專利名稱：：Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及應(yīng)用重組DNA技術(shù)制備的基因工程蛋白藥物，具體說(shuō)是從畢赤酵母中表達(dá)Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白。這種融合蛋白可以作為治療糖尿病藥物的主要成分。
背景技術(shù)：
：Exendin-4是胰高血糖素樣肽-l(GLP-1)類似物[1]。其合成類似物Exenatide，己經(jīng)由Lilly公司開(kāi)發(fā)，2005年通過(guò)FDA審批上市，商品名為Byetta，本品用于治療P細(xì)胞機(jī)能尚好，暫不需要注射胰島素，通過(guò)口服糖尿病治療藥已無(wú)法充分控制血糖水平的糖尿患者[2]。由于Exendin-4半衰期短，而且糖尿病患者用藥幾乎是終生的，因此需要多次長(zhǎng)期給藥(一天兩次)。人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin,HSA)是血液中的一個(gè)非常重要的天然蛋白，在人血液循環(huán)中可以存在20天以上。研究表明將單個(gè)Exendin-4與人血清白蛋白基因融合表達(dá)的融合蛋白可降低體內(nèi)藥物的清除速率，延長(zhǎng)生物半衰期[3]。但是，將多個(gè)Exendin-4與人血清白蛋白基因融合表達(dá)的融合蛋白，是否能進(jìn)一步延長(zhǎng)其體內(nèi)的作用時(shí)間國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白是利用基因工程技術(shù)制備而成的長(zhǎng)效制劑。與Exendin-4相比，在體內(nèi)的作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)，可以減少給藥次數(shù)，減輕病人治療時(shí)的痛苦。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是根據(jù)糖尿病患者終身用藥的特點(diǎn)，進(jìn)一步地延長(zhǎng)Exendin-4在體內(nèi)的作用時(shí)間，提供一種長(zhǎng)效的Exendin-4融合蛋白，其結(jié)構(gòu)可以表示成下列結(jié)構(gòu)中的任何一種1)E-L1-E-L2-HSA;2)E-L1-E-L2-E-L3-HSA;3)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-HSA;4)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-HSA;5)E-Ll-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-E-L6-HSA;其中，E表示Exendin-4，HSA表示人血清白蛋白，Ll-6表示肽接頭；添加的肽接頭是為了防止?jié)撛诘慕Y(jié)構(gòu)域相互作用而影響融合蛋白的生物學(xué)功能和穩(wěn)定性。本發(fā)明中肽接頭選自具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]m的多肽，其中m為0,1,2，3，4，5或6;優(yōu)選為l-2個(gè)重復(fù)序列。我們最優(yōu)選的融合蛋白序列見(jiàn)SEQIDNo:l。為了達(dá)到上述目的，我們根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的Exendin-4氨基酸序列(www.expasv.org.Swiss-proentryP26349),采用酵母偏愛(ài)的密碼子人工合成了含肽接頭的exendin-4串聯(lián)多肽基因。同時(shí)在5'端和3'端分別引入Xhol和BamHI的酶切位點(diǎn)。為得到編碼融合蛋白的完整基因，將exendin-4串聯(lián)多肽基因的pBlueScriptSK質(zhì)粒，經(jīng)Xhol和BamHI雙酶切，經(jīng)電泳后，切膠回收得到exendin-4串聯(lián)多肽基因片段，再克隆到含有人血清白蛋白基因的pMD18-T載體中，然后按Invitrogen公司Pichiaexpressionkit的說(shuō)明將融合基因插入到pPIC9質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化酵母菌GS115,經(jīng)過(guò)篩選并表達(dá)得到高產(chǎn)菌種，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，具體實(shí)施方案可以參考實(shí)施例1。收集的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和柱層析、疏水柱層析和凝膠柱層析順序組合純化，得到了高純度的Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白。通過(guò)糖耐量實(shí)驗(yàn)證明Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白比單個(gè)Exendin-4與人血清白蛋白的融合蛋白的作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備本發(fā)明的融合蛋白的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是得到的純化Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白，在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是得到Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白在制備減肥制品中的應(yīng)用。本發(fā)明具有的特點(diǎn)是-1)采用酵母偏愛(ài)的密碼子，人工合成了Exendin-4串聯(lián)多肽的基因片斷。2)采用的表達(dá)系統(tǒng)是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，其特點(diǎn)是該表達(dá)系統(tǒng)含有特有的強(qiáng)有力的AOX(甲醇氧化酶基因)啟動(dòng)子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。一般外源蛋白基肉整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失；外源基因表達(dá)產(chǎn)物可以直接分泌到發(fā)酵液中，有利于分離純化；發(fā)酵工藝成熟，易放大。本發(fā)明中基因工程制備的Excndin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白，經(jīng)測(cè)定其對(duì)給藥后正常小鼠糖耐量的影響和作用時(shí)間，結(jié)果表明它具有與單個(gè)Exendin-4多肽與人血清白蛋白的融合蛋白相近的作用效果，但其作用時(shí)間較單個(gè)Exendin-4多肽與人血清白蛋白的融合蛋白至少長(zhǎng)1.5倍。比文獻(xiàn)報(bào)道的Exendin-4的作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)w。因融合蛋白具有產(chǎn)量大、易于提取、純化方便、中間流程少、體內(nèi)停留的半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)，可以開(kāi)發(fā)為新的糖尿病治療藥物。圖1是本發(fā)明的親和層析圖譜實(shí)線為洗脫曲線，虛線為電導(dǎo)檢測(cè)。圖2是本發(fā)明的SOURCEPHE疏水層析圖譜實(shí)線為洗脫曲線，虛線為屯導(dǎo)檢測(cè)。圖3是本發(fā)明的S印hadex凝膠層析圖譜實(shí)線為洗脫曲線，虛線為電導(dǎo)檢測(cè)。圖4是融合蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖譜1:分子量marker;2:融合蛋白。圖5是融合蛋白的HPLC分析圖譜圖6是給藥2小時(shí)后正常小鼠的糖耐量反應(yīng)圖7是給藥16小時(shí)后正常小鼠的糖耐量反應(yīng)圖8是給藥24小時(shí)后正常小鼠的糖耐量反應(yīng)圖9是給藥38小時(shí)后正常小鼠的糖耐量反應(yīng)圖10是給藥64小時(shí)后正常小鼠的糖耐量反應(yīng)圖11是給藥72小時(shí)后正常小鼠的糖耐量反應(yīng)具體實(shí)施例方式以下提供了實(shí)施例，以便進(jìn)一步描述本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不是僅僅由以下實(shí)施例組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，此處描述的特定試劑、設(shè)備和程序僅僅是說(shuō)明性的，并沒(méi)有以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例l:融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建E-LI-E-L2基因委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成并克隆亍pBluescriptSK質(zhì)粒，其中E為Exendin-4,LI為[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]2，L2為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。序列如下GAGGAGGAGGCCGTCCGTCTTTTCATCGAGTGGCTGAAAAATGGAGGACCTTCCTCCGGAGCCCCT'TTTATTGAATGGTTGAAGAACGGTGGTCCATCTTCTGGTGCTCCACCACCATCTGGTGGTGGTGGATCC3'在其5'端和3'端分別存在XhoI酶切位點(diǎn)和BamHI酶切位點(diǎn)。為了將E-Ll-E-L2與HSA以融合蛋白的形式在畢赤酵母中分泌表達(dá)，將含E-LI-E-L2的pBluescriptSK質(zhì)粒用XhoI和BamHI酶切，回收280bp左右的重組片段；將含有人血清白蛋白基因的重組質(zhì)茅立pMD18-T-HSA用XhoI和BamHI酶切，回收2kb的大片段。用T4DNA連接酶連接兩個(gè)片段，16'C過(guò)夜，轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5ot感受態(tài)細(xì)胞。用含氨芐青霉素的LB瓊脂板，37'C培養(yǎng)過(guò)夜，篩選轉(zhuǎn)化菌。挑取單克隆菌落，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37'C培養(yǎng)過(guò)夜，抽提含融合蛋白基因的pMD18-T重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。含融合蛋白基因的pMD18-T重組質(zhì)粒用XhoI和EcoRI酶切，回收目的片段E-Ll-E-L2-HSA。將質(zhì)粒pPIC9用XhoI和EcoRI酶切，回收大片段。用T4DNA連接酶連接兩個(gè)片段，16'C過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌鋪于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，37'C培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆菌落，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過(guò)夜，抽提含融合蛋白基因的pPIC9表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。重組的表達(dá)質(zhì)粒委托TaKaRa公司測(cè)序。經(jīng)測(cè)序分析證明，融合蛋白的基因序列是正確的(見(jiàn)SEQID2)。表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,篩選重組表達(dá)融合蛋白的工程菌。實(shí)施例2:融合蛋白的表達(dá)參考Pichiae鄧ressionkit，將表達(dá)融合蛋白工程菌的陽(yáng)性單克隆接種至100mlBMGY培養(yǎng)液，30。C/230rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜使OD6。o達(dá)到4-8。采用3000rpm/2分鐘離心收集菌體，菌體重懸于50mlBMMY培養(yǎng)液中，置30'C/230rpm搖床培養(yǎng)。每24h加入甲醇至終濃度為0.7%,連續(xù)誘導(dǎo)3天，5000rpm/10分鐘離心，收獲上清液保存于-30'C。實(shí)施例3:融合蛋白的純化按實(shí)施例2中獲得的畢赤酵母發(fā)酵液，使用雙蒸水進(jìn)行稀釋，使其電導(dǎo)與親和平衡緩沖液相當(dāng)，并調(diào)節(jié)pH為6.0-7.0，將稀釋后的發(fā)酵液用0.45pm微孔濾膜過(guò)濾，再使用截留分子量為10000的超濾系統(tǒng)濃縮至小體積；然后在8ml/分鐘流速下，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)作為流動(dòng)相，通過(guò)BlueSepharose6FastFlow柱(GEhealth)吸附融合蛋白，最后用20mM磷酸鈉和2M氯化鈉(pH7.0)緩沖液進(jìn)行洗脫，再收集洗脫峰，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為215nm，其中目標(biāo)峰1為含有融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物(圖l)。收集目標(biāo)峰l樣品，加入20mM磷酸鈉和2M硫酸銨(pH7.0)，調(diào)節(jié)電導(dǎo)以及pH與疏水平衡緩沖液相當(dāng)。用PhenylSepharoseHighPerformance柱(GEhealth)，在20mM磷酸鈉和1.6M硫酸銨(pH7.0)緩沖液中吸附融合蛋白，采用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗脫蛋白，流速為5ml/分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為215nm，其中目標(biāo)峰2為進(jìn)一步純化的融合蛋白(圖2)。采用HiTrapDesalting柱(GEhealth)對(duì)上述含融合蛋白的組分進(jìn)行脫鹽處理，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為215nm，其中目標(biāo)峰3為脫鹽后的融合蛋白(圖3)。并用截流分子量為5000的超濾系統(tǒng)濃縮。實(shí)施例4:融合蛋白的鑒定實(shí)施例4aSDS-PAGE我們采用SDS-PAGE對(duì)融合蛋白進(jìn)行鑒定，膠濃度為8%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，融合蛋白的分子量與我們預(yù)期一致，同時(shí)其SDS-PAGE純度已經(jīng)〉95。/。(見(jiàn)圖4)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成奠定了基礎(chǔ)。實(shí)施例4bHPLC純度分析我們采用HPLC凝膠色譜檢測(cè)其純度，條件如下色譜柱:WatersProteinPak125A，7.8X300mm，分子量范圍2000-80000lOOmM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉(pH6.5)220nm0.5ml/ml流動(dòng)相:UV檢測(cè)波長(zhǎng):流速實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，融合蛋白的純度己經(jīng)>95%(圖5)。實(shí)施例5:融合蛋白的活性檢測(cè)實(shí)施例5a融合蛋白對(duì)正常小鼠的糖耐量實(shí)驗(yàn)正常ICR小鼠(購(gòu)自浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體重為18-22g，禁食不禁水12小時(shí)，然后皮下分別給予蒸餾水和純化的融合蛋白，給藥后2小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、38小時(shí)、64小時(shí)、72小時(shí)后小鼠的糖耐量反應(yīng)。小鼠的糖耐量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)如下灌服葡萄糖溶液2g/kg(10mg/ml)，使用血糖儀(艾康生物技術(shù)有限公司)測(cè)定灌服葡萄糖后10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘時(shí)血液中的葡萄糖濃度，然后繪制耐糖曲線圖。給藥后2小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)、38小時(shí)、64小時(shí)和72小時(shí)后小鼠糖耐量反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖6、圖7、圖8、圖9、圖10和圖11(其中Nl表示單個(gè)Exendin-4和人血清白蛋白的融合蛋白，由我們自己實(shí)驗(yàn)室表達(dá)制備，給予劑量為0.18mg/20g小鼠；N2表示兩個(gè)Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白，給予劑量為0.2mg/20g小鼠)。我們從圖6-11中可以觀察到灌服葡萄糖后，血糖濃度的峰值時(shí)間在10-20分鐘，90分鐘后基本上恢復(fù)到初始水平。從圖6中，我們可以觀察到N1在2小時(shí)時(shí)，已有降血糖作用，但是與對(duì)照組比較，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);從圖7中可以看出，在16小時(shí)時(shí)出現(xiàn)了明顯的降血糖作用(p〈0.05)，然后在24小時(shí)后，已經(jīng)沒(méi)有明顯的控制血糖作用(p>0.05)，因此其作用時(shí)間約為24小時(shí)。從圖6-ll中，我們可以觀察到N2起效較快，在2小時(shí)時(shí)，與對(duì)照組比較，已經(jīng)出現(xiàn)明顯的控制血糖作用。然后，在16小時(shí)、24小時(shí)、38小時(shí)、64小時(shí)時(shí)仍然有明顯的控制血糖峰濃度的作用，但是在72小時(shí)時(shí)，已經(jīng)沒(méi)有控制血糖峰濃度的作用；因此，N2的作用時(shí)間持續(xù)64小時(shí)以上，其反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)了至少1.5倍。因此，我們可以看出，Exendin-4串聯(lián)多肽和人血清白蛋白的融合蛋白體內(nèi)作用時(shí)間明顯延長(zhǎng)。實(shí)施例6:融合蛋白在制備減肥制品中的應(yīng)用從文獻(xiàn)中w,我們可以看到Exendin-4能夠明顯降低食欲，從而控制動(dòng)物的體重。我們?cè)趯?shí)施例5a的小鼠實(shí)驗(yàn)中，也觀察到Exendin-4串聯(lián)多肽和人血清白蛋白的融合蛋白有明顯的食欲抑制作用。控制體重需要長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到目的，因此，我們制備的Exendin-4串聯(lián)多肽和人血清白蛋白的融合蛋白，適合于用來(lái)制備減肥制品。本發(fā)明涉及的部分參考文獻(xiàn)1.JEng,WAKleinman,LSinghetal.Isolationandcharacterizationofexendin-4,anexendin-3analogue,fromHelodermasuspectumvenom.Furtherevidenceforanexendinreceptorondispersedacinifromguineapigpancreas.丄Biol.Chem.1992,267(11):7402-7405.2.JohnB.Buse,RobertR.Henry,JennyHanetal.Effectsofexenatide(exendin-4)onglycemiccontrolover30weeksinsulfonylurea-treatedpatientswithtype2diabetes.DiabetesCare2004,27:2628-2635.3.YanshanHuang,ZhiChen,YiqiongChenetal.Preparationandcharacterizationofanovalexendin-4humanserumalbuminfusionproteinexpressedinP/ch/apasto〃—s.丄peptidescience.2007Nov12.PMID17994612.[Epubaheadofprint]4.AAYoung,已RGedulin,SBhavsaretal.Glucose-loweringandinsulin-sensitizingactionsofexendin-4:studiesinobesediabetic(ob/ob，db/db)mice,diabeticfattyZuckerrats,anddiabeticrhesusmonkeys(/Wacacamu/a斷Diabetes.1999,48:1026-1034.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>GinArg290LysAla305PheAlaGluCysLeuAlaLysGlu370GluVal385AspPheAspValAspTyrThrLeu450LysVal465lieLysGinAsnThrProLysCys530TyrLeu545ProValArgArgLysGluLeuSer610LeuVal625MetAsp275LeuTrpGluCysLys355CysGluValPheSer435GluPheGinAlaThr515CysSerSerProPhe595GluLysAspLysAlaValHis340TyrCysAsnGluLeu420ValLysAspAsnLeu500LeuLysValAspCys580AsnLysHisPheCysValSer325GlylieGluAspSer柳GlyValCysGluCys485LeuValHisValArg565PheAlaGluLysAlaAlaAla310LysAspCysLysGlu390LysMetLeuCysPhe470GluValGluProLeu550ValSerGluArgPro630AlaSer295ArgLeuLeuGluPro375MetAspPheLeuAla455LysLeuArgValGlu535AsnThrAlaThrGin615LysPhe280LeuLeuValLeuAsn360LeuProValLeuLeu440AlaProPheTyrSer520AlaGinLysLeuPhe600lieAlaValGinSerThrGlu345GinLeuAlaCysTyr425ArgAlaLeuGluThr505ArgLysLeuCysGlu585ThrLysThrGluLysGinAsp330CysAspGluAspLys410GluLeuAspValGin490LysAsnArgCysCys570ValPheLysLysLysPheArg315LeuAlaSerLys二eu395AsnTyrAlaProGlu475LeuLysLeuMetVal555ThrAspHisGinGlu635CysGly300PheThrAsplieSer380ProTyrAlaLysHis460GluGlyValGlyPro540CeuGluGluAlaThr620GinCys285GluProLysAspSer365HisSerAlaArgThr445GluProGluProLys525CysHisSerThrAsp605AlaLeuLysArgAlaPheLysValArg350SerCysLeuGluArg430TyrCysGinTyrGin510ValAlaGluLeuTyr590lieLeuLysAlaAlaGlu320HisThr335AlaAspLysLeulieAlaAlaAla400AlaLys415HisProGluThrTyrAlaAsnLeu480LysPhe495ValSerGlySerGluAspLysThr560ValAsn575ValProCysThrValGluAlaVal640AspAsp9<image>imageseeoriginaldocumentpage10</image>權(quán)利要求1.一種Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于其結(jié)構(gòu)可以表示成下列結(jié)構(gòu)中的任何一種1)E-L1-E-L2-HSA；2)E-L1-E-L2-E-L3-HSA；3)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-HSA；4)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-HSA；5)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-E-L6-HSA；其中，E表示Exendin-4，L1-6表示肽接頭，HSA表示人血清白蛋白。2.權(quán)利要求l的融合蛋白，其特征在于其結(jié)構(gòu)可以表示成下列結(jié)構(gòu)E-LI-E-L2-HSA。3.權(quán)利要求l-2的融合蛋白，其特征為肽接頭選自富含甘氨酸的多肽。4.權(quán)利要求l-2的融合蛋白，其特征為肽接頭選自具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]m的多肽，其中m為0，1，2，3，4，5或6。5.權(quán)利要求1-2的融合蛋白，其特征為融合蛋白可以表示成E-LI-E-L2-HSA，Ll為[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]2，L2為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，氨基酸序列[SEQIDl]如下所示；<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>ValValLeuLeuLeuArgLeuAlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCysCysAlaAlaAlaAspProHisGluCysTyrAlaLysValPheAspGluPheLysProLeuValGluGluProGinAsnLeulieLysGinAsnCysGluLeuPheGluGinLeuGlyGluTyrLysPheGinAsnAlaLeuLeuValArgTyrThrLysLysValProGinValSerThrProThrLeuValGluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHisProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValValLeuAsnGinLeuCysValLeuHisGlulysThrProValSerAspArgValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPheSerAlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAlaGluThrPheThrPheHisAlaAsplieCysThrLeuSerGluLysGluArgGinlieLysLysGinThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLysProLysAlaThrLysGluGinL_euLysAlaValMetAspAspPheAlaAlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPheAlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGinAlaAlaLeuGlyLeu06.—種制備權(quán)利要求l-5任意一項(xiàng)融合蛋白的方法，其特征在于包含以下步驟(1)將編碼權(quán)利要求l-5任意一項(xiàng)融合蛋白的基因序列通過(guò)表達(dá)載體，導(dǎo)入酵母菌或大腸桿菌中表達(dá)；(2)隨后將含有權(quán)利要求l-5任意一項(xiàng)融合蛋白的發(fā)酵液通過(guò)親和柱層析、疏水層析、和凝膠柱層析順序組合純化，制備得到融合蛋白。7.權(quán)利要求6所述的制備融合蛋白方法，其特征在于所述酵母菌為畢赤酵母:。8.權(quán)利要求6，7所述的制備融合蛋白方法，其特征在于所述畢赤酵母為GS115。9.權(quán)利要求6-8所述的制備融合蛋白方法，其特征在于所述編碼基因轉(zhuǎn)入酵母中時(shí)，所述表達(dá)載體為pPIC9。10.權(quán)利要求6-9所述的制備融合蛋白方法，其特征在于所述親和層析柱填料為BlueS印harose。11.權(quán)利要求6-9所述的制備融合蛋白方法，其特征在于所述疏水層析柱填料為PhenylS印harose。12.權(quán)利要求1-5的任意一項(xiàng)融合蛋白在制備用于糖尿病治療藥物中的用途。13.—種適用于治療糖尿病的藥物制劑，其特征是包含權(quán)利要求1-5的任意一項(xiàng)融合蛋白。14.權(quán)利要求13的藥物制劑，其特征在于該藥物制劑為注射劑。15.權(quán)利要求13的藥物制劑，其特征在于該藥物制劑通過(guò)鼻腔或肺部給藥。16.權(quán)利要求1-5的任意一項(xiàng)融合蛋白在制備減肥制品中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及Exendin-4串聯(lián)多肽與人血清白蛋白的融合蛋白及其制備方法和用途。我們通過(guò)基因工程的方法表達(dá)了exendin-4串聯(lián)多肽和人血清白蛋白的融合蛋白，該融合蛋白在體內(nèi)顯示出長(zhǎng)效的控制血糖活性，克服了exendin-4多肽在體內(nèi)半衰期較短的問(wèn)題，并且制備方便。該融合蛋白可以用于制備糖尿病治療藥物和減肥制品。文檔編號(hào)A61K9/08GK101525386SQ200810060038公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2008年3月5日優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日發(fā)明者孔建龍,徐小蓉,徐海達(dá),朱小娟,王安行,盛靈通,健秦,管其君,詹金彪,樂(lè)陸,黃建松申請(qǐng)人:浙江華陽(yáng)藥業(yè)有限公司