專利名稱：：一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬納米粒的應(yīng)用，主要涉及一種負(fù)載了抗病毒藥物的脂質(zhì)納米粒及其在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：病毒性疾病作為傳染性疾病已經(jīng)成為人類健康的主要威脅之一。慢性乙型肝炎是危害嚴(yán)重的病毒性傳染病，是引起肝纖維化、肝硬化和肝癌的最主要原因。全球每年有超過50萬人死于原發(fā)性肝癌，而其中多達(dá)80°/。的原發(fā)性肝癌是由慢性乙肝引起的。由于現(xiàn)有的抗病毒藥物不能完全抑制、清除病毒，存在著給藥劑量大、療效低、毒副作用和易產(chǎn)生耐藥的問題，因此，對于病毒性疾病的治療，尤其是病毒慢性感染的治療仍然是醫(yī)學(xué)上的難題。現(xiàn)有的抗病毒化療藥物，具有一般化療藥物的體內(nèi)非特異性分布特點(diǎn)，同時(shí)受到體內(nèi)生物膜吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)屏障，酶代謝的影響，藥物無法大量進(jìn)入其分子靶標(biāo)，從而導(dǎo)致療效低、劑量大、毒副作用以及耐藥性的產(chǎn)生。通過靶向制劑技術(shù)，改變以藥物自身性質(zhì)為主導(dǎo)的藥物體內(nèi)分布模式，將外源性的藥物輸送到藥物作用的分子靶標(biāo)，可最大限度地提高藥物作用的療效，降低藥物在正常臟器的分布和毒副作用?？笻BV化療藥物的分子作用位點(diǎn)，除HBV吸附抑制劑外，均作用于宿主細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器，因此理想的抗HBV靶向制劑應(yīng)具有高效的肝臟、肝細(xì)胞和肝細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器靶向功能。國內(nèi)外的科學(xué)家，通過對藥物載體大小、表面理化性質(zhì)的調(diào)控、以及在此基礎(chǔ)上的配體或抗體修飾技術(shù)，目前己經(jīng)實(shí)現(xiàn)了藥物向肝臟細(xì)胞的靶向輸送，亞細(xì)胞器靶向載體技術(shù)己成為當(dāng)前實(shí)現(xiàn)藥物分子靶向治療的核心環(huán)節(jié)。固體脂質(zhì)給藥系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新型膠體給藥系統(tǒng)，它是繼乳劑、脂質(zhì)體、聚合物納米粒之后，極具發(fā)展?jié)摿Φ陌邢蚩蒯尳o藥系統(tǒng)。固體脂質(zhì)給藥系統(tǒng)采用天然或合成的類脂材料，如硬脂酸、卵磷脂、單甘酯等為載體，將藥物包裹于類脂核中制成固體膠粒給藥系統(tǒng)。它既具備聚合物給藥系統(tǒng)控釋、避免藥物泄漏等優(yōu)點(diǎn)，又兼具了乳劑、脂質(zhì)體的毒性低、生物相容性好、生物利用度高的優(yōu)點(diǎn)。但是，固體脂質(zhì)給藥系統(tǒng)也存在一些潛在的局限性，如有限的載藥能力、儲(chǔ)存過程的藥物排擠現(xiàn)象等問題。在固體脂質(zhì)中混和形態(tài)相異的液體脂質(zhì)作為混合類脂基質(zhì)，以此制備得到新型納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructuredlipidcarrier,NLC)。液體脂質(zhì)的加入，可擾亂固體脂質(zhì)規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)，增加納米粒結(jié)構(gòu)中不規(guī)則晶型的比例，使承載脂溶性藥物的空間容量增加，從而提高載體的載藥能力。通過控制液體脂質(zhì)比例，還可使NLC在體溫下保持固體骨架結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)NLC藥物的控制釋放。研究發(fā)現(xiàn)固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體均具有快速的細(xì)胞攝取和細(xì)胞漿滯留特性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，所述脂質(zhì)納米粒由抗病毒藥物和脂質(zhì)材料組成，該脂質(zhì)納米粒負(fù)載了分子靶標(biāo)位于細(xì)胞內(nèi)的抗病毒藥物，所述抗病毒藥物包括阿德福韋酯等藥物，阿德福韋酯的含量為脂質(zhì)納米粒的1°/。-4%。其中的脂質(zhì)材料可由單硬脂酸甘油酯、棕櫚酸甘油酯、硬脂酸、或單硬脂酸甘油酯和油酸等一種或兩種脂質(zhì)組成，其重量占納米粒的96-99%;其中由兩種脂質(zhì)材料組成時(shí)，油酸占脂質(zhì)材料的比例為5-20%;本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該脂質(zhì)納米粒在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。該脂質(zhì)納米粒與病毒感染細(xì)胞共孵育后，與藥物的溶液對照相比，可顯著抑制病毒的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和DNA(HBVDNA)含量，體現(xiàn)出良好的抗病毒療效。本發(fā)明的有益之處是通過具有高效細(xì)胞攝取和細(xì)胞漿滯留功能的脂質(zhì)納米粒，對分子靶標(biāo)位于細(xì)胞內(nèi)的抗病毒藥物的包封，可大大增加病毒細(xì)胞對藥物的攝取，以及藥物分子靶標(biāo)部位的藥物濃度。增加病毒細(xì)胞對藥物的攝取，有利于減小藥物在正常組織或細(xì)胞的分布，降低藥物的毒副作用；而藥物分子耙標(biāo)部位的藥物濃度的增加，有利于提高抗病毒藥物的療效。本發(fā)明利用固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體均具有快速的細(xì)胞攝取和細(xì)胞漿滯留功能，負(fù)載阿德福韋酯等抗病毒藥物，以提高藥物分子靶標(biāo)部位的藥物濃度，從而達(dá)到提高該類藥物的抗乙肝病毒療效的目的。圖1為不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液與1^。62.2.15細(xì)胞共孵育后，對HBsAg的抑制率變化。圖2為不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液與HepG2.2.15細(xì)胞共孵育后，對HBeAg的抑制率變化。圖3為不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液與HepG2.2.15細(xì)胞共孵育后，對HBV-DNA表達(dá)的抑制率變化。具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1:負(fù)載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的制備與應(yīng)用1)負(fù)載阿德福韋酯單甘脂脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸甘油酯50mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴5(TC溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400rmin—1機(jī)械攪拌條件下，將有機(jī)相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負(fù)載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mol丄"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000r'min"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用lmol'L"NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表l為所制備得到的負(fù)載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表l:負(fù)載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2)負(fù)載阿德福韋酯單甘脂脂質(zhì)納米粒的體外抗乙肝病毒療效取1^口02.2.15細(xì)胞，在含有約10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(5%C02，37'C孵箱)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)對數(shù)生長期時(shí)，即可進(jìn)行接種。取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS潤洗后，加入胰酶消化并用培養(yǎng)液稀釋，按每孔口104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)。24孔培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞貼壁生長后，棄去舊培養(yǎng)液，使用PH7.4的緩沖溶液(PBS)潤洗2遍后分別加入含不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2-5天后，收集培養(yǎng)液，酶免疫測定試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)液中的表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)含量,即時(shí)PCR定量法測定乙肝病毒DNA(HBVDNA)含量。不同藥物濃度的阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒和阿德福韋酯溶液與HepG2.2.15細(xì)胞共孵育后，對HBsAg，HBeAg和HBV-DNA表達(dá)的抑制率變化結(jié)果見圖1-3。結(jié)果顯示阿德福韋酯經(jīng)脂質(zhì)納米粒包封后，與阿德福韋酯溶液相比，對HBsAg,HBeAg和HBV-DNA表達(dá)的抑制率顯著增加，揭示阿德福韋酯經(jīng)脂質(zhì)納米粒的顯著抗病毒效果。實(shí)施例2:負(fù)載阿德福韋酯單甘脂脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸甘油酯50mg和5mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴50'C溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400r'min—1機(jī)械攪拌條件下，將有機(jī)相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負(fù)載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mol七"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000rmin"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用lmol'L'1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表2為所制備得到的負(fù)載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表2:負(fù)載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。體均粒徑表面電位藥物包封率載藥量(腦)(畫mV)(%)(%)381.338.610.21.0實(shí)施例3:負(fù)載阿德福韋酯硬脂酸脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸50mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴5(TC溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400rmin"機(jī)械攪拌條件下，將有機(jī)相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負(fù)載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mol丄"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000r'min"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用lmol'L—1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表3為所制備得到的負(fù)載阿德福韋酯硬脂酸脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表3:負(fù)載阿德福韋酯硬脂酸脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例4:負(fù)載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯油酸脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸甘油酯47.5mg，油酸2.5mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴5(TC溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400。min"機(jī)械攪拌條件下，將有機(jī)相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負(fù)載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mo卜L"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000rmin"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用1mol'L/1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表4為所制備得到的負(fù)載阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表4:負(fù)載阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例5:負(fù)載阿德福韋酯單硬脂酸甘油酯油酸脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取單硬脂酸甘油酯40mg，油酸10mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴5(TC溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400rmin"機(jī)械攪拌條件下，將有機(jī)相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負(fù)載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3mol'L"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000rmin"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w，/v)再分散后，用lmol'L"NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表5為所制備得到的負(fù)載阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表5:負(fù)載阿德福韋酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例6:負(fù)載阿德福韋酯棕櫚酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的制備負(fù)載阿德福韋酯單甘脂脂質(zhì)納米粒的制備分別精密稱取棕櫚酸甘油酯50mg和10mg阿德福韋酯，置于2mL無水乙醇中，水浴50'C溶解。以PH7.2的磷酸緩沖液為分散相，置冰浴中。在400r，min—1機(jī)械攪拌條件下，將有機(jī)相注入10mL分散相中，攪拌5min，得到負(fù)載阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。所得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液用3moHL"HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，以20000rmin"離心10min，沉淀加0.1%泊洛沙姆(Poloxamer)(w/v)再分散后，用lmol'I/1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。即得得到阿德福韋酯的脂質(zhì)納米粒分散液。表6為所制備得到的負(fù)載阿德福韋酯棕櫚酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率等理化性質(zhì)。表6:負(fù)載阿德福韋酯棕櫚酸甘油酯脂質(zhì)納米粒的粒徑、表面電位和藥物包封率。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1.一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，所述脂質(zhì)納米粒由藥物和脂質(zhì)材料組成，其特征是該脂質(zhì)納米粒負(fù)載了抗病毒藥物，該抗病毒藥物為分子靶標(biāo)位于細(xì)胞內(nèi)的藥物。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，其特征是.-所述藥物選用阿德福韋酯，阿德福韋酯的含量為脂質(zhì)納米粒的1%-4%。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，其特征是其中的脂質(zhì)材料可由單硬脂酸甘油酯、棕櫚酸甘油酯、硬脂酸、或單硬脂酸甘油酯和油酸等一種或兩種脂質(zhì)組成，其重量占納米粒的96-99%，其中由兩種脂質(zhì)材料組成時(shí)，油酸占脂質(zhì)材料的比例為5-20%。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種具有抗乙肝病毒活性的脂質(zhì)納米粒，所述脂質(zhì)納米粒由抗病毒藥物和脂質(zhì)材料組成，所述藥物選用阿德福韋酯。本發(fā)明利用固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體均具有快速的細(xì)胞攝取和細(xì)胞漿滯留功能，對分子靶標(biāo)位于細(xì)胞內(nèi)的抗病毒藥物的包封，可大大增加病毒細(xì)胞對藥物的攝取，以及藥物分子靶標(biāo)部位的藥物濃度。增加病毒細(xì)胞對藥物的攝取，有利于減小藥物在正常組織或細(xì)胞的分布，降低藥物的毒副作用；而藥物分子靶標(biāo)部位的藥物濃度的增加，有利于提高抗病毒藥物的療效，可在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K47/12GK101288646SQ20081006144公開日2008年10月22日申請日期2008年4月30日優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日發(fā)明者杜永忠,靜繆,胡富強(qiáng),弘袁申請人:浙江大學(xué)