專利名稱：一種由谷胱甘肽與氨基酸形成的非共價復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于非共價復(fù)合物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種由谷胱甘肽(GSH)與氨基酸形成的 非共價復(fù)合物，這種非共價復(fù)合物是一種潛在的保健品和治療藥物。
背景技術(shù)：
主體和客體之間的非共價相互作用包括蛋白質(zhì)受體與藥物配體、酶與底物以及抗原和 抗體等之間相互作用，是導(dǎo)致分子特異性識別及多種生物現(xiàn)象的化學(xué)基礎(chǔ)。疾病通常是由 于與共價鍵復(fù)合物相關(guān)的正常的生物過程異常而引起的，因此，深入研究這些非共價復(fù)合 物的形成機理、鍵合位點等可以在分子水平上了解在健康和疾病狀態(tài)下各種生物大分子的 功能和性質(zhì)，以便設(shè)計出特殊療效的藥物去恢復(fù)正常的生理功能，這已經(jīng)成藥物開發(fā)的重 要路徑。
本發(fā)明同時也為了研究與谷胱甘肽結(jié)合的氨基酸、混合氨基酸形成的非共價復(fù)合物的 生理功能。
谷胱甘肽是細胞內(nèi)廣泛存在的小分子硫醇類化合物。還原型谷胱甘肽是細胞內(nèi)非蛋白 硫氫基團的主要組成部分，具有許多重要的生理功能。谷胱甘肽能對細胞提供抗氧化、抗 毒性和輔酶等三重保護，并對一些巰基酶有激活作用。谷胱甘肽可通過共價鍵結(jié)合，參與 Meister循環(huán)中氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運。谷胱甘肽在細胞對外界異物的解毒，以及對羥基過氧化 物、自由基和親電試劑的清除中起著重要作用。谷胱甘肽是谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘 肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的特有底物，通過這兩種酶的作用來保護細胞，抵御活性氧及其衍生物 的氧化損害。因此，GSH是細胞抗損傷及代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵物質(zhì)之一。
氧化型谷胱甘肽(GSSG)/還原型谷胱甘肽(GSH)的比值是細胞氧化還原狀況的一個重 要指標，蛋白質(zhì)與谷胱甘肽結(jié)合的程度也會隨之作出相應(yīng)的變化，該比值偏高，要促進蛋 白質(zhì)與谷胱甘肽共價鍵結(jié)合；比值偏低，則會導(dǎo)致釋放谷胱甘肽.
近年來，谷胱甘肽新的作用正在不斷的被發(fā)現(xiàn)。例如，蛋白質(zhì)的谷胱甘肽化是細胞內(nèi) 信息傳導(dǎo)的重要因素，谷胱甘肽和有機砷酸可以通過共價鍵或非共價鍵結(jié)合。此外，谷胱 甘肽還是許多金屬離子的鰲合劑，以維持體內(nèi)平衡。
迄今為止，從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸近300種，然而，能夠參與蛋白質(zhì)組成的常 見氨基酸(或稱基本氨基酸)大約有20種，如天冬氨酸、精氨酸和蘇氨酸等，它們又可 稱為蛋白質(zhì)氨基酸。大部分的氨基酸為非常見氨基酸，它們都是在已合成的肽鏈上由常 見氨基酸在專一酶催化下，經(jīng)過化學(xué)修飾轉(zhuǎn)化而來。在生命現(xiàn)象中起重要作用蛋白質(zhì)和多肽都是由氨基酸通過肽鍵連接而成的。而單純氨 基酸在生命現(xiàn)象中也能直接起重要作用。例如氨基酸治療已經(jīng)成功地應(yīng)用于抗衰老、提高 記憶力、減少抑郁癥、減輕關(guān)節(jié)炎、減少皰疹和促進頭發(fā)生長等。在體內(nèi)，谷氨酸在谷丙 轉(zhuǎn)氨酶的作用下，可以將分子中的氨基轉(zhuǎn)移給丙酮酸，生成丙氨酸。精氨酸能提高人體免 疫力，促進釋放人體生長激素(HGH)，快速療傷，以及減輕動脈粥樣硬化等。
非常見氨基酸的應(yīng)用較為廣泛，可以作為合成其它含氮物質(zhì)的前體，如激素和抗生素 等，作為組成細菌細胞壁的成分，還可參與充當神經(jīng)遞質(zhì)，同時非常見氨基酸還參與跨膜 離子通道的形成。氨基酸的構(gòu)型通常采用D、 L標記法。常見氨基酸和大部分非常見氨基酸 為L-型氨基酸。少量非常見氨基酸為D-型氨基酸，它們一般以各種形式分布于植物、細 菌和動物體內(nèi)。D-型氨基酸在醫(yī)藥、食品、農(nóng)藥、科學(xué)研究等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用。例如在 醫(yī)藥方面，用于合成多肽藥物，如多肽抗生素(阿撲西林Aspoxicillin)。此外，通過研究生 物體內(nèi)氨基酸D， L型異構(gòu)體含量的變化，可作為年帶記時器進行氣候、水文研究，還有， D-型氨基酸可用于酶的結(jié)構(gòu)和功能分析方面的研究。
在臨床上，混合氨基酸門冬氨酸鳥氨酸可以治療因急、慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、 肝炎所致的高血氨癥，特別適用于因肝臟疾患引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的解除及肝性腦病 的搶救。在體內(nèi)，門冬氨酸鳥氨酸通過產(chǎn)生兩種氨基酸即鳥氨酸和門冬氨酸，作用于兩個 主要的氨解毒途徑——尿素合成和谷酰胺合成。而鳥氨酸是尿素循環(huán)的關(guān)鍵性物質(zhì)。門冬 氨酸可以參與肝細胞內(nèi)核酸的合成，以利于修復(fù)被損傷的肝細胞。另外，門冬氨酸對肝細 胞內(nèi)三羧循環(huán)代謝過程有間接促進作用。但是，有關(guān)谷胱甘肽與氨基酸和混合氨基酸形成 的非共價復(fù)合物至今未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種由谷胱甘肽與氨基酸形成的非共價復(fù)合物。 本發(fā)明提出的谷胱甘肽與氨基酸形成的非共價復(fù)合物，是在體外將常見氨基酸、非常 見氨基酸或混合氨基酸和谷胱甘肽按1:1 1:2摩爾比混合，然后在室溫和pH6~8條件下， 將混合物在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45-60分鐘，使反應(yīng)完全，即得到谷胱甘肽與它們形成的非共價 復(fù)合物；對該非共價復(fù)合物采用電噴霧質(zhì)譜進行表征。用曲線擬合法將電噴霧質(zhì)譜測得的 數(shù)據(jù)處理后，得到該非共價復(fù)合物的生成常數(shù)為102~103。
本發(fā)明中谷胱甘肽與氨基酸和混合氨基酸非共價復(fù)合物的形成對谷胱甘肽的Meister 循環(huán)，以及各種單個及其混合氨基酸的生理功能可能有促進作用，因此可以為制備新的具 有各種生理功能的藥物提供依據(jù)。
本發(fā)明中，電噴霧質(zhì)譜儀為裝有Sciex離子噴霧界面的三級四極桿串級質(zhì)譜(PE-Sciex,Concord, ON,加拿大，m/z 2400)。質(zhì)譜儀的質(zhì)量由聚丙二醇(PPG)校正。溶液的pH值 由PHS-3C精密pH計(上海林達儀器廠)測試。噴霧器上加上4800V電壓，檢測采用正 離子模式，檢測器電壓為-4000V。進樣板電壓(Interface plate voltage)為650 V，進樣小孔 電壓(orifice plate voltage)為65 V， Q。為射頻模式，為質(zhì)量分辨模式。霧化氣為普氮 (98%)，簾氣為高純氮(99.99%)。
具體實施方式
實施例1
本發(fā)明中，將常見氨基酸包括酸性氨基酸天冬氨酸(Asp),堿性氨基酸賴氨酸(Lys)、精 氨酸(Arg)，極性氨基酸蘇氨酸(Thr),以及非極性氨基酸丙氨酸(Ala)和谷胱甘肽按1:1 1:2摩 爾比混合，然后在室溫和pH6 8條件下，將混合物在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60分鐘，使反應(yīng)完全， 即得到Asp、 Lys、 Arg、 Thr， Ala等與谷胱甘肽形成的非共價復(fù)合物。
非共價復(fù)合物的鑒定采用電噴霧質(zhì)譜。電噴霧質(zhì)譜儀為裝有Sciex離子噴霧界面的三 級四極桿串級質(zhì)譜(PE-Sciex， Concord, ON,加拿大，m/z 2400)。
Asp、 Lys、 Arg、 Thr、 Ala等與谷胱甘肽形成的非共價復(fù)合物一般為單電荷離子， [GSH-Asp + H]+、 [GSH-Lys + H]+、 [GSH-Arg + H]+、 [GSH-Thr + H]+、 [GSH-Ala + H]+的 m/z分別為441.1, 454.19, 482.2， 427.12和397.1。
用曲線擬合法將電噴霧質(zhì)譜測得的數(shù)據(jù)處理后，得到該非共價復(fù)合物的生成常數(shù)為io2 ~ 103. 實施例2
本發(fā)明中，將非常見氨基酸N-a-苯甲酰L-精氨酸C6HsCO(Arg)、鳥氨酸(Orn)和谷胱甘 肽按l:l- l:2摩爾比混合，然后在室溫和pH 6~8條件下，將混合物在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60分 鐘，使反應(yīng)完全，即得到N-a-苯甲酰L-精氨酸C6H5CO(Arg)、和鳥氨酸(Orn)與谷胱甘肽形 成的非共價復(fù)合物。
非共價復(fù)合物的鑒定采用電噴霧質(zhì)譜。電噴霧質(zhì)譜儀為裝有Sciex離子噴霧界面的三 級四極桿串級質(zhì)譜(PE-Sciex, Concord, ON,加拿大，m/z 2400)。
N-a-苯甲酰L-精氨酸的m/z為279.1。谷胱甘肽與N-a-苯甲酰L-精氨酸或鳥氨酸形成 的非共價復(fù)合物，它們的單電荷分子離子峰[GSH-C6H5CO-Arg + H]+和[GSH-Orn + H]+的 m/z分別為586.2和440.3。
N-a-苯甲酰L-精氨酸的結(jié)構(gòu)式如下所示<formula>formula see original document page 6</formula>實施例3
本發(fā)明中，將D-型氨基酸谷氨酰胺(Gln)和谷胱甘肽按1:1 1:2摩爾比混合，然后在室 溫和pH6 8條件下，將混合物在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60分鐘，使反應(yīng)完全，即得到D-型Gln和 谷胱甘肽的非共價復(fù)合物。
非共價復(fù)合物的鑒定采用電噴霧質(zhì)譜。電噴霧質(zhì)譜儀為裝有Sciex離子噴霧界面的三 級四極桿串級質(zhì)譜(PE-Sciex, Concord, ON,加拿大，m/z 2400)。
谷胱甘肽與D-型Gin可以形成谷胱甘肽與D-型Gin非共價復(fù)合物，單電荷分子離子 峰[GSH-Gln + H]+的m/z為454.2。 實施例4
本發(fā)明中，將注射用混合氨基酸門冬氨酸(Asp)鳥氨酸(Om)和谷胱甘肽按1:1 1:2摩爾 比混合，然后在室溫和pH 6~8條件下，將混合物在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60分鐘，使反應(yīng)完全， 即得到谷胱甘肽與Asp,以及谷胱甘肽與Orn兩種非共價復(fù)合物.
兩種非共價復(fù)合物的鑒定采用電噴霧質(zhì)譜。電噴霧質(zhì)譜儀為裝有Sciex離子噴霧界面 的三級四極桿串級質(zhì)譜(PE-Sciex, Concord, ON，加拿大，m/z 2400)。
谷胱甘肽與Asp，以及谷胱甘肽與Orn兩種非共價復(fù)合物的單電荷分子離子峰 [GSH-Asp + H]+和[GSH-Orn + H]+的m/z分別為441.1和440.2.實驗中沒有觀察到谷胱甘 肽與門冬氨酸和鳥氨酸三者混配的非共價復(fù)合物。
權(quán)利要求
1、一種由谷胱甘肽與氨基酸形成的非共價復(fù)合物，其特征在于由下述步驟制備獲得在體外將常見氨基酸、非常見氨基酸或混合氨基酸和谷胱甘肽按1∶1～1∶2摩爾比混合，然后在室溫和pH 6～8條件下，將混合物在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45-60分鐘，使反應(yīng)完全，即得到谷胱甘肽與它們形成的非共價復(fù)合物；對該非共價復(fù)合物采用電噴霧質(zhì)譜進行表征，該非共價復(fù)合物的生成常數(shù)為102～103。
全文摘要
本發(fā)明屬于非共價復(fù)合物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種谷胱甘肽與氨基酸形成非共價復(fù)合物，其中氨基酸包括常見氨基酸和非常見氨基酸。本發(fā)明中谷胱甘肽與氨基酸、混合氨基酸形成的非共價復(fù)合物的鑒定采用電噴霧質(zhì)譜技術(shù)。非共價復(fù)合物的合成是將氨基酸或混合氨基酸和谷胱甘肽按1∶1～1∶2摩爾比混合，然后在室溫和pH 6～8條件下，將混合物在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，使反應(yīng)完全，即得到谷胱甘肽與它們形成的非共價復(fù)合物。用曲線擬合法將電噴霧質(zhì)譜測得的數(shù)據(jù)處理后，得到該非共價復(fù)合物的生成常數(shù)為10²～10³。
文檔編號A61K31/185GK101244254SQ20081003402
公開日2008年8月20日 申請日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者丁傳凡, 儲艷秋, 戴兆云, 潘婷婷 申請人:復(fù)旦大學(xué)