專利名稱：：麥冬多糖mdg-1在制備治療糖尿病的藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及麥冬多糖MDG-1新的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：養(yǎng)陰類中藥具有生津潤燥、滋陰養(yǎng)液等功效，以治療陰虛證為主，它們的毒性一般較小，作用比較溫和，以滋補作用為主，對提高人體免疫力，防病治病具有重要的意義。隨著人們對多糖藥理作用的認識，多糖的研究也愈來愈受到重視，具有養(yǎng)陰作用的中藥常含有大量的多糖，它們的生理活性作用分別體現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、降血糖、降血脂作用、抗氧化、抗衰老、保肝作用、抗病毒作用、抗疲勞、耐缺氧、抗纖維化、抗?jié)冏饔玫雀鞣矫妗Ｖ袊鴮＠鸆N1445244A于2003年10月1日公開的麥冬多糖MDG-1是分子量為5000的P-D-果聚糖，以2—1連接的呋喃型果糖為主，平均每2.8個主鏈基上有一個/^//(2—6),2T//(2—分支，且該多糖的還原端可能與a-D-Glc相連。麥冬多糖MDG-1抗心肌缺血作用顯著，是一種具有藥用價值的活性多糖。麥冬多糖MDG-1可以使缺血再灌的心臟收縮幅度和冠脈流量較快地恢復，并可抑制心率加快，還可降低缺血后血漿中乳酸脫氫酶的釋放。說明麥冬多糖MDG-1對缺血再灌的心肌細胞具有保護作用。(鄭琴、馮怡、徐德生等麥冬多糖MDG-l對鼠實驗性心肌缺血的保護作用，中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27(12):1116)。文獻中尚未見麥冬多糖MDG-1治療糖尿病及作用機理的報道
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于開發(fā)麥冬多糖MDG-1的新用途，提供麥冬多糖MDG-1在制備治療糖尿病藥物中應用。本發(fā)明中的麥冬多糖MDG-1是從麥冬總多糖中分離獲得的。中國專利CN1445244A于2003年10月1日公開了麥冬多糖MDG-1的制備方法。本發(fā)明通過動物實驗發(fā)現(xiàn)麥冬多糖MDG-1對于高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射造成的實驗性糖尿病大鼠模型(DM大鼠)，經(jīng)口服給藥9周后，MDG-l組(37mg/kg)飲食、飲水及尿量與模型組相比明顯減少，同時在實驗終末期，MDG-1組血糖與模型組相比明顯降低。綜合說明，MDG-1組能夠改善匿大鼠的多食、多飲及多尿癥狀，具有一定的降血糖作用。本發(fā)明通過血管生成抗體芯片實驗發(fā)現(xiàn)麥冬多糖MDG-1能使FGF-p，F(xiàn)GF-a上調(diào)，這些結(jié)果說明MDG-1可能是通過S1P/Akt/ERK信號通路，穩(wěn)定細胞膜，促進新生血管的生成，從而改善缺血心肌的血液和能量供給，達到治療心肌缺血的作用；在實驗中還發(fā)現(xiàn)麥冬多糖MDG-1能使L印tin，TNFa下調(diào)，而L印tin，TNFot同糖尿病發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)，提示了麥冬多糖MDG-1可能通過抑制L印tin和TNFa通路，起到治療糖尿病的作用。本發(fā)明中，麥冬多糖MDG-1最好以片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或其他適合于口服的固體或液體藥物的形式存在于一個攝入單位中，而每個攝入單位麥冬多糖MDG-1的含量最好為0.03—0.3g，且每個攝入單位中麥冬多糖MDG-1的重量百分比最好為6-60%，余量為藥用輔料或附加劑。圖1是麥冬多糖MDG-150mg/ml組血管生成抗體芯片實驗結(jié)果。圖2是麥冬多糖MDG-1lmg/ml組血管生成抗體芯片實驗結(jié)果。具體實施例方式有關(guān)本發(fā)明前述及其它技術(shù)內(nèi)容、特點與功效，在以下較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現(xiàn)。實施例l(麥冬多糖MDG-1降血糖實驗研究)1、糖尿病大鼠模型的建立清潔級$SD大鼠60只，體重(90士10)g，隨機進行分組，其中10只作為正常對照組，給予普通標準飼料喂養(yǎng)，其余50只予高糖高脂飲食，5周后將高脂高糖詞料喂飼的動物，給予腹腔注射P/。STZ(40mg/kg)造模，正常對照組給予等容量溶媒，72小時后，空腹血糖>16.7腿01/1，尿糖在+++以上作為糖尿病造模成功大鼠，將DM大鼠根據(jù)血糖及尿糖隨機分為4組，分別為模型組(N=10)，MDG低劑量(37mg/kg)治療組(N二9)，MDG高劑量(75mg/kg)治療組(N=10)，二甲雙胍組(N二10，20mg/kg)。各組按上述藥物劑量灌胃，正常對照組給予以等量的生理鹽水，匿大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)高脂高糖飼料，空白組飼養(yǎng)個普通詞料，治療9周。2、觀測指標治療后的第3周、第6周、第9周代謝籠收集24h尿液，同時檢測24小時飲食、飲水、尿量、尿糖。體重每周測一次。給藥9周后，禁食12h，次日以25y。烏拉坦麻醉大鼠，腹主動脈收集血標本，測空腹血清血糖、糖化血紅蛋白(均為常規(guī)生化方法)。3、指標測定血糖測定禁食8小時后，尾靜脈取血，用葡萄糖氧化酶法測定，用血糖飲食、飲水、尿量的測定采用代謝籠，分別于第3周、第6周、第9周測定大鼠的飲食、飲水和收集24h尿液，觀察其變化。每周稱量大鼠的體重，觀察其變化。用藥9周后，禁食8小時后麻醉，腹主動脈取血，用生化分析儀測定血糖，用羅氏ModularP800全自動生化分析儀測定糖化血紅蛋白。4、統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)用x士s表示，用SPSS13.O統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，采用單因素方差分析。5、實驗結(jié)果5.l.造模情況50只高脂高糖飼料喂養(yǎng)的大鼠詞養(yǎng)5周后，然后按照40mg/kg的劑量腹腔注射l。/。的STZ后，血糖〉16.7，尿糖+++或以上納入DM造模成功大鼠,共有39只，按照血糖、尿糖及體重隨機進行分組，包括模型組(n=10)、MDG-l低劑量組(37mg/kg，n=9)、MDG-1高劑量組(75mg/kg，n=10)、二甲雙胍組(n=10)。各濕組血糖與正常對照組比較有顯著性差異(p〈0.01)。見表l。表1.注射1%STZ后各組血糖的變化正常對照組模型組MDG低劑量組MDG高劑量組二甲雙胍血糖4.2±0.218.9±2.3"20.0±3.1"19.8±2.9"19.3±3.1"AP<0.05，"P〈0.01vscontrolgroup5.2.各組大鼠治療期間飲食變化在給藥后的第3周、第6周、第9周，與正常對照組相比，各DM組飲食有顯著增加(P〈0.01);與模型組相比，MDG-1低劑量組飲食在給藥后的6周、9周均有顯著降低(P〈0.05)，而MDG-1高劑量組差異無統(tǒng)計學意義(p〉0.05)。_表2,造模后各組飲食的變化(單位g/24小時)_空白組模型組MDG低劑量組MDG高劑量組二甲雙胍組3周30.6±0.539.3±3.7**39.5±2.041.7±5.439.4±6.56周25.5±1.643.7±i.3甜38.1±0.5"42.1±3.141.9±4.9"9周26.8±0.445.6±1.0**37.8±2.9"41.1±6.237.1±4,8"P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;"<0.05，"P<0.01vsmodelgro卯5.3.各組大鼠治療期間飲水變化在治療后的第3周、第6周、第9周，與正常對照組相比，各DM組飲水顯著增加(P〈0.01);與模型組相比，各治療組組飲水顯著降低(P<0.05)。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P<0.05,P<0.01vscontrolgroup;AP<0.05,"P〈0.01vsmodelgroup5.4.各組大鼠治療期間尿量的變化在治療后的第3周、第6周、第9周，與正常對照組相比，各DM組飲食明顯增加，有顯著性差異(P〈0.01)，見表2。與模型組尿量相比，MDG-1低劑量組明顯減少，有顯著差異(P<0.05)，而MDG-l高劑量組6、9周尿量差異無顯著意義(p〉0.05)。_表4.造模后各組尿量的變化(單位ml)_空白組模型組MG低劑量組MG高劑量組二甲雙胍組3周21.3±7.433.2±14.5#6周14.5±4.640.7±20.489周16.4±5.137.2±6.0##將》P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;*P<0.05,"P<0.01vsmodelgroup15.2±6.4**20.8±9.6*24.7±12.125.8±10.0A38.5±14.49.8±3.6A17.3±6.5A36.2±1.712.4±5.5.5.各組大鼠給體重的變化造模后，DM組開始給藥，正常對照組給予同等量的生理鹽水，在整個給藥期間與空白對照組相比，各DM組體重出現(xiàn)明顯的減少見表2。與模型組相比，各治療組體重無明顯變化(p〉0.05)。表5.造模后各組體重在不同時間段的情況(g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P<0.05,P<0.01vscontrolgroup;<0.05，"P<0.01vsmodelgroup5.6.給藥9周大鼠血糖及糖化血紅蛋白影響與正常對照組比較，模型組血糖、糖化血紅蛋白顯著升高(P〈0.01);與模型組相比，MDG-l低劑量血糖顯著降低(P<0.05)糖化血紅蛋白有所下降，但無統(tǒng)計學差異(p>0.05)結(jié)果見表6。表6.實驗終末期各組血糖、糖化血紅蛋白的變化(單位mniol/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P<0.05，P<0.01vscontrolgroup;*P<0.05，"P<0.01vsmodelgroup6、實驗結(jié)論高脂高糖飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射是實驗性糖尿病大鼠常用造模方法。通過高熱量飼料喂養(yǎng)，在此基礎(chǔ)上給予一定劑量STZ破壞部分胰島e細胞，引起大鼠高血糖狀態(tài)。在此次實驗中，先給予SD大鼠5周的高脂高糖飼料喂養(yǎng)，然后腹腔注射40mg/kg的1%STZ,與正常對照組相比，各DM組大鼠血糖、尿糖明顯升高(P〈0.0D，同時表現(xiàn)出明顯的"三多一少"癥狀，飲食、飲水、尿量明顯增多，體重減輕。經(jīng)給藥9周后，MDG-1低劑量組(37mg/kg)飲食、飲水及尿量與模型組相比明顯減少，同時在實驗終末期，MD-1G低劑量組(37mg/kg)血糖與模型組相比明顯降低。綜合說明，MDG-1低劑量組能夠改善DM大鼠的多食、多飲及多尿癥狀，具有一定的降血糖作用。實施例2(麥冬多糖MDG-1對血管生成抗體芯片實驗的影響)1、細胞培養(yǎng)和加藥取對數(shù)生長期HMEC-1細胞，放置于6孔板中，放置37"C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞數(shù)達到106個時，換無血清MCDB131培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，然后加入用無血清MCDB131培養(yǎng)液配制的麥冬多糖MDG-1培養(yǎng)液。共兩組，其中一組加藥組(lmg/ml或50mg/ml)，另一組為空白對照組。加藥后分別于18h時提取蛋白。2、蛋白樣品制備每瓶細胞加lml4。C預冷的PBS。平放輕輕搖動洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。100jil裂解液加0.5filPMSF(100mM)禾卩l(xiāng)pl抑制劑，搖勻置于冰上。每瓶細胞加IOOW裂解液，于冰上裂解30min后，4°C下14000rpm離心15min。3、蛋白含量的測定取樣品1.5ml至離心管中，每管加入4"C儲存的工作液lml?？瞻讓φ战M加入20pl水，樣品組加入5W樣品和15W水。采用分光光度法，以空白對照組為空白對照，測定595nm下樣品組吸光度。測定數(shù)值用y-0.7174x+0.0954計算，所得y值乘4即為蛋白濃度。4、免疫反應將AngiogenesisAntibodyArray膜放入8孑L板中，力口入3ml1XBlockingBuffer,確保膜蛋白面向上，室溫孵化lh。移去1XBlockingBuffer,用4mlIXWashBufferII洗膜兩次，棄去多余液體。力口500nl樣品于膜的蛋白面，室溫孵化l2h。傾去樣品液，用4mllXWashBufferI在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用4ml1XWashBufferII在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。取出膜，用濾紙吸去殘留液，裝入新孔中，將Biotin-ConjugatedAnti-AngiogenesisMix用lXWashBufferII稀釋至適當濃度加入孔中。室溫下孵育2h后，用4mllXWashBufferI在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用4mlIXWashBufferII在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。同上方法準備lXStr印avidin-HRPConjugate稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育lh后，用4ml1XWashBufferI在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用4mllXWashBufferII在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。5、化學發(fā)光，顯影，定影將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合后加在膜的蛋白面上，使其與混合液充分接觸；5min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。在暗室中，將lx顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X—光片，用切紙刀剪裁適當大??；打開X-光片夾，把X—光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間，以達最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。6、凝膠圖象分析將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。7、實驗結(jié)果麥冬多糖MDG-150mg/ml組見圖1。麥冬多糖MDG-1lmg/ml組見圖2?？贵w芯片位點數(shù)據(jù)見圖3。結(jié)果分析見表2.1。如圖2所示，lmg/ml麥冬多糖MDG-1能使FGF-(3上調(diào)，使Leptin，TNFa，HGF下調(diào)。如圖1所示，50mg/ml麥冬多糖MDG-l能使IFNy，IL-12,FGF-P上調(diào)，使Leptin，TNFoc，HGF下調(diào)。表2.1抗體芯片位點數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>8、實驗結(jié)論血管生成抗體芯片實驗結(jié)果表明MDG-1能使Leptin，TNFa下調(diào)，由于Leptin，TNFa同糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)成發(fā)展過程密切相關(guān)，所以麥冬多糖MDG-1抑制Leptin和TNFa的作用有利于治療糖尿病以及減少糖尿病并發(fā)癥，其治療糖尿病的作用可能同抑制Leptin和TNFa通路相關(guān)。實施例3(麥冬多糖MDG-1片的制備)麥冬多糖MDG-110克；輔料HPMC、十八烷醇、硬脂酸鎂，共40克；制備將主藥及HPMC、十八垸醇充分混合均勻，過IOO目篩，加粘合劑制成軟材，過16目篩制粒，4(TC干燥，整粒。加硬脂酸鎂作潤滑劑，混合后壓片，共制100片，每片0.5克，即可。本實施例制得的麥冬多糖MDG-1片，每片為一個攝入單位，每個攝入單位中含麥冬多糖MDG-10.1克，重量百分含量為20%。實施例4(麥冬多糖MDG-1膠囊的制備)取麥冬多糖MDG-115克；輔料淀粉、糊精、碳酸鈣等共45克；制備:將主藥及輔料充分混合均勻，裝膠囊，共制100粒，每粒0.5克，即可。本實施例制得的麥冬多糖MDG-1膠囊，每1粒為一個攝入單位，每個攝入單位中含麥冬多糖MDG-10.15克，重量百分含量為30%。實施例5(麥冬多糖MDG-1顆粒劑的制備)麥冬多糖MDG-1IO克；輔料淀粉、糊精、糖粉等，共90克；將主藥及輔料充分混合均勻，用適當濃度的乙醇適量制軟材，制粒，干燥，整粒，分裝，每包2克，共制50包，即可。本實施例制得的麥冬多糖MDG-1顆粒，每包為一個攝入單位，每個攝入單位中含麥冬多糖MDG-10.2克，重量百分含量為10%。實施例6(麥冬多糖MDG-1口服液的制備)取麥冬多糖MDG-1500克，加適量水溶解，過濾，加入適量甜味劑及防腐劑溶解后，加水至1000ml，分裝，每瓶10ml，即可。本實施例制得的麥冬多糖MDG-1口服液，每瓶為一個攝入單位，每個攝入單位中含麥冬多糖MDG-15.0克，體積百分含量為50%。權(quán)利要求1、麥冬多糖MDG-1在制備治療糖尿病的藥物中的應用。2、權(quán)利要求l的用途，其特征是，麥冬多糖MDG-1以片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或其他適合于口服的固體或液體藥物的形式存在于一個攝入單位中。3、權(quán)利要求2的用途，其特征是，每個攝入單位含有麥冬多糖MDG-10.03—0.3g。4、權(quán)利要求2或3的用途，其特征是，每個攝入單位中麥冬多糖MDG-1的重量百分比為6-60%,余量為藥用輔料或附加劑。全文摘要本發(fā)明涉及麥冬多糖MDG-1在制備治療糖尿病的藥物中的應用。麥冬多糖MDG-1能夠改善DM大鼠的多食、多飲及多尿癥狀，且具有一定的降血糖作用，其作用機制可能涉及通過抑制Leptin和TNFα通路，起到治療糖尿病的作用。文檔編號A61P3/10GK101564399SQ200810043279公開日2009年10月28日申請日期2008年4月23日優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日發(fā)明者怡馮,徐德生,曉林,嵐沈申請人:上海中醫(yī)藥大學