專利名稱：：一類新型pi3k酶抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類新型PI3K酶抑制劑——5-(3-氨基苯)煙酸甲酯類似物的新用途，具體的說，涉及5-(3-氨基苯)煙酸甲酯類似物作為新型PI3K酶抑制劑及其在抑制PI3K酶活性過高導(dǎo)致的疾病治療中的應(yīng)用。技術(shù)背景癌癥、高血壓和血栓病都是人類目前最難克服的幾種頑癥，亦是世界醫(yī)學(xué)的幾大難題。癌癥是世界上奪走生命最多的疾病,每年死亡人數(shù)有七百萬左右。我國癌癥年新發(fā)病例為200萬，因癌癥死亡人數(shù)為140萬，每死亡5人中，即有l(wèi)人死于癌癥。癌癥已成為我國城市的第一殺手，農(nóng)村的第二大死因。高血壓是常見高發(fā)疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)到2025年全世界將有超過15億高血壓患者，其中四分之三的患者將來自發(fā)展中國家。高血壓會(huì)導(dǎo)致心血管、腦血管、腎血管以及大血管等病變。血栓病亦是困擾人們的常見疾病。因此針對(duì)上述幾種疾病的藥物開發(fā)與研制已成為近年來的重要課題。PI3Ks(磷酯酰肌醇3-激酶)抑制劑作為這幾種疾病治療的潛在價(jià)值引起了廣泛關(guān)注。PI3Ks主要包括PI3Ka、PI3Kp、PI3Ky和PI3KS四種形態(tài)。其主要功能包括1)激活PI3Ks/Akt通路控制下游的凋亡抑制蛋白來抑制細(xì)胞凋亡，從而誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性(CancerTreatmentReviews2004,30:193-204)。2)控制PI3Ks/Akt通路下游蛋白(GSK3，mTOR,Mdm2等)促進(jìn)細(xì)胞增殖(CancerTreatmentReviews2004,30:193-204)。3)磷酸化并激活鳥嘌呤交換因子(GEFs),如Vav,Tiaml,SOS，P-Rexl，活化的GEFs進(jìn)一步激活控制細(xì)胞游走的關(guān)鍵蛋白R(shí)ho-GTPases(J.CellBiol.2003,160:17-23;Cell2002,108:809-821)。4)控制細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，從而影響到細(xì)胞的生長與分裂(TRENDSinpharmacologicalSciences2003,24:366-376)。藥理研究(Science2000,287:1049-1053;Science2000,287:1046-1049;Science2000,287:1040-1046;FASEBJ.2001,15:2019-2021)表明，PI3Ky缺失老鼠對(duì)各種炎癥和血栓病表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗性，抑制PBKs酶活性有助于改善心血管的收縮性和治療高血壓??；反之，高活性的PI3Ks能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和抑制腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡。因此PI3Ks酶是一個(gè)重要的疾病治療耙標(biāo)，PI3Ks酶抑制劑成為多種疾病治療的潛在藥物。LY294002是目前已進(jìn)入臨床研究的PI3K酶抑制劑藥物，然而其活性太強(qiáng)，對(duì)正常細(xì)胞毒性大，尋求新型PI3Ks酶抑制劑也就成為當(dāng)前PI3Ks酶研究的熱點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一類新型PI3K酶抑制劑——5-(3-氨基苯)煙酸甲酯類似物，作為治療PI3K酶活性過高導(dǎo)致的疾病的潛在藥物，以滿足PI3Ks酶抑制劑藥物開發(fā)的需要。本發(fā)明公開的新型PI3K酶抑制劑，具有通式I、II、III的化合物或其藥學(xué)上可接受的其中一Ri為一NH2，一CH2NFb或一CONH2;—R2，一R3，一R4為一CH3或者一OCH3或者一OCH(CH3)2。優(yōu)化的化合物為3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。其中最優(yōu)化的化合物為3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽本發(fā)明所說的鹽沒有特殊限制，只有當(dāng)它們作治療用途時(shí)，是藥學(xué)上可接受的。本發(fā)明化合物含有堿性基團(tuán)可與酸成鹽。這類酸加成鹽的例子包括與無機(jī)酸，尤其是氫鹵酸(如氫溴酸、氫碘酸、氫氯酸)，硝酸、硫酸、磷酸、碳酸等形成的鹽；與低級(jí)垸基磺酸，如甲磺酸、三氟甲磺酸形成的鹽；與芳基磺酸，如苯磺酸或?qū)妆交撬嵝纬傻柠}；與有機(jī)酸，如乙酸、富馬酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、馬來酸、蘋果酸或琥珀酸形成的鹽；與氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸形成的鹽。本發(fā)明公開了式I、II、III所示PI3K酶抑制劑的用途，用于制備治療PI3K酶活性過高導(dǎo)致疾病的藥物。且該P(yáng)I3K酶抑制劑的細(xì)胞選擇性優(yōu)于LY294002。所述的PI3K酶活性過高導(dǎo)致的疾病包括炎癥、血栓、自身免疫性疾病、心血管疾病和腫瘤?。痪唧w包括急性胰腺炎，慢性腸道炎，支氣管哮喘；急性心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、瓣膜病、心房顫動(dòng)；糖尿病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，慢性甲狀腺炎；動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓；乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和淋巴瘤。本發(fā)明的PI3K酶抑制劑毒性低，活性高，預(yù)示具有較大的臨床應(yīng)用前景。圖1為WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)的七種目標(biāo)化合物對(duì)PI3Ks酶活性的影響。圖2為3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺與LY294002的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖3為4-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺與LY294002的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4為3-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯胺的細(xì)胞選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5為4-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺的細(xì)胞選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖6為3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺與ly294002的細(xì)胞選擇性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖中1號(hào)化合物為3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺。圖7為4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺與ly294002的細(xì)胞選擇性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖中2號(hào)化合物為4-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺。圖8為本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的通式。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明并不受限于下述實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。實(shí)施例13-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺步驟A:3-溴-2，4，6-三甲基吡啶的制備將稱取的2，4，6-三甲基吡啶滴加入到3.0ml三氟乙酸中(瓶中溶液顏色變深，放出大量的熱)，待溫度降下來之后，再加入濃硫酸(4.0ml)和N-溴代丁二酰亞胺(NBS，分4次加入)，室溫下攪拌36h，反應(yīng)需避光。事先配制2mol/L的NaOH溶液置于-20'C冰箱冷凍備用。待反應(yīng)結(jié)束，將NaOH溶液緩緩滴加入單口燒瓶(冰浴中進(jìn)行，配合冷凝裝置，磁力攪拌)，中和至pH為7。乙酸乙酯萃取，萃取液用Na2S04干燥后旋轉(zhuǎn)蒸干，得到淡黃色的液體，即產(chǎn)物3-溴-2，4，6-三甲基吡啶。Rf值(石油醚:乙酸乙酯-8:2)0.61，MS(EI):m/z199，m/z201[M]+，^-NMR(500MHz，CDC13):S2.33(s，3H),S2.42(s，3H),S2.62(s，3H),56.87(s，1H)。步驟B:2,4,6-三甲基-3-(3-硝基苯)吡啶的合成將稱取的2，4，6-三甲基-3-溴吡啶(O.Olmol，1.99g)和3-硝基苯硼酸(O.Olmol，1.66g)放入100ml三頸燒瓶中，加入甲醇6.5ml，甲苯37.5ml，磁力攪拌溶解。再加入Na2C032.125g，蒸餾水12.5ml，繼續(xù)攪拌，通N2氣20min。稱取Pd(PPh3)40.6g，加入三頸燒瓶，繼續(xù)通N2氣15min。油浴加熱，開始回流時(shí)計(jì)時(shí)，反應(yīng)24h。反應(yīng)完后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到一圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸發(fā)儀蒸去溶劑。蒸干后，用乙酸乙酯提取，超聲共振助溶解，放置一段時(shí)間使產(chǎn)物充分溶解到乙酸乙酯中。將固體雜質(zhì)抽濾出去，所得濾液點(diǎn)硅膠板，得到Rf值0.23(石油醚乙酸乙酯=3:1)。經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為乙酸乙酯-石油醚(1:6)收集有用的組分。旋轉(zhuǎn)蒸干，重結(jié)晶(乙酸乙酯石油醚=1:1)得到白色固體即產(chǎn)物2,4，6-三甲基-3-(3-硝基苯)吡啶，產(chǎn)率為71%，Mp117-119°C，MS(EI):m/z242，m/z242[M]+。步驟C:3-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯胺的合成將中間體化合物化合物2,4,6-三甲基-3-(3-硝基苯)吡啶(0.267g)與氯化亞錫U.745g)一同加入盛有適量異丙醇的圓底燒瓶中，加入濃HC13.5ml，油浴加熱，磁力攪拌，加熱至60。C時(shí)，開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5h。配制10。/。的NaOH溶液，置冰箱中備用。待反應(yīng)完之后，將NaOH溶液從冰箱中取出，把三頸燒瓶中的反應(yīng)液傾倒入其中，并調(diào)pH值至中性，發(fā)現(xiàn)有白色沉淀產(chǎn)生。抽濾，所得固狀濾餅用乙酸乙酯提取。再次抽濾，濾液中加無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸干，經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為乙酸乙酯-石油醚(1:1)，得到淡黃色的液體，即產(chǎn)物3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺，產(chǎn)率為38%。Rf(乙酸乙酯石油醚=2:1)0.3;MS(ESI):m/z213([M]+,100%);'H-NMR(500MHz，CDC13):2.02(s,3H),2.27(s，3H),2.52(s，3H),3.72(brs,J=2.48Hz，2H),6.46(s,J=1.75Hz,1H),6.52(d,J=7.51Hz,lH),6.68(d,J=10.28Hz,1H),6.89(s,lH)，7.21(m，J=15.48,1H)，純度為96.7%。實(shí)施例24-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺步驟A:4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]氰苯的合成具體方法同實(shí)施例1中步驟B，此反應(yīng)中的芳鹵為3-溴-2,4，6-三甲基吡啶(1.592g，8mmo1)，苯硼酸則為對(duì)腈基苯硼酸(U76g，8mmo1)。經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為乙酸乙酯-石油醚(h8)，乙酸乙酯-石油醚(h1)重結(jié)晶得到白色晶體，即目標(biāo)產(chǎn)物4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]氰苯，Rf(石油醚乙酸乙酯=4:1)0.61，產(chǎn)率為58.6%;MS(EI):m/z222([M]+,100%)。步驟B:4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺的合成將20ml叔丁醇置于單口圓底燒瓶中，加入稱取的中間體化合物4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]氰苯(0.5g)和NaOH(0.43g)，磁力攪拌，油浴加熱回流1.5h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸干，用飽和食鹽水洗滌3次，并將洗滌液用乙酸乙酯萃取。合并萃取得到的乙酸乙酯，旋轉(zhuǎn)蒸干，再經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為甲醇-石油醚(h10)，甲醇-石油醚(1:8)重結(jié)晶得到白色晶體即產(chǎn)物4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺，產(chǎn)率為63.5%，Rf(甲醇石油醚=5:1)0.18，Mp201-202。C。MS(ESI):m/z240詞+，100%);!H-NMR(500MHz，CDC13):51.98(s，3H)，52.05(s，2H)，S2.22(s，3H)，S2.52(s，3H)，S6.94(s，1H)，S7.24(d，m7Hz，2H)，S7.91(d，風(fēng)19Hz，2H);純度為99.0%。實(shí)施例34-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲酰胺步驟A:3-氯-6-異丙氧基噠嗪的制備在1L的三頸燒瓶中，于常溫下，將3，6-二氯噠嗪(O.lmol)溶解于500ml的異丙醇中，加入金屬鈉(O.lmol)，水浴加熱，控制溫度為60'C，攪拌2小時(shí)后，反應(yīng)液冷卻至室溫，抽濾，濾液減壓濃縮，水洗，抽濾，重結(jié)晶(乙醇)，得產(chǎn)物3-氯-6-異丙氧基噠嗪。Mp77-79°C;MS(EI):m/z174，m/zl76岡+。步驟B:4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]氰苯的合成具體方法同實(shí)施例l中步驟B，本反應(yīng)中的芳鹵為3-氯-6-異丙氧基噠嗪(1.392g，0.008mol)，苯硼酸則為對(duì)腈基苯硼酸(U76g,0.008mol)，經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為乙酸乙酯-石油醚(h12)，乙酸乙酯-石油醚(l:l)重結(jié)晶得到淺黃色晶體，即目標(biāo)產(chǎn)物4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]氰苯，產(chǎn)率為39.3%;Rf(石油醚:乙酸乙酯=8:1)0.21;Mp120~123°C;MS(EI):m/z239(網(wǎng)+,100%);^-NMR(500MHz，CDC13):1.48(d,6H)，5.66(m,J=24.7Hz,lH)，7.03(d,J=9.2Hz,1H)，7.80(m,J=15.9Hz,3H)，8.14(d,J=8.6Hz,2H);元素分析CwHi3N30實(shí)測值(理論值)/。/。為C70.29(70.47)，H5.44(5.02),N17.57(17.65)。步驟C:4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲酰胺的合成具體方法同實(shí)施例2中步驟B，反應(yīng)物為中間體化合物4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]氰苯(L912g，0.008mol)，經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為乙酸乙酯-石油醚(2:1)，乙酸乙酯重結(jié)晶得到白色晶體即產(chǎn)物4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲酰胺，產(chǎn)率為37.7%;Rf(乙酸乙酯石油醚=4:1)0.26;Mp233-234。C;MS(ESI):m/z257([M]+,100%);^-NMR(500MHz，CDC13):1.43(m,J=10.51Hz,6H)，5.54(m，J=24.61Hz,lH),7.17(d，J=9.26Hz,1H),8.01(d,J=8.58Hz,2H),8.10(d,J=10.20Hz,3H)，純度為98.6%實(shí)施例44-[2-(4,6-二甲氧基啼啶)]苯甲酰胺步驟A:4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]氰苯的合成具體方法同實(shí)施例1中步驟B，本反應(yīng)中的芳鹵為2-氯-4,6-二甲氧基嘧啶(1.396g，t).008mo1)，苯硼酸則為對(duì)腈基苯硼酸(1.176g，0.008mol)。經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為乙酸乙酯-石油醚(1:4)，乙酸乙酯-石油醚(1:2)重結(jié)晶得到白色晶體即中間產(chǎn)物4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]氰苯，產(chǎn)率為75.9%;Rf(石油醚乙酸乙酯6.5:3.5)0.878;Mpl56-157。C;MS(EI):m/z240([M-H]+,100%);^-NMR(500MHz，CDC13):4.05(s,6H),6.03(s,1H),7.75(d,戶8.5Hz,2H),8.56(d，盧8.6Hz,2H);元素分析C13HuN302實(shí)測值(理論值)/%為C64.76(64.73)，H4.29(4.56)，N17.61(17.43)。步驟B:4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺具體方法同實(shí)施例2中步驟B,反應(yīng)物為中間體化合物4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]氰苯(1.92g，0.008mol)，經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為乙酸乙酉旨-石油醚(2:1)，乙酸乙酯重結(jié)晶得到白色晶體即產(chǎn)物4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺，產(chǎn)率為54.3%;Rf(乙酸乙酯石油醚=4:1)0.36;Mpl93-195。C;MS(EI):m/z258([M-H]+,100%);'H-NMR(500MHz,CDC13):4.11(s,7H)，5.74(brs,1H)，6.06(s,1H),6.17(brs,1H),7.91(d,J=8.3Hz,2H),8.54(d,J=8.3Hz,2H);元素分析(:131113^03實(shí)測值(理論值)/%為C60.77(60.23)，H4.91(5.02)，N15.81實(shí)施例54-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺步驟A:4-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]氰苯的合成具體方法及數(shù)據(jù)同實(shí)施例2步驟A。步驟B:4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺的合成在三頸燒瓶中加入適量的THF，緩緩加入LiAlH40.76g(20mmo1)，磁力攪拌。4-[3-(2,4,6隱三甲基吡啶)]氰苯(l.llg，5mmo1)溶于少量的THF中，緩慢的滴加入三頸燒瓶中，油浴加熱反應(yīng)5h。待反應(yīng)結(jié)束后，緩緩滴加2ml去離子水THF=1:1的溶液(冰水浴)，再滴加2ml20M的NaOH溶液，然后再次滴加8ml去離子水THF=1:1的溶液。濾去沉淀，濾餅用THF洗三次。經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為甲醇-石油醚(4:1)，得到淡黃色的液體即產(chǎn)物4-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺；產(chǎn)率為54.3%;Rf(甲醇石油醚=8:1)0.70;MS(ESI):m/z226([M]+,100%);'H誦NMR(500MHz，CDC13):51.25(m，J:14.04Hz，2H)，S2.0(s，3H)，S2.25(s，3H，S2.52(s，3H)，S3.94(s，2H)，56.92(s，1H)，S7.12(d，聲8.05Hz2H)，S7.38(d，M23Hz,2H);純度為99.9%。實(shí)施例64-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲胺步驟A:3-氯-6-異丙氧基噠嗪的制備具體方法及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同實(shí)施例3步驟A。步驟B:4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]氰苯的合成具體方法及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同實(shí)施例3步驟B。步驟C:4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲胺的合成具體方法同實(shí)施例5中步驟B，反應(yīng)物為中間體化合物4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]氰苯(1.912g，0.008md)。經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為甲醇-石油醚(4:1)，旋干得到黃色粘狀液體，即產(chǎn)物4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲胺，產(chǎn)率為31.2%，Rf(甲醇石油醚=8:1)0.88;MS(ESI):m/z243([M]+,100%);^-NMR(500MHz，CDC13):51.23(t，戶14.01Hz，1H)，51.43(d，M16Hz，6H)，S3.9(s，2H)，S5.61(m，《/=24.66Hz，1H)，S6.97(d，戶19.21Hz，1H)，S7.45(d，J:8.22Hz，2H)，57.76(d，J:9.23Hz，1H)，S7.98(d，^8.23Hz，2H);純度為99.6%。實(shí)施例74-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺步驟A:4-[2-(4，6-二甲氧基嘧啶)]氰苯的合成具體方法及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同實(shí)施例4步驟A。步驟B:4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺的合成具體方法同實(shí)施例5中步驟B，反應(yīng)物為中間體化合物4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺，經(jīng)柱層析分離，洗脫劑為甲醇-石油醚(4:1)，旋干得到黃色粘狀液體，即產(chǎn)物4-[2-(4，6-二甲氧基噴啶)]苯甲胺，產(chǎn)率為25.9%，Rf(甲醇:石油醚=10:1)0.68，MS(ESI):m/z246([M+H]+,100%)，iH-NMR(500MHz，CDC13);53.94(s，2H)，S3.98(s，1H)，S4.05(s,，6H)，5.96(s，1H)，7.40(d，聲7.25Hz，2H)，8.41(d,，凡56Hz，2H);純度為98.9%。實(shí)施例83-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺的鹽酸鹽取3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺(1.696g，0.008mol)，溶于50ml甲醇，加入濃度為O.lmol/L的鹽酸溶液80ml，磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去大部分甲醇，冷卻析出晶體，以甲醇重結(jié)晶。得到3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺鹽酸鹽，產(chǎn)率為31%。MS(EI):m/z213綱+，100%);'H-畫R(500MHz，CDC13):2.02(s，3H)，2.27(s，3H)，2.52(s，3H)，3.72(brs，J=2.48Hz，2H)，6.46(s，J=1.75Hz，1H)，6.52(d，J=7.51Hz，lH)，6.68(d，J=10.28Hz，1H)，6.89(s,1H)，7.21(m，J=15.48，IH)。實(shí)施例94-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺的鹽酸鹽具體方法同實(shí)施例8，產(chǎn)率為42%。MS(EI):m/z240([M]+,100%);!H-NMR(500MHz，CDC13):S1.98(s，3H)，S2.05(s，2H)，52.22(s，3H)，52.52(s，3H)，S6.94(s，1H)，S7.24(d，聲8.17Hz，2H)，57.91(d，J:8.19Hz，2H)。實(shí)施例IO4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲酰胺的鹽酸鹽具體方法同實(shí)施例8，產(chǎn)率為47.3%;MS(ESI):m/z257([M]+,100%);^-NMR(500MHz，CDC13):L43(m,J=10.51Hz，6H),5.54(m,J=24.61Hz,1H)，7.17(d,J=9.26Hz,1H),8.01(d，J=8.58Hz,2H)，8.10(d,J=10.20Hz,3H)。實(shí)施例114-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺的鹽酸鹽具體方法同實(shí)施例8，產(chǎn)率為39.2%;MS(EI):m/z258([M-H]+，100%);^-NMR(500MHz,CDC13):4.11(s,7H),5.74(brs，IH)，6.06(s,1H),6.17(brs,1H),7.91(d，J=8.3Hz,2H)，8.54(d,J=8.3Hz,2H)。實(shí)施例124-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺的鹽酸鹽具體方法同實(shí)施例8，產(chǎn)率為33.9%;MS(ESI):m/z226([M]+，100%);^-NMR(500MHz,CDC13):51.25(m，弁14.04Hz，2H)，52.0(s，3H)，52.25(s，3H，S2.52(s，3H)，S3.94(s，2H)，S6.92(s，IH)，S7.12(d，片05Hz2H)，S7.38(d，風(fēng)23Hz，2H)。實(shí)施例134-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲胺的鹽酸鹽具體方法同實(shí)施例8，產(chǎn)率為41%;MS(ESI):m/z243([M]+,100%);'H-NMR(500MHz，CDC13):S1.23(t，^14.01Hz，1H)，51.43(d，J:6.16Hz，6H)，S3.9(s，2H)，55.61(m，7=24.66Hz，1H)，56.97(d，《/=19.21Hz，1H)，57.45(d，^8.22Hz，2H)，S7.76(d，J:9.23Hz，1H)，57.98(d，風(fēng)23Hz，2H)。實(shí)施例144-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺的鹽酸鹽具體方法同實(shí)施例8，產(chǎn)率為47%;MS(ESI):m/z246([M+H]+,100%)，^-NMR(500MHz，CDC13);53.94(s，2H)，S3.98(s，1H)，S4.05(s，，6H)，5.96(s，1H)，7.40(d，J:7.25Hz，2H)，8.41(d，，凡56Hz，2H)。實(shí)施例157種目標(biāo)化合物的活性篩選具體方法密度達(dá)80~卯％的人卵巢瘤細(xì)胞A2780細(xì)胞(購于中國科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞研究所)經(jīng)抑制劑處理4小時(shí)，處理后細(xì)胞懸浮于RIPA緩沖液(100mMTris，150mMNaCl,1%Triton,1%脫氧膽酸，0.1%SDS,1mMEDTA,and2mMNaF)，另補(bǔ)加lmM釩酸鈉，lmM亮抑酶肽，lmM抑肽酶，lmM苯甲基磺酰氟(PMSF)，lmM二硫蘇糖醇(DTT)，lmM胃酶抑素A，冰浴30分鐘。細(xì)胞裂解液12000g離心15分鐘，收集上清，使用Bio-Rad(Hercules,CA,USA)的蛋白濃度測定試劑測定蛋白濃度。將等濃度蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。使用特異性抗體通過免疫雜交的方式(WesternBlot印跡法)檢測目的蛋白。WesternBlot印跡法結(jié)果(見中圖1)采用復(fù)日Smartview生物電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，評(píng)價(jià)被篩選化合物的生物活性。抑制率計(jì)算參照式I，圖l中的號(hào)碼與各化合物一一對(duì)應(yīng)，詳見表l。表l各化合物對(duì)PI3K酶的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>9實(shí)施例4:4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺9.310陽性對(duì)照品LY29400296.8陰性對(duì)照掃描值一實(shí)驗(yàn)組掃描值PI3K酶抑制率=-X100%......式I陰性對(duì)照掃描值如上7種目標(biāo)化合物和先導(dǎo)化合物3-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯胺、3-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯胺及PI3K酶特異性抑制劑LY294002在50pM濃度下分別能抑制93.3%，96.7%，21.4%，50.8%,-11.2%，-0.6%，9.3%,60.8%，35.4%及96.8%的PI3Ks酶活性，對(duì)應(yīng)圖1上的編號(hào)分別為l，2，5，6，7，8，3，4，9。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為負(fù)的化合物具有刺激性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除7和8號(hào)化合物對(duì)PI3K酶反而具有刺激作用外，其他化合物均有抑制活性。且1號(hào)和2號(hào)化合物的抑制率較高，均達(dá)90%以上，與LY294002的抑制率較為相近。實(shí)施例163-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯胺的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)將3-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯胺和LY294002分別用DMSO助溶，配成5pmol/L、10nmol/L、20nmol/L、40pmol/L、80[imol/L、160nmol/L的濃度待用。配陰性對(duì)照液，艮P酉己制與藥液中相同濃度的DMSO溶液。DMSO的濃度50.5%。(1)接種細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的人口腔表皮癌細(xì)胞&8-八-1(該細(xì)胞為美國國立健康研究院(NationalInstitutesofHealth,U.S.A.)Prof.IraPastan禾卩Prof.MichealM.Gottesman惠贈(zèng))，用含10。/。胎牛血清的RPMI1604培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103~104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100pl。(2)培養(yǎng)細(xì)胞將培養(yǎng)板放入C02孵箱，在37'C、5%<302及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后加入藥液。(3)96孔板上設(shè)加藥孔，對(duì)照孔和空白孔。加藥孔中加入濃度梯度的藥物，每孔100pl，設(shè)4個(gè)復(fù)孔；陽性對(duì)照空中加入相應(yīng)濃度的LY294002藥液，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；陰性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照液，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。(4)呈色培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)，37。C繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150plDMSO，振蕩10min，使甲臜充分溶解。(5)比色選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，光吸收值(A)為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。通過Origin軟件計(jì)算IC50值。判斷IC5QS15(^M，結(jié)果為陽性，IC5c>15(HiM，結(jié)果為陰性。陽性的化合物即為有效的PI3Ks酶抑制劑。3-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯胺的IC50值為100.8拜1/L，LY294002的IC50值為36.7pmol/L。3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺雖與LY294002的抑制效果有一定差距，但是仍不失為一種有效的PI3K酶抑制劑。具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖2(見)與表2。表23-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)l苯胺和LY294002的IC鄰值3-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯胺LY294002ICso(Mmol/L)100.836.7實(shí)施例174-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)具體方法步驟同實(shí)施例16，4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺的IC5o值為IO9.lpmol/L，LY294002的ICso值為37.lpmol/L。4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺雖與LY294002的抑制效果有一定差距，但是仍不失為一種有效的PI3K酶抑制劑。具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖3(見)與表3。表34-3-(2，4，6-三甲基吡啶)苯甲胺和LY294002的IC50值4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺LY294002IC5o(nmol/L)109.137.1實(shí)施例183-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯胺的細(xì)胞選擇性實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)方法步驟同實(shí)施例16，實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞為人口腔表皮癌細(xì)胞KB-A-1，人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，人正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV。3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺對(duì)人體正常細(xì)胞的抑制率較低，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率較高，具有不錯(cuò)的細(xì)胞選擇性。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4(見)和表4。表43-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)l苯胺在不同濃度下對(duì)不同細(xì)胞的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例194-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺的細(xì)胞選擇性實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)方法步驟同實(shí)施例16，實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞為人口腔表皮癌細(xì)胞KB-A-1，人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT，人正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明4-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺對(duì)人體正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的選擇性不高。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5(見)和表5。表54-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)苯甲胺在不同濃度下對(duì)不同細(xì)胞的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例203-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺與LY294002的細(xì)胞選擇性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體實(shí)驗(yàn)方法步驟同實(shí)施例16，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為人口腔表皮癌細(xì)胞KB-A-1，人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT。實(shí)驗(yàn)證明，3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺對(duì)細(xì)胞的選擇性要優(yōu)于LY294002。具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖6(見)和6。表63-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)]苯胺與ly294002的細(xì)胞選擇性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例214-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺與LY294002的細(xì)胞選擇性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體實(shí)驗(yàn)方法步驟同實(shí)施例16，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為人口腔表皮癌細(xì)胞KB-A-1，人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，4-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺與LY294002對(duì)細(xì)胞的選擇性相仿，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖7(見)和表7。表74-[3-(2，4，6-三甲基吡啶)苯甲胺與ly294002的細(xì)胞選擇性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1、通式I、II、III的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽其中-R1為-NH2，-CH2NH2或-CONH2；-R2，-R3，-R4為-CH3或者-OCH3或者-OCH(CH3)2。2、根據(jù)權(quán)利要求1所說的通式I、II、III所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，R4為CH3I為，。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于，通式I、II、in所示的化合物為5-(3-氨基苯)煙酸甲酯類似物。4、根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，作為制備PI3K酶抑制劑的應(yīng)用，其特征在于，所說的鹽包括無機(jī)酸鹽、有機(jī)酸鹽或氨基酸鹽；具體包括氫嗅酸鹽、氫碘酸鹽、鹽酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、乙酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、天冬氨酸鹽或谷氨酸鹽。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為以下列舉中的任一3-[3-(2,4,6-三甲基吡啶)]苯胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(2，4,6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[2-(4,6-二甲氧基嘧啶)]苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(6-異丙氧基噠嗪)]苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于最優(yōu)化的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為3-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。7、根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于PI3K酶抑制劑的細(xì)胞選擇性優(yōu)于LY294002。8、根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療PI3K酶活性過高導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述的PI3K酶活性過高導(dǎo)致的疾病包括炎癥、血栓、自身免疫性疾病、心血管疾病和腫瘤??；具體包括急性胰腺炎，慢性腸道炎，支氣管哮喘；急性心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、瓣膜病、心房顫動(dòng)；糖尿病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，慢性甲狀腺炎；動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓；乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和淋巴瘤。10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于最優(yōu)化的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為3-[3-(2,4，6-三甲基吡啶)]苯胺或其藥學(xué)上可接受的鹽、4-[3-(2，4,6-三甲基吡錠)〗苯甲胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。全文摘要本發(fā)明公開了一類PI3K酶抑制劑的制備及其應(yīng)用。首先對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造并且通過合成得到，然后用Western印跡法測定目標(biāo)化合物對(duì)PI3K酶的抑制率，進(jìn)行生物活性篩選，從而獲得一類較為理想的新型PI3K酶抑制劑。經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明了本發(fā)明的PI3K酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞有比較顯著的抑制作用。可作為制備治療PI3K酶活性過高導(dǎo)致疾病的潛在藥物；本發(fā)明的PI3K酶抑制劑，活性高，毒性低，預(yù)示具有較大的臨床應(yīng)用前景。所說的PI3K酶抑制劑，為具有通式I、II、III的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。文檔編號(hào)A61K31/44GK101333187SQ200810036220公開日2008年12月31日申請(qǐng)日期2008年4月18日優(yōu)先權(quán)日2008年4月18日發(fā)明者任宇紅,吳娉娉,陶欣藝,魏東芝申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)