專利名稱：：一種黃芪顆粒及其質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于藥物制備工藝及質(zhì)量控制
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種黃芪顆粒及其質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
：黃芪又稱膜莢黃芪或黃耆，為豆科、多年生草本。主根長，圓柱形，稍帶木質(zhì)，外質(zhì)土黃色或棕紅色。喜干旱，適應(yīng)性強(qiáng)。分布河北、山西、陜西、甘肅、青海、遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古等地。黃芪的根是著名的常用中藥。商品黃芪呈圓柱形，略扭曲，長2060厘米，以條粗長、皺紋少、質(zhì)堅(jiān)而綿、粉性足、味甜者為好。主要含有香豆素、黃酮類化合物、皂苷及微量葉酸和數(shù)種維生素等。其味甘，微溫，具有補(bǔ)氣固袞，托瘡生肌、利水的功效，主治氣血虛弱、自汗、久瀉脫肛、子宮脫垂、腎炎浮腫、蛋白尿、糖尿病、慢性潰瘍等癥。近年來臨床也用于治療高血壓和急慢性腎炎等。黃芪顆粒是以黃芪藥材為原料經(jīng)過提取制成的顆粒劑，其傳統(tǒng)的制備方法是取黃芪1000g，加水煎煮二次，第一次3小時(shí)，第二次2小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度約為1.26，加乙醇使含乙醇量為70%,攪勻，靜置，取上清液回收乙醇，濃縮成相對密度為1.36(38。C)的清膏，加輔料適量，制成顆粒，低溫干燥，制成1000g，即得。該傳統(tǒng)方法采用了水提醇沉的方法制備黃芪顆粒，黃芪的主要功效成分是黃芪多糖和總皂苷，黃芪多糖和總皂苷均可溶解于水中，故傳統(tǒng)方法采用了水提的方法，而以水作為溶劑提取黃芪，在煎煮過程中，也會將較多水溶性無效成分如淀粉、鞣質(zhì)等一并提取出來，故采用醇沉的方法進(jìn)行純化。但由于多糖在乙醇中溶解性不好，在醇沉過程中，會除去大部分多糖，且由于生產(chǎn)環(huán)節(jié)的增加，也會對總皂苷造成損耗。黃芪顆粒制劑傳統(tǒng)的質(zhì)量控制方法是(1)取黃芪顆粒5g，加水50ml，浸漬過夜，濾過，取濾液lml，加0.2%茚三酮溶液2滴，在沸水浴中加熱5分鐘，顯紫色。(2)取黃芪顆粒5g，加甲醇20ml，置水浴上加熱回流l小時(shí)，濾過，濾液置于經(jīng)處理的中性氧化鋁柱(100120目，5g，內(nèi)徑1015mm)上，用40%甲醇100ml洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次20ml，棄去水液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状?.5ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲甙對照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2u1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿一甲醇一水(13:7:2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105i:烘約5分鐘。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的棕褐色斑點(diǎn)。該傳統(tǒng)方法中僅僅采用了茚三酮顯色反應(yīng)和薄層色譜法對其中含有的黃芪甲苷等進(jìn)行了定性鑒別，沒有涉及任何含量測定，很顯然，這對于黃芪顆粒的質(zhì)量控制是不夠準(zhǔn)確可靠的，也不可能確保其臨床療效。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對上述黃芪顆粒的傳統(tǒng)制備工藝及質(zhì)量控制現(xiàn)狀，提供一種采用新的制備方法獲得的黃芪顆粒，可使黃芪藥材中含有的黃芪多糖及總皂苷等盡量保留在制劑中，大大提高有效成分的含量，從而提高所得黃芪顆粒的臨床有效性；同時(shí)，本發(fā)明還為上述黃芪顆粒提供了一種可靠的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種黃芪顆粒，按照包括下述主要步驟的方法制備而得(1)制取黃芪清膏取黃芪藥材，加水煎煮提取2次，每次煎煮1.52.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.201.30(7080°C)的黃芪清膏；(2)制備黃芪顆粒在上述黃芪清膏中加入蔗糖和/或其他制備顆粒劑時(shí)常用的糖類輔料，其加入量以1000g黃芪原生藥材制得1000g顆粒計(jì)算，混勻后制粒，干燥，分裝，滅菌，即制得所述的黃芪顆粒。上述黃芪顆粒在制備過程中，其步驟(1)"制取黃芪清膏"過程中，可優(yōu)選采用下述減壓濃縮方法對濾過后的濾液進(jìn)行濃縮壓力-0.06mpa-0.09mpa、溫度5565。C。上述黃芪顆粒的質(zhì)量控制方法，在傳統(tǒng)的黃萬顆粒質(zhì)量控制基礎(chǔ)上，主要增加了以黃芪甲苷和/或總皂苷的含量測定為評價(jià)指標(biāo)來進(jìn)行質(zhì)量控制，其中所述的黃芪顆粒中，黃芪甲苷(CHfi80H)含量為0.21.0mg/g，總皂苷含量以黃芪甲苷(C,賊i)計(jì)為0.64.4mg/g。上述黃芪甲苷含量可采用高效液相色譜法來測定而得，總皂苷可采用紫外-可見分光光度法測定而得，具體測定方法可如下一、黃芪甲苷的含量測定方法(1)對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋成每lml含0.450.55mg的溶液，即得；(2)供試品溶液的制備取黃芪顆粒，研細(xì)，精密稱定約4.55.5g，取置具塞瓶中，加濃度>90%的甲醇溶液或甲醇(作為提取溶劑)75250ml，超聲處理3040分鐘(可適時(shí)振搖)，放冷，濾過，用相同溶劑分次洗滌瓶、濾紙和濾渣，洗液并入濾液中，濾液置水浴上蒸干；殘?jiān)铀?015ml，使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取45次，每次3040ml，合并正丁醇液；用氨試液(參照中華人民共和國藥典2005版一部中記載的方法制備取濃氨溶液■ml,加水使成1000ml，即得)充分洗滌23次，每次4050ml，分別合并￡—r醇液、氨試液，正丁醇液備用；將氨試液用3050ml水飽和正丁醇反提至少1次，分離所得的正丁醇層并入上述備用的正丁醇液中；置水浴上蒸千，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至1020ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得；(3)色譜條件色譜柱以十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水(,積比32:68)為流動相，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度4(TC，載氣壓力3.5bar，流速1,0ml/min;(4)測定法精密吸取對照品溶液5W，供試品溶液IOW，分別注入高效液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，得黃芪顆粒中黃芪甲苷的含量。二、總皂苷的含量測定方法(1)對照品溶液的制備取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml含0.40.6mg的溶液，即得；(2)供試品溶液的制備按照與前述"黃芪甲苷的含量測定方法"中供試品溶液的制備方法，制得用微孔濾膜濾過后的續(xù)濾液，再精密量取此續(xù)濾液，稀釋至5倍，搖勻，即可；或者，也可直接精密量取上述"黃芪甲苷的含量測定方法"中制得的供試品溶液，置量瓶中，加甲醇稀釋至5倍，搖勻，即得；(3)測定法精密量取對照品溶液與供試品溶液各lml，分別置具塞試管中，置水浴上揮干，精密加入5y。香草醛冰醋酸溶液lml和高氯酸4ml，混勻，置6(TC水浴中加熱1540分鐘，立即用水冷卻，精密加入冰醋酸15ml，混勻，參照《中國藥典》一部附錄VA中的記載，采用紫外-可見分光光度法，在530nm波長處測定吸光度，計(jì)算，即得黃芪顆粒中總皂苷的含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明黃芪顆粒采用新的方法制得，減少了醇沉步驟，改變了煎煮時(shí)間，更有利于有效成分的溶出和保留，使黃芪藥材中含有的黃芪多糖及總皂苷等有效成分盡量保留在制劑黃芪顆粒中，大大提高了其有效成分的含量，從而提高所得黃芪顆粒的臨床有效性；并且通過減少醇沉步驟、縮短煎煮時(shí)間等工藝環(huán)節(jié)，使生產(chǎn)周期明顯縮短，并減少能耗，成本降低；同時(shí)，在一定程度上，也克服了本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)對黃萬藥材的提取均采用水煮醇沉法這樣的技術(shù)偏見。發(fā)明人通過藥理學(xué)試驗(yàn)等也證實(shí)，本發(fā)明的提取工藝所得的黃芪提取物A與傳統(tǒng)方法所得的黃芪提取物B相比，兩者均具有提高小鼠的特異性免疫和非特異性免疫功能的作用，對大黃致脾虛小鼠的胃腸推進(jìn)功能有明顯的恢復(fù)作用，同時(shí)，A、B藥物相同劑量間比較A藥物中劑量較B藥物中劑量有明顯的促進(jìn)脾虛小鼠腸推進(jìn)的功能，結(jié)果顯示黃芪提取物A的藥理作用較優(yōu)于黃芪提取物B，證明改進(jìn)后的工藝更能保留黃芪的有效成分，有利于提高臨床療效。此外，本發(fā)明提供的上述黃芪顆粒的質(zhì)量控制方法，在傳統(tǒng)質(zhì)量控制基礎(chǔ)上增加了黃芪甲苷和/或總皂苷的含量作為黃芪顆粒質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，并提供了其相應(yīng)的含量檢測方法，與傳統(tǒng)方法相比更科學(xué)，更準(zhǔn)確，能更有效的控制黃芪顆粒的內(nèi)在質(zhì)量和臨床療效。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一歩的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1本實(shí)施例為通過下述方法制得的黃芪顆粒取黃芪1000g加水煎煮二次，第一次煎煮2小時(shí)，第二次煎煮2小吋，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度約1.30(7(TC)的清膏，加入蔗糖適量，制成顆粒1000g，干燥，分裝成15g/袋，滅菌，即得。實(shí)施例2本實(shí)施例為通過下述方法制得的黃芪顆粒取黃芪1000g加水煎煮二次，第一次煎煮2.5小時(shí)，第二次煎煮1.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度約1.20(8CTC)的清膏，加入乳糖適量，制成顆粒1000g，干燥，分裝成10g/袋，滅菌，即得。本實(shí)施例為通過下述方法制得的黃芪顆粒取黃茛lOOOg加水煎煮二次，第一次煎煮1.5小時(shí)，第二次煎煮2.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓(壓力-O.06mpa-0.07mpa、溫度556(TC)濃縮至相對密度約1.25(75°C)的清膏，加入木糖醇適量，制成顆粒1000g，干燥，分裝成10g/袋，滅菌，即得。實(shí)施例4本實(shí)施例為通過下述方法制得的黃芪顆粒取黃貧1000g加水煎煮二次，第一次煎煮2小時(shí)，第二次煎煮1.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓(壓力-0.08mpa_0.09即a、溫度6065。C)濃縮至相對密度約1.28(7(TC)的清膏，加入葡萄糖適量，制成顆粒1000g，干燥，分裝成15g/袋，滅菌，即得。實(shí)施例5本實(shí)施例為本發(fā)明研發(fā)過程中對黃芪顆粒制備工藝的部分考察研究試驗(yàn)，主要是對黃芪提取工藝的考察由于在該工藝路線屮，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間長短、是否取消醇沉環(huán)節(jié)等對黃芪提取液及黃芪顆粒產(chǎn)品的主要成分及含量等都有較大影響，故在進(jìn)行提取工藝考察吋對二者進(jìn)行研究，均選用黃芪甲苷含量、黃芪多糖含量和干膏收率為評價(jià)指標(biāo)。其中，黃芪甲苷的含量測定采用下述方法按《中華人民共和國藥典》2005版一部附錄VID高效液相色譜法測定；色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙睛_水(體積比32:68)為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測；對照品溶液的制備取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml含0.5mg的溶液，即得；供試品溶液的制備精密量取提取液各10ml，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次30ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌兩次，每次40ml，再用正丁醇飽和的水30ml洗滌1次，棄去水液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(O.45Wn)濾過，取續(xù)濾液，即得；測定法精密吸取對照品溶液5W，IOW，供試品溶液10W，分別注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，即得。黃芪多糖的含量測定采用下述方法參考《中華人民共和國藥典》2005版一部"靈芝"項(xiàng)下多糖測定方法測定；對照品溶液的制備取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每lml含0.lmg的溶液，即得；標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取上述對照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、l.Oml、1.2ml，置具塞試管中，加水至2.0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密稱取蒽酮O.2g，加硫酸100ml使溶解，搖勻)6ml，搖勻，置水浴中加熱15分鐘，取出，放入冰浴中，冷卻15分鐘；以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2005版一部附錄VA)，在625nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；供試品溶液的制備精密量取提取液各10ml，分別加入乙醇150ml，搖勻，4。C放置12h，取出，傾出上清液，沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶巾，過濾，取續(xù)濾液，精密量取該溶液lml，加水稀釋并定容于100ml，搖勻，即得；測定法精密量取供試品溶液lml加水稀釋至2ml，置具塞試管中，照"標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備"項(xiàng)下方法，自"精密加入硫酸蒽酮溶液6ml"起，依法測定吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖的含量，計(jì)算，即得。干膏收率的測定采用下述方法精密量取提取液各25ml，置于恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)?05r干燥5小時(shí)，取出，置于干燥器中放置30分鐘，稱重，計(jì)算即得。一、黃芪提取時(shí)間的考察1.試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)利用單因素試驗(yàn)法，分別提取，每次提取時(shí)間分別為1小時(shí)、L5小時(shí)、2h小時(shí)、2.5h小時(shí)、3小時(shí)，也即采用由相同處方量，相同加水量，不同提取時(shí)間制備提取液，以提取物中黃芪甲苷含量、黃芪多糖含量及干膏收率為評價(jià)指標(biāo)，并采用綜合評價(jià)方式進(jìn)行分析，確定藥材的提取時(shí)間。綜合評價(jià)計(jì)算公式綜合得分二Y1X40%+Y2X40%+Y3X20%Yl為黃芪甲苷含量得分，=100X(含量/最大含量值)Y2為黃芪多糖含量得分，=100X(含量/最大含量值)Y3為干膏收率得分，=100X(收率/最大收率)2.試驗(yàn)方法稱取500g黃芪藥材五份，分別加入水煎煮(提取時(shí)間分別為①1小時(shí)；②l.S小時(shí)；③2小時(shí)；④2.5小吋；3小時(shí))2次，每次的提取液分別濾過，濾液分別減壓濃縮(-0.08-0.09mpa、60°C)至500ml容暈瓶中，定容。測定其中黃芪甲苷及黃芪多糖含量、干膏收率等，第l次提取時(shí)間的考察結(jié)果見下述表1和表2;第2次(均以第一次提取時(shí)間為2小時(shí)并濾過后的黃芪藥渣為原料)提取時(shí)間的考察結(jié)果見下述表3和表4。表1第一次提取時(shí)間的考察結(jié)果提収黃芪甲苷含黃芪甲苷含量多糖含量多糖含量平干膏收干膏收率時(shí)問量(mg/m])平均值(mg/ml)(mg/ml)均值(g/ml)率(％)平均值(%)0.3241.1316.540.3440.96丄6.320.36肌8016.110.6052.4223.991.5h0.6052.852丄丄0.6153.0824.120.6453.2325.052h0.6253.7824.70.5954.3224.4i0.6849.2326.012.5h0.6649.2125.80.6549.1925.630.6145.2127.0430.6045.0627.10.5944.9127.16表2第一次提取時(shí)間的考察結(jié)果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表1和表2可知，第一次提取時(shí)，提取時(shí)間為1.5小時(shí)、2小時(shí)和2.5小時(shí)的樣品綜合得分均最高，且差異較小。而隨著提取時(shí)間的增長，出膏率越來越大，但提取出的黃芪甲苷和黃芪多糖含量卻越來越少，分析原因可能是由于有效成分對熱不穩(wěn)定，產(chǎn)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致含量減少。因此，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取1.52.5小時(shí)作為黃芪藥材第一次的提取時(shí)間。表3第二次提取吋間的考察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4第二次提取時(shí)間的考察結(jié)果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表3和表4可知，第二次提取時(shí)，提取時(shí)間為1.5小時(shí)、2小時(shí)和2.5小時(shí)的樣品綜合得分均最高，且差異較小。而隨著提取時(shí)間的增長，出膏率越來越大，有效成分含量卻越來越少。因此，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取1.52.5小時(shí)作為黃芪藥材的第二次提取時(shí)間。綜上，黃茛藥材的兩次提取時(shí)間最佳值均為1.52.5小時(shí)。二、醇沉前后工藝對比考察1.試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)采用不同工藝提取(①醇沉②不醇沉)的樣品進(jìn)行考察，對比研究醇沉前后樣品的差異。以提取物中黃芪甲苷含量、黃芪多糖含量及干膏收率為評價(jià)指2.試驗(yàn)方法未醇沉樣品制備稱取500g黃芪藥材，分別加水煎煮二次，第一次提取2小時(shí)，第二次提取2小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮(-0.08-0.09mpa、6(TC)至500ml容量瓶中，定容。醇沉樣品制備稱取500g黃芪藥材，分別加水煎煮二次，第一次提取2小吋，第二次提取2小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度約為1.26(6CTC)，加乙醇使含醇量為70%，搖勻，靜置過夜，取上清液回收乙醇，減壓濃縮(-0.08_0.09卿a、6(TC)至500ml容量瓶中，定容。測定其中黃芪甲苷及黃芪多糖含量、干膏收率等，試驗(yàn)結(jié)果下述表5。表5醇沉工藝對比考察提取黃芪甲苷含黃芪甲苷含量多糖含量工藝量(mg/ml)平均值(mg/ml)(mg/ml)多糖含量平均干膏收干膏收率值(mg/ml)率(％)平均值(％)醇沉未醇沉0.410.460.630.670.440.6542.4042.0655.0255.1442.2355.0816.4516.1325.0825.1516.2925.12由表5可知，醇沉對樣品中的黃芪甲苷、黃芪多糖等有效成分及干膏收率都有較大影響，即醇沉環(huán)節(jié)對有效成分的損耗較大，故考慮取消醇沉環(huán)節(jié)。因此，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，確定本發(fā)明黃芪顆粒的制備過程中黃芪的提取工藝為取黃芪藥材，加水煎煮提取2次，每次煎煮1.52.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.201.30(7080°C)的黃芪清膏。實(shí)施例6本實(shí)施例為黃芪顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中黃芪甲苷含量測定方法的研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃芪皂苷為黃芪的主要有效成分?！吨袊幍洹芬渣S芪甲苷為指標(biāo)成分，采用HPLC法測定黃芪藥材中黃芪甲苷的含量。為與原料藥材保持一致，本發(fā)明參考《中國藥典》2005年版一部中黃芪的含量測定方法，以黃芪甲苷為指標(biāo)成分，建立了HPLC法測定本發(fā)明黃芪顆粒中黃芪甲苷的含量。1、色譜條件的選擇使用十八垸基硅烷鍵合硅膠柱。選擇乙腈-水系統(tǒng)作為流動相，參考《中國藥典》2005年版一部中黃芪的含量測定方法，并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證后確定其比例為乙腈-水的體積比32:68，此時(shí)黃芪甲苷保留時(shí)間適宜，與相鄰峰分離良好。由于黃芪甲苷僅有紫外末端吸收，且使用紫外檢測器時(shí)其他組分的干擾很大，因此釆用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。選擇漂移管溫度為4(TC，載氣壓力為3.5bar，在此條件下，圖譜基線平穩(wěn)，黃芪甲苷與相鄰峰分離良好。艮iJ，經(jīng)試驗(yàn)后確定色譜條件為色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，即使用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；以乙腈-水(體積比32:68)為流動相；流速1.0ml/min;使用蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度4(TC，載氣壓力3.5bar。2、測定法的確定參照上述藥典記載的黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的測定法，精密吸取對照品溶液5W、IOW，供試品溶液10W，分別注入液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算。3、供試品溶液的制備藥典記載的黃芪藥材供試品溶液的制備方法較為復(fù)雜，所用時(shí)間較長；而且，黃芪顆粒制劑與黃芪藥材在組分等方面的差異也決定其不適宜采用完全一致的處理方法。因此，發(fā)明人重點(diǎn)對黃芪顆粒供試品溶液的制備進(jìn)行了不同處理方法的對比研究分析，主要試驗(yàn)內(nèi)容如下-(1)提取溶劑的選擇取黃芪顆粒(批號070601)，研細(xì)，精密稱取5g，取4份，置具塞錐形瓶中，分別加甲醇(無水)、90%甲醇、70%甲醇、無水乙醇各70ml,超聲處理30分鐘，濾過，用約10ml同種溶劑洗滌濾紙和濾渣，洗液并入濾液中，揮干，殘?jiān)盟柡驼〈嫁D(zhuǎn)移至分液漏斗中，用氨試液洗滌正丁醇層2次，每次40ml，分別合并正丁醇液、氨試液，用水飽和正丁醇20ml反洗，洗液并入正丁醇液中，置水浴上揮干，殘?jiān)蛹状嫁D(zhuǎn)入10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(微孔直徑0.45iim)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取供試品溶液和黃芪甲苷對照品溶液各10nl進(jìn)樣，記錄色譜圖，測定黃芪甲苷含量并加以比較，結(jié)果見下述表6。表6提取溶劑考察結(jié)果<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，用甲醇和90%甲醇提取的結(jié)果無顯著差異，均顯著高于無水乙醇的提取結(jié)果；用70%甲醇提取時(shí)，由于溶劑含水量較高，提出的糖類物質(zhì)較多，無法揮干溶劑，操作費(fèi)時(shí)，因此將提取溶劑確定為》90%的甲醇溶液或甲醇。(2)提取方式的選擇取黃芪顆粒(批號070702)，研細(xì)，精密稱取5g，取2份，置具塞錐形瓶中，各加甲醇70ml，分別超聲提取30分鐘和回流提取2小時(shí)，自超聲處理后的"濾過"之后按照前文(1)"提取溶劑的選擇"中的方法測定，結(jié)果見下述表7。<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲提取30分鐘的測定結(jié)果高于回流提取2小時(shí)的結(jié)果，故選擇超聲處理作為提取方式。(3)超聲提取時(shí)間的選擇取黃芪顆粒(批號070601)，研細(xì)，精密稱取5g，取3份，置具塞錐形瓶中，各加甲醇70ml，分別超聲提取20、30和40分鐘，自超聲處理后的"濾過"之后按照前文(1)"提取溶劑的選擇"中的方法測定，結(jié)果見下述表8。表8超聲提取時(shí)間的考察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，使用50ml甲醇提取的含量測定結(jié)果明顯偏低，使用75ml甲醇與100ml甲醇的提取結(jié)果無顯著性差異，說明100ml甲醇已能將黃芪甲苷提取完全，當(dāng)然，溶劑多于100ml也能提取較完全；從提取效果和節(jié)約成本等綜合考慮，確定提取溶劑的體積為75250ml。(5)是否需要凈化處理取黃芪顆粒(批號070601)，研細(xì)，精密稱取5g，取2份，置具塞錐形瓶中，各加甲醇100ml，超聲提取30分鐘，自超聲處理后的"濾過"之后按照前文(l)"提取溶劑的選擇"中的方法測定，但正丁醇層均不用氨試液洗滌，直接揮千，殘?jiān)謩e用甲醇和流動相溶解，微孔濾膜過濾后進(jìn)樣分析。結(jié)果色譜圖中其他組分峰多，相互重疊，主峰峰形鈍，且峰面積減小，干擾嚴(yán)重，說明樣品必須經(jīng)凈化處理后才能有利于準(zhǔn)確測定。(6)凈化用堿溶液的選擇取黃芪顆粒(批號070702)，研細(xì)，精密稱取5g，取2份，置具塞錐形瓶中，各加甲醇100ml，均超聲提取30分鐘，自超聲處理后的"濾過"之后按照前文(l)"提取溶劑的選擇"中的方法測定，區(qū)別為凈化用堿性溶液分別使用氨試液和1%氫氧化鈉溶液，測定結(jié)果見下述表10。表10凈化用堿性溶液的考察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種洗滌方式處理后黃芪甲苷含量無顯著性差異，且色譜圖基線均較平穩(wěn)，利于測定。但用1%氫氧化鈉溶液萃取時(shí)乳化較嚴(yán)重，操作費(fèi)時(shí)，故選用氨試液洗滌正丁醇層。(s)是否用正r醇對氨液層進(jìn)行反洗的考察為考察凈化用的氨試液是否需要用正丁醇反洗，取黃芪顆粒(批號070702)，研細(xì)，精密稱取5g，取2份，置具塞錐形瓶中，各加甲醇100ml，均超聲提取30分鐘，自超聲處理后的"濾過"之后按照前文(1)"提取溶劑的選擇"中的方法測定，但分別用正丁醇對氨液層進(jìn)行反洗和不反洗處理，測定黃芪甲苷的含量，結(jié)果見下述表ll。表11是否反洗的考察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，用正丁醇對氨液層進(jìn)行反洗的含量顯著高于不反洗處理的含量，說明在凈化用氨試液中含有少量黃芪甲苷，需要用正丁醇對氨試液層進(jìn)行反洗，以避免測定組分的損失。綜合七述試驗(yàn)研究，確定了如本發(fā)明所述的供試品溶液的制備方法，艮口取黃芪顆粒，研細(xì)，精密稱定約4.55.5g，置具塞瓶中，加濃度》90%的甲醇溶液或甲醇75250ml，超聲處理3040分鐘，放冷，濾過，用相同溶劑分次洗滌瓶、濾紙和濾渣，洗液并入濾液中，濾液置水浴上蒸干；殘?jiān)铀?015ml，使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取45次，每次3040ml，合并正丁醇液；用氨試液充分洗滌23次，每次4050ml，分別合并正丁醇液、氨試液，正丁醇液備用；將氨試液用3050ml水飽和正丁醇反提至少1次，分離所得的正丁醇層并入上述備用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至1020ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。根據(jù)上述試驗(yàn)研究確定的供試品溶液制備方法、及色譜條件和測定法等，及藥品研究的相關(guān)規(guī)定，發(fā)明人還進(jìn)行了色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以對照品溶液和供試品溶液各進(jìn)樣，記錄色譜圖，以黃芪甲苷峰計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，測得色譜柱的理論板數(shù)為1.1X101;在供試品溶液的色譜圖中，黃甚甲苷峰與其相鄰的色譜峰均可以完全分離；計(jì)算得黃芪甲苷峰的拖尾因子為0.92，峰形基本對稱。此外，發(fā)明人還進(jìn)行了專屬性、線性范圍、日內(nèi)精密度、日間精密度、回收率、重復(fù)性、耐用性等方法學(xué)考察研究。結(jié)果證實(shí)上述測定方法的專屬性良好(陰性無干擾)黃芪甲苷峰面積的對數(shù)值與進(jìn)樣量的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系；日內(nèi)精密度及日間精密度良好;平均回收率為99.2呢，其RSD值為3.9%;對同一批次黃芪顆粒(批號070701)6份樣品測得的平均含量為0.724mg/g，其RSD為值1.80/0，重復(fù)性良好；在Kromasil100-5U柱(150X4.6腿，5Wn)、Luna5PCIS(2)100A柱(150X4.6mm)、ReliasilU柱(150X4.6腿，5rtn)三禾中色譜柱上黃芪甲苷都可與相鄰峰分離，且保留時(shí)間相近，方法耐用性好。實(shí)施例7本實(shí)施例為黃芪顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中總皂苷含量測定方法的研究-黃芪含有多種皂苷類成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，留體皂苷類成分在高氯酸溶液中，與香草醛反應(yīng)呈現(xiàn)紫色，可用于含量測定。本發(fā)明參考文獻(xiàn)的方法，建立了比色法(紫外-可見分光光度法)測定本品中總皂苷的含量。1、溶液的制備對照品溶液的制備取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml含約0.5mg的溶液，即得。供試品溶液的制備按照本發(fā)明"黃芪甲苷的含量測定方法"中供試品溶液的制備方法，取黃芪顆粒，研細(xì)，精密稱定5g，置具塞瓶中，加濃度甲醇75ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，用甲醇分次洗滌瓶、濾紙和濾渣，洗液并入濾液中，濾液置水浴上蒸干；殘?jiān)铀?0ml，使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次30ml，合并正丁醇液；用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，分別合并正丁醇液、氨試液，正丁醇液備用；將氨試液用30ml水飽和正丁醇反提1次，分離所得的正丁醇層并入上述備用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液稀釋至5倍，精密量取2ml，置10ml量瓶屮，加甲醇稀釋至刻度，即得。2、測定方法的建立(1)測定波長的選擇為確定測定波長，精密量取對照品溶液和供試品溶液各lml，置具塞試管中，在水浴上揮干溶劑，精密加入5y。香草醛冰醋酸溶液lml和高氯酸4ml，混勻，在6(TC水浴中加熱15分鐘，取出，立即用水冷卻，精密加入冰醋酸15ml，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，在400800nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果供試品溶液與對照品溶液在約530nm波長處均有最大吸收，故確定其測定波長為530nm。(2)加熱溫度的選擇取對照品溶液和供試品溶液(批號070701)，照前文(1)"測定波長的選擇"項(xiàng)下的方法試驗(yàn)，加熱溫度分別為40°C、50°C、60。C、7(TC和8(TC，測定總皂苷含量并加以比較，結(jié)果見下述表12。表12加熱溫度的考察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，在408(TC下加熱后測定，結(jié)果無明顯差異。但隨加熱溫度升高，吸收度值會明顯增加，以6(TC時(shí)含量測定結(jié)果相對穩(wěn)定，且溫度適中，故選擇6crc為加熱溫度。試驗(yàn)結(jié)果還表明，加熱溫度對溶液的吸光度值影響顯著，所以測定時(shí)應(yīng)注意供試品溶液和對照品溶液的加熱溫度應(yīng)完全一致，否則會影響測定的結(jié)果。(3)加熱時(shí)間的選擇取對照品溶液和供試品溶液(批號070601)，照前文(1)"測定波長的選擇"項(xiàng)下的方法試驗(yàn)，在6(TC水浴中分別加熱10min、15min、20min、30min和40min后，測定吸光度，計(jì)算總皂苷含量并加以比較，結(jié)果見下述表13。表13加熱時(shí)間的考察結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，加熱1540min，測定結(jié)果無明顯差異且測定值穩(wěn)定，故選擇加熱時(shí)間為1540min。綜合上述試驗(yàn)研究，確定了如本發(fā)明所述的測定方法，艮口①對照品溶液的制備取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml含0.40.6mg的溶液，即得；②供試品溶液的制備按照本發(fā)明"黃芪甲苷的含量測定方法"中供試品溶液的制備方法，制得用微孔濾膜濾過的續(xù)濾液后，精密量取并稀釋至5倍，搖勻，即得。③測定法精密量取對照品溶液和供試品溶液各lml，置具塞試管屮，在水浴上揮干溶劑，精密加入5。/Q香草醛冰醋酸溶液lml和高氯酸4ml，混勻，在6CTC水浴中加熱154'0分鐘，取出，立即用水冷卻，精密加入冰醋酸15ml，搖勻，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2005年版一部附錄VA)，在530皿波長處測定吸光度，計(jì)算，即得。實(shí)施例9本實(shí)施例為采用下述方法測定7批試制黃芪顆粒中黃芪甲苷含量(1)對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋成每lml含0.5mg的溶液，即得；(2)供試品溶液的制備取試制的各批次黃芪顆粒，分別研細(xì)，精密稱定約5g，各置具塞錐形瓶中，加甲醇IOOml，超聲處理30分鐘，適時(shí)振搖，放冷，濾過，用甲醇分次洗滌錐形瓶、濾紙和濾渣，洗液并入濾液中，濾液置水浴上蒸干；殘?jiān)铀?0ml，微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次30ml，合并正丁醇液；用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，分別合并正丁醇液、氨試液，正丁醇液備用；將氨試液用30ml水飽和正丁醇反提1次，分離所得的正丁醇層并入上述備用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45tim)濾過，取續(xù)濾液，即得；(3)色譜條件色譜柱以十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水(休積比32:68)為流動相，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度40°C，載氣壓力3.5bar，流速1.Oml/min;(4)測定法精密吸取對照品溶液514，IOW，供試品溶液IOW，分別注入高效液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，得黃芪顆粒中黃芪甲苷的含量。其中，該7批試制黃芪顆粒為采用不同批次黃芪藥材、采用下述方法制得:取黃芪藥材1000g，加水煎煮提取2次，每次煎煮2小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.201.30(708CTC)的黃芪清膏；在清膏中加入蔗糖，制得1000g顆粒，混勻后制粒，干燥，分裝成15g/袋，滅菌，即得。批號分別為070601、070701、070702、070703、070704、070801、070802。黃芪甲苷含量測定結(jié)果見下述表14。表14試制樣品中黃芪甲苷的含量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例10本實(shí)施例為采用下述方法測定7批試制黃芪顆粒(即實(shí)施例9中的7批黃芪顆粒)中總皂苷含量(1)對照品溶液的制備取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml含0.5mg的溶液，即得；(2)供試品溶液的制備精密量取實(shí)施例9中制得的供試品溶液各2ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；(3)測定法精密量取對照品溶液與供試品溶液各lml，分別置具塞試管中，置水浴上揮干，精密加入5y。香草醛冰醋酸溶液lml和高氯酸4ml，混勻，置6CrC水浴中加熱15分鐘，立即用水冷卻，精密加入冰醋酸15ml，混勻，采用紫外-可見分光光度法，在530nm波長處測定吸光度，計(jì)算，即得黃貧顆粒中總皂苷的含量。測定結(jié)果見下述表15。表15總皂苷含量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實(shí)施例11本實(shí)施例為黃芪顆粒傳統(tǒng)制備方法和本發(fā)明制備方法中對黃芪藥材兩種提取工藝得到的黃芪提取物的部分藥效學(xué)對比試驗(yàn)研究。試驗(yàn)藥物包括兩種一種是用本發(fā)明工藝所制備的提取物A(按照實(shí)施例1的方法制得的相對密度約1.30(70°C)的黃芪清膏)，一種是以傳統(tǒng)工藝(按照傳統(tǒng)方法制得的相對密度為1.30(7(TC)的黃芪清膏)所制備的提取物B;主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)從非特異性免疫功能、特異性免疫功能、補(bǔ)氣健脾三個(gè)方面進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與研究，對工藝改進(jìn)前后兩種制劑的黃芪提取物進(jìn)行主要的藥效學(xué)試驗(yàn)與對比研究，為其臨床應(yīng)用和工藝改進(jìn)提供藥理學(xué)依據(jù)。1、藥物配置精確量取A、B提取液各三份，分別為25ml、12.5ml、6.25ml，分別用蒸餾水定容至100ml混勻，配置為黃芪提取物A、B的高、中、低劑量組藥液，根據(jù)給藥劑量，小鼠以0.2ml/10g的給藥容量灌胃給藥。各受試藥物按劑量設(shè)計(jì)表(見下述表16)配成水溶液。A藥、B藥均為棕褐色澄清的液體，各藥物組顏色深淺不同。其中A藥和B藥的高、中劑量組藥液在冰箱久置會有少許沉淀物生成。以上各組藥物4。C冷藏，灌胃給藥前溫水浴預(yù)熱，并且充分搖勻后給藥。表16黃芪提取物小鼠藥效試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)表組別組別說明動物日用量約相當(dāng)于臨床倍數(shù)——蒸餾水——蒸餾水37.5mg/kg1015ml/kg104g/kg1010g藥材/kg205g藥材/kg102.5g藥材/kg510g藥材/kg205g藥材/kg102.5g藥材/kg_§_鹽酸左旋咪唑片、復(fù)方阿膠漿和歸脾丸(濃縮丸)，分別為重慶市青陽藥業(yè)空白組空白對照組模型組模型對照組西陽組左旋咪唑組^M。表17中為復(fù)方阿膠漿組中陽組表i9中歸脾丸組A高組A藥高劑量組A中組A藥中劑量組A低組A藥低劑量組B高組B藥高劑量組B中組B藥中劑量組B低組B藥低劑量組有限公司、山東東阿阿膠股份有限公司和河南宛西制藥股份有限公司產(chǎn)品。2、試驗(yàn)動物昆明種小鼠，普通級，18-26g，雌雄各半；由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，合格證號均為SCXK(川)2004-15。部分試驗(yàn)小鼠由成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動物中心提供，合格證號SCXK(川)2004-11。3、實(shí)驗(yàn)方法3.1非特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)(小鼠外周血象的影響)取健康、體重為22土2g的小鼠104只，雌雄各半，按體重分層，隨機(jī)分為10組，即空白組(12只)、模型組(12只)、西陽組(10只)、中陽組(10只)，A藥高劑量組(10只)、A藥中劑量組(10只)、A藥低劑量組(10只)、B藥高劑量組(10只)、B藥中劑量組(10只)、B藥低劑量組(10只)，各受試藥物組小鼠均按表16設(shè)計(jì)的劑量以20ml/kg的給藥容量灌胃給藥，空白組和模型組給予等容量的蒸餾水，預(yù)給藥3天。各組小鼠于開始給藥的第4天給藥后1小時(shí)后，每鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺]00mg/kg進(jìn)行免疫抑制造模。造模后繼續(xù)灌胃給藥3日，末次給藥后1小時(shí)后各鼠摘取眼球取血，進(jìn)行血細(xì)胞分析。分析結(jié)果見下述表17。表17對環(huán)磷酰胺致免疫:抑帝l」l小鼠外周血ll的影響(+1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注與模型組比較，*尸<%A5",林/Yft(9/，*林尸、.W/.表17結(jié)果表明模型組小鼠的WBC、RBC、HGB、PLT、HCT均低于空白組其中WBC明顯低于空白組(P<0.001)，表明造模成功。WBC(白細(xì)胞總數(shù))各給藥組藥物都有升高WBC的趨勢，其中A藥物高劑量、中劑量，B藥物高劑量、中劑量、低劑量均有明顯的升高WBC的作用(P<0.05或P〈0.01或P〈0.001)。RBC(紅細(xì)胞總數(shù))各給藥組藥物都有升高RBC的趨勢，其中A藥物中劑量有明顯的升高RBC的作用(P<0.05)。HGB(血紅蛋白)A藥物高、中、低劑量都有升高HGB的趨勢(P〉0.05)。HCT(紅細(xì)胞壓積)A藥物中劑量能明顯升高HCT(P<0.05)。PLT(血小板總數(shù))各給藥組藥物都有升高PLT的趨勢，其中B藥物高劑量有明顯的升高PLT的作用(P<0.05)。以上各指標(biāo)A、B藥物相同劑量間比較無明顯差異(P〉0.05)。3.2特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)(對二硝基氯苯(DNCB)致小鼠遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)的影響)取健康、體重為22士2g的小鼠90只，雌雄各半，按體重分層，隨機(jī)分為9組，即空白組、模型組、西陽組、A藥高劑量組、A藥中劑量組、A藥低劑量組、B藥高劑量組、B藥中劑量組、B藥低劑量組，每組10只，各受試藥物組小鼠均按表16設(shè)計(jì)的劑量以20ml/kg的給藥容量灌胃給藥，空白組和模型組給予等容量的蒸餾水，預(yù)給藥3天。各組小鼠于開始給藥的第3天給藥后1小時(shí)后，每鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg進(jìn)行免疫低F模型的造模。第4天給藥后1小時(shí)以8%硫化鈉溶液脫毛劑在小鼠腹部脫毛，脫毛范圍3X3cm2，將5。/。DNCB(二硝基氯苯，用丙酮溶解配制)在脫毛處致敏，每鼠10ul，涂勻。各組小鼠繼續(xù)給藥致敏后第6天用2.5%DNCB，10u1均勻涂抹于小鼠的左耳兩面進(jìn)行攻擊，24小時(shí)后頸椎脫臼處死小鼠，立即剪下左右兩耳郭，用打孔器在兩耳相同部位取下直徑5mm的耳片稱重，以左右耳片重量之差值(mg)做為小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的指標(biāo)。結(jié)果見下述表18。表18藥物對小鼠DNCB遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)的影響(I±s)組別動物數(shù)(只)左右耳片重量之差(g)空白組100.0069±0.0021*模型組100.0048±0.0016西陽組100.0053±0.0021A高組100.0062士0.0016A中組100.0063±0.0021A低組100.0054±。.0024B高組100.0053±0.0027B中組100.()064±0.0026B低組100.0059±0.0019注與模型組比較，*/Vft銜。/，表18結(jié)果表明模型組小鼠的左右耳片重量之差值低于空白組(P〈0.05)，表明造模成功。A、B藥物均有一定的增強(qiáng)免疫低下小鼠細(xì)胞免疫功能的趨勢，尤其是A藥物中劑量組和B藥物中劑量組均有一定的增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的趨勢(P>0.05)。A、B藥物相同劑量間比較無明顯差異(P〉0.05)。3.3藥物對小鼠脾虛模型的影響取小鼠110只，體重18-22g，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、模型組、中陽組、A藥高劑量組、A藥中劑量組、A藥低劑量組、B藥高劑量組、B藥中劑量組、B藥低劑量組共九組，每組12-14只。除空白組外，各組小鼠每日每只灌服100%大黃水浸液0.8ml，模型組給予等量的蒸餾水，連續(xù)8日，體征變化表現(xiàn)為小鼠出現(xiàn)便溏、泄瀉、納呆、食欲減退、活動減少、行動遲緩、微寒肢冷(雜堆起暖)、毛散無華、脫肛(部分)等脾虛癥狀，且個(gè)別小鼠出現(xiàn)死亡。表明造模成功。觀察并記錄造模成功前的小鼠的體重。并于造模成功后，即第9天起，分別按設(shè)計(jì)劑量灌胃給予藥物或蒸餾水進(jìn)行治療，連續(xù)8日，給藥期間除空白組外其余各組繼續(xù)灌胃給予100%大黃水浸液0.4ml(即早上9點(diǎn)鐘灌胃給藥，晚上9點(diǎn)鐘灌胃給予100。/。大黃水浸液每只0.4ml)觀察，然后于第8曰晚禁食20小時(shí)，次日灌胃給藥一次，給藥后30min，每只小鼠灌服10%活性炭生理鹽水溶液，20分鐘后脫頸椎處死小鼠，打開腹腔，分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉直，以直尺測量腸管的長度為"小腸總長度"，從幽門至炭末前沿的距離為"炭末在腸內(nèi)的推進(jìn)距離"，計(jì)算炭末推進(jìn)百分率，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，比較各組差異。結(jié)果見下述表19。灌胃給予大黃水煎液8天，小鼠出現(xiàn)便溏、泄瀉、納呆、食欲減退、活動減少、行動遲緩、微寒肢冷(雜堆起暖)、毛散無華、脫肛(部分)等脾虛癥狀，表明造模成功。表19藥牽<table>complextableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>注丄J模，iR比較，版林尸《ftW，承林/VflW/;A、B藥物相同劑量間比較，ft/Vft版表19結(jié)果表明模型組小鼠炭末推進(jìn)率明顯低于空白組(P<0.001)，表明造模成功。A藥高劑量、A藥中劑量、B藥高劑量能明顯促進(jìn)脾虛小鼠的腸推進(jìn)功能(P〈0.01或P〈0.001)。A、B藥相同劑量間比較A藥中劑量較B藥中劑量有明顯的促進(jìn)脾虛小鼠腸推進(jìn)的功能(P<0.05)。本發(fā)明中所使用的各種溶液，當(dāng)其純度不為100%時(shí)，在未作特別說明時(shí)，均是指水溶液；液體與液體混合形成的溶液中其比例均為體積比，固體與液體形成的溶液巾其比例均為重量體積比。權(quán)利要求1.一種黃芪顆粒，按照包括下述主要步驟的方法制備而得(1)制取黃芪清膏取黃芪藥材，加水煎煮提取2次，每次煎煮1.5～2.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至70～80℃溫度下相對密度為1.20～1.30的黃芪清膏；(2)制備黃芪顆粒在上述黃芪清膏中加入蔗糖和/或其他制備顆粒劑的糖類輔料，其加入量以1000g黃芪原生藥材制得1000g顆粒計(jì)算，混勻后制粒，干燥，分裝，滅菌，即制得所述的黃芪顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃芪顆粒，其特征在于所述的歩驟(l)"制取黃芪清膏"過程中，采用下述減壓濃縮方法對濾過后的濾液進(jìn)行濃縮壓力-0.06mpa-0.09即a、溫度5565t:。3.—種權(quán)利要求1所述的黃芪顆粒的質(zhì)量控制方法，其特征在于以黃芪甲苷和/或總皂苷的含量測定作為質(zhì)量控制的評價(jià)指標(biāo)，其中所述的黃芪顆粒中，黃芪甲苷含量為0.21.0mg/g;總皂苷含量以黃芪甲苷計(jì)為0.64.4mg/g。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃芪顆粒的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述的黃芪甲苷的含量測定采用包括下述主要步驟的高效液相色譜法(1)對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋成每lml含0.450.55mg的溶液，即得；(2)供試品溶液的制備取黃芪顆粒，研細(xì)，精密稱定4.55.5g，取置具塞瓶中，加濃度》90%的甲醇溶液或甲醇75250ml，超聲處理3040分鐘，放冷，濾過，用相同溶劑分次洗滌瓶、濾紙和濾渣，洗液并入濾液中，濾液置水浴上蒸干；殘?jiān)铀?015ml，使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取45次，每次3040ml，合并正丁醇液；用氨試液充分洗滌23次，每次4050ml，分別合并正丁醇液、氨試液，正丁醇液備用；將氨試液用3050ml水飽和正丁醇反提至少l次，分離所得的正丁醇層并入上述備用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至1020ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得；(3)色譜條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為32:68的乙腈-水為流動相，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度4CTC，載氣壓力3.5bar，流速:1.0ml/min;(4)測定法精密吸取對照品溶液5W,1014，供試品溶液IOW，分別注入高效液相色譜儀，測定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，得黃芪顆粒中黃芪甲苷的含量。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃芪顆粒的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述的總皂苷的含量測定采用包括下述主要?dú)i驟的紫外-可見分光光度法(1)對照品溶液的制備取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml含0.40.6mg的溶液，即得；(2)供試品溶液的制備取黃芪顆粒，研細(xì)，精密稱定4.55.5g，取置具塞瓶屮，加濃度》90%的甲醇溶液或甲醇75250ml，超聲處理3040分鐘，放冷，濾過，用相同溶劑分次洗滌瓶、濾紙和濾渣，洗液并入濾液中，濾液置水浴上蒸干；殘?jiān)铀?015ml，使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取45次，每次3040ml，合并正丁醇液；用氨試液充分洗滌23次，每次4050ml，分別合并正丁醇液、氨試液，正丁醇液備用；將氨試液用3050ml水飽和正丁醇反提至少l次，分離所得的正丁醇層并入上述備用的正丁醇液中；置水浴上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至1020ml的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液，置量瓶中，加甲醇稀釋至5倍，搖勻，即得；(3)測定法精密量取對照品溶液與供試品溶液各lml，分別置具塞試管中，置水浴上揮干，精密加入5。/。香草醛冰醋酸溶液lml和高氯酸4ml，混勻，置6(TC水浴中加熱1540分鐘，立即用水冷卻，精密加入冰醋酸15ral，混勻，采用紫外-可見分光光度法，在530nm波長處測定吸光度，計(jì)算，即得黃芪顆全文摘要本發(fā)明公開了一種黃芪顆粒，按照下述方法制得取黃芪藥材，加水煎煮提取2次，每次煎煮1.5～2.5小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.30(70～80℃)的清膏；加入輔料，混勻后制粒，干燥，分裝，滅菌，即得。該黃芪顆粒采用新的方法制得，減少了醇沉步驟，改變了煎煮時(shí)間，更有利于有效成分的溶出和保留，使黃芪藥材中含有的黃芪多糖及總皂苷等有效成分盡量保留在制劑黃芪顆粒中，大大提高了其有效成分的含量，從而提高所得黃芪顆粒的臨床有效性；同時(shí)可使生產(chǎn)周期明顯縮短，并減少能耗，成本降低。本發(fā)明還提供了一種上述黃芪顆粒的質(zhì)量控制方法。文檔編號A61P17/02GK101342230SQ20081004591公開日2009年1月14日申請日期2008年8月28日優(yōu)先權(quán)日2008年8月28日發(fā)明者曾大富申請人:四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司