
Met
185
Val
200
Lys
215
lie
230
lie
245
Phe
260
Gly
275
lie
Ser
Phe
Val
Gly
Pro
Asn
Gly
Val
Cys
Ser
Ser
Pro
Ser
Leu
Gly
Pro
Ala
Gly
Leu lie lie Ser Tyr lie Phe Ser Leu Lys Glu Asn Asn Pro Gly Pro Lys Asn Ala Leu Asn Lys Phe Met Phe Ser Met Phe Gly Leu Gly His Ala Met lie Val Arg Phe
Thr
Ala
Thr 10 Ser 25 Gly 40 Lys 55 Asp 70 Phe 85 Leu 訓(xùn) lie 115 Asn 130 His 145 Val 160 Asn 175 Tyr 190 Ala 205 Tyr 220 Phe His Arg 235 Pro 250 Leu 265 Phe 280
Phe
Ser
Ala
His
lie
Phe
Arg
Gin
Ser
Phe
lie
Pro
Glu
Gly
Val
Thr
Asn
<210〉 <211〉 <212〉 <213〉
<220> <223〉
7
133 PRT
犬埃里希體(Ehrlichia canis)
P28-5蛋白的部分氨基酸序列
Asp
Lys
Glu
Trp
Thr
Gly
Glu
Asn
His
Phe
Ala
lie
lie
Ser
Ser
Asn
Leu Met Thr lie Tyr Val Glu Arg Asn Gly Val Gin Phe Ala Leu Glu Asn Tyr Ser Ser Leu Lys Cys Tyr Cys Ala Asn Pro lie Ser Val lie Gly Ser Val Cys
Ser
Gin
Pro
Asn
Gly
Asn
Gly
Val
Leu 15 Asp 30 Ser 45 Ser 60 Thr 75 Tyr 90 Ala 105 Leu 120 Lys Asn 135 Ala Thr 150 Asn Glu 165 Asp lie 180 Gly Val 195 Lys lie 210 Ser Glu 225 Gly Asn 240 Asn Leu 255 His Phe 270
<400〉 7
Met Asn Cys Lys Lys Val Phe Thr lie Ser Ala Leu lie Ser Ser 5 10 15
lie Tyr Phe Leu Pro Asn Val Ser Tyr Ser Asn Pro Val Tyr Gly 20 25 30
Asn Ser Met Tyr Gly Asn Phe Tyr lie Ser Gly Lys Tyr Met Pro 35 40 45Ser Val Pro Lys Thr Thr Ala lie Ser Tyr Ser Phe Ala lie Gly Ser Tyr Glu
His Phe 50
Val Val
65 Ser Gin
80 Lys Tyr
95 Tyr Ser
110 Ala Phe
125
Gly Tyr Ser Ala lie Asp
lie Gly Pro Ser Gly Val
Phe Leu Asp Asn Ser Lys
Ser Lys Asp Lys Pro Asn
Ala
55
Glu
70
Asn
85
Phe
100
Arg
115
Gin
130
<210> <211〉 <212> 〈213〉
<220〉 <223>
8
287 PRT
犬埃里希體(Ehrlichia canis)
p28-4蛋白的氨基酸序列
<400〉 8 Met Lys Tyr
Thr Ser Ala Thr lie Ser lie His Asp Ser Phe Leu Pro Glu Asn Phe
Ser Thr Ser Lys Asn Phe Gly Glu Ser Asp Val Asn Tyr Thr Tyr His
Phe lie His Val Asn Lys Tyr lie His Gly Leu Ala lie Thr Thr Lys
Lys Thr His Phe Leu Asn Tyr Ser Phe Lys Asn Leu Cys Cys Gin lie Val
Lys 5
His 20 Asn 35 Gly 50 Val 65 Asp 80 Lys 95 lie 110 Asp 125 Tyr 140 Ser 155 Lys 170 Tyr 185
Ala Gly 200
Asn Lys 215
Asn Ser 230
lie Gly
Thr Phe Phe lie Gly Thr Asn Gly Thr Cys Gly Asn Asp
Phe lie Tyr Phe Leu Ala Asn Asn Lys Ala Asp Glu lie lie lie Arg Asn
Thr Pro lie Ser Asp Lys Pro Ser Asn Leu Trp Gly Thr Gly Ser Val Glu
Val Phe Ser Ala Gin Ser Phe Arg Pro Ser Tyr Leu Thr Thr Tyr Ser Phe
Glu Asn Phe Leu lie Gly
Glu Glu Trp AIei Thr lie Gly Phe Glu Val Asn Asn
Thr
10
Tyr
25
Gly
40
Lys
55
Arg
70
Leu
85
Leu
100
lie
115
Gly
130
His
145
Thr
160
Leu
175
Glu
190
Asp
205
Gin
220
Val
235
Lys
Ala
Ser
Lys
Glu
Leu
Lys
Gly
Glu
Asn
Gly
Ala
Asp
Lys
Leu
Gly
Phe
Gly
Lys Gly Arg Ala Glu
Leu Val Pro Ala Tyr Met Glu Gin Ser His Val Gin Phe Ala Leu Glu Asn Tyr Ser His Lys Thr Val Ser Met Pro lie Ser Lys Leu Ala Gly lie Pro
Leu Arg Pro Ser Asn Asn Gly Val Leu lie Asp Phe Phe Met Gly Gly Thr
Lys
60
Asp
75
Asn
90
Val
105
Met
120
Leu
15
Ala
30
Thr
45
Phe
60
lie
75
Tyr
90
Ala
105
Ser
120
Asn
135
Cys
150
Lys
165
Met
180
Ser
195
Phe
210
Leu
225
His
240
LeuLeu Pro Asp Thr Leu Asp Phe Phe
245 250 255
Gly Ser Asn lie Lys Val Gin Gin Ser Ala Thr Val
260 265 270
Val Cys His Phe Gly Leu Glu lie Gly Ser Arg Phe
275 280 285
<210〉 <211〉 <212〉 〈213〉
<220〉 <223〉
9
281 PRT
恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis)
恰菲埃里希體P28的氨基酸序列
<400〉 9
Met lie Gly Ala Thr lie Ser lie 丁yr Glu Met I>eu Gly Thr Tyr Ser Phe Gly Phe
Asn Ser lie Ser Val Ser Phe Gly Glu Ala Ser Leu Glu Asp Gin Val Arg Lys Gly
Tyr Ser Asn His Gly Asn Lys Tyr Thr His Ser Asp Gly Leu Gly Phe Asp Gly lie
Lys Leu Gly Phe Val Ser Tyr Ser Phe Arg Ala lie lie Val Lys lie lie Asn Glu
Lys 5
Pro
20
Asn
35
Gly
50
Phe
65
Ser
80
Glu
95
Met
110
Asp
125
Tyr
140
Ser
155
Ser
170
Pro
185
Ser
200
Leu
215
Gly
230
Pro
245
Tyr
260
Eeu
275
Val Gly Phe Val Gly Pro Asn Asp Val Cys Asn Phe Phe Met Gly Gly Thr Pro Gly
Phe Val Tyr Phe Leu Asn Asn Gly Lys Ala Asn Met Ser Phe Leu His lie
lie Thr Ser Phe lie Ser Ser Ala Lys Gin Asp Val Pro Phe Pro Arg Asn Gin Leu Ser Phe Val Leu Asn Pro Tyr Glu Ala Ser Tyr Phe His lie Pro Ala lie Val Gly Arg Phe
Ser
10
Ser
25
Gly
40
Lys
55
Asn
70
Phe
85
Leu
100
lie
115
Gly
130
His
145
Phe
160
Ala
175
lie
190
Thr
205
Ser
220
Lys
235
Thr
250
lie
265
Ala
280
Ala Leu Asp Pro Lys Tyr Glu Glu Trp Asp Thr Val Gly Phe Glu Leu Asn Asn Asn Ser Leu Lys Cys Tyr Cys Ala Asn Pro lie Ser Val lie Gly Ser Leu Asp Phe
lie
Ala
Met
Arg
Gly
Ser
Ala
Glu
Tyr
Ala
Asn
Asp
Gly
Lys
Pro
Gly
Thr
Val
Ser Leu 15
Gly Ser
30 Pro Ser
45 Asn Thr
60 Ser Ala
75 Asn Tyr
90 Gly Ala
105 Val Ser
120 Lys Asn
135 Ala Asp
150 Glu Gly
165 Val Val
180 lie Gly
195 lie Ser
210 Glu Ala
225 Asn Glu
240 Leu Ala
255 Cys His
270<210〉 10
<211〉 283
<212〉 PRT
<213〉 恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis) <220>
<223〉恰菲埃里希體0MP-1B的氨基酸序列
<400> 10 Met Asn Tyr
Met Ser lie
Asn Asp Thr
Val Lys Tyr
Glu Glu Ala
Phe Gly Leu
Asn Arg Thr
Gly Phe Ser
Glu Leu Glu
Asn Asn Asp
Ser Arg Glu
Asn Glu Gly
Asp lie Thr
Gly Val Gly
Lys Phe Ser
Pro Glu Val
Gly Asn Asn
Glu Gly Ala
Gly Tyr Phe
Lys Lys lie 5
Leu Pro Tyr 20
Gly lie Asn 35
Asn Pro Ser 50
Pro lie Asn 65
Lys Lys Asp 80
Asp Pro Ala 95
Gly Ser lie
110 Ala Ala Tyr
125 Thr Asn Ser
140 Asp Ala lie
155 lie Thr Phe
170 Ala Glu Gly
185 Ala Asp Leu
200 Tyr Gin Gly
215 Ser Ala Phe
230 Phe Asn Lys
245 Pro Gin Thr
260 Gly Gly Glu
275
Phe Val Ser Gin Ser Phe Asp Ser Arg lie Ser His Gly Asn Thr Gly Asp lie Leu Glu Phe Gly Tyr Ala Gin Lys Phe Gly Asp Tyr Ala Asp Lys Met Ser Leu Val Pro Phe lie Asn Val Lys lie Gly lie Gly Gly lie Pro Val Thr Ser Als Val Gly Val
Ser Ala Leu 10
Ala Asp Pro 25
Glu Gly Phe 40
Phe Arg Lys 55
Ser lie Thr 70
Ala Gin Ser 85
Gin Asn Asn 100
Met Asp Gly 115
Asp Ala Lys 130
Tyr Lys Tyr 145
Lys Tyr Val 160
Met Val Asn 175
lie Pro Tyr 190
Phe Lys Asp 205
lie Ser Tyr 220
Tyr Tyr His 235
lie Thr Pro 250
Leu Val Thr 265
Arg Phe Thr 280
lie Ser Leu 15
Val Thr Ser 30
Tyr lie Ser 45
Phe Ser Ala 60
Lys Lys Val 75
Ala Asn Phe 90
Leu lie Ser 105
Pro Arg lie 120
Asn Pro Asp 135
Phe Gly Leu 150
Val Leu Lys 165
Thr Cys Tyr 180
Ala Cys Ala 195
Phe Asn Leu 210
Pro lie Thr 225
Gly Val lie 240
Val Val Leu 255
lie Asp Thr 270
Phe
<210〉 11
<211〉 280
<212> PRT
<213〉 恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis) <220〉<223>恰菲埃里希體OMP-1C的氨基酸序列
<400〉 11
Met Met Asp Ser Pro Ser Ser lie Tyr Asp Asn Leu Glu Asp Gin Val Arg
Asn Ser Ser Ala Thr Ala Phe Gly Glu Ala Ala Asp Gly Leu Gly Phe Asp
Ala Thr Gly Val
Cys Phe Val Ser Val Ser Lys Tyr Thr His Thr lie lie lie Lys Val lie Pro Glu
Lys Lys 5
Leu Pro
20 Ser Gly
35 His Phe
50 Ala Leu
65 Ser His
80 Tyr Glu
95 Ser Met
110 Phe Asp
125 Arg Tyr
140 Ala Ser
155 Ser Leu
170 Pro Phe
185 Ser Met
200 Leu Gly
215 Gly Gly
230 Ser Thr
245 Asp Leu
260 Leu Gly
275
Phe Gly Asn Gly Tyr Ala Asn Gly Val Cys His Met Ser Phe Leu His Leu Ala Gly
Phe lie Phe Val Gly Asp Asn Gly Lys Ala Tyr Leu Pro Glu Ser Phe Lys Thr Arg
lie Leu Tyr Phe Leu Ala Pro Pro Asn Leu Val Asn Tyr Ala Tyr His Ala Val Phe
Thr Leu lie Ser Lys Asp Phe Arg Gin Asp Leu Ala lie lie Ser Lys Phe Thr Asn
Thr
10
Ser
25
Ser
40
Ala
55
Gin
70
Phe
85
Leu
100
lie
115
Gly
130
Arg
145
Leu
160
Cys
175
Cys
190
Asn
205
lie
220
Val
235
Ala
250
Leu
265
Phe
280
Ala Leu Ala Glu Pro Val Gly Lys Tyr Lys Glu Glu Asp Trp Asn Asn Asn Lys Gly Phe Ala Glu Phe Glu Gly Asn Tyr Lys Ala Ser Lys Asn Glu Tyr Asp Val Ala Gly Val Pro Lys lie Asn Pro Glu Ala Gly Asn Thr Pro Ser Ser Val Cys
Leu Pro 15
Gin Asp
30 Met Pro
45 Lys Asn
60 Gly Val
75 Gly Tyr
90 Gly Ala
105 Val Ser
120 Lys Asn
135 Ser Thr
150 Gly Leu
165 Val Ser
180 Gly Thr
195 Ser Tyr
210 Ala Ser
225 Glu Phe
240 Ser Ala
255 His Phe
270
<210〉 12 <211〉 286 <212〉 PRT
<213〉 恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis) <220〉
<223〉恰菲埃里希體OMP-ID的氨基酸序列 <400〉 12
Met Asn Cys Glu Lys Phe Phe lie Thr Thr Ala Leu Thr
5 10 Met Ser Phe Leu Pro Gly lie Ser Leu Ser Asp Pro Val
20 25
Leu Leu 15
Gin Asp 30Asp Ser Thr Val Tyr Ala Ser Asn Glu Asn Asp Gly Lys Pro Gly Ala Val Leu
Asn lie Ala Ser Thr Val lie Ser Ser Phe lie Gly Tyr Glu Glu Ala Thr Gin Glu Gly Val lie lie Gly lie Ser Glu Ala Asn Glu Leu Ala Phe Tyr
Ser Gly 35
His Phe 50
Gly Val
65 Arg Thr
80 Lys Tyr
95 Tyr Ser
110 Ala Phe
125 His Arg
140 lie Asp
155 Leu Leu
170 Ser Glu
185 lie Asp
200 Tyr Gin
215 Ser Val
230 Phe Arg
245 Gly Lys
260 Phe Gly
275
Asn Gly Phe Thr Glu Met Asp Tyr Gly Asp Gly Leu Gly Phe Asp Gly lie
Phe Val Gly Leu Asn Asp Val Tyr Ala Lys lie Val Lys lie lie Asn Glu
Tyr Phe lie Ser Asn Gly Lys Ala Gly Ser Pro Ser Leu Gly Pro Tyr Leu
lie
Ser
Glu
Asp
Leu
Pro
Asn
Ser
Phe
Phe
Met
Gly
Gly
Thr
Pro
Gly
Ser
40
Ala
55
Gin
70
lie
85
Phe
100
Arg
115
Gin
130
Ser
145
Ala
160
Met
175
Ser
190
Phe
205
Leu
220
His
235
Met
250
Ala
265
Gly
280
Gly Lys Lys Glu Asp Trp Phe 丁hr Ser Gly lie Glu Gly Asn His Leu Ser Val Leu Asn Pro Tyr Glu Alai Ser Tyr Phe His lie Pro lie Val Arg Phe
Tyr Met Glu Arg Asp Arg Val Pro Phe Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Gly Phe Leu Ala Cys lie Cys lie Asn Pro lie Lys Val Ser Glu Thr Leu Asn Phe
Pro
45
Asn
60
Cys
75
Asn
90
Gly
105
Val
120
Lys
135
Thr
150
lie
165
Tyr
180
Ala
195
Pro
210
Ser
225
lie
240
Ser
255
Asp
270
Gin
285
<210> <211〉 〈212〉 〈213〉
<220〉 <223〉
13
278
PRT
恰菲埃里希體(Ehrlichia chaff eensis)
恰菲埃里希體OMP-IE的氨基酸序列
〈400〉 13 Met Asn Cys
Met Ser Phe
Asp Asn lie
Ser Ala Ser
Pro Thr Val
Lys Lys Phe Phe lie Thr Thr
5 10
Leu Pro Gly lie Ser Phe Ser
20 25
Ser Gly Asn Phe Tyr Val Ser
35 40
His Phe Gly Met Phe Ser Ala
50 55
Ala Leu Tyr Gly Leu Lys Gin
65 70
Ala Leu Val Ser Leu 15
Asp Pro Val Gin Gly 30
Gly Lys Tyr Met Pro 45
Lys Glu Glu Lys Asn 60
Asp Trp Glu Gly lie 75Ser Ser lie Tyr Asp lie Leu Glu Asp Gin Val Arg Pro Glu
Ser Phe Gly Glu Ala Pro Asp Ser Leu Gly Phe Asp Asp Leu
Ser Lys Tyr Thr His Lys lie lie lie I>ys lie lie Leu Gly
Ser Tyr Ser Phe Arg Thr Ser Pro Ser Leu Gly Pro Ala Gly
His
80
Glu
95
Met
110
Asp
125
Tyr
140
Ser
155
Phe
170
Leu
185
Met
200
Gly
215
Gly
230
Thr
245
lie
260
Arg
275
Asn
Asn
Gly
Val
Cys
Lys
Met
Ser
Phe
Leu
His
Leu
Val
Phe
Asp Asn Gly Lys Ala Tyr Leu Pro Glu Ser Phe Lys Thr Asn
Asn Pro Pro Asn Leu Val Asn Tyr Ala Tyr His Ala Leu Phe
His
Phe
Arg
Gin
Gly
Leu
Ala
lie
Thr
Ser
Lys
Phe
Ser
Phe
85
Leu
訓(xùn)
Val
115
Gly
130
Gin
145
Leu
160
Cys
175
Cys
190
Asn
205
lie
220
Val
235
Val
250
Val
265
Asn Asn Gly Phe Glu Phe Asn Asn Gin Asp Lys Ser Tyr Asp Ala Gly Pro Lys Asn Pro lie Gly Thr Ser Cys His
Lys Gly Tyr 90
Ala Gly Ala 105
Glu Val Ser 120
Tyr I>ys Asn 135
Asn Ser Gly 150
Glu Gly Leu 165
lie lie Asn 180
Val Gly Thr 195
lie Ser Tyr 210
Glu Ala Ser 225
Asn Glu Phe 240
Ser Ala Thr 255
Phe Gly lie 270
<210> <211〉 <212〉 <213〉
<220〉 <223〉
14
280
PRT
恰菲埃里希體(Ehrlichia chaffeensis) 恰菲埃里希體0MP-1F的氨基酸序列
<400〉 14
Met Asn Cys Lys
Met Ser Phe Leu
Asp Ser Thr Thr Tyr Ala Ser
Asn Val Thr lie Ser Val Tyr
Val Ser Thr Ser Phe Gly Glu
Gly His Gly Lys Lys Tyr Thr
Lys 5
Pro
20
Gly
35
Phe
50
Val
65
Asn
80
Tyr
95
Leu
110
Phe
Phe Gly Asn Gly Phe Ser Glu Met Asp
Phe lie Phe Val Gly Pro Asn Asn Val
lie Ser Tyr Phe Leu Glu Asn Gly Lys
Thr Phe lie Ser Lys Asn Pro Pro Asn
Thr
10
Ser
25
Ser
40
Ala
55
Gin
70
Thr
85
Phe
100
Arg
115
Gin
Thr
Asp
Gly
Lys
Asp
Phe
Leu
lie
Gly
Leu Val Ala Val Lys Tyr Gin Glu Trp Asp Asn Val Gly Phe Glu Leu Asn Asn
Ser Leu 15
Gin Asn
30 Vai Pro
45 Arg Asn
60 Gly Ser
75 Pro Asn
90 Ala Gly
105 Glu Met
120 Tyr LysAsn Lys Gly lie Gly Ser Ala Glu Thr Gly
Asp Leu Leu Ser Thr Tyr Ser Phe Gly Val
Ala Ser Leu Glu Asp Gin Val Arg Asn Glu
His Asn Asp Gly Leu Gly Phe Asp His Leu
125 Lys 140 Ala 155 lie 170 lie 185 lie 200 Lys 215 Val 230 lie 245 Phe 260 Gly 275
Tyi
Gly
Ser
Pro
Ser
Leu
Gly
Pro
Thr
Gly
Tyr Asp Leu Phe Met Gly Gly Ala lie Arg
Ala tys Met Ser Phe Leu His Met Val Phe
Leu Phe Leu Pro Glu Ser Phe lie Thr Asn
130 Thr 145 Val 160 Asn 175 Tyr 190 Ala 205 Tyr 220 His 235 Pro 250 Leu 265 Phe 280
His Asn Ser Gly
Phe Leu Lys Asn
Ala Cys Tyr Asp
lie Cys Ala Gly
lie Asn Pro Lys
Ser lie Ser Pro
Lys Val lie Gly
Ser Thr Ser Thr
Ser Val Cys His
135 Gly 150 Glu 165 Val 180 Val 195 lie 210 Glu 225 Asn 240 Leu 255 Phe 270
<210> <211〉 <212〉 <213>
<220〉 <223〉
15
284
PRT
反芻類考德里氏體(Cowdria ruminantium)
反芻類考德里氏體MAP-1的氨基酸序列
<400〉 15 Asn Cys
Met Val Glu Pro Arg Val Asp Gly Val Lys Ser Leu
Ser Phe Asn Asn Thr Ala Asp Thr Lys Thr Tyr Ser Ala Val Ser Tyr Asn Asp Thr Ala Thr Asp
Lys Leu Pro Ser Lys Pro Phe Gly Glu Ala Gly lie
Lys 5
Pro
20
Val
35
His
50
Ala
65
Ser
80
Lys
95
Tyr
110
Thr
125
His
140
Ala
155
Ser
170
lie Gly Gly Phe Val Gly Tyr Ser Phe Met Thr Leu
Phe Val Ser Gly Phe Asn Glu Met Asp Tyr Thr Met
lie Ser Val L_ys Gly Thr Asn Asn Val Cys Ser Leu
Thr Phe Tyr Met I>eu Asn Asn Gly Arg Ala Val Asn
Ser
10
Ser
25
lie
40
Ser
55
Lys
70
Ser
85
Pro
100
Pro
115
Asn
130
Leu
145
Met
160
Ala
175
Thr Asp Ser lie Lys lie Phe Arg Pro Asp Val Cys
Leu Val Ala Lys Asp Phe Leu lie Gly Thr Lys Tyr
lie Ser
lie Gin
Lys Tyr
Glu Asp
Trp Asp
Thr Glu
Gly Phe
Glu Phe
Gly Asn
Ala Ser
Asn Glu
Asp lie
Leu
15
Glu
30
Met
45
Ser
60
Gly
75
Lys
90
Ala
105
Glu
120
Tyr
135
Ser
150
Asn
165
Met
180
40Leu Asp Gly Thr Asp Leu Tyr Gin Gly Ser lie Phe Phe Lys Asp Ala Ser Ser Val Cys His
Met Pro
185 Val Ser
200 tys Leu
215 lie Gly
230 lie Ala
245 Ala Val
260 Phe Gly
275
Val Val Gly Gly Thr Ser lie
Ser Pro lie Asn lie Ser His Phe Ser Lys Pro Gly Glu lie
Tyr Ala Tyr His Val Phe Gly
Val 190 Thr 205 Ser 220 Arg 235 Phe 250 Ala 265 Gly 280
Cys Asn lie Val Thr Ser Arg
Ala Gly lie Pro Lys Leu Asn Pro Glu lie Gly Asn Ser Ser Gly Ala lie Leu Phe Val Phe
Gly 195 Ser 210 Ala 225 Glu 240 Asn 255 Asp 270
<210> 16
<211> 20
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 primer—bind
<222〉反芻類^1惠里氏體MAP-1的核苷酸313-332，也是恰菲埃里希體P28的核苷酸307-326
<223〉 PCR正向引物793
<400〉 16
gcaggagctg ttggttactc
20
<210〉 17
<211〉 21
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221> primer—bind
<222〉 反芻類^"德里氏體MAP-1的核苷酸823-843,也是恰菲埃里希體P28的核苷酸814-834
<223〉 PCR反向引物1330
<400〉 17
ccttcctcca agttctatgc c 21
〈210〉 <211> <212〉 <213>
<220> <221〉 <223〉
18 24 脆
人工序列
primer_bind
引物46f,對p28-5基因特異性
<400〉 18
atatacttcc tacctaatgt ctca
<210> 19 <211〉 20
24<212> DNA <213>人工序列
〈220〉
<221〉 primer—bind
<223>用于犬g里希體28-kDa蛋白基因測序的引物
<400〉 19
agtgcagagt cttcggtttc 20
<210> 20
<211〉 18
<212> DMA
<213〉 人工序列
<220>
<221> primer—bind
<223>用于犬&里希體28-kDa蛋白質(zhì)基因測序的引物
<400〉 20
gttacttgcg gaggacat 18
<210> 21
<211> 24
<212〉 DNA
〈213〉 人工序列
<220〉
<221> primer—bind
<222〉犬埃里^體p28-7的核苷酸687-710
<223〉 PCR引物394
<400> 21
gcatttccac aggatcatag gtaa 24
<210〉 22
〈211〉 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 primer—bind
<222〉 犬埃里^體p28-7的核苷酸710-687
<223> PCR引物394C
<400〉 22
ttacctatga tcctgtggaa atgc 24
<210> 23
<211> 20
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221〉 primer—bind<223>與犬埃里希體p28-7的一個區(qū)域退火的引物793C,用于擴增基因p28_6和p28_7基因間區(qū)
<400〉 23
gagtaaccaa cagctcctgc 20
<210> 24
<211〉 24
<212〉 薩 <213〉人工序列
<220〉
<221〉 primer—bind <222>
〈223〉與鄰近P28-7開放閱讀框的非編碼區(qū)互補的引物EC280M-F
<400> 24
tctactttgc acttccacta ttgt 24
<210〉 25
<211〉 24
<212> 腿
<213〉 人工序列
<220>
<221〉 primer—bind 〈222〉
<223> 與鄰近P28-7的開放閱讀框互補的引物EC280M-R
<400〉 25
attcttttgc cactattttt cttt 24
<210〉 26
<211〉 25
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<221> primer—bind
〈223〉 對應(yīng)于p28-6內(nèi)區(qū)域的引物ECaSA3-2，用于擴增基因p28-6和P28_7之間的基因間區(qū)NC3
<400> 26
ctaggattag gttatagtat aagtt 25
〈210〉 27
<211> 23
<212〉 PRT
<213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis) <220〉
<221〉 PEPTIDE
<223〉 p28-7和p28-6的預(yù)測的N-末端信號肽
<400〉 27
Met Asn Cys Lys Lys lie Leu lie Thr Thr Ala Leu Met Ser Leu 5 10 15<formula>formula see original document page 44</formula><400〉 31 taatttcgtg ctgtatacaa tacaagttta
atgctttgtt actcactagt atacttccac
gtacacatat
ccaagcttat aatgtacact tattaatact aatttatact tattgttaat
cacg犯gcta
tctcac犯aa tagcttcact ctacataata agaatatata ttattttcac
aaattgtttt attacctaac cttcttgtgt actgtagagt tgttaaattt ttctgacttg tattttaggt
tttatctctg 50 aatatgaicag 100 cttttatctc 150 gtgtttatca 200 ttcttacaaa 250 tatttgcttt 300 gtaat 345
<210> 〈211〉 〈212〉 〈213〉
〈220〉 〈223〉
32
345
DNA犬埃里希體(Ehrlichia canis) 基因間非編碼區(qū)3 (28NC3)的核酸序列
<400> 32
tgattttatt
ttgctacata
gagggggggg
tatattcaaa
ttttatttat
atctctaatg
gcacttccac
gttgccacat
ggggactaaa tagcacaact taiccaeitcct ttttatactt tattgttaat
tttaccttct caatgcttcc
犯t aetata ttattttcac
attcttctaa agg肌aatat attaaatttc ttctggcttg tattttaggt
gtttttatta 50 gtagcaataa 100 tattctttac 150 gtttctaata 200 tcttacaaaa 250 tatttacttt 300 gtaat 345
〈210〉 33
<211〉 355
〈212〉 醒
<213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis) <220〉
<223〉基因間非編碼區(qū)4(28NC4)的核酸序列
<400〉 33
taattttatt
ttgctacata
aggggggggg
gctatttatg
gttgccacat
gggacc肌at
tttatttatt cactagtatt ct1xtactat
attaaaaMg aaa3t8gtgg ttatcttxta cagaaggtaa accaatctta
ttttaattta
atctaaactt
tgcttcccaa tatcctcacg
atatatattc tttg"tcacta
gtttttawta 50 tagcaataag 100 gtUtttcyc 150 gaaaacttat 200 taaatttctc 250 tgacttgctt 300 ttaggtt3ta 350 355
<210〉 <211〉 <212〉 <213〉
34 24 DNA
人工序列
<220> <223>
引物p28-5-818f
<400〉 34
ttaaaca/tat gccacttcgg acta
24
<210〉 35<211〉 28
<212〉 醒
<213〉 人工序列
<220>
<223> 引物1191
<400〉 35
tatgatcgtg taaaattgct gtgagtat 28
<210〉 36
<211〉 20
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220〉
<223> 引物ECa28-75C
<400〉 36
tactggcacg tgctggacta 20
<210〉 37
<211> 22
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<223> 引物ECa5'-1600
<400> 37
caccaataaa tgcagagact tc 22
<210〉 38
<211〉 26
<212> DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<223〉 引物3125
<400〉 38
aatccatcat ttctcattac agtgtg 26
<210〉 39 <211〉 879 <212〉 DNA
<213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis) <220〉
<223〉犬埃里希體p28-l的核酸序列 <400〉 39
atgaataata aactcaaatt tactataata aacacagtat tagtatgctt 50attgtcatta
gttttcagta tatagcttta gtgtaggtat tttcaagata tgaaggtaca aaaaccctgg gcscgtga犯 tagtattttt
ccttacatat attacacatt taccatctaa ggcaatcaat tatacctaaa gaggtgaaat
cctaatatat cggattatat atttttcagt
tagt肌ccca attctgtcaa agagttgaaa
cacactgt犯 tgtttgctac gtggaggagc aagtttgcat cattagtctc
attacatccg tggtgc卿a
cttcctcaaa atcagtggac taaagaaacc ttgactctat tcaaatttta tttcaatgga tag肌ggttc ctaagtgatg tagttttaca tgagaaatga gatttctctt aggggt卿t atc犯agcaa tttgctagtt aaatgtccaa cagttgctac ttgacattt
ggccataaac
aatgtcataa tgaaaccaag ctatccccta actattggtt ttatgaggaa cctatcgcta ccteiaagaaa tggattatct tgaacaattt gctatagaat gctaggtatt tatsttacca catgttgctg acttaatatt
aMaacgcta 100 cagtgtttct 150 ctaaaaacct 200 actgatgcca 250 tacagctgta 300 acacctttgc 350 tttgatgtta ■ ttttgcatta 450 aagtttctaa 500 ataatatctg 550 gtcaatatcg 600 tcttcgatgt 650 gcttattctc 700 taaagtaatg 750 aacttgcaag 800 ggUattttg 850 879
<210〉 40
<211〉 293
<212〉 PRT
<213> 犬埃里希體(Ehrlichia canis) <220〉
<223〉犬埃里希體p28-l蛋白的氨基酸序列
<400〉 40 Met Asn Asn
Cys Asn Lys Asn Ser Ser Val Arg Pro Ala Ser lie Asn Ala
Leu Asn Pro Val lie Asn Asn Val Gly Arg Asn lie Leu lie
Leu Ala Ser lie Glu Phe Phe Glu Gly Glu Ser Ser Ser Glu
Lys
Ser
Lys
Val
Thr
Thr
Thr
Asn
lie
Tyr
Met
lie
Val
lie
Phe
Leu
5 Leu
20 Lys
35 Ser
50 乙ys
65 Lys
80 lie
95 Gly 110 Glu 125 Thr 140 Lys 155 Phe 170 lie 185 Ser 200 Phe
二ys Pro Tyr Val Asn Thr Pro Thr Gly Leu Gly His Val Pro Asp
Phe 八sn 丁yr Phe Leu Asp Tyr lie Ser Ser Asn Thr Asn Tyr Val
Thr lie Gly Ser lie Ala Thr Gly Tyr Asp Ser Val Val lie Leu
lie Ser Leu Asn Ala Ser Ala Tyr Glu Ala Phe Met Cys Cys His
lie
10 Ser
25 丁yr
40 Phe
55 Leu
70 Val
85 Val 100 Thr 115 Glu 130 Tyr 145 Thr 160 Arg 175 Tyr 190 Gly 205 lie
Asn
Ser
lie
Ser
Gly
Phe
Phe
Phe
Arg
Pro
Asn
Asp
Gly
Thr Val Lys Ala Ser Gly Val Lys Lys Asp lie Ser Gin Asp Ala Glu Asp Vsl Tyr Phe Lys Glu Asp Gly Phe Ser Ala Gly Phe Ala
Leu
lie
Gin
Glu
Val
Asn
Asn
Gly
Ala
Lys
Leu
Leu
Val
Tyi
Val
15 Asn
30 Tyr
45 Thr
60 Asp
75 Pro
90 Ser 105 Thr 120 Asn 135 Leu 150 Val 165 Ser 180 Asn 195 Asp 210 Gin215 220
Ser Lys Leu Gly lie Ala Tyr Ser Leu Pro Ser
230 235
Phe Ala Ser Leu Tyr Tyr His Lys Val Met Gly
245 250
Asn Leu Asn Val Gin His Val Ala Glu Leu Ala
260 265 lie Thr Ser Ala VaAla Thr Leu Asn lie Gly
275 280
Glu lie Gly Ala Arg Leu Thr Phe
290 293
225
Asn lie Ser Leu 240
Asn Gin Phe Lys 255
Ser lie Pro Lys 270
Tyr Phe Gly Gly 285
<210> 41
<211〉 840
<212〉 DNA
<213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis)
<220〉
<223〉犬埃里希體p28-2的核酸序列
<400〉 41
3tgaMtataagaaaattctgcgttaatctcattaatgtc50
aatcttaccatatcagtcttttgcagatcctgtaggttcaagaactaatg100
aggcttctacattagtgcaaagtacaatcc150
cactttagaaaattctctgctgaagaaactcctattaatggaacaa^ttc200
tctcact犯aaaagttttcggactaangaa柳tggtgat250
a^g3cg3ttttacaagagtagctccaggcattgattttca300
atatcaggattttcaggaagtattggttactctatggacggaccaagaa/t350
agaacttgaagctgcatatcaacaatttaaax:cg3taaca400
atgatactgataatggtgaaattttgcattatCtCgt￡L￡L￡L450
gatgcaatggaagatcagcaatatgtagtacttaaaaatgacggcataac500
ttttatgtcattgatggttaatacttgctatgacattacagctgaaggag550
tatctttcgtaccatatgcatgtgcaggtatcttatcact600
atttttaaagacctcaatcta肌atttgctt3cc犯ggaaaaataggtat650
tagttaccctatcacaccagaagtctctgcatttattggtggatactacc700
atggcgttattttg3gaag3tacctgt犯taactcctgta750
gtattaaatgatgctcctcaaaccacatctgcttcagtaactcttgacgt800
tggatactttggcggagaaattggaatgaggttcaccttc840
〈210〉 42
<211〉 280
<212〉 PRT
〈213〉 犬埃里希體(Ehrlichia canis)
<220〉
<223〉犬埃里希體p28-2蛋白的氨基酸序列
<400〉 42
Met Asn Tyr Lys Lys lie Leu Val Arg Ser Ala 5 10
Met Ser lie Leu Pro Tyr Gin Ser Phe Ala Asp 20 25
Arg Thr Asn Asp Asn Lys Glu Gly Phe Tyr lie 35 40
Asn Pro Ser lie Ser His Phe Arg Lys Phe Ser
Leu lie Ser Leu 15
Pro Val Gly Ser 30
Ser Ala Lys Tyr 45
Ala Glu Glu Thr50Pro lie Asn Gly Thr Asn Ser 65Lys Lys Asp Gly Asp lie Thr 80Ala Pro Gly lie Asp Phe Gin 95Gly Ser lie Gly Tyr Ser Met 110Ala Ala Tyr Gin Gin Phe Asn 125Thr Asp Asn Gly Glu Tyr Tyr 140Asp Ala Met Glu Asp Gin Gin 155lie Thr Phe Met Ser Leu Met 170Ala Glu Gly Val Ser Phe Val 185Ala Asp Leu lie Thr lie Phe 200Tyr Gin Gly Lys lie Gly lie 215Ser Ala Phe lie Gly Gly Tyr 230Phe Glu Lys lie Pro Val lie 245Pro Gin Thr Thr Ser Ala Ser 260Gly Gly Glu lie Gly Met Arg 275<210〉 43 <211> 828 <212〉 DNA<213> 犬埃里希體(EhrlichiaLeu Lys Asn Asp Pro Lys Tyr Val Pro Lys Ser Tyr Thr Val PheThr Lys Asn Gly Lys His Val Asn Tyr Asp Tyr His Pro Thr Thrcanis)55 Lys70 Asp85 Leu 100 Pro 115 Asn 130 Phe 145 Val 160 Thr 175 Ala 190 Leu 205 Pro 220 Gly 235 Val 250 Leu 265 Phe 280Lys Asp lie Arg Thr Ala Leu Cys Cys Asn lie Val Val Asp<220〉<223〉犬埃里希體p28-3的核酸序列<400〉 43atgaactgtatcttttacctcaggaaacttgggaacttttcttttaatat ggatttgcag tgaagtatca acaatgatgc atgaaaagtg atcactc3tg tttcacctta ga^gct3t3a tccaataagcVal 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<223>44276PRT犬埃里希體(Ehrlichia canis)犬埃里希體p28-3蛋白的氨基酸序列<400> MetThr Asn Ser Thr lie Ser lie Tyr Asp Met Asp Arg Leu Gly Ser Val Phe GlyAsn lie Asn lie Thr lie Phe Gly Glu Ala Lys lie Met lie Lys Met Pro Ala Tyr44 Cys LysLeu LeuThr ThrSer HisThr GlyLeu AspLys TyrTyr SerThr PheHis LysSer GlySer LeuPro PhePhe MetLeu GlyGly ValVal Leulie ValArg ValLys 5Pro20 Gly35 Phe50 lie65 Lys80 Glu95 lie 110 Asp 125 Tyr 140 Lys 155 Met 170 Ser 185 Phe 200 Phe 215 His 230 Leu 245 Lys 260 Ser 275lie Gly Asn Gly Phe Glu Asn Gly Val Cys Phe Leu Pro Asp Asn Phe Thr Leu PheLeu lie Phe Asn Gly His Asn Ser Gin Ala Val Asn Tyr Ala Tyr His Ala Serlie Ser Tyr Phe Leu Ala Pro Pro Asn Leu Phe Val lie lie Pro Lys Gly lieThr Phe lie Ser Lys Ala Phe Arg Pro Ser Leu Cys Cys Asn lie Val Gly CysThr10 Ser25 lie40 Ala55 Glu70 Phe85 Leu 100 lie 115 Gly 130 Asn 145 Lys 160 Tyr 175 Ala 190 His 205 Ser 220 Thr 235 Leu 250 His 265Thr Lys Gly Lys Ser Asn Gly Glu Asp Asp Asn Asp Gly Lys Pro Asn Ala PheLeu Val Pro lie Lys Tyr Glu 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權(quán)利要求
1.一種編碼犬埃里希體30kDa蛋白質(zhì)的分離的DNA序列，其特征在于，所述蛋白質(zhì)與抗犬埃里希體血清具有免疫反應(yīng)性。
2. 如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID No. 2, 4, 6, 40， 42, 44和46的氨基酸序列。
3. 如權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于，所述蛋白質(zhì)具有N-末端信號 序列。
4. 如權(quán)利要求3所述的DNA序列，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是經(jīng)翻譯后修飾 成28kDa蛋白質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA含有選自SEQIDNo. 1,3,5， 39,41,43和45的序列。
6. 如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA包含在犬埃里希體的一個基因座中。
7. 如權(quán)利要求6所述的DNA序列，其特征在于，所述基因座是長10，677bp的 一個多基因基因座。
8. 如權(quán)利要求7所述的DNA序列，其特征在于，所述基因座含有編碼犬埃里 希體同源性28kDa蛋白質(zhì)的基因。
9. 如權(quán)利要求8所述的DNA序列，其特征在于，所述犬埃里希體的同源性 28kDa蛋白選自p28陽l， p28陽2， p28-3， p28陽4， p28-5， p28-6， p28-7， p28-8和p28-9。
10. —種含有權(quán)利要求1所述的DNA序列的載體。
11. 如權(quán)利要求10所述的載體，其特征在于，所述載體是一種表達載體，當所 述載體被引入細胞時，能夠表達選自SEQIDNo. 1,3,5, 39， 41,43和45的序列編 碼的肽或多肽。
12. —種重組蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID No. 2, 4， 6, 40, 42， 44和46的氨基酸序列。
13. 如權(quán)利要求12所述的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列由含有 選自SEQIDNo. 1,3, 5, 39, 41, 43和45的序列的核酸區(qū)段所編碼。
14. 一種宿主細胞，其特征在于，該細胞含有選自SEQIDNo. 1,3,5，39,41，43和45的核酸區(qū)段。
15. —種產(chǎn)生權(quán)利要求12所述的重組蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括步驟獲得含有表達區(qū)的載體，所述表達區(qū)含有與啟動子可操縱性連接的、編碼選 自SEQ ID No. 2， 4, 6， 40, 42， 44和46的氨基酸序列的序列; 將所述載體轉(zhuǎn)染入細胞；和 在有效表達所述表達區(qū)的條件下培養(yǎng)所述細胞。
16. —種抗體，其特征在于，該抗體與含有選自SEQ ID No. 2, 4， 6, 40， 42, 44 和46的氨基酸序列的多肽具有免疫反應(yīng)性。
17. —種抑制個體內(nèi)犬埃里希體感染的方法，其特征在于，該方法包括步驟 在接觸前或懷疑已接觸，或已感染犬埃里希體時鑒定個體；和 以抑制犬埃里希體感染的有效量施用含有犬埃里希體28kDa抗原的組合物。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述28kDa抗原是重組蛋白質(zhì)， 它含有選自SEQ ID No. 2, 4， 6, 40, 42, 44和46的氨基酸序列。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述重組蛋白質(zhì)由含有選自 SEQ ID No. 1,3,5,39,41,43和45的序列的基因編碼。
20. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述含有28kDa抗原的組合物分 散于藥物學(xué)上可接受的載體中。
全文摘要
本發(fā)明針對犬埃里希體的一個多形性多基因家族的同源免疫反應(yīng)性28kDa蛋白質(zhì)基因，p28-1、-2、-3、-5、-6、-7、-9的克隆、測序和表達。還公開了編碼犬埃里希體所有9個同源28kDa蛋白質(zhì)基因的多基因基因座。重組犬埃里希體28kDa蛋白質(zhì)與犬埃里希體感染的犬的恢復(fù)期抗血清反應(yīng)，可用于開發(fā)對于疾病預(yù)防和血清診斷特別有效的疫苗和血清診斷法。
文檔編號A61K38/00GK101307312SQ200810092719
公開日2008年11月19日 申請日期2001年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月12日
發(fā)明者D·H·沃克, J·W·麥克布里奇, 于學(xué)杰 申請人:研究發(fā)展基金會